Summary
En metod för isolering av neurala stamceller och oligodendrocytstamceller från hjärnan hos levande råttor presenteras här i experimentell detalj. Det tillåter flera samlingar av dessa celler från samma djur utan att äventyra deras välbefinnande.
Abstract
Vävnadsspecifika neurala stamceller (NSC) förblir aktiva i den postnatala hjärnan hos däggdjur. De finns i specialiserade nischer, där de genererar nya neuroner och glia. En sådan nisch är den subependymala zonen (SEZ; även kallad den ventrikulära subventrikulära zonen), som ligger tvärs över de laterala ventriklarnas sidoväggar, intill det ependymala celskiktet. Oligodendrocytstamceller (OPC) är rikligt fördelade i hela det centrala nervsystemet och utgör en pool av proliferativa stamceller som kan generera oligodendrocyter.
Både NSC och OPC uppvisar självförnyelsepotential och vilo-/aktiveringscykler. På grund av deras läge utförs isolering och experimentell undersökning av dessa celler efter döden. Här beskriver vi i detalj "brain milking", en metod för isolering av bland annat NSC och OPC från levande djur. Detta är ett tvåstegsprotokoll som är utformat för användning på gnagare och testat på råttor. Först "frigörs" cellerna från vävnaden via stereotaktisk intracerebroventrikulär (i.c.v.) injektion av en "frisättningscocktail". Huvudkomponenterna är neuraminidas, som riktar sig mot ependymala celler och inducerar ventrikulär väggdenudation, en integrin-β1-blockerande antikropp och fibroblasttillväxtfaktor-2. I ett andra "insamlingssteg" utförs flytande biopsier av cerebrospinalvätska från cisterna magna, i sövda råttor utan behov av ett snitt.
Resultaten som presenteras här visar att isolerade celler behåller sin endogena profil och att NSC i SEZ bevarar sin vila. Denudationen av det ependymala skiktet är begränsad till den anatomiska injektionsnivån och protokollet (frisättning och insamling) tolereras väl av djuren. Detta nya tillvägagångssätt banar väg för att utföra longitudinella studier av endogen neurogenes och gliogenes i försöksdjur.
Introduction
Vävnadsspecifika stamceller är delvis bundna celler som kan ge upphov till alla cellpopulationer som utgör respektive vävnad. Förutom att de är multipotenta är de självförnyande celler och avgörande för att upprätthålla homeostasen och den regenerativa kapaciteten hos vävnader1. Vissa vävnadsspecifika stamceller förblir i ett aktivt, starkt proliferativt tillstånd, såsom tarmstamceller eller hematopoetiska stamceller. Andra, som hjärnstamceller, förblir i stort sett vilande eller vilande2. I den vuxna hjärnan finns neurala stamceller (NSC) i specialiserade områden, ofta kallade nischer. Två sådana väl beskrivna områden finns i den subependymala zonen (SEZ) i de laterala ventriklarna och i gyrus dentatus i hippocampus. SEZ-nischen genererar det högsta antalet celler, främst neuroblaster som migrerar mot luktbulberna och bidrar till den lokala interneuronpopulationen; Däremot migrerar genererade oligodendroblaster till den intilliggande corpus callosum (CC)3. Oligodendrocytstamceller (OPC) är mitotiskt aktiva celler, brett distribuerade i hela det centrala nervsystemet, som: i) är bundna till oligodendrogliallinjen, ii) kan migrera till platser för demyelinisering och iii) kan differentiera till myeliniserande oligodendrocyter. OPC:er uppvisar också potential för självförnyelse och passivitet4.
Fram tills nu har isolering och studier av NSC och OPC krävt postmortem dissociation av den dissekerade hjärn- och ryggmärgsvävnaden. För att kringgå denna experimentella begränsning etablerade vi en metod som för första gången gör det möjligt att isolera hjärnans NSC och OPC från levande djur. Vi kallar denna metod "mjölkning", eftersom den möjliggör flera samlingar av celler eftersom deras pooler inte är uttömda. Protokollet utvecklades på råttor, på grund av deras stora hjärnstorlek, och riktar sig främst mot SEZ, eller CC, och innehåller två huvudsteg. Först "avlägsnas" NSC eller OPC från vävnaden via intravenös injektion av en "frisättningscocktail" som innehåller neuraminidas, ett toxin som inducerar ventrikulär väggdenudation, en integrin-β1-blockerande antikropp och fibroblasttillväxtfaktor 2 (FGF2). Cocktailen injiceras stereotiskt bilateralt i de laterala ventriklarna. Om den avsedda användningen är isolering av NSCs är rostrala områden i de laterala ventriklarna inriktade. Om syftet är att isolera OPC mer rent, injiceras cocktailen kaudalt i området kring hippocampus fimbri. I ett andra "insamlingssteg" utförs flytande biopsier av cerebrospinalvätska (CSF) från cisterna magna från sövda råttor, utan behov av ett snitt. Den flytande biopsin blandas med NSC-odlingsmedium och kan förvaras vid 4 °C fram till plätering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djuravel, underhåll och försöksprocedurer utfördes i enlighet med UK Animals (Scientific Procedures) Act 1986, godkänd av inrikesministeriet, och med presidentdekret 56/2013 från Republiken Grekland, granskad av djurskydds- och etiska granskningsorgan vid universiteten i Cambridge och Patras, samt godkänd och granskad av den lokala kommittén för prefekturens djurvård och användning (protokollnummer: 5675/39/18-01-2021). Han- och honråttor av typerna Sprague-Dawley, Wistar och Long-Evans, med åldrar som varierade mellan 2 och 4 månader och med kroppsvikt mellan 150 g och 250 g, användes. Protokollet sammanfattas grafiskt i figur 1.
1. Släpp cocktailberedningen
OBS: Förbered färskt på dagen för proceduren och håll på is. Mängderna anges per 2 μl som ska injiceras intravenöst i varje lateral kammare. Bered ytterligare 1 μl per avsedd injektion.
- Bered 0,5 μl 500 mU neuraminidas från Clostridium perfringens (Clostridium welchii).
OBS: Förvara detta som en 1 U/μL buljong utspädd i sterilt vatten vid -20 °C. Andra typer av neuraminidaser har inte testats. - Bered 1 μl innehållande 1 μg integrin-β1-blockerande antikroppar.
OBS: Förvara den vid 4 °C. - Bered 0,5 μl innehållande 0,5 μg basisk fibroblasttillväxtfaktor (rekombinant human FGF-basisk).
OBS: Förvara den som en 1 μg/μL buljong utspädd i sterilt vatten vid -20 °C.
2. Injektion av frisättningscocktail
OBS: Hela processen kan utföras inom 20 minuter. Var noga med att utföra operationen under aseptiska förhållanden. Rengör alla ytor med antiseptiskt medel (t.ex. 3 % eller 6 % väteperoxid). Använd autoklaverade eller lätt sterila verktyg, handskar, rockar och draperier.
- Bedöva försöksdjuret genom inhalation av isofluran (2,5 % för induktion och 2 % för underhållsbehandling). Bekräfta anestesidjupet genom att kontrollera hornhinnereflexen, reaktionen på stimuli (test av bakben och svansklämning) och andningssättet.
OBS: Kirurgiska ingrepp kan utföras under generell anestesi inducerad av intraperitonealt injicerbar anestesi (t.ex. ketamin [40 mg/kg] och xylazin [10 mg/kg]). Djup anestesi bekräftades genom kontroll av hornhinnans reflex, reaktionen på stimuli (test av bakben och svansklämning) och andningssättet. - Administrera analgesi subkutant (t.ex. 0,3 mg/ml buprenorfin) vid induktion av anestesi.
- Montera råttan på den stereotaktiska ramen.
- Raka pälsen på huvudet med en rakhyvel och rengör huden med antiseptiska medel, till exempel 10 % povidon-jodlösning och sedan alkohol. Applicera det antiseptiska medlet tre gånger med sterila bomullspinnar. Gnugga i en cirkelrörelse i 3-5 s varje gång. Applicera ögonsalva för att förhindra torrhet.
- Gör ett 2 cm långt snitt i huvudets hud längs mittlinjen med hjälp av en steril skalpell.
- Rensa skallen noggrant med sterila svabbar och steril koksaltlösning.
- Identifiera bregman med hjälp av nålkanten på en 10 μL Hamilton-spruta monterad på den stereotaktiska enheten. Ställ in bregma som "punkt 0,0".
OBS: Bregma identifieras som skärningspunkten mellan sagittal- och koronasuturerna. Mer detaljer finns i råtthjärnatlasen över Paxinos och Watson5. - Flytta enheten till koordinaterna anterioposterior (AP) = 0.3 mm, lateral (L) = +1.2 mm (för att rikta in sig på SEZ), eller AP = 1.5 mm, L = +2.0 mm (för att rikta in sig på CC).
- Borra ett 1 mm borrhål med en tandläkarborr.
OBS: När du borrar för hand, var försiktig så att du inte skadar den kortikala ytan. Blödningen förväntas inte bli betydande. Rensa eventuellt blod med koksaltlösning och tryck för att stoppa mer ihållande blödningar. - Fyll på 4 μl av frisättningscocktailen i 10 μL Hamilton-sprutan.
- Sänk nålen (helst med den trubbiga eller koniska kanten) på Hamilton-sprutan för att komma i kontakt med duran.
- Stick in nålen på önskat djup (D = 3,5 mm).
OBS: Häll saltlösning på ytan av dura för att hålla vävnaden återfuktad. - Låt 2 μl av frisättningscocktailen dra med en hastighet av 1 μL/min.
- Låt nålen sitta kvar i ytterligare 2 minuter innan du långsamt tar upp den för att undvika att cocktailen kommer upp till ytan.
- Upprepa steg 2.8-2.14 för det andra halvklotet vid koordinaterna AP = 0.3 mm, L = -1.2 mm (för att rikta in sig på SEZ), eller AP = 1.5 mm, L = -2.0 mm (för att rikta in sig på CC).
- Suturera snittet med 5-0 nylon (diameter 0,1 mm) och rengör det suturerade området med antiseptiskt medel.
- Ta bort masken som ger bedövningsmedlet och överför djuret till övervakningsområdet efter operationen.
OBS: Återhämtning från anestesi och upprätthållande av liggande bör ske inom 5-10 minuter och full återhämtning (normalt beteende) inom 25 min.- Övervaka noggrant återhämtningen (livlig och oavbruten rörelse, frekvent tillgång till vatten) i ett väl uppvärmt (24-25 °C), tyst utrymme utan strö med små partiklar, som kan blockera luftvägarna. Återlämna djuret till sällskapet med dess burkamrater (inte till nya djur) först efter att ha bekräftat att djuret är helt återställt.
- Övervaka djuret på underhållsanläggningen i minst 48 timmar efter operationen. Åtgärda tecken på smärta (döljande av huvudet, onormal huvud- eller kroppshållning, överkänslighet och hyperexcitabilitet för hantering) genom att administrera smärtlindring (t.ex. 0,3 mg/ml buprenorfin, subkutant). Hänvisa djur med missfärgad eller upprätt päls till ansvarig veterinär.
3. Vätskebiopsi av cerebrospinalvätska (CSF)
OBS: Hela processen kan utföras inom 10 minuter. Den flytande biopsin som beskrivs här utförs 3 dagar efter injektion av frisättningscocktailen men kan utföras på exakt samma sätt när det behövs. Var noga med att utföra operationen under aseptiska förhållanden. Rengör alla ytor med antiseptiskt medel (t.ex. 3 % eller 6 % väteperoxid). Använd autoklaverade eller lätt sterila verktyg, handskar, rockar och draperier.
- Bedöva djuret genom inhalation av isofluran (2,5 % för induktion och 2 % för underhållsbehandling). Bekräfta anestesidjupet genom att kontrollera hornhinnan
reflex, reaktionen på stimuli (test av bakben och svansklämning) och andningssätt.
OBS: De kirurgiska ingreppen kan utföras under generell anestesi inducerad av intraperitonealt injicerbar anestesi (t.ex. ketamin [40 mg/kg] och xylazin [10 mg/kg]). Detta är dock inte tillrådligt eftersom proceduren är kort, särskilt om biopsier kommer att utföras flera gånger på varandra följande dagar. - Administrera analgesi subkutant (t.ex. 0,3 mg/ml buprenorfin) vid induktion av anestesi.
- Montera försöksdjuret på den stereotaktiska ramen. Använd öronstängerna för att fixera huvudet utan att hindra rotationsrörelsen framåt och bakåt.
- Stabilisera huvudet i en nedåtgående 40° vinkel så att en bra förlängning av nacken kan uppnås.
OBS: Ett sätt att göra detta är att använda munstången på enheten6. - Raka pälsen i nackområdet med en rakhyvel och rengör huden med antiseptiska medel, såsom 10 % povidon-jodlösning och sedan alkohol. Applicera det antiseptiska medlet tre gånger med sterila bomullspinnar. Gnugga i en cirkelrörelse i 3-5 s varje gång.
- Med fingertoppen hittar du det rombformade depressibla området som är placerat mellan nackutbuktningen och ryggraden på atlas6.
- Rita en punktmarkering (t.ex. med hjälp av en markör).
- Fäst en spruta på 1 ml eller 0,5 ml på den stereotaktiska ramen.
OBS: Det är tillrådligt att använda sprutor med icke-löstagbara nålar eftersom de ger bättre sug och har mindre dödvolym. - För nålen vid kontaktpunkten med huden vid punktmarkeringen.
- Lyft huden med en pincett samtidigt som du sänker sprutan genom hudlagren.
- Dra upp kolven en aning för att skapa ett undertryck i sprutan.
- Starta om för att doppa nålen mycket långsamt tills vätska (CSF) syns i sprutan.
- Sätt nålen i denna position och tillåt det långsamma flödet av CSF.
OBS: Nålen kan sänkas eller höjas något om CSF-flödet är mycket långsamt. - Börja ta bort cerebrospinalvätskan långsamt (i steg om 40 μL/min) upp till 120 μL.
- Dra långsamt upp sprutan.
- Intraperitonealt administrera 1 ml normalt serum för att stödja försöksdjurets påfyllning av vätska.
- Blanda den flytande biopsin (CSF) med 400 μL NSC-medium och håll mikrocentrifugröret vid 4 °C tills vidare användning.
OBS: Flytande biopsier bör behandlas inom 3 timmar om de inte är frysta. - Ta bort masken som ger bedövningsmedlet och överför djuret till övervakningsområdet efter operationen.
OBS: Återhämtning från anestesi och upprätthållande av liggande bör ske inom 5-10 minuter och full återhämtning (normalt beteende) inom 25 min.- Övervaka noggrant återhämtningen (livlig och oavbruten rörelse, frekvent tillgång till vatten) i ett väl uppvärmt (24-25 °C), tyst utrymme utan strö med små partiklar, som kan blockera luftvägarna. Återlämna djuret till sällskapet med dess burkamrater (inte till nya djur) först efter att fullständig återhämtning har bekräftats.
- Övervaka djuret på underhållsanläggningen i minst 48 timmar efter operationen. Om tecken på smärta (döljande av huvudet, onormal huvud- eller kroppshållning, överkänslighet och hyperexcitabilitet för hantering) observeras, administrera analgesi (t.ex. 0,3 mg/ml buprenorfin subkutant). Hänvisa djur med missfärgad eller upprätt päls till ansvarig veterinär.
4. Bearbetning av vävnad för immunofluorescens
- Avliva djuret genom intrakardiell infusion av 20 ml iskall koksaltlösning, följt av 50 ml iskall 4 % paraformaldehyd (PFA; i fosfatbuffrad koksaltlösning [PBS] med pH = 7,4).
- Dissekera hjärnvävnaden.
- Separera huvudet från kroppen med en sax för att göra ett snitt i livmoderhalsområdet. Använd saxen för att ta bort huden och klipp sedan skallbenet längs den sagittala mittlinjen, med saxens spetsar pekande uppåt för att inte skada hjärnvävnaden. Sikta på att fortsätta klippa så mycket som möjligt och passera den koronala mittlinjen.
- Använd pincett för att ta bort benen, med början från supraoccipital- och parietalbenen och slutligen frontalbenen.
- När hjärnvävnaden avslöjas, använd en pincett eller en spatel för att lyfta ut den ur skallen. För att underlätta detta kan du skära av nerverna vid hjärnans bas och luktbulberna, om du inte vill det.
- Fixera vävnaden över natten i 2 % PFA vid 4 °C.
- Kryoskydda vävnaden i 30 % sackaros (i PBS) i minst 48 timmar vid 4 °C tills vävnaden sjunker till botten.
- Vävnaden fryses ned vid -80 °C.
- Skär hjärnvävnaden i 14 μm tjocka koronasektioner med en kryostat.
- Utför immunofluorescensfärgning med hjälp av standardprotokoll 3,7
- Inkubera snitten med blockerande buffert (3 % bovint serumalbumin [BSA], 0,1 % Triton X-100, i PBS) i 2 timmar vid rumstemperatur.
- Utför antigenhämtning (kokning i 15 minuter i 10 mM citratbuffert, pH = 6,0, med hjälp av glasburkar).
OBS: Detta steg är valfritt, men nödvändigt för nukleära antigener. - Värm till rumstemperatur och inkubera med primära antikroppar mot gliafibrillärt surt protein (GFAP), dubbelkortin (Dcx), S100β och β-catenin (se materialtabellen) i blockerande buffert över natten vid 4 °C.
- Inkubera i 2 timmar med sekundära antikroppar i PBS med 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) för nukleär motfärgning vid rumstemperatur (se materialtabellen).
- Montera täckglasen.
5. Bearbetning av isolerade celler för immunofluorescens
- Plätera cellerna till 96-hålsplattor som är kompatibla för mikroskopi, belagda med poly-D-lysin (100 μg/ml).
- Fixera cellerna i iskall 2% PFA i 10 min och tvätta 3 gånger med PBS.
- Utför immunofluorescens med standardprocedur3,7 för PDGFRα, GFAP, Dcx, SOX2 och ID3 (se materialtabellen).
- Förvara cellerna i PBS + NaN3 (0,1 %) vid 4 °C i mörker.
6. Mikroskopi och bildanalys
- Ta bilder med epifluorescens eller konfokalmikroskopi och utför cellräkningar med hjälp av standardverktyg för bildanalys, t.ex. cellräknare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utgivning och insamling av NSC:er
NSC i den särskilda ekonomiska zonen separeras från cerebrospinalvätskan endast av monolagret av ependymala celler, även om de förblir i direkt kontakt med det ventrikulära innehållet via interkalerande monocilierade utskott 8,9. Neuraminidas verkar specifikt på ependymala celler via klyvning av sialinsyrarester och kan inducera denudation av ventrikelväggen. Detta leder till anhopning av neuroblaster på ytan av ventrikeln10,11. Dessutom har ett flöde av neuroblaster observerats i cerebrospinalvätskan efter intravenös injektion av en integrin-β1-blockerande antikropp, troligen på grund av uppluckring av de interependymala cellövergångarna12. Dessa observationer har lett till utvecklingen av ett protokoll som möjliggör isolering av hjärnans stam- och stamceller via kontrollerad kompromettering av integriteten hos den laterala ventrikelns väggar. I ett första steg induceras frisättningen från parenkymet och det efterföljande flödet av NSC eller OPC inuti CSF via intravenös injektion av frisättningscocktailen. Cocktailen injiceras stereotiskt med en hastighet av 1 μL/min, bilateralt (2 μL per injektion) i de laterala ventriklarna (koordinater riktade mot SEZ NSCs: AP = 0,3 mm, L = ± 1,2 mm, D = 3,5 mm; koordinater riktade mot CC OPC: AP = 1,5 mm, L = ± 2 mm, D = 3,5 mm). Det andra steget ("insamling") innebär att man utför vätskebiopsier från cisterna magna från cerebrospinalvätska. Råttorna behöver sövas och biopsin kan göras med 1 ml sprutor. Användningen av den stereotaktiska anordningen gör det möjligt att nästan fullständigt hämta cirka 100 μL CSF, utan behov av snitt. Den flytande biopsin tillsätts till isodlingsmediet och förvaras vid 4 °C tills den pläteras i <3 timmar (NSC-odlingsmediet innehåller Dulbeccos modifierade Eagle-medium [DMEM], B27-tillskott [2 %], N2-tillskott [1 %], FGF2 [20 ng/ml] och epidermal tillväxtfaktor [EGF; 20 ng/ml]).
Histologisk bedömning av det periventrikulära området efter injektion av frisättningscocktailen
En första kohort av experiment avslöjade att vid injektion av mer än 3 μL vätska kunde kamrarna skadas på grund av ospecifik, mekanisk skada (Figur 2B,C). Den långsamma injektionen av 2 μL frisättningscocktail ledde till uppkomsten av kluster av Dcx-immunpositiva neuroblaster vid den ventrikulära ytan. Dessa kluster förblev synliga även 8 månader efter injektion (Figur 2D). Eftersom metoden var avsedd för longitudinella studier, med sikte på långtidsuppföljning av djuren, bedömdes vävnadsskadorna orsakade av frisättningscocktailen. Immunfärgning utfördes på 14 μm tjocka kryostatsnitt av hjärnan för ependymala cellmarkörer, såsom S100β och β-catenin13, och den totala integriteten hos det ependymala skiktet bedömdes. Ställen för denudation av det ependymala skiktet fanns endast nära den rostrocaudala nivån av injektionerna, med en gradvis minskning av störningar i det ependymala skiktet som upptäcktes i mer bakre och mer främre områden av SEZ (figur 2E,F) och som uteblev efter ett avstånd på ±2 mm från injektionsstället. Ovan nämnda resultat visar att den partiella denudationen av det ependymala skiktet som orsakas av intravenös injektion av frisättningscocktailen är fokal, begränsad i närheten av injektionsstället och lämnar resten av det periventrikulära ependymala skiktet intakt.
Markörprofil och in vitro-beteende hos insamlade celler
Därefter bedömdes in vitro-beteendet och markörprofilen för de celler som isolerats via mjölkningsprotokollet. Det genomsnittliga cellutbytet för varje flytande biopsi är cirka 300 ± 45 celler (per biopsi på 100 μL)7. Mjölkningsbiopsier resulterade i NSC-odlingar med en genomsnittlig passagepotential på 3,17 ± 0,45. Celler isolerade från koksaltinjicerade råttor kunde passera i genomsnitt 1,92 ± 0,76 gånger. Däremot nådde de som isolerats via mjölkning till och med nio passager (p = 0,038, t-test ) (Figur 3A)7. Den genomsnittliga passaging-kapaciteten för standard postmortem, SEZ-härledda neurosfärkulturer är högre än 12 passager i våra händer. Eftersom in vivo-expansionspotentialen hos SEZ NSCs, som avslöjats av in vivo cell-fate mapping experiment14, har visat sig vara begränsad, producerar mjölkning celler med signifikant annorlunda in vitro-beteende än celler i standardkulturer, om än mycket närmare beteendet hos endogena NSC. Insamlade celler pläterades på poly-D-lysinbelagda brunnar, där de växte både som vidhäftande monolager och mer sällan som neurosfärer (Figur 3B). Nyligen isolerade celler (insamlade 3 dagar efter injektion och fixerade 24 timmar efter plätering) som var immunpositiva för astrogliamarkören GFAP var också immunpositiva för ID3, en markör för viloläge, och hade karakteristika för NSC-bipolär morfologi (Figur 3C). Dessutom, som tidigare rapporterats7, visade en mer detaljerad immunocytokemisk jämförelse av biopsi-härledda celler och av postmortem-härledda celler från samma djur, 3 dagar efter injektion (där man letade efter GFAP+-astrocyter, Dcx+-neuroblaster, PDGFRa+-oligodendrocytprogenitorer och SOX2+-celler av neural härstamning) att profilen för insamlade celler liknade den för endogena SEZ-celler (Figur 3D). När biopsi- och vävnadsderiverade celler jämfördes under olika förhållanden (t.ex. injektion av en frisättningscocktail med och utan FGF2) fann man att tillväxtfaktorn resulterade i en samtidig och signifikant ökning av närvaron av SOX2+-celler, samt i en signifikant minskning av förekomsten av Dcx+-neuroblaster i båda proverna (Figur 3D). Dessa data bekräftade att alla förändringar som förekommer i profilen för endogena populationer av NSC återspeglas i mjölkgenererade cellprover.
Figur 1: Grafisk sammanfattning av mjölkning. En koronal del av ena hjärnhalvan med de viktigaste anatomiska landmärkena (den laterala ventrikeln, den överliggande corpus callosum, och den främre kommissuren nedanför [den vita substansen i grått] och den subependymala zonen vid sidoväggarna [i blått]). Frisättningscocktailen injiceras i den laterala ventrikeln, vilket leder till att vävnadens integritet äventyras och att neurala stamceller från hjärnan frigörs i cerebrospinalvätskan, från vilken de kan samlas in via flytande biopsier. Förkortningar: SEZ = subependymal zon; LV = lateral ventrikel; CSF = cerebrospinalvätska; pbNSCs = neurala stamceller i hjärnan efter födseln; β1-int = beta1-integrin. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Histologisk bedömning av effekterna av intravenösa injektioner. (A-D) Lågförstorande bilder av den dorsala halvan av den laterala ventrikeln efter immunfärgning för Dcx (i rött, för att markera neuroblaster). (A) En enkel intravenös injektion av en Hamilton-spruta stör inte cytoarkitekturen i den särskilda ekonomiska zonen, medan intravenös injektion av 10 ml (infusionshastighet på 1 ml/min) leder till allvarliga skador på kammarväggen oavsett dess innehåll. (B) Saltlösning och (C) frigör cocktail. (D) Injektion av 2 μL av frisättningscocktailen leder till en kontrollerad kompromettering av ventrikelväggen, som observerats även 8 månader efter operationen. Detaljer med högre förstoring av den särskilda ekonomiska zonens vägg 7 och 14 dagar efter injektion visas i (E) respektive (F). Det finns en oorganiserad struktur, med Dcx+ neuroblaster (i grönt) som vilar på väggens yta och de andra cellerna i nischen (Sox2+, i vitt) som vilar djupare. Den periventrikulära vävnaden är skadad på rostrocaudal nivå av injektionen vid 2-månaderstidpunkten (i G), medan vävnaden är intakt på en mer kaudal nivå (i H) hos samma djur. Ventrikulärväggen bedöms genom immunfärgning för ependymala markörer S100β och β-catenin. Detaljer om väggens typiska arkitektur visas i (I). Kärnfärgning utförs med DAPI (visas i blått). Skalstreck = 300 μm (A-C,G,H, infällningar), 150 μm (D), 30 μm (E,F) och 50 μm (I). Denna siffra är modifierad från McClenahan et al.13. Förkortningar: SEZ = subependymal zon; I.C.V = intracerebroventrikulär, Dcx = dubbelkortin; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Bedömning av celler som isolerats genom mjölkning. A) Diagram som visar det maximala antalet passager som erhållits per vätskebiopsiprov från koksaltinjicerade djur (grå staplar, totalt 12 prover) eller efter mjölkning (svarta staplar, totalt 29 prover, frisättningscocktail med neuraminidas och integrin-β1-blockerande antikroppar). (B) Representativ konfokalmikroskopibild av primära celler erhållen genom mjölkning, 3 dagar efter injektion, immunfärgad mot GFAP och ID3. (C,D) Ljusfältsbilder av celler isolerade 3 dagar efter injektion, pläterade på poly-D-lysinbelagda brunnar och fick växa i NSC-proliferationsmedium i 7 dagar. E) Diagram som visar celltypsprofilen för celler som isolerats genom mjölkning av den särskilda ekonomiska zonen och för den endogena populationen av NSC i särskilda ekonomiska zoner från samma försöksdjur. SOX2+- och Dcx+-fraktionerna ökade och minskade signifikant efter saminjektion av FGF2. (Envägs ANOVA-analys per markör, följt av post hoc-analys; n = 4-6 djur per försöksgrupp.) Skalstreck = 100 μm (C,D) och 10 μm (B). Denna siffra är modifierad från McClenahan et al.13. Förkortningar: SEZ = subependymal zon; DPI = dagar efter injektion; NSC = neurala stamceller; Dcx = dubbelkortin; GFAP = gliafibrillärt surt protein. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Stam- och stamceller är relativt glesa i hjärnvävnad hos däggdjur. Dessutom är NSC placerade i områden som är otillgängliga för enkla och säkra biopsier (ventrikulära väggar, hippocampus). Därför har det enda sättet att arbeta experimentellt med sådana celler hittills varit att isolera dem efter döden. En metod som gör det möjligt att samla in NSC och OPC från levande råttor på ett eller flera gånger, så kallad mjölkning, beskrivs här steg för steg. Metoden är baserad på två nyckelfunktioner: i) NSC eller OPC separeras av det ependymala cellmonolagret från CSF, som strömmar inom hjärnans ventrikulära system; ii) Ependymala celler och neurala stamceller behåller kontakten mellan dem och med andra närliggande celltyper via integriner. Därför innehåller frisättningscocktailen som injiceras i specifika områden av ventriklarna för att möjliggöra frigöring av NSCs, eller OPC, från hjärnans parenkym neuraminidas, ett toxin som specifikt riktar sig mot och dödar ependymala celler10,11, och en integrin-β1-blockerande antikropp. Den innehåller också FGF2, eftersom denna tillväxtfaktor är avgörande för överlevnad och underhåll av NSC i nischen och i kultur15,16. Det har tidigare visats7 att detta protokoll tolereras väl av djuren; I denna rapport bekräftas vidare att skadorna på ependymala celler, som induceras av frisättningscocktailen som en förutsättning för frisättning av NSCs/OPC i CSF, är begränsad runt den rostrocaudala nivån av injektionen. Detta har varit av avgörande betydelse, eftersom protokollet bör bevara hjärnans homeostatiska funktion, inklusive själva stamcellsnischen, och inte bör äventyra djurens långsiktiga välbefinnande. Den stereotaktiska injektionen av frisättningscocktailen är av lindrig svårighetsgrad och har aldrig lett till döden. Dessutom är utförandet av flytande biopsier från cisterna magna en snabb och minimalt invasiv procedur som kan upprepas flera gånger i följd.
Det är viktigt att notera att NSC-proverna som isolerats via mjölkning nära återspeglar den endogena poolen av NSC. Profilen för SEZ-progenitorer kan påverkas av intravenös injektion av FGF2. När detta sker påverkas profilen för mjölkningshärledda celler på samma sätt. Dessutom har tidigare experimentellt arbete indikerat att NSC som isolerats via mjölkning av SEZ har begränsad potential för självförnyelse, ett beteende som liknar det hos endogena NSC, vilket avslöjas med in vivo, transgena, cell-ödesstrategier14,17. Postnatala hjärn-NSCs bibehålls i vila och övergår sällan mot mitotisk aktivering för att generera neurogen och gliogen avkomma18,19,20. Här ges belägg för att den andel av mjölkningshärledda celler som uttrycker GFAP och förväntas inkludera NSC:er i god tro samuttrycker ID3, en markör för vilande NSCs21. Den berikade närvaron av vilande NSC, som sedan pläteras i det NSC-medium som vanligtvis används för odling av NSC-isolerade postmortem, verkar begränsa expansionspotentialen hos insamlade NSC (t.ex. en process som är avgörande om celler skulle användas för autologa transplantationer). Detta beror på att dessa medier är utformade specifikt för överlevnad och mitotisk expansion av aktiverade NSC; Således kommer genereringen av protokoll som möjliggör effektiv och snabb mitotisk aktivering av vilande NSC att öka värdet och omfattningen av användningen av mjölkning.
Sammantaget tyder dessa data på att mjölkning möjliggör provtagning av postnatala NSC och OPC i hjärnan (beroende på den rostrocaudala nivån av injektion av frisättningscocktailen) från levande råttor. Detta arbete indikerar möjligheten att utföra på varandra följande vätskebiopsier i samma djur, även vid betydande tidslängder efter injektion av frisättningscocktailen (alltså för att planera och utföra longitudinella experimentella studier), eftersom neuroblaster förblir klustrade på kammarväggarna även vid 8 månader efter injektionen. Sådana metoder är av avgörande betydelse eftersom de gör det möjligt att undersöka händelser hos enskilda djur som resulterar i minskat biologiskt brus som genereras av fysiologisk variation. Detta leder i sin tur till ökad noggrannhet och till implementering av principerna för "3R" (ersättning, minskning och förfining). Framtida viktiga steg för att förbättra metoden kommer att vara fastställandet av det maximala antalet och tidsramen som flytande biopsier kan utföras efter en frisläppningsprocedur, även om det bör vara möjligt att utföra ytterligare frisättningsprocedurer om det är nödvändigt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga konkurrerande ekonomiska intressen eller andra intressekonflikter att redovisa.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ett anslag från Action Medical Research (UK) (GN2291) till R.J.M.F. och I.K. Forskningsarbetet stöddes också delvis (djurkostnader och stöd till D.D.) av Hellenic Foundation for Research and Innovation (H.F.R.I.) under "First Call for H.F.R.I. Research Projects to support Faculty Members and Researchers and the procurement of high-cost research equipment grant" (projektnummer: 3395).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Release cocktail | |||
| β1-integrin-blocking antibody | BD Biosciences | #555002 | purified NA/LE Hamster Anti-Rat CD29 Clone Ha2/5, 1 mg/mL. Any abntibody with blocking activity should be appropriate. |
| Neuraminidase from Clostridium perfringens (Clostridium welchii) | Sigma-Aldrich | #N2876 | Neuraminidases fromother sources (e.g., from Vibrio cholerae) have not been tested. |
| Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | #100-18B | kept as a 1 μg/μL stock, diluted in sterile water at -20 °C |
| Surgical procedures | |||
| 10 µL Syringe | Hamilton | #80330 | Model 701 RN, Small Removable Needle, 26s gauge, 2 in., point style 2 |
| BD Micro-fine 1 mL insulin syringes | BD biosciences | 04085-00 | 29 G x 12.7 mm |
| BETADINE CUT.SOL 10% FLx30ML | LAVIPHARM-CASTALIA | SKU: 5201048131168 | |
| Bupaq | RICHTERPHARMA | 1021854AF | 10 mL (buprenophine 0.3 mg/mL) |
| Digital New Standard Stereotaxic, Rat and Mouse | Stoelting | 51500D | |
| Homeothermic Monitoring System | Harvard Apparatus | 55-7020 | |
| ISOFLURIN 1,000 mg/g inhalation vapour, liquid | Vetpharma Animal Health | 32509/4031 | |
| Ketamidor | RICHTER PHARMA | SKU: 9004114002531 | Ketamine 100 mg/mL |
| Nylon suture, Ethilon | Ethicon | D9635 | Clear , size 5-0 |
| Rechargeable Cordless Surgical Trimmers | Stoelting | Item:51472 | |
| Scalpel blades, sterile | Swann Morton | AW050 | |
| Scopettes Jr. 8-inch Swabs | Birchwood Laboratories | 34-7021-12P | |
| Stereotaxic High Speed Drill | Foredom | 1474w/o1464 | |
| Stoelting’s Stereotaxic Instrument Kit | Stoelting | Item: 52189 | |
| Xylan 2% | Chanelle Pharmaceuticals | 13764/03/19-5-2004 | Xylazine, 25 mL |
| Tissue and cells handling and immunostainings | |||
| 96-well plates appropriate for microscopy | Greiner | #655866 | Screen star microplate |
| B27 supplement | ThermoFisher Scientific | A1486701 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Merck | P06-1391100 | Fraction V, heat shock |
| Citrate | Merck | 71497 | Sodium citrate monobasic |
| Cryostat | Leica | CM1510S | |
| DAPI | Merck, Calbiochem | 28718-90-3 | Nuclear staining, Dilution: 1/1,000 |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11995065 | High glucose, pyruvate |
| donkey anti-goat | Biotium | 20016 or 20106 or 20048 | Dilution: 1/1,000 |
| donkey anti-mouse | Biotium | 20014 or 20105 or 20046 | Dilution: 1/1,000 |
| donkey anti-rabbit | Biotium | 20015 or 20098 or 20047 | Dilution: 1/1,000 |
| EGF | Peprotech | 315-09 | |
| FGF-2 (or bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
| goat anti-GFAP | Abcam | ab53554 | Dilution: 1/500 |
| goat anti-SOX2 | Santa Cruz Biotecnology | sc-17320 | Dilution: 1/200 |
| mouse anti-ID3 | Santa Cruz Biotecnology | sc-56712 | Dilution: 1/200 |
| mouse anti-S100β | Sigma | S2532 | Dilution: 1/200 |
| Mowiol | Merck, Calbiochem | 475904 | Mounting medium |
| N2 supplement | ThermoFisher Scientific | 17502048 | |
| Parafolmadehyde | Merck | 158127 | |
| Poly-D-Lysine | Merck, Millipore | A-003-E | Solution, 1.0 mg/mL |
| rabbit anti-Doublecortin (DCX) | Abcam | ab18723 | Dilution: 1/500 |
| rabbit anti-PDGFRα | Abcam | ab51875 | Dilution: 1/200 |
| rabbit anti-β- catenin | Abcam | ab16051 | Dilution: 1/500 |
| Triton X-100 | Merck | X100 | |
| Microscopy and image analysis | |||
| Confocal microscope | Leica | SP6 and SP8 | |
| Image analysis | NIH, USA | ImageJ | |
| Image analysis | Leica | LasX |
References
- Visvader, J. E., Clevers, H. Tissue-specific designs of stem cell hierarchies. Nature Cell Biology. 18 (4), 349-355 (2016).
- Dimitrakopoulos, D., Kakogiannis, D., Kazanis, I. Heterogeneity of quiescent and active neural stem cells in the postnatal brain. The International Journal of Developmental Biology. 66 (1-2-3), 51-58 (2022).
- Kazanis, I., et al. Subependymal zone-derived oligodendroblasts respond to focal demyelination but fail to generate myelin in young and aged mice. Stem Cell Reports. 8 (3), 685-700 (2017).
- Franklin, R. J. M., Ffrench-Constant, C. Regenerating CNS myelin-from mechanisms to experimental medicines. Nature Reviews. Neuroscience. 18 (12), 753-769 (2017).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 7th Edition. , Available from: https://www.elsevier.com/books/the-rat-brain-in-stereotaxic-coordinates/paxinos/978-0-12-391949-6 (2013).
- Pegg, C. C., He, C., Stroink, A. R., Kattner, K. A., Wang, C. X. Technique for collection of cerebrospinal fluid from the cisterna magna in rat. Journal of Neuroscience Methods. 187 (1), 8-12 (2010).
- McClenahan, F., et al. Isolation of neural stem and oligodendrocyte progenitor cells from the brain of live rats. Stem Cell Reports. 16 (10), 2534-2547 (2021).
- Doetsch, F., García-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Regeneration of a germinal layer in the adult mammalian brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (20), 11619-11624 (1999).
- Doetsch, F., Petreanu, L., Caille, I., Garcia-Verdugo, J. -M., Alvarez-Buylla, A. EGF converts transit-amplifying neurogenic precursors in the adult brain into multipotent stem cells. Neuron. 36 (6), 1021-1034 (2002).
- Del Carmen Gómez-Roldán, M., et al. Neuroblast proliferation on the surface of the adult rat striatal wall after focal ependymal loss by intracerebroventricular injection of neuraminidase. The Journal of Comparative Neurology. 507 (4), 1571-1587 (2008).
- Luo, J., Shook, B. A., Daniels, S. B., Conover, J. C. Subventricular zone-mediated ependyma repair in the adult mammalian brain. The Journal of Neuroscience. 28 (14), 3804-3813 (2008).
- Kazanis, I., et al. Quiescence and activation of stem and precursor cell populations in the subependymal zone of the mammalian brain are associated with distinct cellular and extracellular matrix signals. The Journal of Neuroscience. 30 (29), 9771-9781 (2010).
- Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain. Cell Stem Cell. 3 (3), 265-278 (2008).
- Calzolari, F., et al. Fast clonal expansion and limited neural stem cell self-renewal in the adult subependymal zone. Nature Neuroscience. 18 (4), 490-492 (2015).
- Douet, V., Kerever, A., Arikawa-Hirasawa, E., Mercier, F. Fractone-heparan sulphates mediate FGF-2 stimulation of cell proliferation in the adult subventricular zone. Cell Proliferation. 46 (2), 137-145 (2013).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Obernier, K., et al. Adult neurogenesis is sustained by symmetric self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 22 (2), 221-234 (2018).
- Delgado, A. C., et al. Release of stem cells from quiescence reveals gliogenic domains in the adult mouse brain. Science. 372 (6547), 1205-1209 (2021).
- Kalamakis, G., et al. Quiescence modulates stem cell maintenance and regenerative capacity in the aging brain. Cell. 176 (6), 1407-1419 (2019).
- Llorens-Bobadilla, E., et al. Single-cell transcriptomics reveals a population of dormant neural stem cells that become activated upon brain injury. Cell Stem Cell. 17 (3), 329-340 (2015).
- Gajera, C. R., et al. LRP2 in ependymal cells regulates BMP signaling in the adult neurogenic niche. Journal of Cell Science. 123 (11), 1922-1930 (2010).
