El método de "ordeño cerebral" para el aislamiento de células madre neurales y células progenitoras de oligodendrocitos de ratas vivas
Summary
Aquí se presenta un método para el aislamiento de células madre neurales y células progenitoras de oligodendrocitos del cerebro de ratas vivas en detalle experimental. Permite múltiples colecciones de estas células de los mismos animales sin comprometer su bienestar.
Abstract
Las células madre neurales (NSC) específicas de tejido permanecen activas en el cerebro postnatal de los mamíferos. Residen en nichos especializados, donde generan nuevas neuronas y glía. Uno de estos nichos es la zona subependimaria (ZEE; también llamada zona ventricular-subventricular), que se encuentra a lo largo de las paredes laterales de los ventrículos laterales, adyacente a la capa de células ependimarias. Las células progenitoras de oligodendrocitos (OPC) están abundantemente distribuidas por todo el sistema nervioso central, constituyendo un conjunto de células progenitoras proliferativas que pueden generar oligodendrocitos.
Tanto los NSC como los OPC exhiben potencial de autorrenovación y ciclos de inactividad/activación. Debido a su localización, el aislamiento y la investigación experimental de estas células se realiza post mortem. Aquí, describimos en detalle el “ordeño cerebral”, un método para el aislamiento de NSCs y OPCs, entre otras células, de animales vivos. Este es un protocolo de dos pasos diseñado para su uso en roedores y probado en ratas. En primer lugar, las células se “liberan” del tejido a través de una inyección estereotáxica intracerebroventricular (i.c.v.) de un “cóctel de liberación”. Los componentes principales son la neuraminidasa, que se dirige a las células ependimarias e induce la denudación de la pared ventricular, un anticuerpo bloqueante de la integrina-β1, y el factor de crecimiento de fibroblastos-2. En una segunda etapa de “recolección”, se realizan biopsias líquidas de líquido cefalorraquídeo de la cisterna magna, en ratas anestesiadas sin necesidad de incisión.
Los resultados presentados aquí muestran que las células aisladas conservan su perfil endógeno y que las NSC de la ZEE conservan su quiescencia. La denudación de la capa ependimaria se restringe al nivel anatómico de la inyección y el protocolo (liberación y recolección) es bien tolerado por los animales. Este novedoso enfoque allana el camino para realizar estudios longitudinales de neurogénesis endógena y gliogénesis en animales de experimentación.
Introduction
Las células madre específicas de tejido son células parcialmente comprometidas que pueden dar lugar a todas las poblaciones celulares que constituyen los tejidos respectivos. Además de ser multipotentes, son células que se autorrenuevan y son cruciales para mantener la homeostasis y la capacidad regenerativa de los tejidos1. Algunas células madre específicas de tejido permanecen en un estado activo y fuertemente proliferativo, como las células madre intestinales o hematopoyéticas. Otras, como las células madre cerebrales, permanecen en gran medida inactivas o inactivas2. En el cerebro adulto, las células madre neurales (NSC, por sus siglas en inglés) se pueden encontrar en áreas especializadas, a menudo llamadas nichos. Existen dos áreas bien descritas en la zona subependimaria (ZEE) de los ventrículos laterales y en la circunvolución dentada del hipocampo. El nicho de la ZEE genera el mayor número de células, principalmente neuroblastos que migran hacia los bulbos olfatorios y contribuyen a la población local de interneuronas; por el contrario, los oligodendroblastos generados migran al cuerpo calloso adyacente (CC)3. Las células progenitoras de oligodendrocitos (OPC) son células mitóticamente activas, ampliamente distribuidas por todo el sistema nervioso central, que: i) están comprometidas con el linaje oligodendroglial, ii) pueden migrar a sitios de desmielinización, y iii) pueden diferenciarse en oligodendrocitos mielinizantes. Las OPC también exhiben potencial de autorrenovación y quietud4.
Hasta ahora, el aislamiento y estudio de las NSC y OPC requería la disociación postmortem del tejido cerebral y de la médula espinal disecado. Para sortear esta limitación experimental, establecimos un método que permite, por primera vez, aislar las NSC y OPC cerebrales de animales vivos. Llamamos a este método “ordeño”, porque permite múltiples colecciones de células, ya que sus reservas no se agotan. El protocolo se desarrolló en ratas, debido a su gran tamaño cerebral, dirigido principalmente a la ZEE, o CC, e incluye dos pasos principales. En primer lugar, las NSC u OPC se “eliminan” del tejido mediante la inyección intravenosa de un “cóctel de liberación” que contiene neuraminidasa, una toxina que induce la denudación de la pared ventricular, un anticuerpo que bloquea la integrina-β1 y el factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF2). El cóctel se inyecta estereotáxicamente bilateralmente dentro de los ventrículos laterales. Si el uso previsto es el aislamiento de las NSC, se dirigen a las áreas rostrales de los ventrículos laterales. Si el objetivo es aislar las OPC de forma más pura, el cóctel se inyecta caudalmente en la zona de la fimbría del hipocampo. En un segundo paso de “recolección”, se realizan biopsias líquidas de líquido cefalorraquídeo (LCR) de la cisterna magna de ratas anestesiadas, sin necesidad de incisión. La biopsia líquida se mezcla con un medio de cultivo NSC y se puede mantener a 4 °C hasta la siembra.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las células madre y progenitoras son relativamente escasas en el tejido cerebral de los mamíferos. Además, las NSC se encuentran en áreas inaccesibles para realizar biopsias fáciles y seguras (paredes ventriculares, hipocampo). Por lo tanto, la única forma de trabajar experimentalmente con este tipo de células, hasta ahora, ha sido su aislamiento postmortem. A continuación se describe paso a paso un método que permite la recolección única o repetida de NSC y OPC de ratas vivas, llamado ordeño. El método se b…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por una beca de Action Medical Research (Reino Unido) (GN2291) a R.J.M.F. e I.K. El trabajo de investigación también fue parcialmente financiado (costos de animales y apoyo a D.D.) por la Fundación Helénica para la Investigación y la Innovación (H.F.R.I.) en el marco de la “Primera Convocatoria de Proyectos de Investigación H.F.R.I. para apoyar a los miembros de la Facultad e Investigadores y la adquisición de subvenciones para equipos de investigación de alto costo” (Número de proyecto: 3395).
Materials
| Release cocktail | |||
| β1-integrin-blocking antibody | BD Biosciences | #555002 | purified NA/LE Hamster Anti-Rat CD29 Clone Ha2/5, 1 mg/mL. Any abntibody with blocking activity should be appropriate. |
| Neuraminidase from Clostridium perfringens (Clostridium welchii) | Sigma-Aldrich | #N2876 | Neuraminidases fromother sources (e.g., from Vibrio cholerae) have not been tested. |
| Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | #100-18B | kept as a 1 μg/μL stock, diluted in sterile water at -20 °C |
| Surgical procedures | |||
| 10 µL Syringe | Hamilton | #80330 | Model 701 RN, Small Removable Needle, 26s gauge, 2 in., point style 2 |
| BD Micro-fine 1 mL insulin syringes | BD biosciences | 04085-00 | 29 G x 12.7 mm |
| BETADINE CUT.SOL 10% FLx30ML | LAVIPHARM-CASTALIA | SKU: 5201048131168 | |
| Bupaq | RICHTERPHARMA | 1021854AF | 10 mL (buprenophine 0.3 mg/mL) |
| Digital New Standard Stereotaxic, Rat and Mouse | Stoelting | 51500D | |
| Homeothermic Monitoring System | Harvard Apparatus | 55-7020 | |
| ISOFLURIN 1,000 mg/g inhalation vapour, liquid | Vetpharma Animal Health | 32509/4031 | |
| Ketamidor | RICHTER PHARMA | SKU: 9004114002531 | Ketamine 100 mg/mL |
| Nylon suture, Ethilon | Ethicon | D9635 | Clear , size 5-0 |
| Rechargeable Cordless Surgical Trimmers | Stoelting | Item:51472 | |
| Scalpel blades, sterile | Swann Morton | AW050 | |
| Scopettes Jr. 8-inch Swabs | Birchwood Laboratories | 34-7021-12P | |
| Stereotaxic High Speed Drill | Foredom | 1474w/o1464 | |
| Stoelting’s Stereotaxic Instrument Kit | Stoelting | Item: 52189 | |
| Xylan 2% | Chanelle Pharmaceuticals | 13764/03/19-5-2004 | Xylazine, 25 mL |
| Tissue and cells handling and immunostainings | |||
| 96-well plates appropriate for microscopy | Greiner | #655866 | Screen star microplate |
| B27 supplement | ThermoFisher Scientific | A1486701 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Merck | P06-1391100 | Fraction V, heat shock |
| Citrate | Merck | 71497 | Sodium citrate monobasic |
| Cryostat | Leica | CM1510S | |
| DAPI | Merck, Calbiochem | 28718-90-3 | Nuclear staining, Dilution: 1/1,000 |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11995065 | High glucose, pyruvate |
| donkey anti-goat | Biotium | 20016 or 20106 or 20048 | Dilution: 1/1,000 |
| donkey anti-mouse | Biotium | 20014 or 20105 or 20046 | Dilution: 1/1,000 |
| donkey anti-rabbit | Biotium | 20015 or 20098 or 20047 | Dilution: 1/1,000 |
| EGF | Peprotech | 315-09 | |
| FGF-2 (or bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
| goat anti-GFAP | Abcam | ab53554 | Dilution: 1/500 |
| goat anti-SOX2 | Santa Cruz Biotecnology | sc-17320 | Dilution: 1/200 |
| mouse anti-ID3 | Santa Cruz Biotecnology | sc-56712 | Dilution: 1/200 |
| mouse anti-S100β | Sigma | S2532 | Dilution: 1/200 |
| Mowiol | Merck, Calbiochem | 475904 | Mounting medium |
| N2 supplement | ThermoFisher Scientific | 17502048 | |
| Parafolmadehyde | Merck | 158127 | |
| Poly-D-Lysine | Merck, Millipore | A-003-E | Solution, 1.0 mg/mL |
| rabbit anti-Doublecortin (DCX) | Abcam | ab18723 | Dilution: 1/500 |
| rabbit anti-PDGFRα | Abcam | ab51875 | Dilution: 1/200 |
| rabbit anti-β- catenin | Abcam | ab16051 | Dilution: 1/500 |
| Triton X-100 | Merck | X100 | |
| Microscopy and image analysis | |||
| Confocal microscope | Leica | SP6 and SP8 | |
| Image analysis | NIH, USA | ImageJ | |
| Image analysis | Leica | LasX |
References
- Visvader, J. E., Clevers, H. Tissue-specific designs of stem cell hierarchies. Nature Cell Biology. 18 (4), 349-355 (2016).
- Dimitrakopoulos, D., Kakogiannis, D., Kazanis, I. Heterogeneity of quiescent and active neural stem cells in the postnatal brain. The International Journal of Developmental Biology. 66 (1-2-3), 51-58 (2022).
- Kazanis, I., et al. Subependymal zone-derived oligodendroblasts respond to focal demyelination but fail to generate myelin in young and aged mice. Stem Cell Reports. 8 (3), 685-700 (2017).
- Franklin, R. J. M., Ffrench-Constant, C. Regenerating CNS myelin-from mechanisms to experimental medicines. Nature Reviews. Neuroscience. 18 (12), 753-769 (2017).
- . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 7th Edition Available from: https://www.elsevier.com/books/the-rat-brain-in-stereotaxic-coordinates/paxinos/978-0-12-391949-6 (2013)
- Pegg, C. C., He, C., Stroink, A. R., Kattner, K. A., Wang, C. X. Technique for collection of cerebrospinal fluid from the cisterna magna in rat. Journal of Neuroscience Methods. 187 (1), 8-12 (2010).
- McClenahan, F., et al. Isolation of neural stem and oligodendrocyte progenitor cells from the brain of live rats. Stem Cell Reports. 16 (10), 2534-2547 (2021).
- Doetsch, F., García-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Regeneration of a germinal layer in the adult mammalian brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (20), 11619-11624 (1999).
- Doetsch, F., Petreanu, L., Caille, I., Garcia-Verdugo, J. -. M., Alvarez-Buylla, A. EGF converts transit-amplifying neurogenic precursors in the adult brain into multipotent stem cells. Neuron. 36 (6), 1021-1034 (2002).
- Del Carmen Gómez-Roldán, M., et al. Neuroblast proliferation on the surface of the adult rat striatal wall after focal ependymal loss by intracerebroventricular injection of neuraminidase. The Journal of Comparative Neurology. 507 (4), 1571-1587 (2008).
- Luo, J., Shook, B. A., Daniels, S. B., Conover, J. C. Subventricular zone-mediated ependyma repair in the adult mammalian brain. The Journal of Neuroscience. 28 (14), 3804-3813 (2008).
- Kazanis, I., et al. Quiescence and activation of stem and precursor cell populations in the subependymal zone of the mammalian brain are associated with distinct cellular and extracellular matrix signals. The Journal of Neuroscience. 30 (29), 9771-9781 (2010).
- Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain. Cell Stem Cell. 3 (3), 265-278 (2008).
- Calzolari, F., et al. Fast clonal expansion and limited neural stem cell self-renewal in the adult subependymal zone. Nature Neuroscience. 18 (4), 490-492 (2015).
- Douet, V., Kerever, A., Arikawa-Hirasawa, E., Mercier, F. Fractone-heparan sulphates mediate FGF-2 stimulation of cell proliferation in the adult subventricular zone. Cell Proliferation. 46 (2), 137-145 (2013).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Obernier, K., et al. Adult neurogenesis is sustained by symmetric self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 22 (2), 221-234 (2018).
- Delgado, A. C., et al. Release of stem cells from quiescence reveals gliogenic domains in the adult mouse brain. Science. 372 (6547), 1205-1209 (2021).
- Kalamakis, G., et al. Quiescence modulates stem cell maintenance and regenerative capacity in the aging brain. Cell. 176 (6), 1407-1419 (2019).
- Llorens-Bobadilla, E., et al. Single-cell transcriptomics reveals a population of dormant neural stem cells that become activated upon brain injury. Cell Stem Cell. 17 (3), 329-340 (2015).
- Gajera, C. R., et al. LRP2 in ependymal cells regulates BMP signaling in the adult neurogenic niche. Journal of Cell Science. 123 (11), 1922-1930 (2010).
