Summary
هنا ، يتم وصف نهج بسيط وسريع لأداء الحقن داخل بطانة الرحم البطينية في الفئران باستخدام نهج اليد الحرة (أي بدون جهاز مجسم).
Abstract
غالبا ما يتطلب فحص أنظمة الغدد الصم العصبية توصيل الأدوية أو الفيروسات أو العوامل التجريبية الأخرى مباشرة إلى أدمغة الفئران. يسمح الحقن داخل بطانة الرحم البطينية (ICV) بتوصيل العامل التجريبي على نطاق واسع في جميع أنحاء الدماغ (خاصة في الهياكل القريبة من البطينين). هنا ، يتم وصف طرق إجراء حقن ICV اليد في الفئران البالغة. باستخدام المعالم البصرية واللمسية على رؤوس الفئران ، يمكن إجراء الحقن في البطينين الجانبيين بسرعة وموثوقية. يتم إجراء الحقن باستخدام حقنة زجاجية مثبتة في يد المجرب وتوضع على مسافات تقريبية من المعالم. وبالتالي ، فإن هذه التقنية لا تتطلب إطارا مجسما. علاوة على ذلك ، لا تتطلب هذه التقنية سوى تخدير إيزوفلوران قصير ، مما يسمح بالتقييم اللاحق لسلوك الفئران و / أو علم وظائف الأعضاء في الفئران المستيقظة التي تتصرف بحرية. يعد حقن القيمة المحلية الحر أداة قوية للتوصيل الفعال للعوامل التجريبية إلى أدمغة الفئران الحية ويمكن دمجه مع تقنيات أخرى مثل أخذ عينات الدم بشكل متكرر أو التلاعب بالدوائر العصبية أو التسجيل في الجسم الحي للتحقيق في عمليات الغدد الصم العصبية.
Introduction
غالبا ما يكون توصيل العوامل التجريبية ، مثل الأدوية1 أو الفيروسات2 أو الخلايا3 ، إلى الدماغ ضروريا لأبحاث الغدد الصم العصبية. إذا كان العامل لا يعبر بسهولة الحاجز الدموي الدماغي أو كان الهدف التجريبي هو اختبار التأثيرات المركزية للعامل على وجه التحديد ، فمن المهم أن يكون لديك طريقة موثوقة لتوصيل الحقن إلى الدماغ. علاوة على ذلك ، يوفر الحقن في الفضاء داخل المخ البطيني (ICV) الفرصة لتوزيع العامل على نطاق واسع في الدماغ ويوفر منطقة مستهدفة كبيرة ، مما يزيد من احتمال نجاح الحقن2.
تتضمن الطريقة الشائعة لصنع حقن القيمة المحلية وضع قنية دائمة في الداخل. في هذا النهج ، يعد الإطار التجسيمي ضروريا لوضع القنية المتاحة تجاريا أو المصنوعة حسب الطلب ، حيث يتم لصق القنية أو تثبيتها في مكانها. في كثير من الأحيان ، عند الشفاء ، يتم إعطاء جرعة فوق فسيولوجية من الأنجيوتنسين II من خلال القنية ، وإذا لوحظ سلوك الشرب على الفور ، اعتبار القنية موضوعة بشكل صحيح4. هذا النهج له العديد من المزايا ، بما في ذلك القدرة على إجراء التسريب على المدى الطويل والقدرة على حقن نفس عدة مرات. بالإضافة إلى ذلك ، إذا تم استخدام الأنجيوتنسين II ، يمكن تأكيد الموضع الصحيح قبل إعطاء المركبات التجريبية. ومع ذلك ، هناك بعض القيود على وضع قنية دائمة ، بما في ذلك الحاجة إلى معدات باهظة الثمن (إطار مجسم) ، وإمكانية تلف القنية بعد وضعها (على سبيل المثال ، يمكن للفئران مضغ قنية رفيقة القفص) ، وإمكانية حدوث عدوى حول القنية الدائمة. يمكن إجراء حقن ICV واحدة باستخدام إطار تجسيمي3 ، والذي ، على الرغم من فعاليته ، يتطلب تعرضا كبيرا للتخدير ، وبالتالي قد يحجب بعض الآثار الفسيولوجية والسلوكية الحادة للعلاج. بالإضافة إلى ذلك ، يتطلب وضع الفئران في إطار تجسيمي تدريبا كبيرا لتحقيق وضع مستقر ومنع تمزق قنوات الأذن.
هنا ، يتم وصف طريقة ثابتة لإجراء حقن اليد الحرة في الفئران. تعتمد هذه الطريقة على التقارير السابقة 5,6. تتمثل مزايا هذه التقنية في أنها بسيطة وسريعة ولا تتطلب معدات متخصصة مثل الإطار المجسم. كما هو موضح أدناه ، يتضمن هذا الإجراء معالجة حقنة زجاجية بالنسبة للمعالم الموجودة على رأس الماوس لإجراء الحقن ، والتي يمكن إجراؤها بسرعة ، وبالتالي لا تتطلب سوى بضع دقائق من التخدير بالغاز في اليوم التجريبي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل جامعة ولاية كولورادو (# 3960) ولجان رعاية واستخدام المؤسسية بجامعة كاليفورنيا في سان دييغو ، حيث تم جمع البيانات التمثيلية (S13235 ، PI Kellie Breen Church). تم تصوير البيانات من خمس إناث بالغات واثنين من ذكور الفئران C57 / BL6 (9-16 أسبوعا) في قسم البيانات التمثيلية. تم استئصال المبيض لإناث الفئران قبل 3-4 أسابيع من حقن القيمة المحلية وجمع الدم كما هو موضح سابقا7. قبل التجريب ، تم إيواء هذه الفئران بدورة ضوء مظلم لمدة 12 ساعة / 12 ساعة وكان لها حرية الوصول إلى الأعلاف والمياه وفقا لدليل رعاية واستخدام المختبر.
1. إجراء حج القحف
ملاحظة: يمكن إجراء حج القحف قبل يوم واحد أو أكثر من الحقن الفعلي ، مما يجعل عملية الحقن أسرع في يوم التجربة.
- تحضير المواد لحج القحف كما هو موضح أدناه.
- ضع وسادة مقعد نظيفة أو مادة ثنى على سطح العمل. قم بلصق مخروط أنف مبخر isoflurane على سطح العمل (بالقرب من المجرب ، ولكن مواجها بعيدا عنه ؛ انظر الشكل 1 أ).
- ضع أنبوب سيلاستيك على نهاية إبرة حادة معقمة 18 جم بحيث يبرز ~ 1 مم من طرف الإبرة. ضع أنبوب سيلاستيك في نهاية إبرة حادة معقمة بحيث يبرز ~ 1 مم من طرف الإبرة.
ملاحظة: يجب استخدام إبر منفصلة ومعقمة معبأة مسبقا (حادة وغير حادة) لكل ماوس. - اجمع ماكينة حلاقة كهربائية ومقشر باليود وشاش معقم ومنصات كحولية لإعداد موقع الحقن.
- تدرب على تحريك إبرة 2 مم جانبية و 1 مم ذيلية كما هو موضح أدناه.
- استخدم مسطرة وقلما لتمييز ورقة بنقطة بداية (ستكون هذه بريجما) ، وعلامة 2 مم إلى اليسار أو اليمين ، وعلامة أخرى 1 مم فوق آخر علامة (سيكون هذا هو موقع الحقن ؛ انظر الشكل 1 ب).
- تدرب على تحريك الإبرة من نقطة البداية إلى النقطة 1 إلى النقطة 2 (bregma إلى موقع الحقن) حتى تتأكد من أن الحركة قابلة للتكرار بدون أدلة.
ملاحظة: الإحداثيات الموصوفة هنا فعالة في الفئران البالغة C57 / BL6 ، ولكن قد تتطلب السلالات أو الفئات العمرية الأخرى تعديلا.
- تحضير الماوس لحج القحف كما هو موضح أدناه.
- ضع الماوس في غرفة الحث وقم بتخدير الماوس بنسبة 3٪ -4٪ إيزوفلوران في الأكسجين الطبي. مع الممارسة والإلمام بالإجراء ، قلل المدة الإجمالية للتعرض للأيزوفلوران إلى أقل من 10 دقائق لإجراء حج القحف.
تنبيه: التعرض للإيزوفلوران يشكل خطرا على صحة الإنسان. استخدام مبخر إيزوفلوران معتمد وخاضع للتفتيش في منطقة جيدة التهوية مع وسائل كسح غازات النفايات. - بمجرد غياب منعكس إصبع القدم ، حلق رأس. تطبيق مواد تشحيم العين.
- ضع الماوس على سطح العمل مع وضع الرأس في مخروط الأنف للحفاظ على التخدير.
- تطبيق عامل مسكن، مثل البوبرينورفين (0.6-0.8 ملغم/كغم من وزن جسم الفأر، تحت الجلد)، حسب توجيهات المورد.
- قم بتنظيف موقع الحقن عن طريق مسح الرأس بشاش معقم مغموس في محلول اليود (قم بإجراء ثلاثة دعك) ، ثم امسحه باستخدام وسادة فرك الكحول (أداء ثلاث مرات).
ملاحظة: قم بإزالة الفراء وتنظيف الجلد حول موقع الحقن واستخدم أدوات وإبر معقمة ، على النحو الموصى به من قبل الجمعية الطبية البيطرية الأمريكية لمنع العدوى.
- ضع الماوس في غرفة الحث وقم بتخدير الماوس بنسبة 3٪ -4٪ إيزوفلوران في الأكسجين الطبي. مع الممارسة والإلمام بالإجراء ، قلل المدة الإجمالية للتعرض للأيزوفلوران إلى أقل من 10 دقائق لإجراء حج القحف.
- امسك رأس الماوس بحزم باليد غير المهيمنة. ضع الرأس مسطحا على سطح العمل قدر الإمكان.
- حدد موقع الحقن.
- استخدم إبرة 18 G الحادة المعدة لتحديد bregma أولا ؛ لهذا ، اسحب الإبرة عبر جلد الرأس على طول خط الوسط ، وتحرك في المستوى الذيلي المنقاري. تخيل مثلثا متساوي الأضلاع يكون فيه الرأسان هما العينان والرأس الثالث هو الموقع التقريبي للبريغما (انظر الشكل 1C).
- من bregma ، حرك الإبرة 2 مم الجانبية و 1 مم الذيلية إلى موقع الحقن.
- أثناء إمساك الإبرة عموديا ، ادفع الإبرة بقوة عبر الجلد والعظام حتى يتدفق الأنبوب مع الجلد.
- اسحب الإبرة وقم بتدوير الإبرة واضغط على الجلد والعظام مرة أخرى. كرر العملية حتى يتم إنشاء ثقب صغير في العظام.
- استخدم الإبرة الحادة للتحقق من وجود ثقب كاف في العظام. اهدف إلى جعل فتحة في العظم كبيرة بما يكفي لمرور الإبرة غير الحادة.
- أخرج الماوس من مخروط الأنف ، ونظف أي دم من موقع الحقن بشاش معقم ، وضع الماوس في قفص على جهاز تدفئة قفص حتى يستيقظ. نظرا لأن الفتحة التي أحدثها حج القحف صغيرة (إبرة 18 جم) ، لا يلزم إغلاق الموقع بخياطة أو مقاطع جرح.
ملاحظة: الفتحة المنتجة هنا صغيرة (18 جم) ، لذلك تعتبر العديد من المؤسسات هذا الإجراء حقنة بدلا من الجراحة. علاوة على ذلك ، على الرغم من إجراء فتحة عبر الجلد والعظام إلى الدماغ ، فإن تثبيت الجلد مشدودا يؤدي إلى عدم محاذاة الثقوب ، مما يساعد على الأرجح في منع نباتات الجلد أو فراش القفص من الاتصال بالدماغ.
2. جعل الحقن
- تحضير المواد للحقن كما هو موضح أدناه.
- ضع وسادة مقعد نظيفة أو مادة ثنى على سطح العمل. قم بلصق مخروط أنف مبخر isoflurane على سطح العمل (بالقرب من المجرب ، ولكن مواجها بعيدا عنه ؛ انظر الشكل 1 أ).
- قم بتوصيل إبرة بطول 10 مم 27 جم مع شطبة 45 درجة على حقنة زجاجية سعة 5 ميكرولتر. ضع أنبوب سيلاستيك على الإبرة بحيث يبرز 3.5 مم من طرف الإبرة ؛ استخدم الشريط اللاصق المختبري لتثبيت الأنبوب على جسم المحقنة (انظر الشكل 1 د).
- تحضير وسائط الحقن (دواء أو فيروس أو سائل آخر للحقن) في أنبوب. بالنسبة للنتائج التمثيلية في هذه الدراسة ، تم حقن محلول ملحي متساوي التوتر معقم.
ملاحظة: حدد أنبوبا يسمح بالوصول عن طريق المحقنة الزجاجية والإبرة ، مثل أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 2 مل. - ارسم 3 ميكرولتر من وسائط الحقن في المحقنة الزجاجية. أولا ، ارسم أكثر من الحجم المطلوب ، وأخرجه حتى يبقى 3 ميكرولتر في المحقنة.
- جمع فرك اليود ، الشاش المعقم ، ومنصات الكحول لإعداد موقع الحقن.
- ابدأ تشغيل مؤقت المختبر في وضع العد التنازلي وضع المؤقت بحيث يكون مرئيا للمجرب أثناء إجراء الحقن.
- تدرب على تحريك إبرة جانبية 2 مم وذيلية 1 مم كما تم إجراؤها في اليوم السابق.
- تحضير الماوس للحقن كما هو موضح أدناه.
- ضع الماوس في غرفة الحث وقم بتخدير الماوس باستخدام الأيزوفلوران. بمجرد غياب منعكس إصبع القدم ، ضع مادة تشحيم العين ، وضع الماوس على سطح العمل مع وضع الرأس في مخروط الأنف.
- نظف موقع الحقن بثلاث مناديل لكل من اليود والكحول. حدد موقع الحقن بإبرة 18 جم (أو إبرة حادة) كما هو موضح في الخطوة 1.8. يجب أن يكون الثقب الذي تم إنشاؤه أثناء حج القحف قابلا للاكتشاف.
ملاحظة: إذا لم يتم إجراء حج القحف مسبقا ، أو إذا كان الثقب في الجمجمة غير قابل للاكتشاف ، فيمكن إجراء حج القحف هنا.
- قم بإجراء الحقن باستخدام حقنة زجاجية كما هو موضح أدناه.
- امسك رأس الماوس بحزم باليد غير المهيمنة. ضع الرأس مسطحا على سطح العمل قدر الإمكان.
- ضع إبرة المحقنة الزجاجية من خلال الفتحة الموجودة في الجمجمة حتى يستقر الأنبوب الموضوع فوق الإبرة المحضرة في الخطوة 2.1.2 على جلد الفأر.
- امسك المحقنة عموديا قدر الإمكان ، مع الانتباه إلى كل من الطائرات الإكليلية والسهمية. حقن الوسائط ببطء على مدى 1 دقيقة.
- ثبت المحقنة والإبرة في مكانها لمدة دقيقة أخرى بعد الانتهاء من الحقن لتقليل التدفق العكسي. اسحب الإبرة ببطء من رأس الماوس.
- أخرج الماوس من مخروط الأنف ، ونظف أي دم من موقع الحقن بشاش معقم (إذا كان هناك أي وجود) ، وضع الماوس في قفص على قفص أكثر دفئا حتى يستيقظ.
3. تأكيد موقع الحقن
- تخدير الفأر بعمق وتعطيره بالمحلول الملحي و 4٪ بارافورمالدهيد في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) كما هو موضح سابقا8. تخزين الدماغ في 30٪ السكروز في برنامج تلفزيوني في 4 °C حتى يغرق الدماغ (عادة 2 أيام).
- قطع 20-50 ميكرومتر المقاطع الإكليلية على cryostat كما هو موضح سابقا9. أثناء التقسيم ، لاحظ مجرى الحقن في كتلة الأنسجة. سجل ما إذا كان مجرى الحقن يتقاطع بوضوح مع البطين الجانبي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
عند تنفيذها بنجاح ، تسمح هذه التقنية بالتسليم السريع لعامل تجريبي في نظام البطين. يظهر في الشكل 2 أ ملف تعريف نبض الهرمون اللوتيني (LH) من فأر تم استئصال المبيض وتلقى حقنة ICV بقيمة 3 ميكرولتر من محلول ملحي متساوي التوتر معقم ، وهو وسيلة للعديد من المركبات الدوائية. يوضح هذا المثال أن التعرض القصير للتخدير الغازي وحقن 3 ميكرولتر من السائل في نظام البطين وحده لم يغير إفراز الهرمون اللوتيني النابض. في 3 ساعات بعد حقن ICV ، تم القتل الرحيم للحيوان ، وتم جمع الأنسجة العصبية الطازجة المجمدة وقطعها على cryostat. يتقاطع مجرى الحقن بوضوح مع البطين الجانبي. كان مجرى الحقن مرئيا أيضا في الأنسجة العصبية من الفئران التي تم حقنها بالمثبتات (10 مل من محلول ملحي هيبارين متبوعا ب 20 مل من 4٪ بارافورمالدهيد في محلول الفوسفات). يوضح الشكل 2 ب أمثلة على الحقن الموضوعة بشكل صحيح. يوضح الشكل 2 ج مثالين على الحقن الموضوعة بشكل غير صحيح. يتم عرض أمثلة على حقن الحبر الهندي بشكل صحيح (على اليسار) ووضعها بشكل غير صحيح في الشكل 2D. يعد حقن حبر الهند مفيدا لممارسة هذه التقنية لأنه يسمح بالتصور الواضح لموقع الحقن. يمكن رؤية تدفق الصبغة إلى كل من البطينين الجانبيين والبطين الثالث في الحقن الموضوعة بشكل صحيح (الشكل 2D ، على اليسار).
الشكل 1: صور تصور تحضير المعدات وإحداثيات الحقن لحقن القيمة المحلية الحرة. (أ) تهيئة محطة العمل لحقن القيمة المحلية الحرة. (ب) مخطط لممارسة الحركة اللازمة لوضع حقن القيمة المحلية في إناث الفئران C57 / BL6 البالغة من العمر 3-4 أشهر. ج: الموقع التقريبي للبريجما في الفئران البالغة. د: وضع الأنبوب للكشف عن 3.5 مم من طرف إبرة الحقن. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: بيانات الهرمون اللوتيني التمثيلي والأنسجة المتعلقة بحقن القيمة المحلية الحرة. (أ) صورة نبض الهرمون اللوتيني قبل وبعد حقن القيمة المحلية المضافة. تمثل نقاط البيانات ذات الحشوة السوداء الصلبة نبضات كما تم تحديدها باستخدام إعادة صياغة PULSAR10 مع المعلمات المقترحة في هذا المرجع لماوس OVX ومستوى اكتشاف 0.32 نانوغرام / مل. (ب) صور فوتوغرافية لمقطع إكليلي من دماغ الفأر مع حقنة القيمة المضافة الموضوعة بشكل صحيح. (ج) صور فوتوغرافية لمقطع إكليلي من دماغ الفأر مع حقن ICV تم وضعه بشكل غير صحيح: قناة حقن جانبية للبطين (يسار) ، وقناة حقن ظهرية للبطين (يمين). (د) صور فوتوغرافية لمقطع إكليلي من دماغ الفأر مع حقنة ICV من الحبر الهندي موضوعة بشكل صحيح (يسار) وحقنة ICV موضوعة بشكل غير صحيح من حبر الهند (يمين). ملاحظة: تصور اللوحتان B و C أدمغة بارافورمالدهايد التي تم جمعها بعد 3 ساعات من حقن المياه المالحة. اللوحة D يصور أدمغة جديدة تم جمعها على الثلج الجاف بعد 2 دقيقة من حقن الحبر الهندي. شريط المقياس = 1 مم الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا ، يتم وصف وسيلة بسيطة وفعالة لإجراء حقن ICV في الفئران. نظرا لأن هذه التقنية لا تتطلب إطارا مجسما ، فإن هذا النهج للتوصيل المركزي للأدوية والعوامل التجريبية متاح لمزيد من الباحثين. بالإضافة إلى ذلك ، يعد هذا النهج إنتاجية عالية نسبيا حيث يمكن إجراء التحضير والحقن بسرعة.
نظرا لأن هذا الإجراء يتطلب معالجة الإبر والمحقنة الزجاجية يدويا باستخدام مسافات تقريبية ، ينصح بأن يكرس الممارس الجديد بعض الوقت لممارسة الحركات قبل العمل مع الحية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تكون جثث الفئران مفيدة لممارسة التعرف على bregma بالإبرة. بمجرد اكتساب بعض الثقة في الحركة ، تكون الخبرة مع التدريب الحية المخصصة مفيدة. خلال جلسات الممارسة ، فإن حقن 3 ميكرولتر من الحبر الهندي يجعل التقييم البصري لوضع الحقن أسهل. ستؤدي الحقن الموضوعة بشكل صحيح إلى تلطيخ أسود في البطين الجانبي المماثل وغالبا في البطين الثالث والبطين الجانبي المقابل. حقن الحبر هو إجراء نهائي ويجب عدم السماح للفئران بالتعافي من التخدير بعد حقن الحبر. حتى الممارسين ذوي الخبرة يمكنهم الاستفادة من التدرب على الحركة الجانبية 2 مم والحركة الذيلية 1 مم عدة مرات قبل إجراء الحقن. بالإضافة إلى ذلك ، من المهم تثبيت المحقنة الزجاجية عموديا عند وضعها في الدماغ. مع الممارسة ، يمكن توقع وضع >75٪ من الحقن بشكل صحيح. يمكن أن يساعد تثبيت الإبرة في مكانها لمدة ~ 1 دقيقة بعد حقن الحجم الكامل في منع التدفق العكسي للسائل خارج الدماغ. خلال هذا الوقت ، من الضروري تثبيت الإبرة في الموضع الصحيح دون حركة. يتطلب الأداء الناجح لهذا الإجراء خبرة في التعامل مع الإبرة والمحقنة الزجاجية وإمساكها بشكل موثوق.
إذا لم يتم وضع بعض الحقن بشكل صحيح ، فهناك العديد من خيارات استكشاف الأخطاء وإصلاحها. أولا ، تأكد من أن إبرة الحقن مستقيمة (غير مثنية) وأن الإبرة مثبتة بإحكام على المحقنة الزجاجية. بعد ذلك ، إذا كانت الحقن الفائتة متغيرة في موقعها ، فهناك ما يبرر ممارسة إضافية للتلاعب بالمحقنة الزجاجية والإمساك بها. يمكن أن يكون من المفيد أيضا وجود شخص إضافي لتحديد ما إذا كانت المحقنة مثبتة عموديا أثناء الحقن. يتطلب العثور على بريجما على الجلد السليم بالإبرة أيضا ممارسة. يوصى بشدة بأخذ بعض الوقت لتحديد هذا المعلم بثقة قبل الشروع في الحقن. إذا تم وضع الحقن باستمرار في مكان غير صحيح ، فسيكون من الضروري تغيير إحداثيات الحقن. الإحداثيات الموصوفة هنا (±2 مم جانبي ، 1 مم ذيلية إلى بريجما) فعالة في الفئران البالغة C57 / BL6 ، ولكن قد يتعين تعديل هذه الإحداثيات لسلالات أو فئات عمرية أخرى.
على الرغم من أن هذه التقنية يمكن أن تكون فعالة للغاية في تسليم الوكلاء بسرعة مركزيا ، إلا أن هناك بعض القيود. نظرا لأن مكبس المحقنة يتم تحريكه يدويا ، يمكن أن يكون معدل الحقن متغيرا. ينصح بحقنه ببطء نسبيا لتجنب الآثار المحتملة خارج الهدف للضغط في نظام البطين. يوصى بحجم حقن 3 ميكرولتر في هذا البروتوكول ؛ ومع ذلك ، تم استخدام حجم حقن أكبر (5 ميكرولتر) في مختبرات أخرى11. اعتمادا على النتيجة المقاسة ، قد يلزم تعديل حجم الحقن ومعدله. على سبيل المثال ، قد تتحمل الفئران اليافعة أحجام الحقن الأصغر فقط. وبالتالي ، يوصى بإجراء تجارب أولية لاختبار تأثيرات السيارة. هناك قيد إضافي يتمثل في أن تأكيد وضع الحقن الصحيح يقتصر على تقييم شخصي إلى حد ما لقناة الحقن بعد جمع الأنسجة. يمكن رؤية مجرى الحقن في كل من الأنسجة الطازجة المجمدة والأنسجة ذات البارافورمالدهايد التي تم جمعها بعد عدة ساعات من حقن القيمة المحلية (انظر الصور في النتائج التمثيلية). إذا تم إجراء حقن متعددة ، فقد لا يكون واضحا من علامات المسالك إذا تم وضع كل حقنة بنجاح.
يتطلب هذا النهج الحر لإجراء حقن القيمة المحلية التخدير. مع الممارسة ، يمكن إجراء الحقن بسرعة ، مما يؤدي إلى التعرض لفترة وجيزة (3-5 دقائق) للمخدر. من خلال حلق رأس الفأر وإجراء حج القحف (ثقب الجمجمة بإبرة حادة) قبل اليوم التجريبي ، يمكن تقليل الوقت تحت التخدير أثناء التجربة. عادة ما تتعافى الفئران تماما من هذا التعرض القصير للتخدير في غضون بضع دقائق. قد يكون جمع عينات دم طرف الذيل مباشرة بعد التخدير أمرا صعبا ، لذلك يمكن تعليق أخذ العينات لمدة ~ 30 دقيقة بعد الحقن لتقليل الضغط في الفئران ، على الرغم من أن هذا ليس ضروريا تماما. كما نجحت مختبرات أخرى في قياس التغيرات في إفراز الهرمون اللوتيني (عينات لمرة واحدة) بعد 30 دقيقة من إعطاء العوامل الدوائية باستخدام تقنية القيمة المحليةالحرة 1,12. كما تم الكشف عن تغييرات في السلوك الحركي والابتلاع على مدى 24 ساعة بعد حقن القيمة المحلية13 ، لذلك يمكن إجراء مراقبة طويلة المدى. يوصى بإجراء اختبارات أولية لتحديد سهولة أخذ العينات والآثار المحتملة للتخدير على النتائج ذات الأهمية.
باختصار، إن تقنية حقن القيمة المحلية الحرة الموصوفة هنا هي طريقة بسيطة لكنها قوية لتوصيل العوامل التجريبية إلى الدماغ. المزايا المحددة هي أن النهج سريع وبسيط من الناحية الفنية ويتيح معدلا مرتفعا من الحقن التي تم وضعها بنجاح. علاوة على ذلك ، نظرا لأن هذه التقنية لا تتطلب سوى التعرض القصير للتخدير ، فيمكن دمجها مع مجموعة متنوعة من التقنيات الأخرى مثل أخذ عينات الدم المتكررة أو التلاعب بالدوائر العصبية أو التسجيل في الجسم الحي للتحقيق في عمليات الغدد الصم العصبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
ونود أن نشكر الدكتورة كيلي برين تشيرش والسيد مايكل كريسمان والسيدة جيسيكا جانغ على مساهماتهم في جمع البيانات المبينة في النتائج التمثيلية. تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) R00 HD104994 (R.B.M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18-gauge blunt needles | SAI Infusion | B18-150 | |
| 18-gauge needles | BD Medical | 305195 | |
| Alcohol pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Bench pad | Fisher Scientific | 14-206-62AC22 | |
| Betadine solution | Fisher Scientific | NC1696484 | |
| Buprenorphine | Patterson Vet Supply | 07-892-5235 | Controlled substance |
| Eyelube | Fisher Scientific | 50-218-8442 | |
| Glass syringe | Hamilton | 7634-01 | |
| Injection needle | Hamilton | 7803-01 | 27 gauge, Small Hub RN needle, point style: 4, Needle length: 10cm, Angle: 45 |
| Isoflurane | Patterson Vet Supply | 07-893-8441 | |
| Isoflurane vaporizer | Vet Equip | V-10 | |
| Laboratory Tape | VWR | 89098-128 | |
| Medical grade oxygen | Airgas | OX USPEA | |
| Paraformaldehyde | Millipore-Sigma | 8.18715.1000 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | J67802.K2 | |
| PulsaR Software | Open source, University of Otago | See ref 9 | |
| Ruler | Fisher Scientific | 12-00-152 | |
| Silastic tubing (0.040" I.D.) | DOW | 508-005 | |
| Silastic tubing (0.078" I.D.) | DOW | 508-009 | |
| Sterile saline | VWR | 101320-574 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 |
References
- Roseweir, A. K., et al. Discovery of potent kisspeptin antagonists delineate physiological mechanisms of gonadotropin regulation. Journal of Neuroscience. 29 (12), 3920-3929 (2009).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments. (91), e51863 (2014).
- Taylor, Z. V., Khand, B., Porgador, A., Monsonego, A., Eremenko, E. An optimized intracerebroventricular injection of CD4(+) T cells into mice. STAR Protocols. 2 (3), 100725 (2021).
- Russo, K. A., et al. Circadian control of the female reproductive axis through gated responsiveness of the RFRP-3 system to VIP signaling. Endocrinology. 156 (7), 2608-2618 (2015).
- Laursen, S. E., Belknap, J. K. Intracerebroventricular injections in mice. Some methodological refinements. Journal of Pharmacological Methods. 16 (4), 355-357 (1986).
- Haley, T. J., McCormick, W. G. Pharmacological effects produced by intracerebral injection of drugs in the conscious mouse. British Journal of Pharmacology and Chemotherapy. 12 (1), 12-15 (1957).
- McCosh, R. B., et al. Insulin-induced hypoglycaemia suppresses pulsatile luteinising hormone secretion and arcuate Kiss1 cell activation in female mice. Journal of Neuroendocrinology. 31 (12), e12813 (2019).
- Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-Protocol. 11 (5), e3988 (2021).
- Comba, A., et al. Laser capture microdissection of glioma subregions for spatial and molecular characterization of intratumoral heterogeneity, oncostreams, and invasion. Journal of Visual Experiments. (158), e60939 (2020).
- Porteous, R., et al. Reformulation of PULSAR for analysis of pulsatile LH secretion and a revised model of estrogen-negative feedback in mice. Endocrinology. 162 (11), (2021).
- Hohmann, J. G., et al. Differential role of melanocortins in mediating leptin's central effects on feeding and reproduction. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 278 (1), R50-R59 (2000).
- Gottsch, M. L., et al. A role for kisspeptins in the regulation of gonadotropin secretion in the mouse. Endocrinology. 145 (9), 4073-4077 (2004).
- Krasnow, S. M., et al. A role for galanin-like peptide in the integration of feeding, body weight regulation, and reproduction in the mouse. Endocrinology. 144 (3), 813-822 (2003).
