Summary
जीवित चूहों के दिमाग से तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं और ऑलिगोडेंड्रोसाइट पूर्वज कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक विधि प्रयोगात्मक विस्तार में यहां प्रस्तुत की गई है। यह उनकी भलाई से समझौता किए बिना एक ही जानवर से इन कोशिकाओं के कई संग्रह की अनुमति देता है।
Abstract
ऊतक-विशिष्ट तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी) स्तनधारी प्रसवोत्तर मस्तिष्क में सक्रिय रहते हैं। वे विशेष niches में रहते हैं, जहां वे नए न्यूरॉन्स और ग्लिया उत्पन्न करते हैं। ऐसा ही एक आला सबपेंडिमल ज़ोन (एसईजेड; जिसे वेंट्रिकुलर-सबवेंट्रिकुलर ज़ोन भी कहा जाता है) है, जो पार्श्व वेंट्रिकल्स की पार्श्व दीवारों के पार स्थित है, जो एपेंडिमल सेल परत से सटे हैं। ओलिगोडेंड्रोसाइट पूर्वज कोशिकाओं (ओपीसी) को पूरे केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में बहुतायत से वितरित किया जाता है, जो प्रोलिफेरेटिव पूर्वज कोशिकाओं के एक पूल का गठन करता है जो ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स उत्पन्न कर सकते हैं।
एनएससी और ओपीसी दोनों स्व-नवीकरण क्षमता और मौन / सक्रियण चक्र प्रदर्शित करते हैं। उनके स्थान के कारण, इन कोशिकाओं का अलगाव और प्रयोगात्मक जांच पोस्टमॉर्टम की जाती है। यहां, हम विस्तार से "मस्तिष्क दुहने" का वर्णन करते हैं, जीवित जानवरों से अन्य कोशिकाओं के बीच एनएससी और ओपीसी के अलगाव के लिए एक विधि। यह एक दो-चरणीय प्रोटोकॉल है जिसे कृन्तकों में उपयोग के लिए डिज़ाइन किया गया है और चूहों में परीक्षण किया गया है। सबसे पहले, कोशिकाओं को "रिलीज कॉकटेल" के स्टीरियोटैक्सिक इंट्रासेरेब्रोवेंट्रिकुलर (आईसीवी) इंजेक्शन के माध्यम से ऊतक से "रिलीज" किया जाता है। मुख्य घटक न्यूरोमिनिडेस हैं, जो एपेंडिमल कोशिकाओं को लक्षित करते हैं और वेंट्रिकुलर दीवार अनाच्छादन, एक इंटीग्रिन-β1-अवरुद्ध एंटीबॉडी और फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर -2 को प्रेरित करते हैं। एक दूसरे "संग्रह" चरण में, मस्तिष्कमेरु द्रव की तरल बायोप्सी सिस्टर्न मैग्ना से की जाती है, एक चीरा की आवश्यकता के बिना संवेदनाहारी चूहों में।
यहां प्रस्तुत परिणाम बताते हैं कि पृथक कोशिकाएं अपनी अंतर्जात प्रोफ़ाइल को बनाए रखती हैं और एसईजेड के एनएससी उनकी मौन को संरक्षित करते हैं। एपेंडिमल परत का अनाच्छादन इंजेक्शन के शारीरिक स्तर तक ही सीमित है और प्रोटोकॉल (रिलीज और संग्रह) जानवरों द्वारा अच्छी तरह से सहन किया जाता है। यह उपन्यास दृष्टिकोण प्रयोगात्मक जानवरों में अंतर्जात न्यूरोजेनेसिस और ग्लियोजेनेसिस के अनुदैर्ध्य अध्ययन करने का मार्ग प्रशस्त करता है।
Introduction
ऊतक-विशिष्ट स्टेम कोशिकाएं आंशिक रूप से प्रतिबद्ध कोशिकाएं हैं जो संबंधित ऊतकों का गठन करने वाली सभी सेल आबादी को जन्म दे सकती हैं। बहुक्रियाशील होने के अलावा, वे स्व-नवीनीकरण कोशिकाएं हैं और होमियोस्टैसिसऔर ऊतकों की पुनर्योजी क्षमता को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण हैं। कुछ ऊतक-विशिष्ट स्टेम कोशिकाएं एक सक्रिय, दृढ़ता से प्रोलिफेरेटिव अवस्था में रहती हैं, जैसे आंतों या हेमटोपोइएटिक स्टेम सेल। अन्य, जैसे मस्तिष्क स्टेम कोशिकाएं, काफी हद तक मौन या निष्क्रिय रहती हैं2. वयस्क मस्तिष्क में, तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी) विशेष क्षेत्रों में पाए जा सकते हैं, जिन्हें अक्सर निचे कहा जाता है। दो ऐसी अच्छी तरह से वर्णित क्षेत्र पार्श्व निलय के सबपेंडिमल ज़ोन (एसईजेड) और हिप्पोकैम्पस के डेंटेट गाइरस में मौजूद हैं। एसईजेड आला सबसे अधिक संख्या में कोशिकाओं को उत्पन्न करता है, मुख्य रूप से न्यूरोब्लास्ट जो घ्राण बल्बों की ओर पलायन करते हैं और स्थानीय इंटरन्यूरॉन आबादी में योगदान करते हैं; इसके विपरीत, उत्पन्न ऑलिगोडेंड्रोब्लास्ट्स आसन्न कॉर्पस कॉलोसम (सीसी)3में माइग्रेट करते हैं। ओलिगोडेंड्रोसाइट पूर्वज कोशिकाएं (ओपीसी) माइटोटिक रूप से सक्रिय कोशिकाएं हैं, जो पूरे केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में व्यापक रूप से वितरित की जाती हैं, कि: i) ऑलिगोडेंड्रोग्लिअल वंश के लिए प्रतिबद्ध हैं, ii) डिमाइलिनेशन की साइटों पर माइग्रेट कर सकते हैं, और iii) माइलिनेटिंग ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स में अंतर कर सकते हैं। OPCs भी आत्म-नवीकरण क्षमता और मौन4 प्रदर्शित करते हैं।
अब तक, एनएससी और ओपीसी के अलगाव और अध्ययन के लिए विच्छेदित मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के ऊतकों के पोस्टमॉर्टम पृथक्करण की आवश्यकता होती है। इस प्रयोगात्मक सीमा को दरकिनार करने के लिए, हमने एक विधि स्थापित की, जो पहली बार, जीवित जानवरों से मस्तिष्क एनएससी और ओपीसी के अलगाव की अनुमति देती है। हम इस विधि को "दूध देना" कहते हैं, क्योंकि यह कोशिकाओं के कई संग्रह को सक्षम बनाता है क्योंकि उनके पूल समाप्त नहीं होते हैं। प्रोटोकॉल चूहों में विकसित किया गया था, उनके बड़े मस्तिष्क के आकार के कारण, मुख्य रूप से एसईजेड, या सीसी को लक्षित करना, और इसमें दो प्रमुख चरण शामिल हैं। सबसे पहले, एनएससी या ओपीसी को ऊतक से "हटा दिया जाता है" एक "रिलीज कॉकटेल" के आईसीवी इंजेक्शन के माध्यम से जिसमें न्यूरामिनिडेस होता है, एक विष जो वेंट्रिकुलर दीवार अनाच्छादन, एक इंटीग्रिन-β1-अवरुद्ध एंटीबॉडी और फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर 2 (एफजीएफ 2) को प्रेरित करता है। कॉकटेल को पार्श्व निलय के भीतर द्विपक्षीय रूप से इंजेक्ट किया जाता है। यदि इच्छित उपयोग एनएससी का अलगाव है, तो पार्श्व निलय के रोस्ट्रल क्षेत्रों को लक्षित किया जाता है। यदि उद्देश्य ओपीसी को अधिक शुद्ध रूप से अलग करना है, तो कॉकटेल को हिप्पोकैम्पस फिम्ब्रिया के क्षेत्र में पुच्छीय रूप से इंजेक्ट किया जाता है। एक दूसरे "संग्रह" चरण में, मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) की तरल बायोप्सी एक चीरा की आवश्यकता के बिना, संवेदनाहारी चूहों के सिस्टर्न मैग्ना से की जाती है। तरल बायोप्सी एनएससी संस्कृति माध्यम के साथ मिलाया जाता है और चढ़ाना तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है।
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Protocol
पशु प्रजनन, रखरखाव, और प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं ब्रिटेन पशु के अनुसार आयोजित किए गए (वैज्ञानिक प्रक्रियाओं) अधिनियम 1986, गृह कार्यालय द्वारा अधिकृत, और हेलेनिक गणराज्य के राष्ट्रपति डिक्री 56/2013 के साथ, कैम्ब्रिज और Patras के विश्वविद्यालयों के पशु कल्याण और नैतिक समीक्षा निकायों द्वारा जांच की, साथ ही अनुमोदित और स्थानीय प्रीफेक्चुरल पशु की देखभाल और उपयोग समिति (प्रोटोकॉल संख्या: 5675/39/18-01-2021)। नर और मादा स्प्रैग-डॉली, विस्टार, और लॉन्ग-इवांस चूहों, जिनकी उम्र 2 से 4 महीने के बीच और शरीर के वजन 150 ग्राम और 250 ग्राम के बीच थी, का उपयोग किया गया था। प्रोटोकॉल चित्रा 1 में रेखांकन संक्षेप है.
1. रिलीज कॉकटेल तैयारी
नोट: प्रक्रिया के दिन ताजा तैयार करें और बर्फ पर रखें। मात्रा प्रत्येक पार्श्व वेंट्रिकल में इंजेक्ट किया जा करने के लिए 2 μL प्रति दिया जाता है. इरादा इंजेक्शन प्रति एक अतिरिक्त 1 माइक्रोन तैयार करें।
- क्लोस्ट्रीडियम परफ्रिंजेंस (क्लोस्ट्रीडियम वेल्ची) से 500 एमयू न्यूरामिनिडेस के 0.5 माइक्रोन तैयार करें।
नोट: इसे -20 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ पानी में पतला 1 यू/जेडएल स्टॉक के रूप में स्टोर करें। अन्य प्रकार के न्यूरामिनिडेस का परीक्षण नहीं किया गया है। - 1 माइक्रोन तैयार करें जिसमें इंटीग्रिन-β1-अवरुद्ध एंटीबॉडी का 1 माइक्रोन होता है।
नोट: इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। - 0.5 माइक्रोन तैयार करें जिसमें 0.5 माइक्रोन बेसिक बेसिक फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर (पुनः संयोजक मानव एफजीएफ-बेसिक) होता है।
नोट: इसे -20 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ पानी में पतला 1 माइक्रोग्राम/जेडएल स्टॉक के रूप में स्टोर करें।
2. रिलीज कॉकटेल का इंजेक्शन
नोट: पूरी प्रक्रिया 20 मिनट के भीतर की जा सकती है। सड़न रोकनेवाला स्थितियों में सर्जरी करने के लिए ध्यान रखें। एंटीसेप्टिक (जैसे, 3% या 6% हाइड्रोजन पेरोक्साइड) के साथ सभी सतहों को साफ करें। आटोक्लेव या आसानी से बाँझ उपकरण, दस्ताने, गाउन और पर्दे का उपयोग करें।
- आइसोफ्लुरेन इनहेलेशन (प्रेरण के लिए 2.5% और रखरखाव के लिए 2%) द्वारा प्रयोगात्मक जानवर को एनेस्थेटाइज करें। कॉर्नियल रिफ्लेक्स की जांच करके संज्ञाहरण की गहराई की पुष्टि करें, उत्तेजनाओं की प्रतिक्रिया (हिंद अंग और पूंछ चुटकी परीक्षण), और सांस लेने का तरीका।
नोट: सर्जिकल प्रक्रियाओं को इंट्रापेरिटोनली इंजेक्टेबल एनेस्थीसिया (जैसे, केटामाइन [40 मिलीग्राम/किग्रा] और ज़ाइलाज़ीन [10 मिलीग्राम/किग्रा]) द्वारा प्रेरित सामान्य संज्ञाहरण के तहत किया जा सकता है। कॉर्नियल रिफ्लेक्स, उत्तेजनाओं की प्रतिक्रिया (हिंद अंग और पूंछ चुटकी परीक्षण), और सांस लेने के तरीके की जांच करके गहरी संज्ञाहरण की पुष्टि की गई थी। - संज्ञाहरण के प्रेरण पर चमड़े के नीचे एनाल्जेसिया (जैसे, 0.3 मिलीग्राम / एमएल ब्यूप्रेनोर्फिन) का प्रशासन करें।
- स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम पर चूहे माउंट.
- एक रेजर के साथ सिर के फर को शेव करें और एंटीसेप्टिक के साथ त्वचा को साफ करें, जैसे कि 10% पोविडोन-आयोडीन समाधान और फिर शराब। बाँझ कपास झाड़ू का उपयोग करके एंटीसेप्टिक को तीन बार लागू करें। हर बार 3-5 सेकंड के लिए एक परिपत्र गति में रगड़ें। सूखापन को रोकने के लिए आंख मरहम लागू करें।
- एक बाँझ स्केलपेल का उपयोग कर मध्य रेखा के साथ सिर की त्वचा में एक 2 सेमी चीरा बनाओ.
- बाँझ swabs और बाँझ खारा का उपयोग खोपड़ी साफ.
- स्टीरियोटैक्सिक डिवाइस पर घुड़सवार 10 माइक्रोन हैमिल्टन सिरिंज की सुई के किनारे का उपयोग करके ब्रेग्मा की पहचान करें। ब्रेग्मा को "बिंदु 0,0" के रूप में सेट करें।
नोट: ब्रेग्मा को धनु और कोरोनल टांके के बीच चौराहे के बिंदु के रूप में पहचाना जाता है। अधिक विवरण पैक्सिनोस और वाटसन5 के चूहे के मस्तिष्क एटलस में पाया जा सकता है। - डिवाइस को निर्देशांक एंटीरियोपोस्टीरियर (एपी) = 0.3 मिमी, पार्श्व (एल) = +1.2 मिमी (एसईजेड को लक्षित करने के लिए), या एपी = 1.5 मिमी, एल = +2.0 मिमी (सीसी को लक्षित करने के लिए) पर ले जाएं।
- डेंटल ड्रिल का उपयोग करके 1 मिमी बर्र होल ड्रिल करें।
नोट: हाथ से ड्रिलिंग करते समय, ध्यान रखें कि कॉर्टिकल सतह को घायल न करें। रक्तस्राव काफी होने की उम्मीद नहीं है। खारा के साथ किसी भी रक्त को साफ़ करें और अधिक लगातार रक्तस्राव को रोकने के लिए दबाव लागू करें। - 10 μL हैमिल्टन सिरिंज में रिलीज कॉकटेल के 4 माइक्रोन लोड करें।
- ड्यूरा के संपर्क में आने के लिए हैमिल्टन सिरिंज की सुई (अधिमानतः कुंद या शंक्वाकार किनारे) को कम करें।
- वांछित गहराई (डी = 3.5 मिमी) पर सुई डालें.
नोट: ऊतक हाइड्रेटेड रखने के लिए ड्यूरा की सतह पर खारा डालो। - रिलीज कॉकटेल के 2 माइक्रोन को 1 माइक्रोन / मिनट की दर से संक्रमित करें।
- रिलीज कॉकटेल की सरफेसिंग से बचने के लिए धीमी गति से पुनर्प्राप्ति से पहले एक और 2 मिनट के लिए सुई को छोड़ दें।
- निर्देशांक AP = 0.3 मिमी, L = -1.2 मिमी (SEZ को लक्षित करने के लिए), या AP = 1.5 मिमी, L = -2.0 मिमी (CC को लक्षित करने के लिए) पर अन्य गोलार्द्ध के लिए चरण 2.8-2.14 दोहराएँ।
- चीरा को 5-0 नायलॉन (व्यास 0.1 मिमी) के साथ सीवन करें और एंटीसेप्टिक के साथ टांके वाले क्षेत्र को साफ करें।
- संवेदनाहारी की आपूर्ति मुखौटा निकालें और पोस्ट आपरेशन निगरानी क्षेत्र के लिए पशु हस्तांतरण.
नोट: संज्ञाहरण और पुनरावृत्ति के रखरखाव से वसूली 5-10 मिनट के भीतर होनी चाहिए, और 25 मिनट के भीतर पूर्ण वसूली (सामान्य व्यवहार) होना चाहिए।- एक अच्छी तरह से गर्म (24-25 डिग्री सेल्सियस) में वसूली (ज्वलंत और निर्बाध आंदोलन, पानी तक लगातार पहुंच) की बारीकी से निगरानी करें, छोटे-कण बिस्तर के बिना शांत स्थान, जो वायुमार्ग को अवरुद्ध कर सकता है। पूरी तरह से ठीक होने की पुष्टि के बाद ही जानवर को उसके पिंजरे के साथियों (नए जानवरों को नहीं) की कंपनी में लौटाएं।
- सर्जरी के बाद कम से कम 48 घंटे के लिए रखरखाव की सुविधा पर पशु की निगरानी करें। दर्द के संकेतों को संबोधित करें (सिर को छिपाना, असामान्य सिर या शरीर की मुद्रा, अतिसंवेदनशीलता, और हैंडलिंग के लिए हाइपरेक्सिटेबिलिटी) एनाल्जेसिया (जैसे, 0.3 मिलीग्राम / एमएल ब्यूप्रेनोर्फिन, चमड़े के नीचे) का प्रशासन करके। जिम्मेदार पशु चिकित्सक को फीका पड़ा हुआ या खड़ा फर के साथ जानवरों को देखें।
3. मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) तरल बायोप्सी
नोट: पूरी प्रक्रिया 10 मिनट के भीतर की जा सकती है। यहां वर्णित तरल बायोप्सी रिलीज कॉकटेल के इंजेक्शन के 3 दिन बाद की जाती है, लेकिन जब भी आवश्यक हो, ठीक उसी तरह से किया जा सकता है। सड़न रोकनेवाला स्थितियों में सर्जरी करने के लिए ध्यान रखें। एंटीसेप्टिक (जैसे, 3% या 6% हाइड्रोजन पेरोक्साइड) के साथ सभी सतहों को साफ करें। आटोक्लेव या आसानी से बाँझ उपकरण, दस्ताने, गाउन और पर्दे का उपयोग करें।
- आइसोफ्लुरेन इनहेलेशन (प्रेरण के लिए 2.5% और रखरखाव के लिए 2%) द्वारा पशु को एनेस्थेटाइज करें। कॉर्नियल की जांच करके संज्ञाहरण की गहराई की पुष्टि करें
पलटा, उत्तेजनाओं की प्रतिक्रिया (हिंद अंग और पूंछ चुटकी परीक्षण), और सांस लेने का तरीका।
नोट: सर्जिकल प्रक्रियाओं को इंट्रापेरिटोनली इंजेक्शन एनेस्थीसिया (जैसे, केटामाइन [40 मिलीग्राम/किग्रा] और ज़ाइलाज़ीन [10 मिलीग्राम/किग्रा]) द्वारा प्रेरित सामान्य संज्ञाहरण के तहत किया जा सकता है। हालांकि, यह उचित नहीं है क्योंकि प्रक्रिया छोटी है, खासकर अगर बायोप्सी लगातार दिनों में कई बार की जाएगी। - संज्ञाहरण के प्रेरण पर चमड़े के नीचे एनाल्जेसिया (जैसे, 0.3 मिलीग्राम / एमएल ब्यूप्रेनोर्फिन) का प्रशासन करें।
- स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम पर प्रयोगात्मक जानवर माउंट। आगे और पीछे की ओर घूर्णी आंदोलन में बाधा डाले बिना सिर को ठीक करने के लिए कान की सलाखों का उपयोग करें।
- सिर को नीचे की ओर 40 डिग्री के कोण पर स्थिर करें ताकि गर्दन के पीछे का एक अच्छा विस्तार प्राप्त किया जा सके।
नोट: ऐसा करने का एक तरीका डिवाइस6 के माउथ बार का उपयोग करना है। - एक रेजर का उपयोग करके गर्दन क्षेत्र में फर को शेव करें और एंटीसेप्टिक के साथ त्वचा को साफ करें, जैसे कि 10% पोविडोन-आयोडीन समाधान और फिर शराब। बाँझ कपास झाड़ू का उपयोग करके एंटीसेप्टिक को तीन बार लागू करें। हर बार 3-5 सेकंड के लिए एक परिपत्र गति में रगड़ें।
- उंगलियों के साथ, ओसीसीपटल प्रोट्यूबरेंस और एटलस6 की रीढ़ के बीच स्थित रोम्ब के आकार का अवसादग्रस्तता क्षेत्र ढूंढें।
- एक बिंदु-चिह्न बनाएं (उदाहरण के लिए, मार्कर का उपयोग करके)।
- स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम पर 1 एमएल या 0.5 एमएल सिरिंज को ठीक करें।
नोट: गैर-वियोज्य सुइयों के साथ सीरिंज का उपयोग करने की सलाह दी जाती है क्योंकि वे बेहतर चूषण का उत्पादन करते हैं और कम मृत मात्रा रखते हैं। - बिंदु निशान पर त्वचा के साथ संपर्क के बिंदु पर सुई लाओ.
- संदंश की एक जोड़ी के साथ, त्वचा परतों के माध्यम से सिरिंज को कम करते हुए त्वचा को उठाएं।
- सवार थोड़ा सिरिंज में नकारात्मक दबाव उत्पन्न करने के लिए पुनः प्राप्त.
- सिरिंज में तरल (सीएसएफ) प्रकट होने तक सुई को बहुत धीरे-धीरे डुबोने के लिए पुनरारंभ करें।
- इस स्थिति में सुई व्यवस्थित करें और सीएसएफ के धीमे प्रवाह की अनुमति दें।
नोट: सुई को कम किया जा सकता है या थोड़ा ऊंचा किया जा सकता है अगर सीएसएफ प्रवाह बहुत धीमा है। - सीएसएफ को धीरे-धीरे (40 माइक्रोन/मिनट के चरणों में) 120 माइक्रोन तक निकालना शुरू करें।
- धीरे-धीरे सिरिंज पुनः प्राप्त.
- तरल पदार्थ के प्रयोगात्मक जानवर की पुनःपूर्ति का समर्थन करने के लिए सामान्य सीरम के 1 एमएल इंट्रापेरिटोनली प्रशासन।
- एनएससी माध्यम के 400 माइक्रोन के साथ तरल बायोप्सी (सीएसएफ) मिलाएं और आगे उपयोग तक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
नोट: तरल बायोप्सी को 3 घंटे के भीतर संसाधित किया जाना चाहिए यदि जमे हुए नहीं है। - संवेदनाहारी की आपूर्ति है कि मुखौटा निकालें और पोस्ट आपरेशन निगरानी क्षेत्र के लिए पशु स्थानांतरण.
नोट: संज्ञाहरण और पुनरावृत्ति के रखरखाव से वसूली 5-10 मिनट के भीतर होनी चाहिए, और 25 मिनट के भीतर पूर्ण वसूली (सामान्य व्यवहार) होना चाहिए।- एक अच्छी तरह से गर्म (24-25 डिग्री सेल्सियस) में वसूली (ज्वलंत और निर्बाध आंदोलन, पानी तक लगातार पहुंच) की बारीकी से निगरानी करें, छोटे-कण बिस्तर के बिना शांत स्थान, जो वायुमार्ग को अवरुद्ध कर सकता है। पूरी तरह से ठीक होने की पुष्टि होने के बाद ही जानवर को उसके पिंजरे के साथियों (नए जानवरों को नहीं) की कंपनी में लौटाएं।
- सर्जरी के बाद कम से कम 48 घंटे के लिए रखरखाव की सुविधा पर पशु की निगरानी करें। यदि दर्द के लक्षण (सिर का छिपाना, असामान्य सिर या शरीर की मुद्रा, अतिसंवेदनशीलता, और हैंडलिंग के लिए हाइपरेक्सिटेबिलिटी) देखे जाते हैं, तो एनाल्जेसिया (जैसे, 0.3 मिलीग्राम / एमएल ब्यूप्रेनोर्फिन चमड़े के नीचे) का प्रशासन करें। जिम्मेदार पशु चिकित्सक को फीका पड़ा हुआ या खड़ा फर के साथ जानवरों को देखें।
4. इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए ऊतक का प्रसंस्करण
- बर्फ-ठंडे खारा के 20 एमएल के इंट्राकार्डियल जलसेक द्वारा पशु को इच्छामृत्यु दें, इसके बाद 50 एमएल बर्फ-ठंडा 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए; पीएच = 7.4 के फॉस्फेट-बफर खारा [पीबीएस] में)।
- मस्तिष्क के ऊतकों को काटना।
- ग्रीवा क्षेत्र में कटौती करने के लिए कैंची का उपयोग करके सिर को शरीर से अलग करें। त्वचा को हटाने के लिए कैंची का प्रयोग करें और फिर बाण के समान midline के साथ खोपड़ी की हड्डी में कटौती, आदेश में ऊपर की ओर इशारा करते हुए कैंची की युक्तियों के साथ मस्तिष्क के ऊतकों को नुकसान नहीं पहुंचा. कोरोनल मिडलाइन को पार करते हुए, जितना संभव हो उतना काटना जारी रखने का लक्ष्य रखें।
- हड्डियों को हटाने के लिए संदंश का प्रयोग करें, supraoccipital और पार्श्विका हड्डियों और अंत में ललाट हड्डियों से शुरू.
- एक बार मस्तिष्क के ऊतकों का पता चला है, संदंश या एक रंग का उपयोग करने के लिए यह खोपड़ी से बाहर लिफ्ट. इसे सुविधाजनक बनाने के लिए, मस्तिष्क के आधार पर नसों और घ्राण बल्बों को काट लें, यदि नहीं चाहते हैं।
- पोस्ट-4 डिग्री सेल्सियस पर 2% पीएफए में रात भर ऊतक फिक्स.
- क्रायो-30% सुक्रोज (पीबीएस में) में ऊतक को 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 48 घंटे के लिए तब तक सुरक्षित रखें जब तक कि ऊतक नीचे तक न डूब जाए।
- -80 डिग्री सेल्सियस पर ऊतक फ्रीज.
- एक क्रायोस्टेट के साथ 14 माइक्रोन मोटी कोरोनल वर्गों में मस्तिष्क के ऊतकों को काटें।
- मानक प्रोटोकॉल 3,7 का उपयोग कर immunofluorescence धुंधला प्रदर्शन
- कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए अवरुद्ध बफर (3% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन [बीएसए], 0.1% ट्राइटन एक्स -100, पीबीएस में) के साथ वर्गों को इनक्यूबेट करें।
- प्रतिजन पुनर्प्राप्ति प्रदर्शन (ग्लास जार का उपयोग कर 10 मिमी साइट्रेट बफर, पीएच = 6.0 में 15 मिनट के लिए उबलते हुए)।
नोट: यह कदम वैकल्पिक है, लेकिन परमाणु एंटीजन के लिए आवश्यक है। - कमरे के तापमान पर लाओ और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर बफर अवरुद्ध करने में ग्लियाल फाइब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (जीएफएपी), डबलकोर्टिन (डीसीएक्स), एस 100β, और β-कैटेनिन ( सामग्री की तालिका) के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट करें।
- कमरे के तापमान पर परमाणु काउंटरस्टेनिंग के लिए 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलिंडोल (डीएपीआई) के साथ पीबीएस में माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
- कवरस्लिप माउंट करें।
5. इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए पृथक कोशिकाओं का प्रसंस्करण
- कोशिकाओं को माइक्रोस्कोपी के लिए संगत 96-अच्छी प्लेटों में प्लेट करें, पॉली-डी-लाइसिन (100 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ लेपित।
- 10 मिनट के लिए बर्फ ठंडा 2% पीएफए में कोशिकाओं को ठीक करें और पीबीएस के साथ 3x धो लें।
- PDGFRα, GFAP, Dcx, SOX2, और ID3 के लिए मानक प्रक्रियाओं 3,7 का उपयोग करके इम्यूनोफ्लोरेसेंस करें (सामग्री की तालिका देखें)।
- पीबीएस + एनएएन3 (0.1%) में कोशिकाओं को अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
6. माइक्रोस्कोपी और छवि विश्लेषण
- एपिफ्लोरेसेंस या कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके चित्र लें और सेल काउंटर जैसे मानक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर टूल का उपयोग करके सेल काउंट करें।
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Representative Results
एनएससी जारी करना और एकत्र करना
एसईजेड के एनएससी केवल एपिन्डिमल कोशिकाओं के मोनोलेयर द्वारा सीएसएफ से अलग किए जाते हैं, हालांकि वे मोनो-सिलिअटेड प्रक्रियाओं 8,9 को इंटरकैलेटिंग करके वेंट्रिकुलर सामग्री के सीधे संपर्क में रहते हैं। न्यूरोमिनिडेस विशेष रूप से सियालिक एसिड अवशेषों के दरार के माध्यम से एपेंडिमल कोशिकाओं पर कार्य करता है और वेंट्रिकुलर दीवार के अनाच्छादन को प्रेरित कर सकता है। यह वेंट्रिकल10,11 की सतह पर neuroblast क्लस्टरिंग की ओर जाता है. इसके अलावा, neuroblasts का एक प्रवाह एक इंटीग्रिन-β1-अवरुद्ध एंटीबॉडी के आईसीवी इंजेक्शन के बाद सीएसएफ में मनाया गया है, शायद अंतर-ependymal सेल जंक्शनों12 के ढीला करने के कारण. इन अवलोकनों ने एक प्रोटोकॉल के विकास को जन्म दिया है जो पार्श्व वेंट्रिकल की दीवारों की अखंडता के नियंत्रित समझौता के माध्यम से मस्तिष्क के स्टेम और पूर्वज कोशिकाओं के अलगाव को सक्षम बनाता है। पहले चरण में, पैरेन्काइमा से रिहाई और सीएसएफ के अंदर एनएससी या ओपीसी के बाद के प्रवाह को रिलीज कॉकटेल के आईसीवी इंजेक्शन के माध्यम से प्रेरित किया जाता है। कॉकटेल को पार्श्व निलय में द्विपक्षीय रूप से (2 माइक्रोन प्रति इंजेक्शन) 1 μL/min की दर से स्टीरियोटैक्सिक रूप से इंजेक्ट किया जाता है (SEZ NSCs को लक्षित करने वाले निर्देशांक: AP = 0.3 मिमी, L = ± 1.2 मिमी, D = 3.5 मिमी; सीसी OPCs को लक्षित करने वाले निर्देशांक: AP = 1.5 मिमी, L = ± 2 मिमी, D = 3.5 मिमी)। दूसरे ("संग्रह") चरण में सिस्टर्न मैग्ना से सीएसएफ तरल बायोप्सी का प्रदर्शन शामिल है। चूहों को संवेदनाहारी करने की आवश्यकता होती है और बायोप्सी 1 एमएल सीरिंज के साथ की जा सकती है। स्टीरियोटैक्सिक डिवाइस का उपयोग चीरों की आवश्यकता के बिना, सीएसएफ के लगभग 100 माइक्रोन को पुनः प्राप्त करने में लगभग पूर्ण सफलता की अनुमति देता है। तरल बायोप्सी आइस्ड संस्कृति माध्यम में जोड़ा जाता है और <3 घंटे के लिए चढ़ाना तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाता है (एनएससी संस्कृति माध्यम Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम [DMEM], B27 पूरक [2%], N2 पूरक [1%], FGF2 [20 एनजी / एमएल], और एपिडर्मल विकास कारक [ईजीएफ; 20 एनजी / एमएल]).
रिलीज कॉकटेल के इंजेक्शन के बाद पेरिवेंट्रिकुलर क्षेत्र का हिस्टोलॉजिकल मूल्यांकन
प्रयोगों के पहले समूह से पता चला है कि जब तरल के 3 माइक्रोन से अधिक इंजेक्शन लगाते हैं, तो निलय गैर-विशिष्ट, यांत्रिक चोट(चित्रा 2बी,सी)के कारण क्षतिग्रस्त हो सकते हैं। रिलीज कॉकटेल के 2 माइक्रोन के धीमे इंजेक्शन ने वेंट्रिकुलर सतह पर डीसीएक्स-इम्यूनोपोजिटिव न्यूरोब्लास्ट्स के समूहों के उद्भव का नेतृत्व किया। ये क्लस्टर इंजेक्शन के बाद 8 महीने में भी दिखाई दे रहे थे (चित्र 2डी)। चूंकि विधि अनुदैर्ध्य अध्ययन के लिए अभिप्रेत थी, जानवरों के दीर्घकालिक अनुवर्ती के उद्देश्य से, रिलीज कॉकटेल के कारण ऊतक क्षति का आकलन किया गया था। इम्यूनोस्टेनिंग को एपेंडिमल सेल मार्करों के लिए 14 माइक्रोन मोटी क्रायोस्टेट मस्तिष्क वर्गों पर किया गया था, जैसे कि एस 100β और β-कैटेनिन13, और एपेंडिमल परत की समग्र अखंडता का आकलन किया गया था। एपिन्डिमल परत के अनाच्छादन की साइटें इंजेक्शन के रोस्ट्रोकौडल स्तर के करीब ही मौजूद थीं, एसईजेड के अधिक पीछे और अधिक पूर्वकाल क्षेत्रों में पाए गए एपिन्डिमल परत गड़बड़ी में क्रमिक गिरावट के साथ (चित्र 2ई, एफ) और इंजेक्शन की साइट से ±2 मिमी की दूरी के बाद अनुपस्थित हो गए। उपर्युक्त परिणाम बताते हैं कि रिलीज कॉकटेल के आईसीवी इंजेक्शन के कारण एपिन्डिमल परत का आंशिक अनाच्छादन फोकल है, इंजेक्शन साइट की निकटता में संयमित है, और बाकी पेरिवेंट्रिकुलर एपिन्डिमल परत को बरकरार रखता है।
मार्कर प्रोफाइल और एकत्रित कोशिकाओं के इन विट्रो व्यवहार में
इसके बाद, इन विट्रो व्यवहार और दूध देने वाले प्रोटोकॉल के माध्यम से अलग कोशिकाओं के मार्कर प्रोफाइल का मूल्यांकन किया गया। प्रत्येक तरल बायोप्सी की औसत कोशिका उपज लगभग 300 ± 45 कोशिकाओं (100 μL की बायोप्सी प्रति)7है। दूध देने वाली बायोप्सी के परिणामस्वरूप एनएससी संस्कृतियों में औसतन 3.17 ± 0.45 पारित होने की क्षमता थी। खारा-इंजेक्शन चूहों से अलग कोशिकाओं को औसतन 1.92 ± 0.76 बार पारित किया जा सकता है; इसके विपरीत, दूध देने के माध्यम से पृथक किए गए लोग नौ मार्ग (पी = 0.038, टी परीक्षण) (चित्रा 3ए)7तक पहुंच गए। मानक पोस्टमॉर्टम, एसईजेड-व्युत्पन्न न्यूरोस्फीयर संस्कृतियों की औसत पासिंग क्षमता हमारे हाथों में 12 मार्ग से अधिक है। क्योंकि एसईजेड एनएससी के विवो विस्तार क्षमता में, जैसा कि विवो सेल-भाग्य मानचित्रण प्रयोगों14 में पता चला है, सीमित दिखाया गया है, दूध देने से मानक संस्कृतियों में कोशिकाओं की तुलना में इन विट्रो व्यवहार में काफी अलग कोशिकाओं का उत्पादन होता है, यद्यपि अंतर्जात एनएससी के व्यवहार के बहुत करीब। एकत्रित कोशिकाओं पाली-डी-लाइसिन-लेपित कुओं पर चढ़ाया गया, जहां वे दोनों पक्षपाती मोनोलेयर्स के रूप में बढ़े और शायद ही कभी न्यूरोस्फीयर(चित्रा 3बी)के रूप में। हौसले से पृथक कोशिकाओं (इंजेक्शन के बाद 3 दिन एकत्र और चढ़ाना के बाद 24 घंटे तय) कि एस्ट्रोग्लियल मार्कर GFAP के लिए immunopositive थे भी ID3, quiescence के एक मार्कर, के लिए immunopositive थे, और एनएससी द्विध्रुवी आकारिकी(चित्रा 3C)के लिए विशेषता थी. इसके अलावा, जैसा कि पहले7 बताया गया था, बायोप्सी-व्युत्पन्न कोशिकाओं और एक ही जानवरों से पोस्टमॉर्टम-व्युत्पन्न कोशिकाओं की एक अधिक विस्तृत इम्यूनोसाइटोकेमिकल तुलना, इंजेक्शन के बाद 3 दिनों में (जीएफएपी + एस्ट्रोसाइट्स, डीसीएक्स + न्यूरोब्लास्ट्स, पीडीजीएफआरए + ऑलिगोडेंड्रोसाइट पूर्वजों, और तंत्रिका वंश के एसओएक्स 2 + कोशिकाओं की तलाश में) ने दिखाया कि एकत्रित कोशिकाओं की प्रोफाइल अंतर्जात एसईजेड कोशिकाओं (चित्रा 3 डी) के समान थी). विशेष रूप से, जब बायोप्सी- और ऊतक-व्युत्पन्न कोशिकाओं की तुलना अलग-अलग स्थितियों में की गई थी (उदाहरण के लिए, एफजीएफ 2 के साथ और बिना रिलीज कॉकटेल का इंजेक्शन), यह पाया गया कि विकास कारक के परिणामस्वरूप एसओएक्स 2 + कोशिकाओं की उपस्थिति में एक सहवर्ती और महत्वपूर्ण वृद्धि हुई, साथ ही दोनों नमूनों में डीसीएक्स + न्यूरोब्लास्ट की उपस्थिति में उल्लेखनीय कमी आई (चित्र 3 डी)). इन आंकड़ों ने पुष्टि की कि एनएससी की अंतर्जात आबादी के प्रोफाइल में दिखाई देने वाले किसी भी परिवर्तन को दूध देने वाले सेल नमूनों में प्रतिबिंबित किया जाता है।
चित्र 1: दूध देने का चित्रमय सारांश। प्रमुख शारीरिक स्थलों (पार्श्व वेंट्रिकल, अतिव्यापी कॉर्पस कॉलोसम, और नीचे पूर्वकाल कमिश्नर [ग्रे में सफेद पदार्थ ट्रैक्ट], और पार्श्व दीवारों पर सबपेंडिमल ज़ोन [नीले रंग में]) के साथ एक मस्तिष्क गोलार्द्ध का एक कोरोनल खंड। रिलीज कॉकटेल को पार्श्व वेंट्रिकल में इंजेक्ट किया जाता है, जिससे ऊतक की अखंडता से समझौता होता है और मस्तिष्कमेरु द्रव में प्रसवोत्तर मस्तिष्क तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं की रिहाई होती है, जिससे उन्हें तरल बायोप्सी के माध्यम से एकत्र किया जा सकता है। संक्षिप्ताक्षर: SEZ = सबपेंडिमल ज़ोन; LV = पार्श्व वेंट्रिकल; सीएसएफ = मस्तिष्कमेरु द्रव; pbNSCs = प्रसवोत्तर मस्तिष्क तंत्रिका स्टेम कोशिकाएं; β1-int = beta1 इंटीग्रिन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: आईसीवी इंजेक्शन के प्रभावों का हिस्टोलॉजिकल मूल्यांकन। (एडी) डीसीएक्स के लिए इम्यूनोस्टेनिंग के बाद पार्श्व वेंट्रिकल के पृष्ठीय आधे हिस्से की कम आवर्धन छवियां (लाल रंग में, न्यूरोब्लास्ट को चिह्नित करने के लिए)। (ए) हैमिल्टन सिरिंज का सरल आईसीवी सम्मिलन एसईजेड के साइटो-आर्किटेक्चर को परेशान नहीं करता है, जबकि 10 एमएल (1 एमएल / मिनट की जलसेक दर) का आईसीवी इंजेक्शन इसकी सामग्री के बावजूद वेंट्रिकुलर दीवार की गंभीर क्षति की ओर जाता है। (बी) खारा और (सी) रिलीज कॉकटेल। (डी) रिलीज कॉकटेल के 2 माइक्रोन का इंजेक्शन वेंट्रिकुलर दीवार के नियंत्रित समझौता की ओर जाता है, सर्जरी के 8 महीने बाद भी मनाया जाता है। इंजेक्शन के बाद 7 और 14 दिनों में एसईजेड की दीवार का उच्च-आवर्धन विवरण क्रमशः (ई) और (एफ) में दिखाया गया है। एक अव्यवस्थित संरचना है, जिसमें Dcx + न्यूरोब्लास्ट (हरे रंग में) दीवार की सतह पर आराम कर रहे हैं और आला (Sox2+, सफेद रंग में) की अन्य कोशिकाएं गहरी आराम कर रही हैं। पेरिवेंट्रिकुलर ऊतक 2 महीने के समय बिंदु (जी में) पर इंजेक्शन के रोस्ट्रोकौडल स्तर पर क्षतिग्रस्त हो जाता है, जबकि ऊतक एक ही जानवर में अधिक दुम स्तर (एच में) पर बरकरार रहता है। वेंट्रिकुलर दीवार का मूल्यांकन एपिन्डिमल मार्करों S100β और β-कैटेनिन के लिए इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा किया जाता है। दीवार की विशिष्ट वास्तुकला का विवरण (I) में दिखाया गया है। परमाणु धुंधला DAPI (नीले रंग में दिखाया गया है) का उपयोग करके किया जाता है। स्केल बार = 300 माइक्रोन (ए-सी, जी, एच, इनसेट), 150 माइक्रोन (डी), 30 माइक्रोन (ई, एफ), और 50 माइक्रोन (आई)। यह आंकड़ा McClenahan et al.13 से संशोधित है। संक्षिप्ताक्षर: SEZ = सबपेंडिमल ज़ोन; i.c.v = इंट्रासेरेब्रोवेंट्रिकुलर; डीसीएक्स = डबलकॉर्टिन; DAPI = 4', 6-diamidino-2-phenylindole। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: दूध देने के माध्यम से अलग कोशिकाओं का आकलन । (ए) ग्राफ खारा-इंजेक्शन वाले जानवरों (ग्रे बार, कुल 12 नमूने), या दूध देने के बाद (काली पट्टियों, कुल 29 नमूने, न्यूरोमिनिडेस और इंटीग्रिन-β1-अवरुद्ध एंटीबॉडी के साथ कॉकटेल जारी करते हैं) से तरल बायोप्सी नमूना प्रति प्राप्त मार्ग की अधिकतम संख्या दिखा रहा है। (बी)दूध देने के माध्यम से प्राप्त प्राथमिक कोशिकाओं की प्रतिनिधि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी छवि, इंजेक्शन के बाद 3 दिनों में, जीएफएपी और आईडी 3 के खिलाफ इम्यूनोस्टेन। (सी, डी) कोशिकाओं की ब्राइटफील्ड छवियों ने इंजेक्शन के बाद 3 दिनों को अलग किया, पाली-डी-लाइसिन-लेपित कुओं पर चढ़ाया और 7 दिनों के लिए एनएससी प्रसार माध्यम में बढ़ने की अनुमति दी। (ई) ग्राफ एसईजेड के दूध देने के माध्यम से अलग कोशिकाओं के सेल-टाइप प्रोफाइल और एक ही प्रयोगात्मक जानवरों से एसईजेड एनएससी की अंतर्जात आबादी को दर्शाता है। FGF2 के सह-इंजेक्शन के बाद SOX2+ और Dcx+ अंशों में क्रमशः काफी वृद्धि और कमी की गई। (प्रति मार्कर एक तरफा एनोवा विश्लेषण, पोस्ट हॉक विश्लेषण के बाद; एन = प्रयोगात्मक समूह प्रति 4-6 जानवरों। स्केल बार = 100 माइक्रोन (सी, डी) और 10 माइक्रोन (बी)। यह आंकड़ा McClenahan et al.13 से संशोधित है। संक्षिप्ताक्षर: SEZ = सबपेंडिमल ज़ोन; DPI = इंजेक्शन के बाद के दिन; एनएससी = तंत्रिका स्टेम कोशिकाएं; डीसीएक्स = डबलकॉर्टिन; GFAP = ग्लियाल फाइब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
स्टेम और पूर्वज कोशिकाएं स्तनधारी मस्तिष्क के ऊतकों में अपेक्षाकृत विरल होती हैं। इसके अलावा, एनएससी आसान और सुरक्षित बायोप्सी (वेंट्रिकुलर दीवारों, हिप्पोकैम्पस) के लिए दुर्गम क्षेत्रों में स्थित हैं। इसलिए, ऐसी कोशिकाओं के साथ प्रयोगात्मक रूप से काम करने का एकमात्र तरीका, अब तक, उनका पोस्टमॉर्टम अलगाव रहा है। जीवित चूहों से एनएससी और ओपीसी के एकल या बार-बार संग्रह की अनुमति देने वाली एक विधि, जिसे दूध देने का नाम दिया गया है, यहां चरण दर चरण वर्णित है। विधि दो प्रमुख विशेषताओं पर आधारित है: i) एनएससी या ओपीसी को सीएसएफ से एपिन्डिमल सेल मोनोलेयर द्वारा अलग किया जाता है, जो मस्तिष्क के वेंट्रिकुलर सिस्टम के भीतर बहता है; ii) एपेंडिमल कोशिकाएं और तंत्रिका पूर्वज उनके बीच और अन्य पड़ोसी सेल प्रकारों के साथ इंटीग्रिन के माध्यम से संपर्क बनाए रखते हैं। इसलिए, मस्तिष्क पैरेन्काइमा से एनएससी, या ओपीसी के विघटन को सक्षम करने के लिए निलय के विशिष्ट क्षेत्रों में इंजेक्शन रिलीज कॉकटेल में न्यूरोमिनिडेस, एक विष होता है जो विशेष रूप से एपिन्डिमल कोशिकाओं को लक्षित करता है औरमारता है 10,11, और एक इंटीग्रिन-β1-अवरुद्ध एंटीबॉडी। इसमें एफजीएफ 2 भी शामिल है, क्योंकि यह विकास कारक आला में और संस्कृति15,16 में एनएससी के अस्तित्व और रखरखाव के लिए आवश्यक है। यहपहले 7 दिखाया गया है कि इस प्रोटोकॉल अच्छी तरह से जानवरों द्वारा सहन किया जाता है; इस रिपोर्ट में, यह और पुष्टि की गई है कि सीएसएफ में एनएससी/ओपीसी की रिहाई के लिए एक शर्त के रूप में रिलीज कॉकटेल द्वारा प्रेरित एपिन्डिमल कोशिकाओं को नुकसान, इंजेक्शन के रोस्ट्रोकौडल स्तर के आसपास सीमित है। यह महत्वपूर्ण महत्व का रहा है, क्योंकि प्रोटोकॉल को मस्तिष्क के होमोस्टैटिक फ़ंक्शन को संरक्षित करना चाहिए, जिसमें स्टेम सेल आला भी शामिल है, और जानवरों की दीर्घकालिक भलाई से समझौता नहीं करना चाहिए। रिलीज कॉकटेल का स्टीरियोटैक्सिक इंजेक्शन हल्के गंभीरता का है और इसके परिणामस्वरूप कभी मृत्यु नहीं हुई है। इसके अलावा, सिस्टर्न मैग्ना से तरल बायोप्सी का प्रदर्शन एक त्वरित और न्यूनतम इनवेसिव प्रक्रिया है जिसे लगातार कई बार दोहराया जा सकता है।
महत्वपूर्ण रूप से, दूध देने के माध्यम से अलग किए गए एनएससी नमूने एनएससी के अंतर्जात पूल को बारीकी से दर्शाते हैं। एसईजेड पूर्वज की प्रोफाइल एफजीएफ 2 के आईसीवी इंजेक्शन से प्रभावित हो सकती है। जब ऐसा होता है, तो दूध देने वाली व्युत्पन्न कोशिकाओं की प्रोफाइल उसी तरह प्रभावित होती है। इसके अलावा, पिछले प्रयोगात्मक कार्य ने संकेत दिया है कि एसईजेड के दूध के माध्यम से पृथक एनएससी में सीमित आत्म-नवीकरण क्षमता है, अंतर्जात एनएससी के समान व्यवहार के रूप में विवो, ट्रांसजेनिक, सेल-भाग्य रणनीतियों14,17 में पता चला है। प्रसवोत्तर मस्तिष्क एनएससी मौन में बनाए रखा जाता है, शायद ही कभी माइटोटिक सक्रियण की ओर पारगमन न्यूरोजेनिक और gliogenic संतान18,19,20उत्पन्न करने के लिए. यहां, सबूत प्रदान किए जाते हैं कि जीएफएपी को व्यक्त करने वाली दूध देने वाली व्युत्पन्न कोशिकाओं का अंश और वास्तविक एनएससी सह-एक्सप्रेस आईडी 3, मौन एनएससी21 का एक मार्कर शामिल होने की उम्मीद है। मौन एनएससी की समृद्ध उपस्थिति, जो तब एनएससी माध्यम में चढ़ाया जाता है जो आमतौर पर एनएससी पृथक पोस्टमॉर्टम की संस्कृति के लिए उपयोग किया जाता है, एकत्रित एनएससी की विस्तार क्षमता को सीमित करता है (उदाहरण के लिए, एक प्रक्रिया महत्वपूर्ण है अगर कोशिकाओं को ऑटोलॉगस प्रत्यारोपण के लिए उपयोग किया जाना था)। ऐसा इसलिए है क्योंकि इन मीडिया को विशेष रूप से सक्रिय एनएससी के अस्तित्व और माइटोटिक विस्तार के लिए डिज़ाइन किया गया है; इस प्रकार, मौन एनएससी के कुशल और तेजी से माइटोटिक सक्रियण को सक्षम करने वाले प्रोटोकॉल की पीढ़ी दूध देने के उपयोग के मूल्य और दायरे को बढ़ाएगी।
कुल मिलाकर, इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि दूध देने से जीवित चूहों से प्रसवोत्तर मस्तिष्क एनएससी और ओपीसी (रिलीज कॉकटेल इंजेक्शन के रोस्ट्रोकौडल स्तर के आधार पर) के नमूने को सक्षम बनाता है। यह काम एक ही जानवर में लगातार तरल बायोप्सी आयोजित करने की व्यवहार्यता को इंगित करता है, यहां तक कि रिलीज कॉकटेल के इंजेक्शन के बाद महत्वपूर्ण समय लंबाई पर (इस प्रकार, योजना बनाने और अनुदैर्ध्य प्रयोगात्मक अध्ययन करने के लिए), क्योंकि न्यूरोब्लास्ट वेंट्रिकुलर दीवारों पर भी क्लस्टर रहते हैं 8 महीने के बाद इंजेक्शन। इस तरह के तरीके महत्वपूर्ण महत्व के हैं क्योंकि वे व्यक्तिगत जानवरों के भीतर घटनाओं की जांच की अनुमति देते हैं जिसके परिणामस्वरूप शारीरिक भिन्नता से उत्पन्न जैविक शोर कम हो जाता है। यह, बदले में, बढ़ी हुई सटीकता और "3Rs" (प्रतिस्थापन, कमी और शोधन) के सिद्धांतों के कार्यान्वयन की ओर जाता है। विधि के सुधार के लिए भविष्य के महत्वपूर्ण कदम अधिकतम संख्या और समय सीमा का निर्धारण होगा कि तरल बायोप्सी एक रिलीज प्रक्रिया के बाद की जा सकती है, यद्यपि यदि आवश्यक हो तो अतिरिक्त रिलीज प्रक्रियाओं का प्रदर्शन संभव होना चाहिए।
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Disclosures
लेखकों के पास घोषित करने के लिए कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित या अन्य हितों के टकराव नहीं हैं।
Acknowledgments
इस काम को आरजेएमएफ और आईके को एक्शन मेडिकल रिसर्च (यूके) अनुदान (जीएन 22 9 1) द्वारा समर्थित किया गया था। अनुसंधान कार्य को आंशिक रूप से हेलेनिक फाउंडेशन फॉर रिसर्च एंड इनोवेशन (एचएफआरआई) द्वारा "संकाय सदस्यों और शोधकर्ताओं का समर्थन करने के लिए एचएफआरआई अनुसंधान परियोजनाओं के लिए पहली कॉल" और उच्च लागत वाले अनुसंधान उपकरण अनुदान की खरीद के तहत आंशिक रूप से (पशु लागत और डीडी को समर्थन) का समर्थन किया गया था (परियोजना संख्या: 3395)।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Release cocktail | |||
| β1-integrin-blocking antibody | BD Biosciences | #555002 | purified NA/LE Hamster Anti-Rat CD29 Clone Ha2/5, 1 mg/mL. Any abntibody with blocking activity should be appropriate. |
| Neuraminidase from Clostridium perfringens (Clostridium welchii) | Sigma-Aldrich | #N2876 | Neuraminidases fromother sources (e.g., from Vibrio cholerae) have not been tested. |
| Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | #100-18B | kept as a 1 μg/μL stock, diluted in sterile water at -20 °C |
| Surgical procedures | |||
| 10 µL Syringe | Hamilton | #80330 | Model 701 RN, Small Removable Needle, 26s gauge, 2 in., point style 2 |
| BD Micro-fine 1 mL insulin syringes | BD biosciences | 04085-00 | 29 G x 12.7 mm |
| BETADINE CUT.SOL 10% FLx30ML | LAVIPHARM-CASTALIA | SKU: 5201048131168 | |
| Bupaq | RICHTERPHARMA | 1021854AF | 10 mL (buprenophine 0.3 mg/mL) |
| Digital New Standard Stereotaxic, Rat and Mouse | Stoelting | 51500D | |
| Homeothermic Monitoring System | Harvard Apparatus | 55-7020 | |
| ISOFLURIN 1,000 mg/g inhalation vapour, liquid | Vetpharma Animal Health | 32509/4031 | |
| Ketamidor | RICHTER PHARMA | SKU: 9004114002531 | Ketamine 100 mg/mL |
| Nylon suture, Ethilon | Ethicon | D9635 | Clear , size 5-0 |
| Rechargeable Cordless Surgical Trimmers | Stoelting | Item:51472 | |
| Scalpel blades, sterile | Swann Morton | AW050 | |
| Scopettes Jr. 8-inch Swabs | Birchwood Laboratories | 34-7021-12P | |
| Stereotaxic High Speed Drill | Foredom | 1474w/o1464 | |
| Stoelting’s Stereotaxic Instrument Kit | Stoelting | Item: 52189 | |
| Xylan 2% | Chanelle Pharmaceuticals | 13764/03/19-5-2004 | Xylazine, 25 mL |
| Tissue and cells handling and immunostainings | |||
| 96-well plates appropriate for microscopy | Greiner | #655866 | Screen star microplate |
| B27 supplement | ThermoFisher Scientific | A1486701 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Merck | P06-1391100 | Fraction V, heat shock |
| Citrate | Merck | 71497 | Sodium citrate monobasic |
| Cryostat | Leica | CM1510S | |
| DAPI | Merck, Calbiochem | 28718-90-3 | Nuclear staining, Dilution: 1/1,000 |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11995065 | High glucose, pyruvate |
| donkey anti-goat | Biotium | 20016 or 20106 or 20048 | Dilution: 1/1,000 |
| donkey anti-mouse | Biotium | 20014 or 20105 or 20046 | Dilution: 1/1,000 |
| donkey anti-rabbit | Biotium | 20015 or 20098 or 20047 | Dilution: 1/1,000 |
| EGF | Peprotech | 315-09 | |
| FGF-2 (or bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
| goat anti-GFAP | Abcam | ab53554 | Dilution: 1/500 |
| goat anti-SOX2 | Santa Cruz Biotecnology | sc-17320 | Dilution: 1/200 |
| mouse anti-ID3 | Santa Cruz Biotecnology | sc-56712 | Dilution: 1/200 |
| mouse anti-S100β | Sigma | S2532 | Dilution: 1/200 |
| Mowiol | Merck, Calbiochem | 475904 | Mounting medium |
| N2 supplement | ThermoFisher Scientific | 17502048 | |
| Parafolmadehyde | Merck | 158127 | |
| Poly-D-Lysine | Merck, Millipore | A-003-E | Solution, 1.0 mg/mL |
| rabbit anti-Doublecortin (DCX) | Abcam | ab18723 | Dilution: 1/500 |
| rabbit anti-PDGFRα | Abcam | ab51875 | Dilution: 1/200 |
| rabbit anti-β- catenin | Abcam | ab16051 | Dilution: 1/500 |
| Triton X-100 | Merck | X100 | |
| Microscopy and image analysis | |||
| Confocal microscope | Leica | SP6 and SP8 | |
| Image analysis | NIH, USA | ImageJ | |
| Image analysis | Leica | LasX |
References
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