Summary
살아있는 쥐의 뇌에서 신경 줄기 세포와 희소돌기아교세포 전구 세포를 분리하는 방법이 여기에 실험적으로 자세히 제시되어 있습니다. 그것은 그들의 웰빙을 손상시키지 않고 동일한 동물로부터 이러한 세포를 여러 번 수집할 수 있습니다.
Abstract
조직 특이적 신경 줄기 세포(NSC)는 포유류의 출생 후 뇌에서 활성 상태를 유지합니다. 그들은 새로운 뉴런과 신경교세포를 생성하는 특수한 틈새에 상주합니다. 그러한 틈새 중 하나는 뇌실막하 영역(SEZ, 심실-심실하 영역이라고도 함)으로, 뇌실막 세포층에 인접한 외측 심실의 측벽을 가로질러 위치합니다. 희소돌기아교세포 전구세포(OPC)는 중추신경계 전체에 풍부하게 분포되어 있으며, 희소돌기아교세포를 생성할 수 있는 증식성 전구세포 풀을 구성합니다.
NSC와 OPC 모두 자체 갱신 잠재력과 정지/활성화 주기를 나타냅니다. 위치로 인해 이러한 세포의 분리 및 실험 조사는 사후에 수행됩니다. 여기에서는 살아있는 동물에서 다른 세포 중에서도 NSC 및 OPC를 분리하는 방법인 "뇌 착유"에 대해 자세히 설명합니다. 이것은 설치류에 사용하도록 설계되고 쥐에서 테스트된 2단계 프로토콜입니다. 첫째, 세포는 "방출 칵테일"의 입체적 뇌내 뇌실(i.c.v.) 주입을 통해 조직에서 "방출"됩니다. 주성분은 뇌실막세포를 표적으로 하여 심실벽 침상을 유도하는 뉴라미니다아제, 인테그린-β1 차단 항체, 섬유아세포 성장인자-2입니다. 두 번째 "수집" 단계에서, 뇌척수액의 액체 생검은 절개 없이 마취된 쥐에서 수조 마그나(cisterna magna)에서 수행됩니다.
여기에 제시된 결과는 분리된 세포가 내인성 프로파일을 유지하고 SEZ의 NSC가 정지를 유지한다는 것을 보여줍니다. 뇌실막층의 퇴색은 주입의 해부학적 수준으로 제한되며 프로토콜(방출 및 수집)은 동물에 의해 잘 견뎌집니다. 이 새로운 접근법은 실험 동물의 내인성 신경 발생 및 신경 형성에 대한 종단 연구를 수행하기 위한 길을 열어줍니다.
Introduction
조직 특이적 줄기세포는 각 조직을 구성하는 모든 세포 집단을 생성할 수 있는 부분적으로 커밋된 세포입니다. 다능성 외에도 자가 재생 세포이며 조직의 항상성과 재생 능력을 유지하는 데 중요합니다1. 일부 조직 특이적 줄기세포는 장 또는 조혈모세포와 같이 활성화되고 강하게 증식하는 상태로 남아 있습니다. 뇌 줄기세포와 같은 다른 세포들은 대부분 정지 상태이거나 휴면 상태로 남아 있다2. 성인의 뇌에서 신경 줄기 세포(NSC)는 종종 틈새라고 불리는 특수 영역에서 발견될 수 있습니다. 이렇게 잘 기술된 두 개의 영역은 외측 심실의 뇌막하 영역(SEZ)과 해마의 치상이랑에 존재합니다. SEZ 틈새는 가장 많은 수의 세포를 생성하며, 주로 후각 전구로 이동하여 지역 인터뉴런 개체군에 기여하는 신경아세포를 생성합니다. 대조적으로, 생성된 희소돌기아세포는 인접한 뇌량(corpus callosum, CC)3으로 이동합니다. 희소돌기아교세포 전구세포(OPC)는 중추신경계 전체에 널리 분포하는 유사분열 활성 세포로, i) 희소돌기아교세포에 전념하고, ii) 탈수초화 부위로 이동할 수 있으며, iii) 수초성 희소돌기아교세포로 분화할 수 있습니다. OPC는 또한 자체 재생 잠재력과 정지4를 나타낸다.
지금까지 NSC와 OPC의 분리 및 연구는 절개된 뇌와 척수 조직의 사후 해리가 필요했습니다. 이러한 실험적 한계를 피하기 위해 우리는 처음으로 살아있는 동물에서 뇌 NSC와 OPC를 분리할 수 있는 방법을 확립했습니다. 우리는 이 방법을 "착유"라고 부르는데, 이는 세포의 풀이 고갈되지 않기 때문에 세포를 여러 번 수집할 수 있기 때문입니다. 이 프로토콜은 뇌 크기가 크기 때문에 쥐를 대상으로 개발되었으며 주로 SEZ 또는 CC를 대상으로 하며 두 가지 주요 단계를 포함합니다. 먼저, NSC 또는 OPC는 심실 벽 침상을 유도하는 독소인 뉴라미니다아제, 인테그린-β1 차단 항체 및 섬유아세포 성장 인자 2(FGF2)를 포함하는 "방출 칵테일"의 i.c.v. 주입을 통해 조직에서 "제거"됩니다. 칵테일은 측심실 내에서 양측으로 입체적으로 주입됩니다. 의도된 용도가 NSC의 격리인 경우 외측 심실의 로스트랄 영역이 표적이 됩니다. OPC를 보다 순수하게 분리하는 것이 목표인 경우 칵테일은 해마 핌브리아(hippocampal fimbria) 영역에 꼬리 방향으로 주입됩니다. 두 번째 "수집" 단계에서는 절개 없이 마취된 쥐의 수조 마그나에서 뇌척수액(CSF)의 액체 생검을 수행합니다. 액체 생검은 NSC 배양 배지와 혼합되며 도금될 때까지 4°C에서 보관할 수 있습니다.
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Protocol
동물 사육, 유지 관리 및 실험 절차는 영국 내무부가 승인한 1986년 영국 동물(과학적 절차)법과 그리스 공화국 대통령령 56/2013에 따라 수행되었으며, 케임브리지 및 파트라스 대학의 동물 복지 및 윤리 검토 기관에서 면밀히 조사하고, 지역 현 동물 관리 및 사용 위원회(프로토콜 번호: 5675/39/18-01-2021). 수컷과 암컷 Sprague-Dawley, Wistar 및 Long-Evans 쥐를 사용했으며, 연령은 2개월에서 4개월 사이이고 체중은 150g에서 250g 사이였습니다. 프로토콜은 그림 1에 그래픽으로 요약되어 있습니다.
1. 칵테일 준비 해제
알림: 시술 당일에 신선하게 준비하고 얼음에 보관하십시오. 양은 각 외측 심실에 주입하기 위해 2μL당 제공됩니다. 의도한 주사당 추가로 1μL를 준비합니다.
- 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium welchii)에서 0.5μL의 500mU 뉴라미니다아제를 준비합니다.
참고: -20°C의 멸균수에 희석한 1U/μL 육수로 보관하십시오. 다른 유형의 뉴라미니다아제는 테스트되지 않았습니다. - 인테그린-β1 차단 항체 1μg을 포함하는 1μL를 준비합니다.
알림: 4 °C에서 보관하십시오. - 염기성 섬유아세포 성장인자 0.5μg(재조합 인간 FGF-염기성)을 함유한 0.5μL를 제조한다.
참고: -20°C의 멸균수에 희석한 1μg/μL 스톡으로 보관하십시오.
2. 방출 칵테일 주입
알림: 전체 프로세스는 20분 이내에 수행할 수 있습니다. 무균 상태에서 수술을 수행하도록 주의하십시오. 방부제(예: 3% 또는 6% 과산화수소)로 모든 표면을 청소하십시오. 고압멸균 또는 쉽게 멸균할 수 있는 도구, 장갑, 가운 및 커튼을 사용하십시오.
- 이소플루란 흡입(유도 2.5%, 유지 2%)으로 실험 동물을 마취합니다. 각막 반사, 자극에 대한 반응 (뒷다리와 꼬리 꼬집기 테스트), 호흡 모드를 확인하여 마취 깊이를 확인합니다.
참고: 수술 절차는 복강 내 주사 가능한 마취(예: 케타민[40mg/kg] 및 자일라진[10mg/kg])에 의해 유도된 전신 마취 하에 수행할 수 있습니다. 각막 반사, 자극에 대한 반응 (뒷다리와 꼬리 꼬집기 테스트), 호흡 모드를 확인하여 심부 마취를 확인했습니다. - 마취 유도 시 진통을 피하(예: 0.3mg/mL 부프레노르핀)로 투여합니다.
- 입체 프레임에 쥐를 장착하십시오.
- 면도기로 머리털을 면도하고 10% 포비돈 요오드 용액과 알코올과 같은 소독약으로 피부를 청소합니다. 멸균 면봉을 사용하여 소독제를 세 번 바릅니다. 매번 3-5초 동안 원을 그리며 문지릅니다. 건조함을 방지하기 위해 눈 연고를 바르십시오.
- 멸균 메스를 사용하여 중간 선을 따라 머리 피부를 2cm 절개합니다.
- 멸균 면봉과 멸균 식염수를 사용하여 두개골을 꼼꼼하게 청소합니다.
- 입체 장치에 장착된 10μL Hamilton 주사기의 바늘 가장자리를 사용하여 브레그마를 식별합니다. 브레그마를 "point 0,0"으로 설정합니다.
참고: 브레그마는 시상과 관상 봉합사 사이의 교차점으로 식별됩니다. 자세한 내용은 Paxinos 및 Watson5의 쥐 뇌 지도에서 찾을 수 있습니다. - 장치를 전후(AP) = 0.3mm, 측면(L) = +1.2mm(SEZ 대상) 또는 AP = 1.5mm, L = +2.0mm(CC 대상) 좌표로 이동합니다.
- 치과용 드릴을 사용하여 1mm 버 구멍을 뚫습니다.
알림: 손으로 드릴링할 때 피질 표면이 손상되지 않도록 주의하십시오. 출혈은 크지 않을 것으로 예상된다. 식염수로 혈액을 맑게 하고 더 지속적인 출혈을 막기 위해 압력을 가합니다. - 10μL Hamilton 주사기에 방출 칵테일 4μL를 로드합니다.
- 경막과 접촉하기 위해 Hamilton 주사기의 바늘(가급적이면 뭉툭하거나 원뿔형 가장자리)을 내립니다.
- 원하는 깊이(D = 3.5mm)에 바늘을 삽입합니다.
알림: 조직을 수분으로 유지하기 위해 경막 표면에 식염수를 붓습니다. - 방출 칵테일 2μL를 1μL/분의 속도로 주입합니다.
- 릴리스 칵테일이 표면화되지 않도록 천천히 회수하기 전에 바늘을 2분 더 제자리에 두십시오.
- 좌표 AP = 0.3mm, L = -1.2mm(SEZ 대상) 또는 AP = 1.5mm, L = -2.0mm(CC 대상)에서 다른 반구에 대해 2.8-2.14단계를 반복합니다.
- 절개 부위를 5-0 나일론(직경 0.1mm)으로 봉합하고 봉합 부위를 소독제로 청소합니다.
- 마취제를 공급하는 마스크를 제거하고 동물을 수술 후 모니터링 구역으로 옮깁니다.
알림: 마취 회복 및 누운 자세 유지는 5-10분 이내에 이루어져야 하며 완전한 회복(정상 행동)은 25분 이내에 이루어져야 합니다.- 기도를 막을 수 있는 작은 입자 침구가 없는 잘 가열된(24-25°C) 조용한 공간에서 회복(생생하고 중단 없는 움직임, 빈번한 물 접근)을 면밀히 모니터링하십시오. 완전히 회복된 것을 확인한 후에만 동물을 케이지 동료(새 동물이 아님)와 함께 돌려보내십시오.
- 수술 후 최소 48시간 동안 유지 관리 시설에서 동물을 모니터링하십시오. 진통제(예: 0.3mg/mL 부프레노르핀, 피하)를 투여하여 통증 징후(머리 숨기기, 비정상적인 머리 또는 몸 자세, 과민증 및 취급 과흥분)를 해결합니다. 털이 변색되거나 발기된 동물은 담당 수의사에게 의뢰하십시오.
3. 뇌척수액(CSF) 액체 생검
알림: 전체 프로세스는 10분 이내에 수행할 수 있습니다. 여기에 설명된 액체 생검은 방출 칵테일 주입 후 3일 후에 수행되지만 필요할 때마다 정확히 동일한 방식으로 수행할 수 있습니다. 무균 상태에서 수술을 수행하도록 주의하십시오. 방부제(예: 3% 또는 6% 과산화수소)로 모든 표면을 청소하십시오. 고압멸균 또는 쉽게 멸균할 수 있는 도구, 장갑, 가운 및 커튼을 사용하십시오.
- 이소플루란 흡입(유도 2.5%, 유지 2%)으로 동물을 마취합니다. 각막을 확인하여 마취 깊이 확인
반사, 자극에 대한 반응(뒷다리 및 꼬리 꼬집기 테스트) 및 호흡 모드.
참고: 수술 절차는 복강 내 주사 가능한 마취(예: 케타민[40mg/kg] 및 자일라진[10mg/kg])에 의해 유도된 전신 마취 하에 수행할 수 있습니다. 그러나 절차가 짧기 때문에, 특히 생검이 연속적으로 여러 번 수행되는 경우에는 권장하지 않습니다. - 마취 유도 시 진통을 피하(예: 0.3mg/mL 부프레노르핀)로 투여합니다.
- 실험용 동물을 입체 프레임에 장착합니다. 이어 바를 사용하여 앞뒤로 회전하는 움직임을 방해하지 않고 머리를 고정하십시오.
- 목 뒤쪽이 잘 확장될 수 있도록 머리를 아래쪽 40° 각도로 고정합니다.
알림: 이를 수행하는 한 가지 방법은 장치6의 마우스 바를 사용하는 것입니다. - 면도기를 사용하여 목 부분의 털을 면도하고 10% 포비돈 요오드 용액과 알코올과 같은 소독제로 피부를 청소합니다. 멸균 면봉을 사용하여 소독제를 세 번 바릅니다. 매번 3-5초 동안 원을 그리며 문지릅니다.
- 손가락 끝으로 아틀라스6의 후두부 돌기와 척추 사이에 위치한 마름모꼴 모양의 함몰 부위를 찾습니다.
- 포인트 마크를 그립니다(예: 마커 사용).
- 1mL 또는 0.5mL 주사기를 입체 프레임에 고정합니다.
알림: 분리할 수 없는 바늘이 있는 주사기는 흡입력이 더 좋고 데드 볼륨이 적기 때문에 사용하는 것이 좋습니다. - 피부와 접촉하는 지점의 지점에 바늘을 가져옵니다.
- 한 쌍의 집게를 사용하여 피부층을 통해 주사기를 내리면서 피부를 들어 올립니다.
- 플런저를 약간 회수하여 주사기에 음압을 생성합니다.
- 주사기에 액체(CSF)가 나타날 때까지 바늘을 매우 천천히 담그려면 다시 시작합니다.
- 이 위치에 바늘을 고정하고 CSF의 느린 흐름을 허용합니다.
알림: CSF 흐름이 매우 느린 경우 바늘을 약간 내리거나 올릴 수 있습니다. - 뇌척수액을 천천히(40μL/분 단위로) 최대 120μL까지 제거하기 시작합니다.
- 주사기를 천천히 회수합니다.
- 복강내로 1mL의 정상 혈청을 투여하여 실험 동물의 체액 보충을 지원합니다.
- 액체 생검(CSF)을 400μL의 NSC 배지와 혼합하고 더 사용할 때까지 마이크로 원심분리기 튜브를 4°C로 유지합니다.
알림: 액체 생검은 냉동되지 않은 경우 3시간 이내에 처리해야 합니다. - 마취제를 공급하는 마스크를 제거하고 동물을 수술 후 모니터링 구역으로 옮깁니다.
알림: 마취 회복 및 누운 자세 유지는 5-10분 이내에 이루어져야 하며 완전한 회복(정상 행동)은 25분 이내에 이루어져야 합니다.- 기도를 막을 수 있는 작은 입자 침구가 없는 잘 가열된(24-25°C) 조용한 공간에서 회복(생생하고 중단 없는 움직임, 빈번한 물 접근)을 면밀히 모니터링하십시오. 완전히 회복된 것이 확인된 후에만 동물을 케이지 동료에게 돌려보내십시오(새로운 동물이 아님).
- 수술 후 최소 48시간 동안 유지 관리 시설에서 동물을 모니터링하십시오. 통증의 징후(머리 숨기기, 비정상적인 머리 또는 몸의 자세, 과민증 및 취급에 대한 과흥분)가 관찰되면 진통제(예: 0.3mg/mL 부프레노르핀 피하)를 투여합니다. 털이 변색되거나 발기된 동물은 담당 수의사에게 의뢰하십시오.
4. 면역형광을 위한 조직의 가공
- 얼음처럼 차가운 식염수 20mL를 심장내 주입한 후, 얼음처럼 차가운 4% 파라포름알데히드(PFA; pH = 7.4의 인산염 완충 식염수[PBS] 중) 50mL를 넣어 동물을 안락사시킨다.
- 뇌 조직을 해부합니다.
- 가위를 사용하여 머리와 몸통을 분리하여 자궁 경부 부위를 자릅니다. 가위를 사용하여 피부를 제거한 다음 뇌 조직을 손상시키지 않도록 가위 끝이 위쪽을 향하도록 하여 시상 정중선을 따라 두개골의 뼈를 자릅니다. 코로나 정중선을 통과하여 가능한 한 많이 절단하는 것을 목표로하십시오.
- 겸자를 사용하여 후두상골과 두정골에서 시작하여 마지막으로 전두골까지 뼈를 제거합니다.
- 뇌 조직이 드러나면 집게나 주걱을 사용하여 두개골 밖으로 들어 올립니다. 이를 촉진하기 위해, 원하지 않는다면 뇌 기저부의 신경과 후각구를 절단한다.
- 4 °C에서 2 % PFA로 밤새 조직을 고정 한 후
- 조직이 바닥으로 가라앉을 때까지 4°C에서 최소 48시간 동안 30% 자당(PBS)으로 조직을 냉동 보호합니다.
- -80 °C에서 조직을 얼립니다.
- 저온 유지 장치로 뇌 조직을 14μm 두께의 관상 절편으로 자릅니다.
- 표준 프로토콜 3,7을 사용하여 면역형광 염색 수행
- 차단 완충액(3% 소 혈청 알부민[BSA], 0.1% Triton X-100, PBS)으로 절편을 실온에서 2시간 동안 배양합니다.
- 항원 회수를 수행합니다(유리병 사용, 10mM 구연산염 완충액, pH = 6.0에서 15분 동안 끓임).
참고: 이 단계는 선택 사항이지만 핵 항원에 필요합니다. - 실온으로 가져와 4°C에서 밤새 차단 완충액에 신경교세포섬유산성단백질(GFAP), 더블코르틴(Dcx), S100β 및 β-카테닌( 재료 표 참조)에 대한 1차 항체와 함께 배양합니다.
- 실온에서 핵 대조염색을 위해 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)이 있는 PBS의 2차 항체로 2시간 동안 배양합니다( 재료 표 참조).
- 커버슬립을 장착합니다.
5. 면역형광을 위한 분리된 세포 처리
- poly-D-lysine(100μg/mL)으로 코팅된 현미경 검사에 적합한 96웰 플레이트에 세포를 플레이트합니다.
- 셀을 얼음처럼 차가운 2% PFA에 10분 동안 고정하고 PBS로 3번 세척합니다.
- PDGFRα, GFAP, Dcx, SOX2 및 ID3에 대한 표준 절차 3,7을 사용하여 면역형광을 수행합니다(재료 표 참조).
- 어둠 속에서 3 °C에서 PBS + NaN 0.1 (0.1 %)의 세포를 유지하십시오.
6. 현미경 및 이미지 분석
- 형광 또는 공초점 현미경을 사용하여 이미지를 촬영하고 세포 계수기와 같은 표준 이미지 분석 소프트웨어 도구를 사용하여 세포 계수를 수행합니다.
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Representative Results
NSC 공개 및 수집
경제특구의 NSC는 뇌실막세포의 단층에 의해서만 뇌척수액에서 분리되지만, 삽입된 단섬모돌기(intercalating mono-ciliated process) 8,9를 통해 심실 내용물과 직접 접촉한다. 뉴라미니다아제는 시알산 잔기의 절단을 통해 뇌실막 세포에 특이적으로 작용하며 심실 벽의 탈피를 유도할 수 있습니다. 이것은 심실 표면에 신경아세포 군집(neuroblast clustering)을 일으킨다(10,11). 더욱이, 인테그린-β1-차단 항체의 i.c.v. 주입 후 뇌척수액에서 신경아세포의 흐름이 관찰되었는데, 이는 아마도 뇌실막간 세포 접합부의 느슨화에 기인하는것으로 보인다 12. 이러한 관찰은 외측 심실 벽의 무결성을 제어하여 뇌의 줄기 세포와 전구 세포를 분리할 수 있는 프로토콜의 개발로 이어졌습니다. 첫 번째 단계에서, 실질로부터의 방출과 뇌척수액 내부의 NSC 또는 OPC의 후속 흐름은 방출 칵테일의 i.c.v. 주입을 통해 유도됩니다. 칵테일은 외측 심실(SEZ NSC를 표적으로 하는 좌표: AP = 0.3mm, L = ± 1.2mm, D = 3.5mm, CC OPC를 표적으로 하는 좌표: AP = 1.5mm, L = ± 2mm, D = 3.5mm)에서 1μL/분의 속도로 입체적으로 주입됩니다. 두 번째 단계("수집")는 수조 마그나(cisterna magna)에서 뇌척수액 액체 생검을 수행하는 것입니다. 쥐를 마취해야 하며 생검은 1mL 주사기로 수행할 수 있습니다. 입체 택시 장치를 사용하면 절개 없이 약 100μL의 CSF를 회수하는 데 거의 완벽하게 성공할 수 있습니다. 액체 생검을 얼음 배양 배지에 첨가하고 <3시간 동안 도금할 때까지 4°C에서 유지합니다(NSC 배양 배지에는 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지[DMEM], B27 보충제[2%)], N2 보충제[1%], FGF2[20ng/mL] 및 표피 성장 인자[EGF; 20ng/mL]가 포함되어 있습니다.
방출 칵테일 주입 후 뇌실 주위 영역의 조직학적 평가
첫 번째 실험 집단에서는 3μL 이상의 액체를 주입할 때 비특이적 기계적 손상으로 인해 심실이 손상될 수 있음을 보여주었습니다(그림 2B,C). 방출 칵테일 2μL를 천천히 주입하면 심실 표면에 Dcx-면역양성 신경아세포 클러스터가 출현했습니다. 이러한 클러스터는 주입 후 8개월에도 볼 수 있었습니다(그림 2D). 이 방법은 동물의 장기 추적 관찰을 목표로 하는 종단 연구를 위한 것이었기 때문에 방출 칵테일로 인한 조직 손상을 평가했습니다. S100β 및 β-카테닌13과 같은 뇌실막 세포 마커에 대해 14μm 두께의 냉동 유지 장치 뇌 절편에서 면역염색을 수행하고, 뇌실막층의 전반적인 무결성을 평가했습니다. 뇌실막층의 퇴실 부위는 주사제의 로스트로코달 수준에만 존재했으며, SEZ의 더 많은 후방 및 전방 영역에서 뇌실막층 섭동이 점진적으로 감소하고 (그림 2E, F) 주사 부위에서 ±2mm 떨어진 후에는 없어졌습니다. 상술한 결과는 방출 칵테일의 i.c.v. 주입에 의해 야기된 뇌실막층의 부분적인 탈락이 초점이고, 주입 부위의 근접에 억제되고, 뇌실 주위 뇌실막층의 나머지를 온전하게 남겨둔다는 것을 보여준다.
수집된 세포의 마커 프로파일 및 in vitro 거동
이어서, 착유 프로토콜을 통해 분리된 세포의 시험관 내 거동 및 마커 프로파일을 평가했습니다. 각 액체 생검의 평균 세포 수율은 약 300 ± 45개 세포(100μL의 생검당)입니다7. 착유 생검 결과 평균 3.17 ± 0.45 통과 전위를 가진 NSC 배양이 나왔습니다. 식염수 주입 쥐로부터 분리된 세포는 평균 1.92회 ± 0.76회 통과할 수 있었다. 대조적으로, 착유를 통해 분리된 것들은 심지어 9개의 통로에 도달했습니다(p = 0.038, t 검정)(그림 3A)7. 표준 사후 검시, SEZ 유래 신경구 배양의 평균 통과 능력은 우리 손에 있는 12개 구절보다 높습니다. in vivo cell-fate mapping experiments14에 의해 밝혀진 바와 같이, SEZ NSC의 in vivo 확장 잠재력은 제한적인 것으로 나타났기 때문에, 착유는 내인성 NSC의 거동에 훨씬 더 가깝지만, 표준 배양에 있는 세포의 그것과 상당히 다른 in vitro 거동을 가진 세포를 생산한다. 수집된 세포는 poly-D-lysine-coated well에 도말하였다. 그들은 부착 단층으로 성장했으며 더 드물게는 신경 구체로 성장했습니다 (그림 3B). 성상교세포 마커 GFAP에 대해 면역 양성인 갓 분리된 세포(주입 후 3일 후에 수집되고 도금 후 24시간 고정)는 정지 마커인 ID3에 대해서도 면역 양성이었고 NSC 양극성 형태에 대한 특성을 가졌습니다(그림 3C). 더욱이, 이전에 보고된바와 같이7, 주사 후 3일째에 동일한 동물의 생검 유래 세포와 사후 유래 세포의 보다 상세한 면역세포화학적 비교(GFAP+ 성상교세포, Dcx+ 신경아세포, PDGFRa+ 희소돌기아교세포 전구세포 및 신경 계통의 SOX2+ 세포 찾기)는 수집된 세포의 프로파일이 내인성 SEZ 세포의 프로파일과 유사하다는 것을 보여주었습니다(그림 3D). 특히, 생검 및 조직 유래 세포를 서로 다른 조건(예: FGF2가 있는 세포와 없는 방출 칵테일 주입)에서 비교했을 때, 성장 인자는 SOX2+ 세포의 존재를 수반하고 유의하게 증가시켰을 뿐만 아니라 두 샘플에서 Dcx+ 신경아세포의 존재를 현저히 감소시키는 것으로 나타났습니다(그림 3D). 이 데이터는 NSC의 내인성 집단 프로필에 나타나는 모든 변화가 착유 생성 세포 샘플에 반영된다는 것을 확인했습니다.
그림 1: 착유의 그래픽 요약. 주요 해부학적 랜드마크(외측 심실, 위에 놓인 뇌량, 아래쪽 전방 관질[회색의 백질] 및 측벽의 뇌막하 영역[파란색])가 있는 한쪽 뇌반구의 관상 섹션. 방출 칵테일은 측심실에 주입되어 조직의 무결성을 손상시키고 뇌척수액에서 출생 후 뇌 신경 줄기 세포를 방출하여 액체 생검 을 통해 수집할 수 있습니다. 약어: SEZ = 뇌막하 영역; LV = 외측 심실; CSF = 뇌척수액; pbNSCs = 출생 후 뇌 신경 줄기 세포; β1-int = beta1 인테그린. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: i.c.v. 주사의 효과에 대한 조직학적 평가. (A-D) Dcx에 대한 면역염색 후 외측 심실 등쪽 절반의 저배율 이미지(신경아세포를 표시하기 위한 빨간색). (A) 해밀턴 주사기의 간단한 i.c.v. 삽입은 SEZ의 세포 구조를 방해하지 않는 반면, 10mL(주입 속도 1mL/분)의 i.c.v. 주입은 내용물에 관계없이 심실 벽의 심각한 손상을 초래합니다. (B) 식염수 및 (C) 방출 칵테일. (D) 방출 칵테일 2μL를 주입하면 심실 벽의 조절된 손상이 발생하며, 이는 수술 후 8개월에도 관찰됩니다. 주입 후 7일 및 14일에 SEZ 벽의 고배율 세부 사항은 각각 (E) 및 (F)에 표시됩니다. Dcx+ 신경아세포(녹색)는 벽 표면에 있고 틈새의 다른 세포(Sox2+, 흰색)는 더 깊숙이 있는 무질서한 구조가 있습니다. 뇌실 주위 조직은 2개월 시점(G)에서 주사의 꼬리 수준에서 손상되는 반면, 조직은 동일한 동물에서 더 꼬리 수준(H)에서 손상되지 않습니다. 심실벽은 뇌실막 마커 S100β 및 β-카테닌에 대한 면역염색을 통해 평가됩니다. 벽의 전형적인 구조에 대한 세부 사항은 (I)에 나와 있습니다. 핵 염색은 DAPI(파란색으로 표시)를 사용하여 수행됩니다. 스케일 바 = 300 μm(A-C,G,H, 삽입), 150 μm(D), 30 μm(E,F) 및 50 μm(I). 이 그림은 McClenahan et al.13에서 수정되었습니다. 약어: SEZ = 뇌막하 영역; i.c.v = 뇌심실내; Dcx = 더블 코르틴; DAPI = 4',6-디아미디노-2-페닐린돌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 착유를 통해 분리된 세포의 평가. (A) 식염수 주입 동물(회색 막대, 총 12개 샘플) 또는 착유 후(검은색 막대, 총 29개 샘플, 뉴라미니다아제 및 인테그린-β1 차단 항체가 포함된 방출 칵테일)에서 액체 생검 샘플당 얻은 최대 통과 수를 보여주는 그래프. (B) GFAP 및 ID3에 대해 면역염색된 주입 후 3일에 착유를 통해 얻은 일차 세포의 대표 공초점 현미경 이미지. (씨,디) 주입 후 3일 후에 분리한 세포의 명시야 이미지, 폴리-D-라이신 코팅 웰에 도말하고 NSC 증식 배지에서 7일 동안 성장시켰습니다. (E) 동일한 실험 동물에서 SEZ 및 SEZ NSC의 내인성 집단의 착유를 통해 분리된 세포의 세포 유형 프로파일을 보여주는 그래프. SOX2+ 및 Dcx+ 분획은 FGF2의 동시 주입 후 각각 현저하게 증가 및 감소되었습니다. (마커당 단방향 분산 분석 후 사후 분석; n = 실험 그룹당 4-6마리의 동물.) 스케일 바 = 100μm(C,D) 및 10μm(B). 이 그림은 McClenahan et al.13에서 수정되었습니다. 약어: SEZ = 뇌막하 영역; DPI = 주입 후 일수; NSC = 신경 줄기 세포; Dcx = 더블 코르틴; GFAP = 신경교세포섬유산성 단백질. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
줄기세포와 전구세포는 포유류의 뇌 조직에서 상대적으로 드물다. 또한 NSC는 쉽고 안전한 생검을 위해 접근할 수 없는 영역(심실 벽, 해마)에 위치합니다. 그러므로, 지금까지 그러한 세포들을 실험적으로 다루는 유일한 방법은 사후 분리였다. 살아있는 쥐로부터 NSC와 OPC를 단일 또는 반복적으로 채취할 수 있는 방법(착유라고 함)이 여기에 단계별로 설명되어 있습니다. 이 방법은 두 가지 주요 특징을 기반으로 합니다: i) NSC 또는 OPC는 뇌의 심실 시스템 내에서 흐르는 뇌수액에서 뇌실막 세포 단층에 의해 분리됩니다. ii) 뇌실막 세포와 신경 전구 세포는 인테그린을 통해 그들과 다른 이웃 세포 유형과의 접촉을 유지합니다. 따라서 뇌실질에서 NSC(OPC)를 분리할 수 있도록 심실의 특정 부위에 주입된 방출 칵테일에는 뇌실막 세포10,11을 특이적으로 표적으로 삼아 죽이는 독소인 뉴라미니다아제와 인테그린-β1 차단 항체가 포함되어 있습니다. 또한 FGF2를 함유하고 있는데, 이는 이 성장 인자가 틈새 시장과 배양에서 NSC의 생존 및 유지에 필수적이기 때문이다15,16. 이 프로토콜은 동물에 의해 잘 견뎌진다는 것이 이전에 7로 밝혀졌다. 이 보고서에서는 뇌척수액에서 NSC/OPC를 방출하기 위한 전제 조건으로 방출 칵테일에 의해 유도된 뇌실막 세포의 손상이 주사의 로스트로코달 수준 주변에서 제한된다는 것을 추가로 확인했습니다. 프로토콜은 줄기 세포 틈새 자체를 포함하여 뇌의 항상성 기능을 보존해야 하고 동물의 장기적인 웰빙을 손상시켜서는 안 되기 때문에 이것은 매우 중요합니다. 방출 칵테일의 입체 주사는 경미한 중증도이며 사망에 이르지 않았습니다. 또한, 수조 마그나(cisterna magna)의 액체 생검 수행은 여러 번 연속적으로 반복할 수 있는 빠르고 최소 침습적인 절차입니다.
중요한 것은 착유를 통해 분리된 NSC 샘플이 NSC의 내인성 풀을 밀접하게 반영한다는 것입니다. SEZ 전구 세포의 프로파일은 FGF2의 i.c.v. 주입에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 이런 일이 발생하면 착유 유래 세포의 프로필도 동일한 방식으로 영향을 받습니다. 더욱이, 이전의 실험적 연구는 경제특구의 착유를 통해 분리된 NSC가 제한된 자가 재생 잠재력을 가지고 있음을 나타냈으며, 이는 in vivo, 형질전환, 세포-운명 전략(in vivo, transgenic, cell-fate strategies)에서 밝혀진 내인성 NSC의 그것과 유사한 행동이다14,17. 출생 후 뇌 NSC는 정지 상태로 유지되며, 신경인성 및 신경원성 자손을 생성하기 위해 유사분열 활성화로 거의 전환되지 않습니다18,19,20. 여기에서, GFAP를 발현하고 선의의 NSC를 포함할 것으로 예상되는 착유 유래 세포의 분획이 정지 NSC의 마커인 ID3를 함께 발현한다는 증거가 제공된다21. NSC의 분리된 사후 배양에 일반적으로 사용되는 NSC 배지에 도금된 정지 NSC의 농축된 존재는 수집된 NSC의 확장 가능성을 제한하는 것으로 보입니다(예: 세포가 자가 이식에 사용되는 경우 중요한 프로세스). 이것은 이 매체가 활성화한 NSCs의 생존과 유사분열 확장을 위해 특히 디자인되기 때문입니다; 따라서, 정지된 NSCs의 능률 적이고 및 급속한 유사분열 활성화를 가능하게 하는 의정서의 발생은 젖을 짜기의 사용의 가치 그리고 범위를 증가할 것입니다.
전반적으로, 이러한 데이터는 착유가 살아있는 쥐로부터 출생 후 뇌 NSC 및 OPC (방출 칵테일을 주입하는 로스트로 꼬리 수준에 따라 다름)의 샘플링을 가능하게한다는 것을 나타냅니다. 이 연구는 방출 칵테일 주입 후 상당한 시간 길이에서도 동일한 동물에서 연속적인 액체 생검을 수행하는 타당성을 나타냅니다 (따라서 종단 실험 연구를 계획하고 수행하기 위해), 신경 아세포는 주입 후 8 개월에도 심실 벽에 군집되어 있기 때문입니다. 이러한 방법은 개별 동물 내에서 발생하는 사건을 조사하여 생리적 변이에 의해 발생하는 생물학적 노이즈를 줄일 수 있기 때문에 매우 중요합니다. 이는 결과적으로 정확도를 높이고 "3R"(교체, 축소 및 개선)의 원칙을 구현합니다. 이 방법의 개선을 위한 향후 주요 단계는 필요한 경우 추가 방출 절차의 수행이 가능해야 하지만 한 번의 방출 절차 후에 액체 생검을 수행할 수 있는 최대 횟수와 기간을 결정하는 것입니다.
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Disclosures
저자는 선언해야 할 경쟁적인 재정적 이익이나 기타 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 R.J.M.F.와 I.K.에 대한 Action Medical Research(UK) 보조금(GN2291)의 지원을 받았습니다. 이 연구는 또한 그리스 연구 혁신 재단(H.F.R.I.)이 "교수진과 연구원을 지원하기 위한 H.F.R.I. 연구 프로젝트에 대한 첫 번째 요청과 고비용 연구 장비 보조금 조달"(프로젝트 번호: 3395)에 따라 부분적으로 지원되었습니다(동물 비용 및 D.D.에 대한 지원).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Release cocktail | |||
| β1-integrin-blocking antibody | BD Biosciences | #555002 | purified NA/LE Hamster Anti-Rat CD29 Clone Ha2/5, 1 mg/mL. Any abntibody with blocking activity should be appropriate. |
| Neuraminidase from Clostridium perfringens (Clostridium welchii) | Sigma-Aldrich | #N2876 | Neuraminidases fromother sources (e.g., from Vibrio cholerae) have not been tested. |
| Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | #100-18B | kept as a 1 μg/μL stock, diluted in sterile water at -20 °C |
| Surgical procedures | |||
| 10 µL Syringe | Hamilton | #80330 | Model 701 RN, Small Removable Needle, 26s gauge, 2 in., point style 2 |
| BD Micro-fine 1 mL insulin syringes | BD biosciences | 04085-00 | 29 G x 12.7 mm |
| BETADINE CUT.SOL 10% FLx30ML | LAVIPHARM-CASTALIA | SKU: 5201048131168 | |
| Bupaq | RICHTERPHARMA | 1021854AF | 10 mL (buprenophine 0.3 mg/mL) |
| Digital New Standard Stereotaxic, Rat and Mouse | Stoelting | 51500D | |
| Homeothermic Monitoring System | Harvard Apparatus | 55-7020 | |
| ISOFLURIN 1,000 mg/g inhalation vapour, liquid | Vetpharma Animal Health | 32509/4031 | |
| Ketamidor | RICHTER PHARMA | SKU: 9004114002531 | Ketamine 100 mg/mL |
| Nylon suture, Ethilon | Ethicon | D9635 | Clear , size 5-0 |
| Rechargeable Cordless Surgical Trimmers | Stoelting | Item:51472 | |
| Scalpel blades, sterile | Swann Morton | AW050 | |
| Scopettes Jr. 8-inch Swabs | Birchwood Laboratories | 34-7021-12P | |
| Stereotaxic High Speed Drill | Foredom | 1474w/o1464 | |
| Stoelting’s Stereotaxic Instrument Kit | Stoelting | Item: 52189 | |
| Xylan 2% | Chanelle Pharmaceuticals | 13764/03/19-5-2004 | Xylazine, 25 mL |
| Tissue and cells handling and immunostainings | |||
| 96-well plates appropriate for microscopy | Greiner | #655866 | Screen star microplate |
| B27 supplement | ThermoFisher Scientific | A1486701 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Merck | P06-1391100 | Fraction V, heat shock |
| Citrate | Merck | 71497 | Sodium citrate monobasic |
| Cryostat | Leica | CM1510S | |
| DAPI | Merck, Calbiochem | 28718-90-3 | Nuclear staining, Dilution: 1/1,000 |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11995065 | High glucose, pyruvate |
| donkey anti-goat | Biotium | 20016 or 20106 or 20048 | Dilution: 1/1,000 |
| donkey anti-mouse | Biotium | 20014 or 20105 or 20046 | Dilution: 1/1,000 |
| donkey anti-rabbit | Biotium | 20015 or 20098 or 20047 | Dilution: 1/1,000 |
| EGF | Peprotech | 315-09 | |
| FGF-2 (or bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
| goat anti-GFAP | Abcam | ab53554 | Dilution: 1/500 |
| goat anti-SOX2 | Santa Cruz Biotecnology | sc-17320 | Dilution: 1/200 |
| mouse anti-ID3 | Santa Cruz Biotecnology | sc-56712 | Dilution: 1/200 |
| mouse anti-S100β | Sigma | S2532 | Dilution: 1/200 |
| Mowiol | Merck, Calbiochem | 475904 | Mounting medium |
| N2 supplement | ThermoFisher Scientific | 17502048 | |
| Parafolmadehyde | Merck | 158127 | |
| Poly-D-Lysine | Merck, Millipore | A-003-E | Solution, 1.0 mg/mL |
| rabbit anti-Doublecortin (DCX) | Abcam | ab18723 | Dilution: 1/500 |
| rabbit anti-PDGFRα | Abcam | ab51875 | Dilution: 1/200 |
| rabbit anti-β- catenin | Abcam | ab16051 | Dilution: 1/500 |
| Triton X-100 | Merck | X100 | |
| Microscopy and image analysis | |||
| Confocal microscope | Leica | SP6 and SP8 | |
| Image analysis | NIH, USA | ImageJ | |
| Image analysis | Leica | LasX |
References
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