Summary
En metode for isolering av nevrale stamceller og oligodendrocytt-stamceller fra hjernen til levende rotter presenteres her i eksperimentell detalj. Det tillater flere samlinger av disse cellene fra de samme dyrene uten at det går ut over deres velvære.
Abstract
Vevsspesifikke nevrale stamceller (NSC) forblir aktive i pattedyrs postnatale hjerne. De bor i spesialiserte nisjer, hvor de genererer nye nevroner og glia. En slik nisje er den subependymale sonen (SEZ; også kalt ventrikulær-subventrikulær sone), som ligger over sideveggene i sideventriklene, ved siden av det ependymale cellelaget. Oligodendrocytt stamceller (OPCs) er rikelig fordelt over hele sentralnervesystemet, og utgjør et basseng av proliferative stamceller som kan generere oligodendrocytter.
Både NSC-er og OPC-er viser potensial for selvfornyelse og hvile-/aktiveringssykluser. På grunn av deres plassering utføres isolasjonen og eksperimentell undersøkelse av disse cellene postmortem. Her beskriver vi i detalj "hjernemelking", en metode for isolering av blant annet NSC og OPC fra levende dyr. Dette er en to-trinns protokoll designet for bruk hos gnagere og testet på rotter. Først blir celler "frigjort" fra vevet via stereotaksisk intracerebroventrikulær (i.c.v.) injeksjon av en "frigjøringscocktail". Hovedkomponentene er neuraminidase, som retter seg mot ependymale celler og induserer ventrikkelveggdenudasjon, et integrin-β1-blokkerende antistoff og fibroblastvekstfaktor-2. Ved et andre "samling" -trinn utføres flytende biopsier av cerebrospinalvæske fra cisterna magna, i bedøvede rotter uten behov for snitt.
Resultatene som presenteres her viser at isolerte celler beholder sin endogene profil og at NSCs av SEZ bevarer sin ro. Denudasjonen av det ependymale laget er begrenset til det anatomiske injeksjonsnivået, og protokollen (frigjøring og oppsamling) tolereres godt av dyrene. Denne nye tilnærmingen baner vei for å utføre longitudinelle studier av endogen neurogenese og gliogenese hos forsøksdyr.
Introduction
Vevsspesifikke stamceller er delvis engasjerte celler som kan gi opphav til alle cellepopulasjoner som utgjør de respektive vevene. Bortsett fra å være multipotente, er de selvfornyende celler og avgjørende for å opprettholde homeostase og regenerativ kapasitet av vev1. Noen vevsspesifikke stamceller forblir i en aktiv, sterkt proliferativ tilstand, for eksempel intestinale eller hematopoietiske stamceller. Andre, som hjernestamceller, forblir stort sett hvilende eller sovende2. I den voksne hjernen kan nevrale stamceller (NSC) finnes i spesialiserte områder, ofte kalt nisjer. To slike godt beskrevne områder finnes i subependymal sone (SEZ) i laterale ventrikler og i dentate gyrus i hippocampus. SEZ-nisjen genererer det høyeste antall celler, primært neuroblaster som migrerer mot olfaktoriske pærer og bidrar til den lokale interneuronpopulasjonen; I motsetning til dette migrerer genererte oligodendroblaster til det tilstøtende corpus callosum (CC)3. Oligodendrocytt-stamceller (OPCer) er mitotisk aktive celler, utbredt i hele sentralnervesystemet, som: i) er forpliktet til oligodendrogliallinjen, ii) kan migrere til demyeliniseringssteder, og iii) kan differensiere til myeliniserende oligodendrocytter. OPC-er viser også selvfornyelsespotensial og ro4.
Inntil nå har isolasjonen og studien av NSCs og OPCs krevd postmortem dissosiasjon av dissekert hjerne og ryggmargsvev. For å omgå denne eksperimentelle begrensningen etablerte vi en metode som for første gang tillater isolering av hjerne-NSC og OPC-er fra levende dyr. Vi kaller denne metoden "melking", fordi den muliggjør flere samlinger av celler ettersom bassengene deres ikke er utarmet. Protokollen ble utviklet hos rotter, på grunn av deres store hjernestørrelse, hovedsakelig rettet mot SEZ, eller CC, og inkluderer to hovedtrinn. Først blir NSC eller OPCs "fjernet" fra vevet via i.c.v. injeksjon av en "frigjøringscocktail" som inneholder neuraminidase, et toksin som induserer ventrikkelveggdenudasjon, et integrin-β1-blokkerende antistoff og fibroblastvekstfaktor 2 (FGF2). Cocktailen injiseres stereotaktisk bilateralt i laterale ventrikler. Hvis den tiltenkte bruken er isolering av NSC, er rostrale områder av laterale ventrikler målrettet. Hvis målet er å isolere OPC-er renere, injiseres cocktailen kaudalt i hippocampus-fimbriaområdet. Ved et andre "samling" -trinn utføres flytende biopsier av cerebrospinalvæske (CSF) fra cisterna magna av bedøvede rotter, uten behov for et snitt. Den flytende biopsien blandes med NSC-dyrkningsmedium og kan oppbevares ved 4 °C til plettering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreavl, vedlikehold og eksperimentelle prosedyrer ble utført i samsvar med UK Animals (Scientific Procedures) Act 1986, autorisert av innenriksdepartementet, og med presidentdekretet 56/2013 fra den hellenske republikken, gransket av dyrevelferds- og etiske gjennomgangsorganer ved universitetene i Cambridge og Patras, samt godkjent og gransket av den lokale Prefectural Animal Care and Use Committee (protokollnummer: 5675/39/18-01-2021). Mannlige og kvinnelige Sprague-Dawley-, Wistar- og Long-Evans-rotter, med aldre som varierer mellom 2 og 4 måneder og med kroppsvekt mellom 150 g og 250 g, ble brukt. Protokollen er grafisk oppsummert i figur 1.
1. Slipp cocktailforberedelse
MERK: Forbered deg frisk på dagen for prosedyren og hold på is. Mengdene angis per 2 μL som injiseres i.c.v. i hver laterale ventrikkel. Klargjør ytterligere 1 μL per tiltenkt injeksjon.
- Tilbered 0,5 μL 500 mU neuraminidase fra Clostridium perfringens (Clostridium welchii).
MERK: Oppbevar dette som en 1 E/μL-bestand fortynnet i sterilt vann ved -20 °C. Andre typer neuraminidaser har ikke blitt testet. - Klargjør 1 μL inneholdende 1 μg integrin-β1-blokkerende antistoff.
MERK: Oppbevares ved 4 °C. - Forbered 0,5 μL inneholdende 0,5 μg basisk fibroblastvekstfaktor (rekombinant human FGF-basisk).
MERK: Oppbevar den som en 1 μg/μL bestand fortynnet i sterilt vann ved -20 °C.
2. Injeksjon av frigjøringscocktail
MERK: Hele prosessen kan utføres innen 20 minutter. Pass på å utføre operasjonen under aseptiske forhold. Rengjør alle overflater med antiseptisk middel (f.eks. 3 % eller 6 % hydrogenperoksid). Bruk autoklaverte eller lett sterile verktøy, hansker, kjoler og gardiner.
- Bedøv forsøksdyret ved inhalasjon av isofluran (2,5 % ved induksjon og 2 % for vedlikehold). Bekreft dybden av anestesi ved å sjekke hornhinnerefleksen, reaksjonen på stimuli (bakre lem og hale klemme test) og pustemodus.
MERK: Kirurgiske prosedyrer kan utføres under generell anestesi indusert av intraperitonealt injiserbar anestesi (f.eks. ketamin [40 mg / kg] og xylazin [10 mg / kg]). Dyp anestesi ble bekreftet ved å sjekke hornhinnerefleksen, reaksjonen på stimuli (baklem og haleklemmetest) og pustemåten. - Administrer analgesi subkutant (f.eks. 0,3 mg/ml buprenorfin) ved innledning av anestesi.
- Monter rotta på den stereotaksiske rammen.
- Barber pelsen på hodet med en barberhøvel og rengjør huden med antiseptisk, for eksempel 10% povidon-jodoppløsning og deretter alkohol. Påfør antiseptisk tre ganger ved hjelp av sterile bomullspinner. Gni inn en sirkulær bevegelse i 3-5 s hver gang. Påfør øyesalve for å forhindre tørrhet.
- Lag et 2 cm snitt i hodets hud langs midtlinjen ved hjelp av en steril skalpell.
- Fjern skallen omhyggelig ved hjelp av sterile vattpinner og sterilt saltvann.
- Identifiser bregmaen ved hjelp av kanten av nålen på en 10 μL Hamilton sprøyte montert på den stereotaktiske enheten. Sett bregma som "punkt 0,0".
MERK: Bregma er identifisert som skjæringspunktet mellom sagittal og koronal suturer. Flere detaljer finner du i rottehjerneatlaset til Paxinos og Watson5. - Flytt enheten til koordinatene anterioposterior (AP) = 0,3 mm, lateral (L) = +1,2 mm (for å målrette SEZ), eller AP = 1,5 mm, L = +2,0 mm (for å målrette CC).
- Bor et 1 mm burrhull ved hjelp av en tannbor.
MERK: Når du borer for hånd, må du passe på at du ikke skader den kortikale overflaten. Blødningen forventes ikke å være betydelig. Fjern blod med saltvann og trykk for å stoppe mer vedvarende blødning. - Load 4 μL av frigjøringscocktailen i 10 μL Hamilton sprøyten.
- Senk nålen (helst stump eller konisk kant) på Hamilton sprøyten for å komme i kontakt med duraen.
- Stikk kanylen i ønsket dybde (D = 3,5 mm).
MERK: Hell saltvann på overflaten av dura for å holde vevet hydrert. - Tilsett 2 μL av frigjøringscocktailen med en hastighet på 1 μL / min.
- La kanylen være på plass i ytterligere 2 minutter før langsom henting for å unngå overflate av utløsercocktailen.
- Gjenta trinn 2,8-2,14 for den andre halvkule ved koordinatene AP = 0,3 mm, L = -1,2 mm (for å målrette SEZ), eller AP = 1,5 mm, L = -2,0 mm (for å målrette CC).
- Sutur snittet med 5-0 nylon (diameter 0,1 mm) og rengjør det suturerte området med antiseptisk middel.
- Fjern masken som forsyner bedøvelsen og overfør dyret til overvåkingsområdet etter operasjonen.
MERK: Gjenoppretting fra anestesi og vedlikehold av liggende bør skje innen 5-10 minutter, og full gjenoppretting (normal oppførsel) innen 25 minutter.- Overvåk restitusjonen nøye (levende og uavbrutt bevegelse, hyppig tilgang til vann) i et godt oppvarmet (24-25 °C), stille rom uten sengetøy med små partikler, som kan blokkere luftveiene. Returner dyret til selskapet av burkameratene (ikke til nye dyr) først etter å ha bekreftet full gjenoppretting.
- Overvåk dyret på vedlikeholdsanlegget i minst 48 timer etter operasjonen. Behandle tegn på smerte (skjuling av hode, unormal hode- eller kroppsstilling, overfølsomhet og hyperexcitability til håndtering) ved å administrere analgesi (f.eks. 0,3 mg/ml buprenorfin, subkutant). Henvis dyr med misfarget eller oppreist pels til ansvarlig veterinær.
3. Cerebrospinalvæske (CSF) flytende biopsi
MERK: Hele prosessen kan utføres innen 10 minutter. Den flytende biopsien beskrevet her utføres 3 dager etter injeksjon av frigjøringscocktailen, men kan utføres på nøyaktig samme måte når det er nødvendig. Pass på å utføre operasjonen under aseptiske forhold. Rengjør alle overflater med antiseptisk middel (f.eks. 3 % eller 6 % hydrogenperoksid). Bruk autoklaverte eller lett sterile verktøy, hansker, kjoler og gardiner.
- Bedøv dyret ved innånding av ofluran (2,5% for induksjon og 2% for vedlikehold). Bekreft dybden av anestesi ved å sjekke hornhinnen
refleks, reaksjonen på stimuli (bakre lem og hale klemme test), og pustemåten.
MERK: De kirurgiske prosedyrene kan utføres under generell anestesi indusert av intraperitonealt injiserbar anestesi (f.eks. Ketamin [40 mg / kg] og xylazin [10 mg / kg]). Dette er imidlertid ikke tilrådelig da prosedyren er kort, spesielt hvis biopsier vil bli utført flere ganger på påfølgende dager. - Administrer analgesi subkutant (f.eks. 0,3 mg/ml buprenorfin) ved innledning av anestesi.
- Monter forsøksdyret på den stereotaksiske rammen. Bruk ørestenger for å feste hodet uten å hindre rotasjonsbevegelse mot forsiden og baksiden.
- Stabiliser hodet i en nedadgående 40° vinkel slik at en god forlengelse av baksiden av nakken kan oppnås.
MERK: En måte å gjøre dette på er å bruke munnstangen på enheten6. - Barber pelsen i nakkeområdet ved hjelp av en barberhøvel og rengjør huden med antiseptisk middel, for eksempel 10% povidon-jodoppløsning og deretter alkohol. Påfør antiseptisk tre ganger ved hjelp av sterile bomullspinner. Gni inn en sirkulær bevegelse i 3-5 s hver gang.
- Med fingertuppen finner du det rombformede depressible området plassert mellom oksipitalt fremspring og ryggraden til atlas6.
- Tegn et punktmerke (f.eks. ved hjelp av en markør).
- Fest en sprøyte på 1 ml eller 0,5 ml på den stereotaksiske rammen.
MERK: Det anbefales å bruke sprøyter med ikke-avtakbare nåler, da de gir bedre sug og har mindre dødvolum. - Før nålen i kontakt med huden ved punktmerket.
- Løft huden med en tang mens du senker sprøyten gjennom hudlagene.
- Trekk stempelet litt for å generere undertrykk i sprøyten.
- Start kanylen svært sakte på nytt til væske (CSF) kommer til syne i sprøyten.
- Sett nålen i denne posisjonen og tillat den langsomme strømmen av CSF.
MERK: Nålen kan senkes eller forhøyes litt hvis CSF-strømmen er svært langsom. - Begynn å fjerne CSF sakte (i trinn på 40 μL/min) opp til 120 μL.
- Trekk sprøyten langsomt.
- Intraperitonealt administrer 1 ml normalt serum for å støtte det eksperimentelle dyrets påfylling av væsker.
- Bland væskebiopsien (CSF) med 400 mikroliter NSC-medium og hold mikrosentrifugerøret ved 4 °C inntil videre bruk.
MERK: Flytende biopsier skal behandles innen 3 timer hvis de ikke fryses. - Fjern masken som leverer bedøvelsen og overfør dyret til overvåkingsområdet etter operasjonen.
MERK: Gjenoppretting fra anestesi og vedlikehold av liggende bør skje innen 5-10 minutter, og full gjenoppretting (normal oppførsel) innen 25 minutter.- Overvåk restitusjonen nøye (levende og uavbrutt bevegelse, hyppig tilgang til vann) i et godt oppvarmet (24-25 °C), stille rom uten sengetøy med små partikler, som kan blokkere luftveiene. Returner dyret til selskapet av burkameratene (ikke til nye dyr) først etter at full gjenoppretting er bekreftet.
- Overvåk dyret på vedlikeholdsanlegget i minst 48 timer etter operasjonen. Hvis tegn på smerte (skjuler hode, unormal hode- eller kroppsstilling, overfølsomhet og hyperexcitability for håndtering) observeres, administrer analgesi (f.eks. 0,3 mg/ml buprenorfin subkutant). Henvis dyr med misfarget eller oppreist pels til ansvarlig veterinær.
4. Behandling av vev for immunfluorescens
- Avlive dyret ved intrakardial infusjon av 20 ml iskaldt saltvann, etterfulgt av 50 ml iskaldt 4% paraformaldehyd (PFA; i fosfatbufret saltvann [PBS] av pH = 7,4).
- Dissekere hjernevævet.
- Separat hodet fra kroppen ved hjelp av saks for å lage et kutt i livmorhalsområdet. Bruk saksen til å fjerne huden og kutt deretter hodeskallens bein langs den sagittale midtlinjen, med saksens spisser pekende oppover for ikke å skade hjernevevet. Målet er å fortsette å kutte så mye som mulig, passere koronal midtlinje.
- Bruk tang for å fjerne beinene, fra supraoccipital og parietalbenene og til slutt frontbenene.
- Når hjernevevet er avslørt, bruk tangen eller en slikkepott for å løfte den ut av skallen. For å lette dette, kutt nerver i bunnen av hjernen og olfaktoriske pærer, hvis ikke ønsket.
- Etterfiks vevet over natten i 2 % PFA ved 4 °C.
- Kryobeskytt vevet i 30 % sukrose (i PBS) i minst 48 timer ved 4 °C til vevet synker til bunnen.
- Frys ned vevet ved -80 °C.
- Klipp hjernevævet i 14 μm tykke koronale seksjoner med en kryostat.
- Utfør immunfluorescensfarging ved bruk av standardprotokoller 3,7
- Inkuber seksjonene med blokkerende buffer (3% bovint serumalbumin [BSA], 0,1% Triton X-100, i PBS) i 2 timer ved romtemperatur.
- Utfør antigenuthenting (koking i 15 minutter i 10 mM citratbuffer, pH = 6,0, ved bruk av glasskrukker).
MERK: Dette trinnet er valgfritt, men nødvendig for kjernefysiske antigener. - Bring til romtemperatur og inkuber med primære antistoffer mot glialfibrillært surt protein (GFAP), dobbeltkortin (Dcx), S100β og β-catenin (se materialtabellen) i blokkeringsbuffer over natten ved 4 °C.
- Inkuber i 2 timer med sekundære antistoffer i PBS med 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) for nukleær motfarging ved romtemperatur (se materialtabellen).
- Monter dekslene.
5. Behandling av isolerte celler for immunfluorescens
- Plate cellene i 96-brønnplater kompatible for mikroskopi, belagt med poly-D-lysin (100 μg / ml).
- Fest cellene i iskald 2% PFA i 10 min og vask 3x med PBS.
- Utfør immunfluorescens ved hjelp av standard prosedyrer3,7 for PDGFRα, GFAP, Dcx, SOX2 og ID3 (se materialfortegnelsen).
- Hold cellene i PBS + NaN3 (0,1%) ved 4 °C i mørket.
6. Mikroskopi og bildeanalyse
- Ta bilder ved hjelp av epifluorescens eller konfokalmikroskopi og utfør celletellinger ved hjelp av standard programvareverktøy for bildeanalyse, for eksempel celletellere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utgivelse og innsamling av NSC-er
NSC av SEZ er skilt fra CSF bare av monolaget av ependymale celler, selv om de forblir i direkte kontakt med ventrikkelinnholdet via interkalerende mono-cilierte prosesser 8,9. Neuraminidase virker spesifikt på ependymale celler via spaltning av sialinsyrerester og kan indusere denudasjon av ventrikkelveggen. Dette fører til nevroblastklynger på overflaten av ventrikkelen10,11. Videre er det observert en strøm av neuroblaster i cerebrospinalvæsken etter i.c.v.-injeksjon av et integrin-β1-blokkerende antistoff, sannsynligvis på grunn av løsning av de inter-ependymale celleovergangene12. Disse observasjonene har ført til utviklingen av en protokoll som muliggjør isolering av hjernens stam- og stamceller via kontrollert kompromiss av integriteten til lateral ventrikkelens vegger. I et første trinn induseres frigjøringen fra parenkymet og den påfølgende strømmen av NSC eller OPC-er inne i CSF via i.c.v. injeksjon av frigjøringscocktailen. Cocktailen injiseres stereotaktisk med en hastighet på 1 μL/min, bilateralt (2 μL per injeksjon) i laterale ventrikler (koordinater rettet mot SEZ NSC: AP = 0,3 mm, L = ± 1,2 mm, D = 3,5 mm; koordinater rettet mot CC OPCer: AP = 1,5 mm, L = ± 2 mm, D = 3,5 mm). Det andre ("samling") trinnet innebærer utførelse av CSF flytende biopsier fra cisterna magna. Rottene må bedøves og biopsien kan gjøres med 1 ml sprøyter. Bruken av den stereotaksiske enheten tillater nesten fullstendig suksess i å hente ca. 100 μL CSF, uten behov for snitt. Den flytende biopsien tilsettes isdyrkningsmedium og holdes ved 4 °C til plating i <3 timer (NSC-kulturmedium inneholder Dulbeccos modifiserte ørnemedium [DMEM], B27-tilskudd [2%], N2-tilskudd [1%], FGF2 [20 ng / ml] og epidermal vekstfaktor [EGF; 20 ng / ml]).
Histologisk vurdering av det periventrikulære området etter injeksjon av frigjøringscocktailen
En første kohort av eksperimenter viste at ved injeksjon av mer enn 3 μL væske, kunne ventriklene bli skadet på grunn av ikke-spesifikk, mekanisk skade (figur 2B,C). Den langsomme injeksjonen av 2 μL frigjøringscocktail førte til fremveksten av klynger av Dcx-immunopositive neuroblaster på ventrikkeloverflaten. Disse hopene forble synlige selv 8 måneder etter injeksjon (figur 2D). Siden metoden var ment for longitudinelle studier, med sikte på langtidsoppfølging av dyrene, ble vevsskadene forårsaket av frigjøringscocktailen vurdert. Immunfarging ble utført på 14 μm tykke kryostathjerneseksjoner for ependymale cellemarkører, slik som S100β og β-catenin13, og den totale integriteten til ependymallaget ble vurdert. Steder for denudasjon av det ependymale laget var tilstede bare nær det rostrokaudale nivået av injeksjonene, med en gradvis nedgang i ependymale lagforstyrrelser oppdaget i mer bakre og mer fremre områder av SEZ (figur 2E,F) og ble fraværende etter en avstand på ±2 mm fra injeksjonsstedet. De ovennevnte resultatene viser at den delvise denudasjonen av ependymallaget forårsaket av i.c.v. injeksjon av frigjøringscocktailen er fokal, begrenset i nærheten av injeksjonsstedet, og etterlater resten av det periventrikulære ependymale laget intakt.
Markørprofil og in vitro-oppførsel av innsamlede celler
Deretter ble in vitro-oppførselen og markørprofilen til cellene isolert via melkeprotokollen vurdert. Gjennomsnittlig celleutbytte for hver flytende biopsi er ca. 300 ± 45 celler (per biopsi på 100 μL)7. Melkebiopsier resulterte i NSC-kulturer med gjennomsnittlig 3,17 ± passasjepotensial på 0,45. Celler isolert fra saltvannsinjiserte rotter kunne passeres i gjennomsnitt 1,92 ± 0,76 ganger; Derimot nådde de som ble isolert via melking til og med ni passasjer (p = 0,038, t-test) (figur 3A)7. Den gjennomsnittlige passeringskapasiteten til standard post mortem, SEZ-avledede nevrosfærekulturer er høyere enn 12 passasjer i våre hender. Fordi in vivo-ekspansjonspotensialet til SEZ NSC, som avslørt av in vivo celleskjebnekartleggingseksperimenter14, har vist seg å være begrenset, produserer melking celler med signifikant forskjellig in vitro-oppførsel enn celler i standardkulturer, om enn mye nærmere oppførselen til endogene NSC. Innsamlede celler ble belagt på poly-D-lysinbelagte brønner, hvor de vokste både som adherente monolag og sjeldnere som nevrosfærer (figur 3B). Ferskt isolerte celler (samlet 3 dager etter injeksjon og fiksert 24 timer etter plating) som var immunpositive for astrogliamarkøren GFAP var også immunpositive for ID3, en markør for hvile, og hadde karakteristikken for NSC bipolar morfologi (figur 3C). Videre, som rapportert tidligere7, viste en mer detaljert immunocytokjemisk sammenligning av biopsi-avledede celler og av postmortem-avledede celler fra de samme dyrene, 3 dager etter injeksjon (på jakt etter GFAP+ astrocytter, Dcx + neuroblaster, PDGFRa + oligodendrocytprogenitorer og SOX2 + celler i nevrale avstamning) at profilen til innsamlede celler var lik profilen til endogene SEZ-celler (figur 3D). Spesielt når biopsi- og vevsavledede celler ble sammenlignet under forskjellige forhold (f.eks. injeksjon av en frigjøringscocktail med og uten FGF2), ble det funnet at vekstfaktoren resulterte i en samtidig og signifikant økning i tilstedeværelsen av SOX2 + -celler, samt i en signifikant reduksjon i tilstedeværelsen av Dcx + neuroblaster i begge prøvene (figur 3D). Disse dataene bekreftet at eventuelle endringer som forekommer i profilen til endogene populasjoner av NSC, gjenspeiles i melkegenererte celleprøver.
Figur 1: Grafisk oppsummering av melking. En koronal seksjon av en hjernehalvdel med de viktigste anatomiske landemerkene (lateral ventrikkel, overliggende corpus callosum, og fremre commissure nedenfor [hvite substanskanaler i grått], og subependymal sone ved sideveggene [i blått]). Frigjøringscocktailen injiseres i lateral ventrikkel, noe som fører til kompromittering av vevets integritet og frigjøring av postnatale hjernenevrale stamceller i cerebrospinalvæsken, hvorfra de kan hentes via flytende biopsier. Forkortelser: SEZ = subependymal sone; LV = lateral ventrikel; CSF = cerebrospinalvæske; pbNSCs = postnatale hjernenevrale stamceller; β1-int = beta1 integrin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Histologisk vurdering av effekten av i.c.v. injeksjoner. (A-D) Bilder med lav forstørrelse av den dorsale halvdelen av lateral ventrikkel etter immunfarging for Dcx (i rødt, for å markere nevroblaster). (A) Den enkle innsetting av en Hamilton sprøyte forstyrrer ikke cytoarkitekturen til SEZ, mens i.c.v. injeksjon av 10 ml (infusjonshastighet på 1 ml/min) fører til alvorlig skade på ventrikkelveggen uavhengig av innholdet. (B) saltvann og (C) slipper cocktail. (D) Injeksjonen av 2 μL av frigjøringscocktailen fører til en kontrollert kompromittering av ventrikkelveggen, observert selv 8 måneder etter operasjonen. Detaljer om høyere forstørrelse av veggen til SEZ ved 7 og 14 dager etter injeksjon er vist i henholdsvis (E) og (F). Det er en uorganisert struktur, med Dcx + neuroblaster (i grønt) hviler på overflaten av veggen og de andre cellene i nisje (Sox2 +, i hvitt) hviler dypere. Det periventrikulære vevet er skadet på rostrokaudalt nivå av injeksjonen ved 2 måneders tidspunkt (i G), mens vevet er intakt på et mer kaudalt nivå (i H) i samme dyr. Ventrikkelveggen vurderes ved immunfarging for ependymale markører S100β og β-catenin. Detaljer om den typiske arkitekturen til veggen er vist i (I). Nukleær farging utføres ved hjelp av DAPI (vist i blått). Skalastenger = 300 μm (A-C,G,H, innsats), 150 μm (D), 30 μm (E,F) og 50 μm (I). Denne figuren er modifisert fra McClenahan et al.13. Forkortelser: SEZ = subependymal sone; i.c.v = intracerebroventrikulær; Dcx = dobbeltkortin; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Vurdering av cellene isolert via melking. (A) Graf som viser maksimalt antall passasjer oppnådd per flytende biopsiprøve fra saltvannsinjiserte dyr (grå søyler, totalt 12 prøver), eller etter melking (svarte striper, totalt 29 prøver, frigjøringscocktail med neuraminidase og integrin-β1-blokkerende antistoff). (B) Representativt konfokalmikroskopibilde av primærceller tatt ved melking, 3 dager etter injeksjon, immunfarget mot GFAP og ID3. (C,D) Brightfield-bilder av celler isolert 3 dager etter injeksjon, belagt på poly-D-lysinbelagte brønner og tillatt å vokse i NSC-spredningsmedium i 7 dager. (E) Graf som viser celletypeprofilen til celler isolert via melking av SEZ og av den endogene populasjonen av SEZ NSCs fra de samme forsøksdyrene. SOX2+- og Dcx+-fraksjonene ble henholdsvis signifikant økt og redusert etter samtidig injeksjon av FGF2. (Enveis ANOVA-analyse per markør, etterfulgt av post hoc-analyse; n = 4-6 dyr per forsøksgruppe.) Skalastenger = 100 μm (C,D) og 10 μm (B). Denne figuren er modifisert fra McClenahan et al.13. Forkortelser: SEZ = subependymal sone; DPI = dager etter injeksjon; NSC = nevrale stamceller; Dcx = dobbeltkortin; GFAP = glialfibrillært surt protein. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Stam- og stamceller er relativt sparsomme i pattedyrs hjernevev. I tillegg er NSC lokalisert i områder utilgjengelige for enkle og sikre biopsier (ventrikulære vegger, hippocampus). Derfor har den eneste måten å jobbe eksperimentelt med slike celler, så langt, vært deres post mortem-isolasjon. En metode som tillater enkel eller gjentatt innsamling av NSC og OPC fra levende rotter, kalt melking, beskrives her trinn for trinn. Metoden er basert på to hovedtrekk: i) NSC eller OPCs er separert av det ependymale cellemonolaget fra CSF, som strømmer innenfor hjernens ventrikulære system; ii) Ependymale celler og nevrale forfedre beholder kontakten mellom dem og med andre nærliggende celletyper via integriner. Derfor inneholder frigjøringscocktailen injisert i bestemte områder av ventriklene for å muliggjøre frigjøring av NSC, eller OPCer, fra hjerneparenkymet neuraminidase, et toksin som spesifikt retter seg mot og dreper ependymale celler10,11, og et integrin-β1-blokkerende antistoff. Den inneholder også FGF2, da denne vekstfaktoren er avgjørende for overlevelse og vedlikehold av NSC i nisjen og i kultur15,16. Det ertidligere vist 7 at denne protokollen tolereres godt av dyrene; I denne rapporten bekreftes det videre at skaden på ependymale celler, indusert av frigjøringscocktailen som en forutsetning for frigjøring av NSC/OPC i CSF, er begrenset rundt det rostrokaudale nivået av injeksjonen. Dette har vært av sentral betydning, siden protokollen skal bevare hjernens homeostatiske funksjon, inkludert selve stamcellenisjen, og ikke skal kompromittere dyrenes langsiktige velvære. Den stereotaktiske injeksjonen av frigjøringscocktailen er av mild alvorlighetsgrad og har aldri resultert i døden. Videre er utførelsen av flytende biopsier fra cisterna magna en rask og minimalt invasiv prosedyre som kan gjentas flere ganger etter hverandre.
Det er viktig at NSC-prøvene isolert via melking gjenspeiler det endogene bassenget av NSC-er. Profilen til SEZ-forfedre kan påvirkes av i.c.v. injeksjon av FGF2. Når dette skjer, påvirkes profilen til melkeavledede celler på samme måte. Videre har tidligere eksperimentelt arbeid indikert at NSC-er isolert via melking av SEZ har begrenset potensial for selvfornyelse, en oppførsel som ligner på endogene NSC-er som avslørt med in vivo, transgene, celleskjebnestrategier14,17. NSC for postnatal hjerne beholdes i ro, og går sjelden over mot mitotisk aktivering for å generere nevrogene og gliogene avkom18,19,20. Her er det gitt bevis for at fraksjonen av melkeavledede celler som uttrykker GFAP og forventes å inkludere bona fide NSCs co-uttrykker ID3, en markør for hvilende NSCs21. Den berikede tilstedeværelsen av hvilende NSC-er, som deretter belegges i NSC-mediet som vanligvis brukes til kulturen til NSC-er isolert post mortem, ser ut til å begrense ekspansjonspotensialet til innsamlede NSC-er (f.eks. en prosess som er avgjørende hvis celler skulle brukes til autologe transplantasjoner). Dette er fordi disse mediene er designet spesielt for overlevelse og mitotisk ekspansjon av aktiverte NSC-er; Dermed vil genereringen av protokoller som muliggjør effektiv og rask mitotisk aktivering av hvilende NSC øke verdien og omfanget av bruken av melking.
Samlet sett indikerer disse dataene at melking muliggjør prøvetaking av postnatale hjerne-NSC og OPC-er (avhengig av det rostrokaudale nivået av injeksjon av frigjøringscocktailen) fra levende rotter. Dette arbeidet indikerer muligheten for å gjennomføre suksessive væskebiopsier i samme dyr, selv ved betydelige tidslengder etter injeksjon av frigjøringscocktailen (dermed å planlegge og utføre langsgående eksperimentelle studier), siden neuroblaster forblir gruppert på ventrikulære vegger selv ved 8 måneder etter injeksjon. Slike metoder er av kritisk betydning fordi de gjør det mulig å undersøke hendelser hos enkeltdyr som resulterer i redusert biologisk støy generert av fysiologisk variasjon. Dette fører igjen til forbedret nøyaktighet og til implementering av prinsippene for "3Rs" (erstatning, reduksjon og forfining). Fremtidige viktige skritt for forbedring av metoden vil være fastsettelse av maksimalt antall og tidsrammen for at flytende biopsier kan utføres etter en frigjøringsprosedyre, selv om utførelsen av ytterligere frigivelsesprosedyrer bør være mulig, om nødvendig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser eller andre interessekonflikter å oppgi.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av et Action Medical Research (UK) stipend (GN2291) til RJMF og I.K. Forskningsarbeidet ble også delvis støttet (dyrekostnader og støtte til D.D) av Hellenic Foundation for Research and Innovation (H.F.R.I.) under "First Call for H.F.R.I. Forskningsprosjekter for å støtte fakultetets medlemmer og forskere og anskaffelse av kostbart forskningsutstyrsstipend" (prosjektnummer: 3395).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Release cocktail | |||
| β1-integrin-blocking antibody | BD Biosciences | #555002 | purified NA/LE Hamster Anti-Rat CD29 Clone Ha2/5, 1 mg/mL. Any abntibody with blocking activity should be appropriate. |
| Neuraminidase from Clostridium perfringens (Clostridium welchii) | Sigma-Aldrich | #N2876 | Neuraminidases fromother sources (e.g., from Vibrio cholerae) have not been tested. |
| Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | #100-18B | kept as a 1 μg/μL stock, diluted in sterile water at -20 °C |
| Surgical procedures | |||
| 10 µL Syringe | Hamilton | #80330 | Model 701 RN, Small Removable Needle, 26s gauge, 2 in., point style 2 |
| BD Micro-fine 1 mL insulin syringes | BD biosciences | 04085-00 | 29 G x 12.7 mm |
| BETADINE CUT.SOL 10% FLx30ML | LAVIPHARM-CASTALIA | SKU: 5201048131168 | |
| Bupaq | RICHTERPHARMA | 1021854AF | 10 mL (buprenophine 0.3 mg/mL) |
| Digital New Standard Stereotaxic, Rat and Mouse | Stoelting | 51500D | |
| Homeothermic Monitoring System | Harvard Apparatus | 55-7020 | |
| ISOFLURIN 1,000 mg/g inhalation vapour, liquid | Vetpharma Animal Health | 32509/4031 | |
| Ketamidor | RICHTER PHARMA | SKU: 9004114002531 | Ketamine 100 mg/mL |
| Nylon suture, Ethilon | Ethicon | D9635 | Clear , size 5-0 |
| Rechargeable Cordless Surgical Trimmers | Stoelting | Item:51472 | |
| Scalpel blades, sterile | Swann Morton | AW050 | |
| Scopettes Jr. 8-inch Swabs | Birchwood Laboratories | 34-7021-12P | |
| Stereotaxic High Speed Drill | Foredom | 1474w/o1464 | |
| Stoelting’s Stereotaxic Instrument Kit | Stoelting | Item: 52189 | |
| Xylan 2% | Chanelle Pharmaceuticals | 13764/03/19-5-2004 | Xylazine, 25 mL |
| Tissue and cells handling and immunostainings | |||
| 96-well plates appropriate for microscopy | Greiner | #655866 | Screen star microplate |
| B27 supplement | ThermoFisher Scientific | A1486701 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Merck | P06-1391100 | Fraction V, heat shock |
| Citrate | Merck | 71497 | Sodium citrate monobasic |
| Cryostat | Leica | CM1510S | |
| DAPI | Merck, Calbiochem | 28718-90-3 | Nuclear staining, Dilution: 1/1,000 |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11995065 | High glucose, pyruvate |
| donkey anti-goat | Biotium | 20016 or 20106 or 20048 | Dilution: 1/1,000 |
| donkey anti-mouse | Biotium | 20014 or 20105 or 20046 | Dilution: 1/1,000 |
| donkey anti-rabbit | Biotium | 20015 or 20098 or 20047 | Dilution: 1/1,000 |
| EGF | Peprotech | 315-09 | |
| FGF-2 (or bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
| goat anti-GFAP | Abcam | ab53554 | Dilution: 1/500 |
| goat anti-SOX2 | Santa Cruz Biotecnology | sc-17320 | Dilution: 1/200 |
| mouse anti-ID3 | Santa Cruz Biotecnology | sc-56712 | Dilution: 1/200 |
| mouse anti-S100β | Sigma | S2532 | Dilution: 1/200 |
| Mowiol | Merck, Calbiochem | 475904 | Mounting medium |
| N2 supplement | ThermoFisher Scientific | 17502048 | |
| Parafolmadehyde | Merck | 158127 | |
| Poly-D-Lysine | Merck, Millipore | A-003-E | Solution, 1.0 mg/mL |
| rabbit anti-Doublecortin (DCX) | Abcam | ab18723 | Dilution: 1/500 |
| rabbit anti-PDGFRα | Abcam | ab51875 | Dilution: 1/200 |
| rabbit anti-β- catenin | Abcam | ab16051 | Dilution: 1/500 |
| Triton X-100 | Merck | X100 | |
| Microscopy and image analysis | |||
| Confocal microscope | Leica | SP6 and SP8 | |
| Image analysis | NIH, USA | ImageJ | |
| Image analysis | Leica | LasX |
References
- Visvader, J. E., Clevers, H. Tissue-specific designs of stem cell hierarchies. Nature Cell Biology. 18 (4), 349-355 (2016).
- Dimitrakopoulos, D., Kakogiannis, D., Kazanis, I. Heterogeneity of quiescent and active neural stem cells in the postnatal brain. The International Journal of Developmental Biology. 66 (1-2-3), 51-58 (2022).
- Kazanis, I., et al. Subependymal zone-derived oligodendroblasts respond to focal demyelination but fail to generate myelin in young and aged mice. Stem Cell Reports. 8 (3), 685-700 (2017).
- Franklin, R. J. M., Ffrench-Constant, C. Regenerating CNS myelin-from mechanisms to experimental medicines. Nature Reviews. Neuroscience. 18 (12), 753-769 (2017).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 7th Edition. , Available from: https://www.elsevier.com/books/the-rat-brain-in-stereotaxic-coordinates/paxinos/978-0-12-391949-6 (2013).
- Pegg, C. C., He, C., Stroink, A. R., Kattner, K. A., Wang, C. X. Technique for collection of cerebrospinal fluid from the cisterna magna in rat. Journal of Neuroscience Methods. 187 (1), 8-12 (2010).
- McClenahan, F., et al. Isolation of neural stem and oligodendrocyte progenitor cells from the brain of live rats. Stem Cell Reports. 16 (10), 2534-2547 (2021).
- Doetsch, F., García-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Regeneration of a germinal layer in the adult mammalian brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (20), 11619-11624 (1999).
- Doetsch, F., Petreanu, L., Caille, I., Garcia-Verdugo, J. -M., Alvarez-Buylla, A. EGF converts transit-amplifying neurogenic precursors in the adult brain into multipotent stem cells. Neuron. 36 (6), 1021-1034 (2002).
- Del Carmen Gómez-Roldán, M., et al. Neuroblast proliferation on the surface of the adult rat striatal wall after focal ependymal loss by intracerebroventricular injection of neuraminidase. The Journal of Comparative Neurology. 507 (4), 1571-1587 (2008).
- Luo, J., Shook, B. A., Daniels, S. B., Conover, J. C. Subventricular zone-mediated ependyma repair in the adult mammalian brain. The Journal of Neuroscience. 28 (14), 3804-3813 (2008).
- Kazanis, I., et al. Quiescence and activation of stem and precursor cell populations in the subependymal zone of the mammalian brain are associated with distinct cellular and extracellular matrix signals. The Journal of Neuroscience. 30 (29), 9771-9781 (2010).
- Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain. Cell Stem Cell. 3 (3), 265-278 (2008).
- Calzolari, F., et al. Fast clonal expansion and limited neural stem cell self-renewal in the adult subependymal zone. Nature Neuroscience. 18 (4), 490-492 (2015).
- Douet, V., Kerever, A., Arikawa-Hirasawa, E., Mercier, F. Fractone-heparan sulphates mediate FGF-2 stimulation of cell proliferation in the adult subventricular zone. Cell Proliferation. 46 (2), 137-145 (2013).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Obernier, K., et al. Adult neurogenesis is sustained by symmetric self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 22 (2), 221-234 (2018).
- Delgado, A. C., et al. Release of stem cells from quiescence reveals gliogenic domains in the adult mouse brain. Science. 372 (6547), 1205-1209 (2021).
- Kalamakis, G., et al. Quiescence modulates stem cell maintenance and regenerative capacity in the aging brain. Cell. 176 (6), 1407-1419 (2019).
- Llorens-Bobadilla, E., et al. Single-cell transcriptomics reveals a population of dormant neural stem cells that become activated upon brain injury. Cell Stem Cell. 17 (3), 329-340 (2015).
- Gajera, C. R., et al. LRP2 in ependymal cells regulates BMP signaling in the adult neurogenic niche. Journal of Cell Science. 123 (11), 1922-1930 (2010).
