Um método para o isolamento de células-tronco neurais e células progenitoras de oligodendrócitos do cérebro de ratos vivos é apresentado aqui em detalhes experimentais. Permite múltiplas coletas dessas células dos mesmos animais sem comprometer seu bem-estar.
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Artigo de método
Método "Brain Milking" para o Isolamento de Células-Tronco Neurais e Células Progenitoras de Oligodendrócitos de Ratos Vivos
Neste artigo
Resumo
Resumo
As células-tronco neurais tecido-específicas (NSCs) permanecem ativas no cérebro pós-natal de mamíferos. Residem em nichos especializados, onde geram novos neurônios e glia. Um desses nichos é a zona subependimária (ZEE, também chamada de zona ventricular-subventricular), que está localizada através das paredes laterais dos ventrículos laterais, adjacente à camada de células ependimárias. As células progenitoras de oligodendrócitos (OPCs) distribuem-se abundantemente pelo sistema nervoso central, constituindo um pool de células progenitoras proliferativas que podem gerar oligodendrócitos.
Tanto NSCs quanto OPCs exibem potencial de auto-renovação e ciclos de quiescência/ativação. Devido à sua localização, o isolamento e a investigação experimental dessas células são realizados post-mortem. Aqui, descrevemos em detalhes a "ordenha cerebral", um método para o isolamento de NSCs e OPCs, entre outras células, de animais vivos. Este é um protocolo de duas etapas projetado para uso em roedores e testado em ratos. Primeiro, as células são "liberadas" do tecido por meio da injeção intracerebroventricular (i.c.v.) estereotáxica de um "coquetel de liberação". Os principais componentes são a neuraminidase, que tem como alvo as células ependimárias e induz o desnudamento da parede ventricular, um anticorpo bloqueador da integrina-β1 e o fator de crescimento de fibroblastos-2. Em uma segunda etapa de "coleta", biópsias líquidas do líquido cefalorraquidiano são realizadas a partir da cisterna magna, em ratos anestesiados, sem a necessidade de incisão.
Os resultados aqui apresentados mostram que as células isoladas mantêm seu perfil endógeno e que as NSCs da ZEE preservam sua quiescência. O desnudamento da camada ependimária é restrito ao nível anatômico de injeção e o protocolo (liberação e coleta) é bem tolerado pelos animais. Esta nova abordagem abre caminho para a realização de estudos longitudinais de neurogênese endógena e gliogênese em animais experimentais.
Introdução
As células-tronco tecido-específicas são células parcialmente comprometidas que podem dar origem a todas as populações celulares que constituem os respectivos tecidos. Além de multipotentes, são células auto-renovadoras e cruciais para a manutenção da homeostase e da capacidade regenerativa dostecidos1. Algumas células-tronco tecido-específicas permanecem em um estado ativo e fortemente proliferativo, como células-tronco intestinais ou hematopoiéticas. Outras, como as células-tronco cerebrais, permanecem em grande parte quiescentes ou dormentes2. No cérebro adulto, as células-tronco neurais (NSCs) podem ser encontradas em áreas especializadas, muitas vezes chamadas de nichos. Duas dessas áreas bem descritas existem na zona subependimária (ZEE) dos ventrículos laterais e no giro denteado do hipocampo. O nicho SEZ gera o maior número de células, principalmente neuroblastos que migram em direção aos bulbos olfativos e contribuem para a população local de interneurônios; em contraste, os oligodendroblastos gerados migram para o corpo caloso adjacente (CC)3. As células progenitoras de oligodendrócitos (OPCs) são células mitoticamente ativas, amplamente distribuídas pelo sistema nervoso central, que: i) estão comprometidas com a linhagem oligodendroglial, ii) podem migrar para sítios de desmielinização e iii) podem se diferenciar em oligodendrócitos mielinizantes. OPCs também apresentam potencial de auto-renovação e quiescência4.
Até agora, o isolamento e o estudo de NSCs e OPCs exigiam a dissociação post-mortem do tecido cerebral e medular dissecado. Para contornar essa limitação experimental, estabelecemos um método que permite, pela primeira vez, o isolamento de NSCs e OPCs cerebrais de animais vivos. Chamamos esse método de "ordenha", porque ele permite várias coletas de células, pois seus pools não se esgotam. O protocolo foi desenvolvido em ratos, devido ao seu grande tamanho cerebral, visando principalmente a ZEE, ou CC, e inclui duas etapas principais. Primeiro, NSCs ou OPCs são "removidos" do tecido por meio da injeção i.c.v. de um "coquetel de liberação" contendo neuraminidase, uma toxina que induz desnudamento da parede ventricular, um anticorpo bloqueador de integrina-β1 e fator de crescimento de fibroblastos 2 (FGF2). O coquetel é injetado estereotaxicamente bilateralmente dentro dos ventrículos laterais. Se o uso pretendido for o isolamento de NSCs, áreas rostrais dos ventrículos laterais são alvo. Se o objetivo é isolar OPCs mais puramente, o coquetel é injetado caudalmente na área da fímbria hipocampal. Em uma segunda etapa de "coleta", biópsias líquidas do líquido cefalorraquidiano (LCR) são realizadas a partir da cisterna magna de ratos anestesiados, sem a necessidade de incisão. A biópsia líquida é misturada com meio de cultura NSC e pode ser mantida a 4 °C até o plaqueamento.
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Protocolo
Os procedimentos de criação, manutenção e experimentação de animais foram conduzidos de acordo com o UK Animals (Scientific Procedures) Act 1986, autorizado pelo Ministério do Interior, e com o Decreto Presidencial 56/2013 da República Helênica, examinados pelos Órgãos de Bem-Estar Animal e Revisão Ética das Universidades de Cambridge e Patras, bem como aprovados e examinados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Prefeitura local (número do protocolo: 5675/39/18-01-2021). Foram utilizados ratos machos e fêmeas da linhagem Sprague-Dawley, Wistar e Long-Evans, com idade variando entre 2 e 4 meses e peso corporal entre 150 g e 250 g. O protocolo está resumido graficamente na Figura 1.
1. Liberar o coquetel de preparação
OBS: Prepare fresco no dia do procedimento e mantenha no gelo. As quantidades são dadas por 2 μL a serem injetados i.c.v. em cada ventrículo lateral. Prepare mais 1 μL por injeção pretendida.
- Preparar 0,5 μL de neuraminidase 500 mU de Clostridium perfringens (Clostridium welchii).
NOTA: Conservar esta conserva em 1 U/μL diluída em água estéril a -20 °C. Outros tipos de neuraminidases não foram testados. - Preparar 1 μL contendo 1 μg de anticorpo bloqueador de integrina-β1.
NOTA: Conservar a 4 °C. - Preparar 0,5 μL contendo 0,5 μg de fator de crescimento básico de fibroblastos (FGF-básico humano recombinante).
NOTA: Conservar como uma reserva de 1 μg/μL diluída em água estéril a -20 °C.
2. Injeção de coquetel de liberação
NOTA: Todo o processo pode ser realizado dentro de 20 min. Tome o cuidado de realizar a cirurgia em condições assépticas. Limpe todas as superfícies com antisséptico (por exemplo, peróxido de hidrogênio a 3% ou 6%). Use ferramentas, luvas, aventais e campos autoclavados ou prontamente estéreis.
- Anestesiar o animal experimental por inalação de isoflurano (2,5% para indução e 2% para manutenção). Confirme a profundidade da anestesia verificando o reflexo corneano, a reação aos estímulos (teste de pinça dos membros posteriores e cauda) e o modo de respiração.
NOTA: Os procedimentos cirúrgicos podem ser realizados sob anestesia geral induzida por anestesia intraperitoneal injetável (por exemplo, cetamina [40 mg/kg] e xilazina [10 mg/kg]). A anestesia profunda foi confirmada pela verificação do reflexo corneano, da reação aos estímulos (teste de pinça dos membros posteriores e cauda) e do modo respiratório. - Administrar analgesia por via subcutânea (por exemplo, 0,3 mg/mL de buprenorfina) na indução anestésica.
- Monte o rato na estrutura estereotáxica.
- Raspe o pelo da cabeça com uma navalha e limpe a pele com antisséptico, como solução de iodopovidona a 10% e, em seguida, álcool. Aplique o antisséptico três vezes usando cotonetes estéreis. Esfregue em um movimento circular por 3-5 s de cada vez. Aplique pomada ocular para evitar o ressecamento.
- Faça uma incisão de 2 cm na pele da cabeça ao longo da linha média usando um bisturi estéril.
- Limpe meticulosamente o crânio usando cotonetes estéreis e soro fisiológico estéril.
- Identifique o bregma utilizando a borda da agulha de uma seringa Hamilton de 10 μL montada no dispositivo estereotáxico. Defina o bregma como "ponto 0,0".
OBS: O bregma é identificado como o ponto de intersecção entre as suturas sagital e coronal. Mais detalhes podem ser encontrados no atlas do cérebro de ratos de Paxinos e Watson5. - Deslocar o aparelho para as coordenadas anteroposterior (AP) = 0,3 mm, lateral (L) = +1,2 mm (para atingir a ZEE) ou AP = 1,5 mm, L = +2,0 mm (para atingir a CC).
- Faça um furo de rebarba de 1 mm usando uma broca dental.
NOTA: Ao perfurar manualmente, tome cuidado para não ferir a superfície cortical. Não se espera que a hemorragia seja considerável. Limpe qualquer sangue com soro fisiológico e aplique pressão para parar o sangramento mais persistente. - Coloque 4 μL do cocktail de libertação na seringa Hamilton de 10 μL.
- Abaixe a agulha (de preferência romba ou borda cônica) da seringa de Hamilton para entrar em contato com a dura-máter.
- Inserir a agulha na profundidade desejada (D = 3,5 mm).
NOTA: Despeje soro fisiológico na superfície da dura-máter para manter o tecido hidratado. - Infundir 2 μL do cocktail de libertação a uma taxa de 1 μL/min.
- Deixe a agulha no lugar por mais 2 minutos antes da recuperação lenta para evitar o surgimento do coquetel de liberação.
- Repita os passos 2,8-2,14 para o outro hemisfério nas coordenadas AP = 0,3 mm, L = -1,2 mm (para atingir a ZEE) ou AP = 1,5 mm, L = -2,0 mm (para atingir a CC).
- Sutura da incisão com náilon 5-0 (diâmetro 0,1 mm) e limpeza da área suturada com antisséptico.
- Retirar a máscara que fornece o anestésico e transferir o animal para a área de monitorização pós-operatória.
NOTA: A recuperação da anestesia e a manutenção da decúbito devem ocorrer dentro de 5-10 min, e a recuperação completa (comportamento normal) dentro de 25 min.- Monitore de perto a recuperação (movimento vívido e ininterrupto, acesso frequente à água) em um espaço bem aquecido (24-25 °C), silencioso, sem camas de partículas pequenas, que podem bloquear as vias aéreas. Devolva o animal à companhia de seus companheiros de gaiola (não a novos animais) somente após confirmar a recuperação completa.
- Monitorar o animal na instalação de manutenção por pelo menos 48 h após a cirurgia. Resolva os sinais de dor (ocultação da cabeça, postura anormal da cabeça ou do corpo, hipersensibilidade e hiperexcitabilidade ao manuseio) administrando analgesia (por exemplo, 0,3 mg/mL de buprenorfina, por via subcutânea). Encaminhe animais com pelos descoloridos ou erguidos ao veterinário responsável.
3. Biópsia líquida do líquido cefalorraquidiano (LCR)
NOTA: Todo o processo pode ser realizado dentro de 10 min. A biópsia líquida descrita aqui é realizada 3 dias após a injeção do coquetel de liberação, mas pode ser realizada exatamente da mesma maneira sempre que necessário. Tome o cuidado de realizar a cirurgia em condições assépticas. Limpe todas as superfícies com antisséptico (por exemplo, peróxido de hidrogênio a 3% ou 6%). Use ferramentas, luvas, aventais e campos autoclavados ou prontamente estéreis.
- Anestesiar o animal por inalação de isoflurano (2,5% para indução e 2% para manutenção). Confirme a profundidade da anestesia verificando a córnea
reflexo, a reação aos estímulos (teste da pinça dos membros posteriores e cauda) e o modo de respiração.
NOTA: Os procedimentos cirúrgicos podem ser realizados sob anestesia geral induzida por anestesia intraperitoneal injetável (por exemplo, cetamina [40 mg/kg] e xilazina [10 mg/kg]). No entanto, isso não é aconselhável, pois o procedimento é curto, especialmente se as biópsias forem realizadas várias vezes em dias consecutivos. - Administrar analgesia por via subcutânea (por exemplo, 0,3 mg/mL de buprenorfina) na indução anestésica.
- Monte o animal experimental sobre a estrutura estereotáxica. Use barras auriculares para fixar a cabeça sem obstruir o movimento rotacional em direção à frente e às costas.
- Estabilize a cabeça em um ângulo descendente de 40° para que uma boa extensão da parte de trás do pescoço possa ser alcançada.
Observação : uma maneira de fazer isso é usando a barra de boca do dispositivo6. - Raspe o pelo na área do pescoço usando uma navalha e limpe a pele com antisséptico, como solução de iodopovidona a 10% e, em seguida, álcool. Aplique o antisséptico três vezes usando cotonetes estéreis. Esfregue em um movimento circular por 3-5 s de cada vez.
- Com a ponta do dedo, encontrar a área depressível em forma de losango posicionada entre a protuberância occipital e a espinha do atlas6.
- Desenhe um ponto (por exemplo, usando um marcador).
- Fixe uma seringa de 1 ml ou 0,5 ml na estrutura estereotáxica.
OBS: É aconselhável o uso de seringas com agulhas não destacáveis, pois produzem melhor sucção e possuem menor volume morto. - Traga a agulha no ponto de contacto com a pele na marca pontual.
- Com um par de pinças, levante a pele enquanto abaixa a seringa através das camadas da pele.
- Recupere ligeiramente o êmbolo para gerar pressão negativa na seringa.
- Reinicie para mergulhar a agulha muito lentamente até que o líquido (LCR) apareça na seringa.
- Assente a agulha nesta posição e permita o fluxo lento do líquor.
NOTA: A agulha pode ser abaixada ou elevada ligeiramente se o fluxo do LCR for muito lento. - Iniciar a remoção lenta do líquor (em passos de 40 μL/min) até 120 μL.
- Recupere lentamente a seringa.
- Administrar intraperitonealmente 1 mL de soro normal para apoiar a reposição de fluidos do animal experimental.
- Misturar a biópsia líquida (LCR) com 400 μL de meio NSC e manter o tubo de microcentrífuga a 4 °C até nova utilização.
NOTA: As biópsias líquidas devem ser processadas dentro de 3 h se não forem congeladas. - Retirar a máscara que fornece o anestésico e transferir o animal para a área de monitoramento pós-operatório.
NOTA: A recuperação da anestesia e a manutenção da decúbito devem ocorrer dentro de 5-10 min, e a recuperação completa (comportamento normal) dentro de 25 min.- Monitore de perto a recuperação (movimento vívido e ininterrupto, acesso frequente à água) em um espaço bem aquecido (24-25 °C), silencioso, sem camas de partículas pequenas, que podem bloquear as vias aéreas. Devolva o animal à companhia de seus companheiros de gaiola (não a novos animais) somente após a recuperação total ter sido confirmada.
- Monitorar o animal na instalação de manutenção por pelo menos 48 h após a cirurgia. Se forem observados sinais de dor (ocultação da cabeça, postura anormal da cabeça ou do corpo, hipersensibilidade e hiperexcitabilidade ao manuseio), administrar analgesia (por exemplo, 0,3 mg/mL de buprenorfina por via subcutânea). Encaminhe animais com pelos descoloridos ou erguidos ao veterinário responsável.
4. Processamento de tecidos para imunofluorescência
- Eutanásia do animal por infusão intracárdica de 20 mL de solução salina gelada, seguida de 50 mL de paraformaldeído a 4% gelado (PFA; em solução salina tamponada com fosfato [PBS] de pH = 7,4).
- Dissecção do tecido cerebral.
- Separe a cabeça do corpo usando uma tesoura para fazer um corte na área cervical. Use a tesoura para remover a pele e, em seguida, corte o osso do crânio ao longo da linha média sagital, com as pontas da tesoura apontando para cima, a fim de não danificar o tecido cerebral. Procure continuar cortando o máximo possível, passando a linha média coronal.
- Use pinças para remover os ossos, começando pelos ossos supraoccipital e parietal e, finalmente, os ossos frontais.
- Uma vez que o tecido cerebral é revelado, use a pinça ou uma espátula para retirá-lo do crânio. Para facilitar isso, corte os nervos na base do cérebro e os bulbos olfativos, se não quiser.
- Pós-fixar o tecido durante a noite em PFA a 2% a 4 °C.
- Crio-proteger o tecido em sacarose a 30% (em PBS) por pelo menos 48 h a 4 °C até que o tecido afunde para o fundo.
- Congelar o tecido a -80 °C.
- Cortar o tecido cerebral em cortes coronais de 14 μm de espessura com um criostato.
- Realizar coloração por imunofluorescência utilizando protocolos padronizados 3,7
- Incubar os cortes com tampão de bloqueio (albumina de soro bovino a 3% [BSA], Triton X-100 a 0,1%, em PBS) por 2 h à temperatura ambiente.
- Realizar recuperação antigênica (fervura por 15 min em tampão citrato 10 mM, pH = 6,0, utilizando frascos de vidro).
NOTA: Esta etapa é opcional, mas necessária para antígenos nucleares. - Levar à temperatura ambiente e incubar com anticorpos primários contra proteína glial fibrilar ácida (GFAP), doublecortin (Dcx), S100β e β-catenina (ver Tabela de Materiais) em tampão de bloqueio durante a noite a 4 °C.
- Incubar durante 2 h com anticorpos secundários em PBS com 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para contramarcação nuclear à temperatura ambiente (ver Tabela de Materiais).
- Monte as lamínulas.
5. Processamento de células isoladas para imunofluorescência
- Placatear as células em placas de 96 poços compatíveis para microscopia, revestidas com poli-D-lisina (100 μg/mL).
- Fixar as células em PFA a 2% gelado por 10 min e lavar 3x com PBS.
- Realizar imunofluorescência usando procedimentos padrão3,7 para PDGFRα, GFAP, Dcx, SOX2 e ID3 (consulte a Tabela de Materiais).
- Manter as células em PBS + NaN3 (0,1%) a 4 °C no escuro.
6. Microscopia e análise de imagens
- Tire imagens usando epifluorescência ou microscopia confocal e realize contagens de células usando ferramentas padrão de software de análise de imagem, como contadores de células.
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Resultados
Lançamento e coleta de NSCs
As NSCs da ZEE são separadas do LCR apenas pela monocamada de células ependimárias, embora permaneçam em contato direto com o conteúdo ventricular por meio de processos monociliados intercalantes 8,9. A neuraminidase age especificamente nas células ependimárias via clivagem de resíduos de ácido siálico e pode induzir desnudamento da parede ventricular. Isso leva ao agrupamento de neuroblastos na su...
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Discussão
As células-tronco e progenitoras são relativamente esparsas no tecido cerebral de mamíferos. Além disso, os NSCs estão localizados em áreas inacessíveis para biópsias fáceis e seguras (paredes ventriculares, hipocampo). Portanto, a única maneira de trabalhar experimentalmente com essas células, até agora, tem sido seu isolamento post-mortem. Um método que permite a coleta única ou repetida de NSCs e OPCs de ratos vivos, denominado ordenha, é descrito passo a passo. O método baseia-se em duas características principais: i...
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Divulgações
Os autores não têm interesses financeiros concorrentes ou outros conflitos de interesse a declarar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por uma bolsa Action Medical Research (UK) (GN2291) para R.J.M.F. e I.K. O trabalho de pesquisa também foi parcialmente apoiado (custos de animais e apoio à D.D.) pela Fundação Helênica para Pesquisa e Inovação (H.F.R.I.) no âmbito da "Primeira Chamada para Projetos de Pesquisa H.F.R.I. para apoiar membros do corpo docente e pesquisadores e a aquisição de bolsa de equipamentos de pesquisa de alto custo" (Número do Projeto: 3395).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| lançamento forte | |||
| β Anticorpo bloqueador de 1-integrina | BD Biosciences | #555002 | purificado NA/LE Hamster Anti-Rato CD29 Clone Ha2/5, 1 mg/mL. Qualquer abntibody com atividade de bloqueio deve ser apropriado. |
| Neuraminidase de Clostridium perfringens (Clostridium welchii) | Sigma-Aldrich | #N2876 | Neuraminidases de outras fontes (por exemplo, de Vibrio cholerae) não foram testadas. |
| FGF-básico humano recombinante (154 a.a.) | Peprotech | #100-18B | mantido como 1 μ g/μ L estoque, diluído em água estéril a -20 &graus; C |
| Procedimentos cirúrgicos | |||
| 10 µ L Seringa | Hamilton | #80330 | Modelo 701 RN, Agulha Pequena Removível, calibre 26s, 2 pol., estilo de ponta 2 |
| BD Seringas de insulina Micro-finas de 1 mL | BD biosciences | 04085-00 | 29 G x 12.7 mm |
| BETADINE CUT. SOL 10% FLx30ML | LAVIPHARM-CASTALIA | SKU: | |
| Bupaq | RICHTERPHARMA | 1021854AF | 10 mL (buprenofina 0,3 mg/mL) |
| Digital Novo Padrão Estereotáxico, Ratos e Ratos | Sistema de Monitoramento | 51500D | |
| Aparelho Harvard | 55-7020 | ||
| ISOFLURINA 1.000 mg/g vapor de inalação, líquido | Vetpharma Animal Health | 32509/4031 | |
| Ketamidor | RICHTER PHARMA | SKU: | Cetamina 100 mg/mL |
| Sutura de nylon, Ethilon | Ethicon | D9635 | Transparente, tamanho 5-0 |
| Aparadores cirúrgicos sem fio recarregáveis | de armazenamento | : 51472 | |
| Lâminas de bisturi, estéreis | Swann Morton | AW050 | |
| Scopettes Jr. Cotonetes de 8 polegadas | Birchwood Laboratories | 34-7021-12P | |
| Broca Estereotáxica de Alta Velocidade | Foredom | 1474w/o1464 | |
| Stoelting' s Kit de Instrumentos Estereotáxicos | Item de armazenamento | : 52189 | |
| Xylan 2% | Chanelle Pharmaceuticals | 13764/03/19-5-2004 | Xilazina, 25 mL |
| Manuseio e imunocoloração de tecidos e células poços > | |||
| apropriadas para microscopia | Greiner | #655866 | Suplemento |
| de microplaca estrela de tela B27ThermoFisher Scientific | A1486701 | ||
| Albumina de soro bovino (BSA) | Merck | P06-1391100 | Fração V, choque térmico |
| Citrato | Merck | 71497 | Citrato de sódio monobásico |
| Criostato | Leica | CM1510S | |
| DAPI | Merck, Calbiochem | 28718-90-3 | Coloração nuclear, Diluição: 1/1.000 |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11995065 | Alto teor de glicose, piruvato |
| de burro anti-cabra | Biotium | 20016 ou 20106 ou 20048 | Diluição: 1/1.000 |
| burro anti-rato | Biotium | 20014 ou 20105 ou 20046 | Diluição: 1/1.000 |
| burro anti-coelho | Biotium | 20015 ou 20098 ou 20047 | Diluição: 1/1.000 |
| EGF | Peprotech | 315-09 | |
| FGF-2 (ou bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
| cabra anti-GFAP | Abcam ab53554 | Diluição: 1/500 | |
| cabra anti-SOX2 | Santa Cruz Biotecnology | sc-17320 | Diluição: 1/200 |
| camundongo anti-ID3 | Santa Cruz Biotecnology | sc-56712 | Diluição: 1/200 |
| camundongo anti-S100β | Sigma | S2532 | Diluição: 1/200 |
| Mowiol | Merck, Calbiochem | 475904 | Meio de montagem |
| suplemento N2 | ThermoFisher Scientific | 17502048 | |
| Parafolmadehyde | Merck | 158127 | |
| Poly-D-Lysine | Merck, Millipore | A-003-E | Solution, 1,0 mg / mL |
| de coelho anti-Doublecortin (DCX) | Abcam | ab18723 | Diluição: 1/500 |
| coelho anti-PDGFR&alfa; | Abcam | ab51875 | Diluição: 1/200 |
| coelho anti-β- catenina | Abcam | ab16051 | Diluição: 1/500 |
| Triton X-100 | Merck | X100 | |
| Microscopia e análise de imagem | |||
| Microscópio confocal | Leica | SP6 e SP8 | |
| Análise de imagem | NIH, EUA | Análise de imagem ImageJ | |
| Leica | LasX |
Referências
- Visvader, J. E., Clevers, H. Tissue-specific designs of stem cell hierarchies. Nature Cell Biology. 18 (4), 349-355 (2016).
- Dimitrakopoulos, D., Kakogiannis, D., Kazanis, I. Heterogeneity of quiescent and active neural stem cells in the postnatal brain. The International Journal of Developmental Biology. 66 (1-2-3), 51-58 (2022).
- Kazanis, I., et al. Subependymal zone-derived oligodendroblasts respond to focal demyelination but fail to generate myelin in young and aged mice. Stem Cell Reports. 8 (3), 685-700 (2017).
- Franklin, R. J. M., Ffrench-Constant, C. Regenerating CNS myelin-from mechanisms to experimental medicines. Nature Reviews. Neuroscience. 18 (12), 753-769 (2017).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 7th Edition. , Available from: https://www.elsevier.com/books/the-rat-brain-in-stereotaxic-coordinates/paxinos/978-0-12-391949-6 (2013).
- Pegg, C. C., He, C., Stroink, A. R., Kattner, K. A., Wang, C. X. Technique for collection of cerebrospinal fluid from the cisterna magna in rat. Journal of Neuroscience Methods. 187 (1), 8-12 (2010).
- McClenahan, F., et al. Isolation of neural stem and oligodendrocyte progenitor cells from the brain of live rats. Stem Cell Reports. 16 (10), 2534-2547 (2021).
- Doetsch, F., García-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Regeneration of a germinal layer in the adult mammalian brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (20), 11619-11624 (1999).
- Doetsch, F., Petreanu, L., Caille, I., Garcia-Verdugo, J. -M., Alvarez-Buylla, A. EGF converts transit-amplifying neurogenic precursors in the adult brain into multipotent stem cells. Neuron. 36 (6), 1021-1034 (2002).
- Del Carmen Gómez-Roldán, M., et al. Neuroblast proliferation on the surface of the adult rat striatal wall after focal ependymal loss by intracerebroventricular injection of neuraminidase. The Journal of Comparative Neurology. 507 (4), 1571-1587 (2008).
- Luo, J., Shook, B. A., Daniels, S. B., Conover, J. C. Subventricular zone-mediated ependyma repair in the adult mammalian brain. The Journal of Neuroscience. 28 (14), 3804-3813 (2008).
- Kazanis, I., et al. Quiescence and activation of stem and precursor cell populations in the subependymal zone of the mammalian brain are associated with distinct cellular and extracellular matrix signals. The Journal of Neuroscience. 30 (29), 9771-9781 (2010).
- Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain. Cell Stem Cell. 3 (3), 265-278 (2008).
- Calzolari, F., et al. Fast clonal expansion and limited neural stem cell self-renewal in the adult subependymal zone. Nature Neuroscience. 18 (4), 490-492 (2015).
- Douet, V., Kerever, A., Arikawa-Hirasawa, E., Mercier, F. Fractone-heparan sulphates mediate FGF-2 stimulation of cell proliferation in the adult subventricular zone. Cell Proliferation. 46 (2), 137-145 (2013).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Obernier, K., et al. Adult neurogenesis is sustained by symmetric self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 22 (2), 221-234 (2018).
- Delgado, A. C., et al. Release of stem cells from quiescence reveals gliogenic domains in the adult mouse brain. Science. 372 (6547), 1205-1209 (2021).
- Kalamakis, G., et al. Quiescence modulates stem cell maintenance and regenerative capacity in the aging brain. Cell. 176 (6), 1407-1419 (2019).
- Llorens-Bobadilla, E., et al. Single-cell transcriptomics reveals a population of dormant neural stem cells that become activated upon brain injury. Cell Stem Cell. 17 (3), 329-340 (2015).
- Gajera, C. R., et al. LRP2 in ependymal cells regulates BMP signaling in the adult neurogenic niche. Journal of Cell Science. 123 (11), 1922-1930 (2010).
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