"Brain Milking"-metoden för isolering av neurala stamceller och oligodendrocytstamceller från levande råttor
Summary
En metod för isolering av neurala stamceller och oligodendrocytstamceller från hjärnan hos levande råttor presenteras här i experimentell detalj. Det tillåter flera samlingar av dessa celler från samma djur utan att äventyra deras välbefinnande.
Abstract
Vävnadsspecifika neurala stamceller (NSC) förblir aktiva i den postnatala hjärnan hos däggdjur. De finns i specialiserade nischer, där de genererar nya neuroner och glia. En sådan nisch är den subependymala zonen (SEZ; även kallad den ventrikulära subventrikulära zonen), som ligger tvärs över de laterala ventriklarnas sidoväggar, intill det ependymala celskiktet. Oligodendrocytstamceller (OPC) är rikligt fördelade i hela det centrala nervsystemet och utgör en pool av proliferativa stamceller som kan generera oligodendrocyter.
Både NSC och OPC uppvisar självförnyelsepotential och vilo-/aktiveringscykler. På grund av deras läge utförs isolering och experimentell undersökning av dessa celler efter döden. Här beskriver vi i detalj “brain milking”, en metod för isolering av bland annat NSC och OPC från levande djur. Detta är ett tvåstegsprotokoll som är utformat för användning på gnagare och testat på råttor. Först “frigörs” cellerna från vävnaden via stereotaktisk intracerebroventrikulär (i.c.v.) injektion av en “frisättningscocktail”. Huvudkomponenterna är neuraminidas, som riktar sig mot ependymala celler och inducerar ventrikulär väggdenudation, en integrin-β1-blockerande antikropp och fibroblasttillväxtfaktor-2. I ett andra “insamlingssteg” utförs flytande biopsier av cerebrospinalvätska från cisterna magna, i sövda råttor utan behov av ett snitt.
Resultaten som presenteras här visar att isolerade celler behåller sin endogena profil och att NSC i SEZ bevarar sin vila. Denudationen av det ependymala skiktet är begränsad till den anatomiska injektionsnivån och protokollet (frisättning och insamling) tolereras väl av djuren. Detta nya tillvägagångssätt banar väg för att utföra longitudinella studier av endogen neurogenes och gliogenes i försöksdjur.
Introduction
Vävnadsspecifika stamceller är delvis bundna celler som kan ge upphov till alla cellpopulationer som utgör respektive vävnad. Förutom att de är multipotenta är de självförnyande celler och avgörande för att upprätthålla homeostasen och den regenerativa kapaciteten hos vävnader1. Vissa vävnadsspecifika stamceller förblir i ett aktivt, starkt proliferativt tillstånd, såsom tarmstamceller eller hematopoetiska stamceller. Andra, som hjärnstamceller, förblir i stort sett vilande eller vilande2. I den vuxna hjärnan finns neurala stamceller (NSC) i specialiserade områden, ofta kallade nischer. Två sådana väl beskrivna områden finns i den subependymala zonen (SEZ) i de laterala ventriklarna och i gyrus dentatus i hippocampus. SEZ-nischen genererar det högsta antalet celler, främst neuroblaster som migrerar mot luktbulberna och bidrar till den lokala interneuronpopulationen; Däremot migrerar genererade oligodendroblaster till den intilliggande corpus callosum (CC)3. Oligodendrocytstamceller (OPC) är mitotiskt aktiva celler, brett distribuerade i hela det centrala nervsystemet, som: i) är bundna till oligodendrogliallinjen, ii) kan migrera till platser för demyelinisering och iii) kan differentiera till myeliniserande oligodendrocyter. OPC:er uppvisar också potential för självförnyelse och passivitet4.
Fram tills nu har isolering och studier av NSC och OPC krävt postmortem dissociation av den dissekerade hjärn- och ryggmärgsvävnaden. För att kringgå denna experimentella begränsning etablerade vi en metod som för första gången gör det möjligt att isolera hjärnans NSC och OPC från levande djur. Vi kallar denna metod “mjölkning”, eftersom den möjliggör flera samlingar av celler eftersom deras pooler inte är uttömda. Protokollet utvecklades på råttor, på grund av deras stora hjärnstorlek, och riktar sig främst mot SEZ, eller CC, och innehåller två huvudsteg. Först “avlägsnas” NSC eller OPC från vävnaden via intravenös injektion av en “frisättningscocktail” som innehåller neuraminidas, ett toxin som inducerar ventrikulär väggdenudation, en integrin-β1-blockerande antikropp och fibroblasttillväxtfaktor 2 (FGF2). Cocktailen injiceras stereotiskt bilateralt i de laterala ventriklarna. Om den avsedda användningen är isolering av NSCs är rostrala områden i de laterala ventriklarna inriktade. Om syftet är att isolera OPC mer rent, injiceras cocktailen kaudalt i området kring hippocampus fimbri. I ett andra “insamlingssteg” utförs flytande biopsier av cerebrospinalvätska (CSF) från cisterna magna från sövda råttor, utan behov av ett snitt. Den flytande biopsin blandas med NSC-odlingsmedium och kan förvaras vid 4 °C fram till plätering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Stam- och stamceller är relativt glesa i hjärnvävnad hos däggdjur. Dessutom är NSC placerade i områden som är otillgängliga för enkla och säkra biopsier (ventrikulära väggar, hippocampus). Därför har det enda sättet att arbeta experimentellt med sådana celler hittills varit att isolera dem efter döden. En metod som gör det möjligt att samla in NSC och OPC från levande råttor på ett eller flera gånger, så kallad mjölkning, beskrivs här steg för steg. Metoden är baserad på två nyckelfunktioner…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av ett anslag från Action Medical Research (UK) (GN2291) till R.J.M.F. och I.K. Forskningsarbetet stöddes också delvis (djurkostnader och stöd till D.D.) av Hellenic Foundation for Research and Innovation (H.F.R.I.) under “First Call for H.F.R.I. Research Projects to support Faculty Members and Researchers and the procurement of high-cost research equipment grant” (projektnummer: 3395).
Materials
| Release cocktail | |||
| β1-integrin-blocking antibody | BD Biosciences | #555002 | purified NA/LE Hamster Anti-Rat CD29 Clone Ha2/5, 1 mg/mL. Any abntibody with blocking activity should be appropriate. |
| Neuraminidase from Clostridium perfringens (Clostridium welchii) | Sigma-Aldrich | #N2876 | Neuraminidases fromother sources (e.g., from Vibrio cholerae) have not been tested. |
| Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | #100-18B | kept as a 1 μg/μL stock, diluted in sterile water at -20 °C |
| Surgical procedures | |||
| 10 µL Syringe | Hamilton | #80330 | Model 701 RN, Small Removable Needle, 26s gauge, 2 in., point style 2 |
| BD Micro-fine 1 mL insulin syringes | BD biosciences | 04085-00 | 29 G x 12.7 mm |
| BETADINE CUT.SOL 10% FLx30ML | LAVIPHARM-CASTALIA | SKU: 5201048131168 | |
| Bupaq | RICHTERPHARMA | 1021854AF | 10 mL (buprenophine 0.3 mg/mL) |
| Digital New Standard Stereotaxic, Rat and Mouse | Stoelting | 51500D | |
| Homeothermic Monitoring System | Harvard Apparatus | 55-7020 | |
| ISOFLURIN 1,000 mg/g inhalation vapour, liquid | Vetpharma Animal Health | 32509/4031 | |
| Ketamidor | RICHTER PHARMA | SKU: 9004114002531 | Ketamine 100 mg/mL |
| Nylon suture, Ethilon | Ethicon | D9635 | Clear , size 5-0 |
| Rechargeable Cordless Surgical Trimmers | Stoelting | Item:51472 | |
| Scalpel blades, sterile | Swann Morton | AW050 | |
| Scopettes Jr. 8-inch Swabs | Birchwood Laboratories | 34-7021-12P | |
| Stereotaxic High Speed Drill | Foredom | 1474w/o1464 | |
| Stoelting’s Stereotaxic Instrument Kit | Stoelting | Item: 52189 | |
| Xylan 2% | Chanelle Pharmaceuticals | 13764/03/19-5-2004 | Xylazine, 25 mL |
| Tissue and cells handling and immunostainings | |||
| 96-well plates appropriate for microscopy | Greiner | #655866 | Screen star microplate |
| B27 supplement | ThermoFisher Scientific | A1486701 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Merck | P06-1391100 | Fraction V, heat shock |
| Citrate | Merck | 71497 | Sodium citrate monobasic |
| Cryostat | Leica | CM1510S | |
| DAPI | Merck, Calbiochem | 28718-90-3 | Nuclear staining, Dilution: 1/1,000 |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11995065 | High glucose, pyruvate |
| donkey anti-goat | Biotium | 20016 or 20106 or 20048 | Dilution: 1/1,000 |
| donkey anti-mouse | Biotium | 20014 or 20105 or 20046 | Dilution: 1/1,000 |
| donkey anti-rabbit | Biotium | 20015 or 20098 or 20047 | Dilution: 1/1,000 |
| EGF | Peprotech | 315-09 | |
| FGF-2 (or bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
| goat anti-GFAP | Abcam | ab53554 | Dilution: 1/500 |
| goat anti-SOX2 | Santa Cruz Biotecnology | sc-17320 | Dilution: 1/200 |
| mouse anti-ID3 | Santa Cruz Biotecnology | sc-56712 | Dilution: 1/200 |
| mouse anti-S100β | Sigma | S2532 | Dilution: 1/200 |
| Mowiol | Merck, Calbiochem | 475904 | Mounting medium |
| N2 supplement | ThermoFisher Scientific | 17502048 | |
| Parafolmadehyde | Merck | 158127 | |
| Poly-D-Lysine | Merck, Millipore | A-003-E | Solution, 1.0 mg/mL |
| rabbit anti-Doublecortin (DCX) | Abcam | ab18723 | Dilution: 1/500 |
| rabbit anti-PDGFRα | Abcam | ab51875 | Dilution: 1/200 |
| rabbit anti-β- catenin | Abcam | ab16051 | Dilution: 1/500 |
| Triton X-100 | Merck | X100 | |
| Microscopy and image analysis | |||
| Confocal microscope | Leica | SP6 and SP8 | |
| Image analysis | NIH, USA | ImageJ | |
| Image analysis | Leica | LasX |
References
- Visvader, J. E., Clevers, H. Tissue-specific designs of stem cell hierarchies. Nature Cell Biology. 18 (4), 349-355 (2016).
- Dimitrakopoulos, D., Kakogiannis, D., Kazanis, I. Heterogeneity of quiescent and active neural stem cells in the postnatal brain. The International Journal of Developmental Biology. 66 (1-2-3), 51-58 (2022).
- Kazanis, I., et al. Subependymal zone-derived oligodendroblasts respond to focal demyelination but fail to generate myelin in young and aged mice. Stem Cell Reports. 8 (3), 685-700 (2017).
- Franklin, R. J. M., Ffrench-Constant, C. Regenerating CNS myelin-from mechanisms to experimental medicines. Nature Reviews. Neuroscience. 18 (12), 753-769 (2017).
- . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 7th Edition Available from: https://www.elsevier.com/books/the-rat-brain-in-stereotaxic-coordinates/paxinos/978-0-12-391949-6 (2013)
- Pegg, C. C., He, C., Stroink, A. R., Kattner, K. A., Wang, C. X. Technique for collection of cerebrospinal fluid from the cisterna magna in rat. Journal of Neuroscience Methods. 187 (1), 8-12 (2010).
- McClenahan, F., et al. Isolation of neural stem and oligodendrocyte progenitor cells from the brain of live rats. Stem Cell Reports. 16 (10), 2534-2547 (2021).
- Doetsch, F., García-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Regeneration of a germinal layer in the adult mammalian brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (20), 11619-11624 (1999).
- Doetsch, F., Petreanu, L., Caille, I., Garcia-Verdugo, J. -. M., Alvarez-Buylla, A. EGF converts transit-amplifying neurogenic precursors in the adult brain into multipotent stem cells. Neuron. 36 (6), 1021-1034 (2002).
- Del Carmen Gómez-Roldán, M., et al. Neuroblast proliferation on the surface of the adult rat striatal wall after focal ependymal loss by intracerebroventricular injection of neuraminidase. The Journal of Comparative Neurology. 507 (4), 1571-1587 (2008).
- Luo, J., Shook, B. A., Daniels, S. B., Conover, J. C. Subventricular zone-mediated ependyma repair in the adult mammalian brain. The Journal of Neuroscience. 28 (14), 3804-3813 (2008).
- Kazanis, I., et al. Quiescence and activation of stem and precursor cell populations in the subependymal zone of the mammalian brain are associated with distinct cellular and extracellular matrix signals. The Journal of Neuroscience. 30 (29), 9771-9781 (2010).
- Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain. Cell Stem Cell. 3 (3), 265-278 (2008).
- Calzolari, F., et al. Fast clonal expansion and limited neural stem cell self-renewal in the adult subependymal zone. Nature Neuroscience. 18 (4), 490-492 (2015).
- Douet, V., Kerever, A., Arikawa-Hirasawa, E., Mercier, F. Fractone-heparan sulphates mediate FGF-2 stimulation of cell proliferation in the adult subventricular zone. Cell Proliferation. 46 (2), 137-145 (2013).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Obernier, K., et al. Adult neurogenesis is sustained by symmetric self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 22 (2), 221-234 (2018).
- Delgado, A. C., et al. Release of stem cells from quiescence reveals gliogenic domains in the adult mouse brain. Science. 372 (6547), 1205-1209 (2021).
- Kalamakis, G., et al. Quiescence modulates stem cell maintenance and regenerative capacity in the aging brain. Cell. 176 (6), 1407-1419 (2019).
- Llorens-Bobadilla, E., et al. Single-cell transcriptomics reveals a population of dormant neural stem cells that become activated upon brain injury. Cell Stem Cell. 17 (3), 329-340 (2015).
- Gajera, C. R., et al. LRP2 in ependymal cells regulates BMP signaling in the adult neurogenic niche. Journal of Cell Science. 123 (11), 1922-1930 (2010).
