Summary
Une méthode d’isolement de cellules souches neurales et de cellules progénitrices d’oligodendrocytes à partir du cerveau de rats vivants est présentée ici en détail expérimental. Il permet de multiples prélèvements de ces cellules chez les mêmes animaux sans compromettre leur bien-être.
Abstract
Les cellules souches neurales (CSN) spécifiques aux tissus restent actives dans le cerveau postnatal des mammifères. Ils résident dans des niches spécialisées, où ils génèrent de nouveaux neurones et des cellules gliales. L’une de ces niches est la zone sous-épendymaire (ZES, également appelée zone ventriculaire-sous-ventriculaire), qui est située à travers les parois latérales des ventricules latéraux, adjacentes à la couche de cellules épendymaires. Les cellules progénitrices oligodendrocytaires (OPC) sont abondamment réparties dans tout le système nerveux central, constituant un pool de cellules progénitrices prolifératives capables de générer des oligodendrocytes.
Les NSC et les OPC présentent tous deux un potentiel d’auto-renouvellement et des cycles de quiescence/activation. En raison de leur emplacement, l’isolement et l’investigation expérimentale de ces cellules sont effectués post-mortem. Nous décrivons ici en détail la « traite cérébrale », une méthode d’isolement des NSC et des OPCs, entre autres cellules, à partir d’animaux vivants. Il s’agit d’un protocole en deux étapes conçu pour être utilisé chez les rongeurs et testé chez les rats. Tout d’abord, les cellules sont « libérées » du tissu par injection intra-intra-ventriculaire stéréotaxique (i.c.v.) d’un « cocktail de libération ». Les principaux composants sont la neuraminidase, qui cible les cellules épendymaires et induit la dénudation de la paroi ventriculaire, un anticorps bloquant l’intégrine-β1, et le facteur de croissance des fibroblastes-2. Lors d’une deuxième étape de « prélèvement », des biopsies liquides du liquide céphalorachidien sont réalisées à partir de la citerne magna, chez des rats anesthésiés sans avoir besoin d’une incision.
Les résultats présentés ici montrent que les cellules isolées conservent leur profil endogène et que les CSN de la ZES préservent leur quiescence. La dénudation de la couche épendymaire est limitée au niveau anatomique de l’injection et le protocole (libération et prélèvement) est bien toléré par les animaux. Cette nouvelle approche ouvre la voie à la réalisation d’études longitudinales de la neurogenèse endogène et de la gliogenèse chez les animaux de laboratoire.
Introduction
Les cellules souches tissulaires spécifiques sont des cellules partiellement engagées qui peuvent donner naissance à toutes les populations cellulaires qui constituent les tissus respectifs. En plus d’être multipotentes, ce sont des cellules auto-renouvelables et cruciales pour le maintien de l’homéostasie et de la capacité de régénération des tissus1. Certaines cellules souches tissulaires restent actives et fortement prolifératives, comme les cellules souches intestinales ou hématopoïétiques. D’autres, comme les cellules souches cérébrales, restent en grande partie au repos ou dormantes2. Dans le cerveau adulte, les cellules souches neurales (CSN) peuvent être trouvées dans des zones spécialisées, souvent appelées niches. Deux de ces zones bien décrites existent dans la zone sous-épendymaire (ZES) des ventricules latéraux et dans le gyrus denté de l’hippocampe. La niche des ZES génère le plus grand nombre de cellules, principalement des neuroblastes qui migrent vers les bulbes olfactifs et contribuent à la population locale d’interneurones ; en revanche, les oligodendroblastes générés migrent vers le corps calleux (CC)3 adjacent. Les cellules progénitrices oligodendrocytaires (OPC) sont des cellules mitotiquement actives, largement distribuées dans tout le système nerveux central, qui : i) sont engagées dans la lignée oligodendrogliale, ii) peuvent migrer vers des sites de démyélinisation et iii) peuvent se différencier en oligodendrocytes myélinisants. Les OPC présentent également un potentiel d’auto-renouvellement et de quiescence4.
Jusqu’à présent, l’isolement et l’étude des NSC et des OPC nécessitaient une dissociation post-mortem des tissus cérébraux et moelle épinière disséqués. Pour contourner cette limitation expérimentale, nous avons mis au point une méthode qui permet, pour la première fois, d’isoler les NSC et OPC cérébraux d’animaux vivants. Nous appelons cette méthode « traite », car elle permet de collecter plusieurs cellules car leurs réserves ne sont pas épuisées. Le protocole a été développé chez le rat, en raison de la grande taille de son cerveau, ciblant principalement la ZES, ou CC, et comprend deux étapes principales. Tout d’abord, les NSC ou OPC sont « éliminés » du tissu par injection intraveineuse d’un « cocktail de libération » contenant de la neuraminidase, une toxine qui induit la dénudation de la paroi ventriculaire, un anticorps bloquant l’intégrine-β1 et le facteur de croissance des fibroblastes 2 (FGF2). Le cocktail est injecté par stéréotaxie bilatéralement dans les ventricules latéraux. Si l’utilisation prévue est l’isolement des NSC, les zones rostrales des ventricules latéraux sont ciblées. Si l’objectif est d’isoler plus purement les OPC, le cocktail est injecté par voie caudale dans la zone des fimbria de l’hippocampe. Lors d’une deuxième étape de « prélèvement », des biopsies liquides de liquide céphalorachidien (LCR) sont effectuées à partir de la citerne magna de rats anesthésiés, sans qu’il soit nécessaire d’incision. La biopsie liquide est mélangée avec un milieu de culture NSC et peut être conservée à 4 °C jusqu’au dressage.
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Protocol
Les procédures d’élevage, d’entretien et d’expérimentation des animaux ont été menées conformément à la loi britannique de 1986 sur les animaux (procédures scientifiques), autorisée par le ministère de l’Intérieur, et au décret présidentiel 56/2013 de la République hellénique, examinées par les organismes de bien-être animal et d’éthique des universités de Cambridge et de Patras, ainsi qu’approuvées et examinées par le comité préfectoral local de protection et d’utilisation des animaux (numéro de protocole : 5675/39/18-01-2021). Des rats Sprague-Dawley, Wistar et Long-Evans mâles et femelles, âgés de 2 à 4 mois et pesant entre 150 g et 250 g, ont été utilisés. Le protocole est résumé graphiquement à la figure 1.
1. Libérer la préparation du cocktail
REMARQUE : Préparez frais le jour de l’intervention et conservez-le sur glace. Les quantités sont données par 2 μL à injecter dans chaque ventricule latéral. Préparer 1 μL supplémentaire par injection prévue.
- Préparer 0,5 μL de neuraminidase à 500 mU de Clostridium perfringens (Clostridium welchii).
REMARQUE : Conservez-le sous forme de 1 U/μL dilué dans de l’eau stérile à -20 °C. D’autres types de neuraminidases n’ont pas été testés. - Préparer 1 μL contenant 1 μg d’anticorps bloquant l’intégrine-β1.
REMARQUE : Conservez-le à 4 °C. - Préparer 0,5 μL contenant 0,5 μg de facteur de croissance des fibroblastes basiques (FGF-basique humain recombinant).
REMARQUE : Conservez-le sous forme de bouillon de 1 μg/μL dilué dans de l’eau stérile à -20 °C.
2. Injection de cocktail de libération
REMARQUE : L’ensemble du processus peut être effectué en 20 minutes. Prenez soin d’effectuer la chirurgie dans des conditions aseptiques. Nettoyez toutes les surfaces avec un antiseptique (p. ex., peroxyde d’hydrogène à 3 % ou 6 %). Utilisez des outils, des gants, des blouses et des champs autoclavés ou facilement stériles.
- Anesthésier l’animal de laboratoire par inhalation d’isoflurane (2,5 % pour l’induction et 2 % pour l’entretien). Confirmez la profondeur de l’anesthésie en vérifiant le réflexe cornéen, la réaction aux stimuli (test de pincement des membres postérieurs et de la queue) et le mode de respiration.
REMARQUE : Les interventions chirurgicales peuvent être réalisées sous anesthésie générale induite par une anesthésie injectable intrapéritonéale (par exemple, kétamine [40 mg/kg] et xylazine [10 mg/kg]). L’anesthésie profonde a été confirmée par la vérification du réflexe cornéen, de la réaction aux stimuli (test de pincement des membres postérieurs et de la queue) et du mode de respiration. - Administrer un analgésique par voie sous-cutanée (p. ex. 0,3 mg/mL de buprénorphine) lors de l’induction de l’anesthésie.
- Montez le rat sur le cadre stéréotaxique.
- Rasez la fourrure de la tête avec un rasoir et nettoyez la peau avec un antiseptique, tel qu’une solution de povidone iodée à 10%, puis de l’alcool. Appliquez l’antiseptique trois fois à l’aide de cotons-tiges stériles. Frottez en effectuant des mouvements circulaires pendant 3 à 5 s à chaque fois. Appliquez une pommade pour les yeux pour prévenir la sécheresse.
- Faites une incision de 2 cm dans la peau de la tête le long de la ligne médiane à l’aide d’un scalpel stérile.
- Nettoyez méticuleusement le crâne à l’aide d’écouvillons stériles et d’une solution saline stérile.
- Identifiez le bregma à l’aide du bord de l’aiguille d’une seringue Hamilton de 10 μL montée sur le dispositif stéréotaxique. Réglez le bregma sur « point 0,0 ».
NOTE : Le bregma est identifié comme le point d’intersection entre les sutures sagittales et coronales. Plus de détails peuvent être trouvés dans l’atlas du cerveau de rat de Paxinos et Watson5. - Déplacez l’appareil vers les coordonnées antériopostérieures (AP) = 0,3 mm, latérales (L) = +1,2 mm (pour cibler la ZES) ou AP = 1,5 mm, L = +2,0 mm (pour cibler le CC).
- Percez un trou de bavure de 1 mm à l’aide d’une perceuse dentaire.
REMARQUE : Lorsque vous percez à la main, veillez à ne pas blesser la surface corticale. L’hémorragie ne devrait pas être considérable. Éliminez tout sang avec une solution saline et appliquez une pression pour arrêter les saignements plus persistants. - Chargez 4 μL du cocktail de libération dans la seringue Hamilton de 10 μL.
- Abaissez l’aiguille (de préférence émoussée ou conique) de la seringue Hamilton afin d’entrer en contact avec la dure-mère.
- Insérez l’aiguille à la profondeur souhaitée (D = 3,5 mm).
REMARQUE : Versez une solution saline sur la surface de la dure-mère pour garder les tissus hydratés. - Infuser 2 μL du cocktail libératoire à raison de 1 μL/min.
- Laissez l’aiguille en place pendant encore 2 minutes avant de la récupérer lentement pour éviter que le cocktail de libération ne remonte à la surface.
- Répétez les étapes 2.8-2.14 pour l’autre hémisphère aux coordonnées AP = 0,3 mm, L = -1,2 mm (pour cibler la ZES) ou AP = 1,5 mm, L = -2,0 mm (pour cibler le CC).
- Suturez l’incision avec du nylon 5-0 (diamètre 0,1 mm) et nettoyez la zone suturée avec un antiseptique.
- Retirez le masque qui fournit l’anesthésique et transférez l’animal dans la zone de surveillance post-opératoire.
REMARQUE : La récupération de l’anesthésie et le maintien de la position couchée doivent se produire dans les 5 à 10 minutes, et la récupération complète (comportement normal) dans les 25 minutes.- Surveillez de près la récupération (mouvement vif et ininterrompu, accès fréquent à l’eau) dans un espace calme et bien chauffé (24-25 °C), sans litière de petites particules, qui peut obstruer les voies respiratoires. Ne remettez l’animal en compagnie de ses compagnons de cage (et non à de nouveaux animaux) qu’après avoir confirmé qu’il est complètement rétabli.
- Surveiller l’animal à l’installation d’entretien pendant au moins 48 h après la chirurgie. Traiter les signes de douleur (masquage de la tête, posture anormale de la tête ou du corps, hypersensibilité et hyperexcitabilité à la manipulation) en administrant un analgésie (par ex. 0,3 mg/mL de buprénorphine, par voie sous-cutanée). Référez les animaux dont la fourrure est décolorée ou érigée au vétérinaire responsable.
3. Biopsie liquide du liquide céphalorachidien (LCR)
REMARQUE : L’ensemble du processus peut être effectué en 10 minutes. La biopsie liquide décrite ici est réalisée 3 jours après l’injection du cocktail libératoire mais peut être réalisée exactement de la même manière chaque fois que nécessaire. Prenez soin d’effectuer la chirurgie dans des conditions aseptiques. Nettoyez toutes les surfaces avec un antiseptique (par exemple, du peroxyde d’hydrogène à 3 % ou 6 %). Utilisez des outils, des gants, des blouses et des champs autoclavés ou facilement stériles.
- Anesthésier l’animal par inhalation d’isoflurane (2,5 % pour l’induction et 2 % pour l’entretien). Confirmez la profondeur de l’anesthésie en vérifiant la cornée
le réflexe, la réaction aux stimuli (test de pincement des membres postérieurs et de la queue) et le mode de respiration.
REMARQUE : Les interventions chirurgicales peuvent être réalisées sous anesthésie générale induite par une anesthésie injectable par voie intrapéritonéale (p. ex., kétamine [40 mg/kg] et xylazine [10 mg/kg]). Cependant, cela n’est pas conseillé car la procédure est courte, surtout si les biopsies doivent être effectuées plusieurs fois sur des jours consécutifs. - Administrer un analgésique par voie sous-cutanée (p. ex. 0,3 mg/mL de buprénorphine) lors de l’induction de l’anesthésie.
- Montez l’animal expérimental sur le cadre stéréotaxique. Utilisez des barres auriculaires pour fixer la tête sans entraver le mouvement de rotation vers l’avant et l’arrière.
- Stabilisez la tête à un angle de 40° vers le bas afin d’obtenir une bonne extension de la nuque.
REMARQUE : Une façon de le faire est d’utiliser la barre buccale de l’appareil6. - Rasez la fourrure dans la région du cou à l’aide d’un rasoir et nettoyez la peau avec un antiseptique, tel qu’une solution de povidone iodée à 10%, puis de l’alcool. Appliquez l’antiseptique trois fois à l’aide de cotons-tiges stériles. Frottez en effectuant des mouvements circulaires pendant 3 à 5 s à chaque fois.
- Du bout du doigt, trouvez la zone dépressible en forme de losange positionnée entre la protubérance occipitale et la colonne vertébrale de l’atlas6.
- Dessinez un repère ponctuel (par exemple, à l’aide d’un marqueur).
- Fixez une seringue de 1 mL ou 0,5 mL sur le cadre stéréotaxique.
REMARQUE : Il est conseillé d’utiliser des seringues avec des aiguilles non détachables car elles produisent une meilleure aspiration et ont moins de volume mort. - Amenez l’aiguille au point de contact avec la peau au niveau de la pointe.
- À l’aide d’une pince, soulevez la peau tout en abaissant la seringue à travers les couches de peau.
- Récupérez légèrement le piston pour générer une pression négative dans la seringue.
- Recommencez à tremper l’aiguille très lentement jusqu’à ce que du liquide (LCR) apparaisse dans la seringue.
- Installez l’aiguille à cette position et laissez l’écoulement lent du LCR.
REMARQUE : L’aiguille peut être abaissée ou légèrement surélevée si le débit du LCR est très lent. - Commencez à retirer le LCR lentement (par pas de 40 μL/min) jusqu’à 120 μL.
- Récupérez lentement la seringue.
- Administrer par voie intrapéritonéale 1 mL de sérum normal pour aider l’animal de laboratoire à se réapprovisionner en liquides.
- Mélanger la biopsie liquide (LCR) avec 400 μL de milieu NSC et maintenir le tube de microcentrifugation à 4 °C jusqu’à la réutilisation.
REMARQUE : Les biopsies liquides doivent être traitées dans les 3 heures si elles ne sont pas congelées. - Retirez le masque qui fournit l’anesthésique et transférez l’animal dans la zone de surveillance postopératoire.
REMARQUE : La récupération de l’anesthésie et le maintien de la position couchée doivent se produire dans les 5 à 10 minutes, et la récupération complète (comportement normal) dans les 25 minutes.- Surveillez de près la récupération (mouvement vif et ininterrompu, accès fréquent à l’eau) dans un espace calme et bien chauffé (24-25 °C), sans litière de petites particules, qui peut obstruer les voies respiratoires. Ne remettez l’animal en compagnie de ses compagnons de cage (et non à de nouveaux animaux) qu’après confirmation de son rétablissement complet.
- Surveiller l’animal à l’installation d’entretien pendant au moins 48 h après la chirurgie. Si des signes de douleur (masquage de la tête, posture anormale de la tête ou du corps, hypersensibilité et hyperexcitabilité à la manipulation) sont observés, administrer un analgésique (par ex. 0,3 mg/mL de buprénorphine par voie sous-cutanée). Référez les animaux dont la fourrure est décolorée ou érigée au vétérinaire responsable.
4. Traitement des tissus pour l’immunofluorescence
- Euthanasier l’animal par perfusion intracardique de 20 mL de solution saline glacée, suivie de 50 mL de paraformaldéhyde glacé à 4 % (PFA ; dans une solution saline tamponnée au phosphate [PBS] de pH = 7,4).
- Disséquer le tissu cérébral.
- Séparez la tête du corps à l’aide de ciseaux pour faire une incision dans la région cervicale. Utilisez les ciseaux pour enlever la peau, puis coupez l’os du crâne le long de la ligne médiane sagittale, avec les pointes des ciseaux pointant vers le haut afin de ne pas endommager le tissu cérébral. Essayez de continuer à couper autant que possible, en passant par la ligne médiane coronale.
- Utilisez des pinces pour enlever les os, en commençant par les os supraoccipitaux et pariétaux et enfin les os frontaux.
- Une fois que le tissu cérébral est révélé, utilisez la pince ou une spatule pour le soulever hors du crâne. Pour faciliter cela, coupez les nerfs à la base du cerveau et les bulbes olfactifs, si vous ne le souhaitez pas.
- Post-fixez le tissu pendant la nuit dans du PFA à 2 % à 4 °C.
- Cryo-protéger le tissu dans du saccharose à 30 % (dans du PBS) pendant au moins 48 h à 4 °C jusqu’à ce que le tissu coule au fond.
- Congeler le tissu à -80 °C.
- Coupez le tissu cérébral en sections coronales de 14 μm d’épaisseur à l’aide d’un cryostat.
- Effectuer une coloration par immunofluorescence à l’aide de protocoles standard 3,7
- Incuber les coupes avec un tampon bloquant (3 % d’albumine sérique bovine [BSA], 0,1 % de Triton X-100, dans du PBS) pendant 2 h à température ambiante.
- Effectuer la récupération de l’antigène (ébullition pendant 15 min dans un tampon de citrate de 10 mM, pH = 6,0, à l’aide de bocaux en verre).
REMARQUE : Cette étape est facultative, mais nécessaire pour les antigènes nucléaires. - Porter à température ambiante et incuber avec des anticorps primaires dirigés contre la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP), la doublecortine (Dcx), le S100β et la β-caténine (voir le tableau des matériaux) dans un tampon bloquant pendant une nuit à 4 °C.
- Incuber pendant 2 h avec des anticorps secondaires dans du PBS avec du 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pour la contre-coloration nucléaire à température ambiante (voir le tableau des matériaux).
- Montez les lamelles.
5. Traitement des cellules isolées pour l’immunofluorescence
- Plaquer les cellules dans des plaques de 96 puits compatibles pour la microscopie, enrobées de poly-D-lysine (100 μg/mL).
- Fixez les cellules dans du PFA glacé à 2 % pendant 10 min et lavez-les 3 fois avec du PBS.
- Effectuer l’immunofluorescence à l’aide des procédures standard3,7 pour PDGFRα, GFAP, Dcx, SOX2 et ID3 (voir le tableau des matériaux).
- Conservez les cellules dans PBS + NaN3 (0,1 %) à 4 °C dans l’obscurité.
6. Microscopie et analyse d’images
- Prenez des images à l’aide de l’épifluorescence ou de la microscopie confocale et effectuez des numérations cellulaires à l’aide d’outils logiciels d’analyse d’images standard, tels que des compteurs de cellules.
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Representative Results
Libération et collecte des NSC
Les CSN de la ZES ne sont séparées du LCR que par la monocouche de cellules épendymaires, bien qu’elles restent en contact direct avec le contenu ventriculaire par l’intermédiaire d’apophyses monociliées intercalées 8,9. La neuraminidase agit spécifiquement sur les cellules épendymaires via le clivage des résidus d’acide sialique et peut induire une dénudation de la paroi ventriculaire. Cela conduit à un regroupement des neuroblastes à la surface du ventricule10,11. De plus, un flux de neuroblastes a été observé dans le LCR après l’injection i.c.v. d’un anticorps bloquant l’intégrine-β1, probablement dû au relâchement des jonctions cellulaires inter-épendymaires12. Ces observations ont conduit à la mise au point d’un protocole qui permet d’isoler les cellules souches et progénitrices du cerveau par compromis contrôlé de l’intégrité des parois du ventricule latéral. Dans un premier temps, la libération du parenchyme et l’écoulement ultérieur de NSC ou d’OPC à l’intérieur du LCR sont induits par injection intraveineuse du cocktail de libération. Le cocktail est injecté par stéréotaxie à raison de 1 μL/min, bilatéralement (2 μL par injection) dans les ventricules latéraux (coordonnées ciblant les CSN des ZES : AP = 0,3 mm, L = ± 1,2 mm, D = 3,5 mm ; coordonnées ciblant les OPC CC : AP = 1,5 mm, L = ± 2 mm, D = 3,5 mm). La deuxième étape (« prélèvement ») consiste à réaliser des biopsies liquides du LCR à partir de la citerne magna. Les rats doivent être anesthésiés et la biopsie peut être effectuée avec des seringues de 1 ml. L’utilisation de l’appareil stéréotaxique permet de prélever presque 100 μL de LCR, sans avoir besoin d’incisions. La biopsie liquide est ajoutée au milieu de culture glacé et est maintenue à 4 °C jusqu’à ce que le placage dure pendant <3 h (le milieu de culture NSC contient le milieu Eagle modifié de Dulbecco [DMEM], le supplément B27 [2 %], le supplément N2 [1 %], le FGF2 [20 ng/mL] et le facteur de croissance épidermique [EGF ; 20 ng/mL]).
Bilan histologique de la zone périventriculaire après l’injection du cocktail libératoire
Une première cohorte d’expériences a révélé que lors de l’injection de plus de 3 μL de liquide, les ventricules pouvaient être endommagés en raison d’une lésion mécanique non spécifique (Figure 2B,C). L’injection lente de 2 μL de cocktail de libération a conduit à l’émergence d’amas de neuroblastes immunopositifs Dcx à la surface ventriculaire. Ces grappes sont restées visibles même 8 mois après l’injection (Figure 2D). La méthode étant destinée à des études longitudinales, visant un suivi à long terme des animaux, les lésions tissulaires causées par le cocktail de libération ont été évaluées. L’immunomarquage a été effectué sur des coupes cérébrales de cryostat de 14 μm d’épaisseur pour les marqueurs cellulaires épendymaires, tels que S100β et β-caténine13, et l’intégrité globale de la couche épendymaire a été évaluée. Les sites de dénudation de la couche épendymaire n’étaient présents qu’à proximité du niveau rostrocaudal des injections, avec une diminution progressive des perturbations de la couche épendymaire détectée dans les zones plus postérieures et plus antérieures de la ZES (Figure 2E, F) et devenant absentes après une distance de ±2 mm du site d’injection. Les résultats mentionnés ci-dessus montrent que la dénudation partielle de la couche épendymaire provoquée par l’injection i.c.v. du cocktail de libération est focale, restreinte à proximité du site d’injection, et laisse intact le reste de la couche épendymaire périventriculaire.
Profil marqueur et comportement in vitro des cellules collectées
Par la suite, le comportement in vitro et le profil marqueur des cellules isolées via le protocole de traite ont été évalués. Le rendement cellulaire moyen de chaque biopsie liquide est d’environ 300 ± 45 cellules (par biopsie de 100 μL)7. Les biopsies de traite ont donné lieu à des cultures de NSC avec un potentiel de passage moyen de 3,17 ± 0,45. Les cellules isolées de rats ayant reçu une solution saline ont pu être traitées en moyenne 1,92 ± 0,76 fois ; en revanche, ceux isolés par traite ont même atteint neuf passages (p = 0,038, test t) (Figure 3A)7. La capacité moyenne de passage des cultures de neurosphères post-mortem standard dérivées de ZES est supérieure à 12 passages entre nos mains. Parce que le potentiel d’expansion in vivo des CSN des ZES, tel que révélé par les expériences de cartographie du destin cellulaire in vivo 14, s’est avéré limité, la traite produit des cellules ayant un comportement in vitro significativement différent de celui des cellules en culture standard, bien que beaucoup plus proche du comportement des CSN endogènes. Les cellules collectées ont été plaquées sur des puits recouverts de poly-D-lysine, où ils se sont développés à la fois sous forme de monocouches adhérentes et plus rarement sous forme de neurosphères (Figure 3B). Les cellules fraîchement isolées (prélevées 3 jours après l’injection et fixées 24 h après la mise en place) qui étaient immunopositives pour le marqueur astroglial GFAP étaient également immunopositives pour ID3, un marqueur de quiescence, et avaient les caractéristiques de la morphologie bipolaire NSC (Figure 3C). De plus, comme indiqué précédemment7, une comparaison immunocytochimique plus détaillée des cellules dérivées de la biopsie et des cellules dérivées post-mortem des mêmes animaux, 3 jours après l’injection (à la recherche d’astrocytes GFAP+, de neuroblastes Dcx+, de progéniteurs d’oligodendrocytes PDGFRa+ et de cellules SOX2+ de la lignée neurale) a montré que le profil des cellules collectées était similaire à celui des cellules SEZ endogènes (Figure 3D). Notamment, lorsque des cellules issues de la biopsie et des tissus ont été comparées dans différentes conditions (par exemple, injection d’un cocktail de libération avec et sans FGF2), il a été constaté que le facteur de croissance entraînait une augmentation concomitante et significative de la présence de cellules SOX2+, ainsi qu’une diminution significative de la présence de neuroblastes Dcx+ dans les deux échantillons (Figure 3D). Ces données ont confirmé que tout changement apparaissant dans le profil des populations endogènes de CSN se reflète dans les échantillons de cellules générées par la traite.
Figure 1 : Résumé graphique de la traite. Une section coronale d’un hémisphère cérébral avec les principaux points de repère anatomiques (le ventricule latéral, le corps calleux sus-jacent et la commissure antérieure en dessous [voies de la substance blanche en gris], et la zone sous-épendymaire aux parois latérales [en bleu]). Le cocktail de libération est injecté dans le ventricule latéral, ce qui compromet l’intégrité du tissu et la libération de cellules souches neurales cérébrales postnatales dans le liquide céphalo-rachidien, à partir duquel elles peuvent être prélevées via des biopsies liquides. Abréviations : ZES = zone sous-épendymaire ; VG = ventricule latéral ; LCR = liquide céphalo-rachidien ; pbNSCs = cellules souches neurales cérébrales postnatales ; β1-int = intégrine bêta1. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Évaluation histologique des effets des injections intraveineuses. (A-D) Images à faible grossissement de la moitié dorsale du ventricule latéral après immunomarquage pour Dcx (en rouge, pour marquer les neuroblastes). (A) La simple insertion d’une seringue Hamilton ne perturbe pas la cyto-architecture de la ZES, tandis que l’injection de 10 mL (débit de perfusion de 1 mL/min) entraîne de graves lésions de la paroi ventriculaire quel que soit son contenu. (B) solution saline et (C) cocktail libératoire. (D) L’injection de 2 μL du cocktail de libération entraîne une atteinte contrôlée de la paroi ventriculaire, observée même à 8 mois après l’intervention. Les détails à fort grossissement de la paroi de la ZES à 7 et 14 jours après l’injection sont indiqués en (E) et (F), respectivement. Il y a une structure désorganisée, avec les neuroblastes Dcx+ (en vert) reposant à la surface de la paroi et les autres cellules de la niche (Sox2+, en blanc) reposant plus profondément. Le tissu périventriculaire est endommagé au niveau rostrocaudal de l’injection au moment de 2 mois (en G), tandis que le tissu est intact au niveau plus caudal (en H) chez le même animal. La paroi ventriculaire est évaluée par immunomarquage pour les marqueurs épendymaires S100β et β-caténine. Le détail de l’architecture typique du mur est montré en (I). La coloration nucléaire est réalisée à l’aide de DAPI (en bleu). Barres d’échelle = 300 μm (A-C, V, H, encarts), 150 μm (D), 30 μm (E, F) et 50 μm (I). Cette figure est modifiée à partir de McClenahan et al.13. Abréviations : ZES = zone sous-épendymaire ; I.C.V = intra-ventriculaire ; Dcx = doublecortine ; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Évaluation des cellules isolées par traite. (A) Graphique montrant le nombre maximal de passages obtenus par échantillon de biopsie liquide chez des animaux ayant reçu une injection de solution saline (barres grises, total de 12 échantillons), ou après la traite (barres noires, total de 29 échantillons, cocktail de libération avec neuraminidase et anticorps bloquant l’intégrine-β1). (B) Image de microscopie confocale représentative de cellules primaires obtenues par traite, 3 jours après l’injection, immunocolorées contre GFAP et ID3. (C,D) Images en fond clair de cellules isolées 3 jours après l’injection, plaquées sur des puits recouverts de poly-D-lysine et laissées se développer dans un milieu de prolifération NSC pendant 7 jours. (E) Graphique montrant le profil de type cellulaire des cellules isolées par traite de la ZES et de la population endogène de CSN ZES provenant des mêmes animaux de laboratoire. Les fractions SOX2+ et Dcx+ ont été significativement augmentées et diminuées, respectivement, après la co-injection de FGF2. (Analyse ANOVA à un facteur par marqueur, suivie d’une analyse post-hoc ; n = 4 à 6 animaux par groupe expérimental.) Barres d’échelle = 100 μm (C,D) et 10 μm (B). Cette figure est modifiée à partir de McClenahan et al.13. Abréviations : ZES = zone sous-épendymaire ; DPI = jours après l’injection ; NSC = cellules souches neurales ; Dcx = doublecortine ; GFAP = protéine acide fibrillaire gliale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Les cellules souches et progénitrices sont relativement rares dans les tissus cérébraux des mammifères. De plus, les CSN sont situés dans des zones inaccessibles pour des biopsies faciles et sûres (parois ventriculaires, hippocampe). Par conséquent, la seule façon de travailler expérimentalement avec de telles cellules, jusqu’à présent, a été leur isolement post-mortem. Une méthode permettant la collecte unique ou répétée de NSC et d’OPC sur des rats vivants, appelée traite, est décrite ici étape par étape. La méthode repose sur deux caractéristiques clés : i) les NSC ou OPC sont séparés par la monocouche de cellules épendymaires du LCR, circulant dans le système ventriculaire du cerveau ; ii) les cellules épendymaires et les progéniteurs neuraux maintiennent le contact entre elles et avec d’autres types de cellules voisines par l’intermédiaire d’intégrines. Par conséquent, le cocktail de libération injecté dans des zones spécifiques des ventricules pour permettre le désengagement des NSC, ou OPC, du parenchyme cérébral contient de la neuraminidase, une toxine qui cible et tue spécifiquement les cellules épendymaires10,11, et un anticorps bloquant l’intégrine-β1. Il contient également du FGF2, car ce facteur de croissance est essentiel à la survie et au maintien des CSN dans la niche et dans la culture15,16. Il a déjà été démontré7 que ce protocole est bien toléré par les animaux ; Dans ce rapport, il est en outre confirmé que les dommages aux cellules épendymaires, induits par le cocktail de libération comme condition préalable à la libération de NSC/OPC dans le LCR, sont limités autour du niveau rostrocaudal de l’injection. Cela a été d’une importance capitale, car le protocole devrait préserver la fonction homéostatique du cerveau, y compris la niche des cellules souches elle-même, et ne devrait pas compromettre le bien-être à long terme des animaux. L’injection stéréotaxique du cocktail de libération est d’une gravité légère et n’a jamais entraîné la mort. De plus, la réalisation de biopsies liquides à partir de la citerne magna est une procédure rapide et peu invasive qui peut être répétée plusieurs fois consécutives.
Il est important de noter que les échantillons de NSC isolés par traite reflètent étroitement le pool endogène de NSC. Le profil des progéniteurs de la ZES peut être influencé par l’injection i.c.v. de FGF2. Lorsque cela se produit, le profil des cellules dérivées de la traite est affecté de la même manière. De plus, des travaux expérimentaux antérieurs ont indiqué que les CSN isolées par traite de la ZES ont un potentiel d’auto-renouvellement limité, un comportement similaire à celui des CSN endogènes tel que révélé par les stratégies in vivo, transgéniques, de destin cellulaire14,17. Les CSN cérébrales postnatales sont maintenues en quiescence, transitant rarement vers l’activation mitotique pour générer une descendance neurogène et gliogène18,19,20. Ici, il est prouvé que la fraction des cellules dérivées de la traite qui expriment la GFAP et qui sont censées inclure des NSC de bonne foi co-expriment ID3, un marqueur des NSC quiescents21. La présence enrichie de CSN quiescentes, qui sont ensuite plaquées dans le milieu de CSN généralement utilisé pour la culture de CSN isolées post-mortem, semble limiter le potentiel d’expansion des CSN collectées (par exemple, un processus crucial si les cellules devaient être utilisées pour des transplantations autologues). En effet, ces milieux sont conçus spécifiquement pour la survie et l’expansion mitotique des NSC activés ; ainsi, la génération de protocoles permettant l’activation mitotique efficace et rapide des CSN quiescentes augmentera la valeur et le champ d’utilisation de la traite.
Dans l’ensemble, ces données indiquent que la traite permet d’échantillonner les NSC et les OPC du cerveau postnatal (en fonction du niveau rostrocaudal d’injection du cocktail de libération) à partir de rats vivants. Ces travaux indiquent la faisabilité de réaliser des biopsies liquides successives chez un même animal, même à des durées significatives après l’injection du cocktail de libération (ainsi, pour planifier et réaliser des études expérimentales longitudinales), puisque les neuroblastes restent regroupés sur les parois ventriculaires même 8 mois après l’injection. De telles méthodes sont d’une importance cruciale car elles permettent d’étudier les événements chez les animaux individuels entraînant une réduction du bruit biologique généré par les variations physiologiques. Ceci, à son tour, conduit à une précision accrue et à la mise en œuvre des principes des « 3R » (remplacement, réduction et raffinement). Les prochaines étapes clés de l’amélioration de la méthode consisteront à déterminer le nombre maximal et le délai pendant lequel des biopsies liquides peuvent être effectuées après une procédure de libération, bien que l’exécution de procédures de libération supplémentaires devrait être réalisable, si nécessaire.
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Disclosures
Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents ou d’autres conflits d’intérêts à déclarer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par une subvention d’Action Medical Research (UK) (GN2291) à R.J.M.F. et I.K. Les travaux de recherche ont également été partiellement financés (coûts des animaux et soutien à D.D.) par la Fondation hellénique pour la recherche et l’innovation (H.F.R.I.) dans le cadre du « Premier appel à projets de recherche H.F.R.I. pour soutenir les membres du corps professoral et les chercheurs et l’obtention d’une subvention d’équipement de recherche à coût élevé » (numéro de projet : 3395).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Release cocktail | |||
| β1-integrin-blocking antibody | BD Biosciences | #555002 | purified NA/LE Hamster Anti-Rat CD29 Clone Ha2/5, 1 mg/mL. Any abntibody with blocking activity should be appropriate. |
| Neuraminidase from Clostridium perfringens (Clostridium welchii) | Sigma-Aldrich | #N2876 | Neuraminidases fromother sources (e.g., from Vibrio cholerae) have not been tested. |
| Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | #100-18B | kept as a 1 μg/μL stock, diluted in sterile water at -20 °C |
| Surgical procedures | |||
| 10 µL Syringe | Hamilton | #80330 | Model 701 RN, Small Removable Needle, 26s gauge, 2 in., point style 2 |
| BD Micro-fine 1 mL insulin syringes | BD biosciences | 04085-00 | 29 G x 12.7 mm |
| BETADINE CUT.SOL 10% FLx30ML | LAVIPHARM-CASTALIA | SKU: 5201048131168 | |
| Bupaq | RICHTERPHARMA | 1021854AF | 10 mL (buprenophine 0.3 mg/mL) |
| Digital New Standard Stereotaxic, Rat and Mouse | Stoelting | 51500D | |
| Homeothermic Monitoring System | Harvard Apparatus | 55-7020 | |
| ISOFLURIN 1,000 mg/g inhalation vapour, liquid | Vetpharma Animal Health | 32509/4031 | |
| Ketamidor | RICHTER PHARMA | SKU: 9004114002531 | Ketamine 100 mg/mL |
| Nylon suture, Ethilon | Ethicon | D9635 | Clear , size 5-0 |
| Rechargeable Cordless Surgical Trimmers | Stoelting | Item:51472 | |
| Scalpel blades, sterile | Swann Morton | AW050 | |
| Scopettes Jr. 8-inch Swabs | Birchwood Laboratories | 34-7021-12P | |
| Stereotaxic High Speed Drill | Foredom | 1474w/o1464 | |
| Stoelting’s Stereotaxic Instrument Kit | Stoelting | Item: 52189 | |
| Xylan 2% | Chanelle Pharmaceuticals | 13764/03/19-5-2004 | Xylazine, 25 mL |
| Tissue and cells handling and immunostainings | |||
| 96-well plates appropriate for microscopy | Greiner | #655866 | Screen star microplate |
| B27 supplement | ThermoFisher Scientific | A1486701 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Merck | P06-1391100 | Fraction V, heat shock |
| Citrate | Merck | 71497 | Sodium citrate monobasic |
| Cryostat | Leica | CM1510S | |
| DAPI | Merck, Calbiochem | 28718-90-3 | Nuclear staining, Dilution: 1/1,000 |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11995065 | High glucose, pyruvate |
| donkey anti-goat | Biotium | 20016 or 20106 or 20048 | Dilution: 1/1,000 |
| donkey anti-mouse | Biotium | 20014 or 20105 or 20046 | Dilution: 1/1,000 |
| donkey anti-rabbit | Biotium | 20015 or 20098 or 20047 | Dilution: 1/1,000 |
| EGF | Peprotech | 315-09 | |
| FGF-2 (or bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
| goat anti-GFAP | Abcam | ab53554 | Dilution: 1/500 |
| goat anti-SOX2 | Santa Cruz Biotecnology | sc-17320 | Dilution: 1/200 |
| mouse anti-ID3 | Santa Cruz Biotecnology | sc-56712 | Dilution: 1/200 |
| mouse anti-S100β | Sigma | S2532 | Dilution: 1/200 |
| Mowiol | Merck, Calbiochem | 475904 | Mounting medium |
| N2 supplement | ThermoFisher Scientific | 17502048 | |
| Parafolmadehyde | Merck | 158127 | |
| Poly-D-Lysine | Merck, Millipore | A-003-E | Solution, 1.0 mg/mL |
| rabbit anti-Doublecortin (DCX) | Abcam | ab18723 | Dilution: 1/500 |
| rabbit anti-PDGFRα | Abcam | ab51875 | Dilution: 1/200 |
| rabbit anti-β- catenin | Abcam | ab16051 | Dilution: 1/500 |
| Triton X-100 | Merck | X100 | |
| Microscopy and image analysis | |||
| Confocal microscope | Leica | SP6 and SP8 | |
| Image analysis | NIH, USA | ImageJ | |
| Image analysis | Leica | LasX |
References
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