Summary
Hier wird ein einfacher und schneller Ansatz zur Durchführung von intrazerebroventrikulären Injektionen bei Mäusen unter Verwendung eines Freihandansatzes (d.h. ohne stereotaktische Vorrichtung) beschrieben.
Abstract
Die Untersuchung neuroendokriner Systeme erfordert oft die Verabreichung von Medikamenten, Viren oder anderen experimentellen Wirkstoffen direkt in das Gehirn von Mäusen. Eine intrazerebroventrikuläre (ICV) Injektion ermöglicht die großflächige Verabreichung des experimentellen Wirkstoffs im gesamten Gehirn (insbesondere in den Strukturen in der Nähe der Ventrikel). Hier werden Methoden zur Freihand-ICV-Injektion bei erwachsenen Mäusen beschrieben. Durch visuelle und taktile Landmarken auf den Köpfen von Mäusen können Injektionen in die Seitenventrikel schnell und zuverlässig durchgeführt werden. Die Injektionen werden mit einer Glasspritze durchgeführt, die in der Hand des Versuchsleiters gehalten und in ungefährem Abstand zu den Landmarken platziert wird. Somit benötigt diese Technik keinen stereotaktischen Rahmen. Darüber hinaus erfordert diese Technik nur eine kurze Isofluran-Anästhesie, die eine anschließende Beurteilung des Verhaltens und/oder der Physiologie von Mäusen bei wachen, sich frei verhaltenden Mäusen ermöglicht. Die Freihand-ICV-Injektion ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die effiziente Verabreichung experimenteller Wirkstoffe in das Gehirn lebender Mäuse und kann mit anderen Techniken wie häufigen Blutentnahmen, neuronalen Schaltkreismanipulationen oder In-vivo-Aufzeichnungen kombiniert werden, um neuroendokrine Prozesse zu untersuchen.
Introduction
Die Abgabe von experimentellen Wirkstoffen wie Medikamenten1, Viren2 oder Zellen3 an das Gehirn ist für die neuroendokrine Forschung oft notwendig. Wenn der Wirkstoff die Blut-Hirn-Schranke nicht ohne weiteres überwindet oder das experimentelle Ziel darin besteht, die zentralen Wirkungen des Wirkstoffs gezielt zu testen, ist es wichtig, eine zuverlässige Methode für die Verabreichung von Injektionen in das Gehirn zu haben. Darüber hinaus bietet die Injektion in den intrazerebroventrikulären Raum (ICV) die Möglichkeit, den Wirkstoff weit im Gehirn zu verteilen und bietet eine große Zielfläche, wodurch die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Injektion erhöhtwird 2.
Eine gängige Methode zur Herstellung von ICV-Injektionen ist das Einsetzen einer permanenten Verweilkanüle. Bei diesem Ansatz ist ein stereotaktischer Rahmen notwendig, um die handelsübliche oder individuell angefertigte Kanüle zu positionieren, da die Kanüle geklebt oder zementiert wird. Oft wird nach der Genesung eine supraphysiologische Dosis Angiotensin II über die Kanüle verabreicht, und wenn das Trinkverhalten sofort beobachtet wird, gilt die Kanüle als korrekt platziert4. Dieser Ansatz hat viele Vorteile, darunter die Möglichkeit, eine Langzeitinfusion durchzuführen und dasselbe Tier mehrmals zu injizieren. Darüber hinaus kann bei Verwendung von Angiotensin II die korrekte Platzierung vor der Verabreichung von experimentellen Verbindungen bestätigt werden. Es gibt jedoch einige Einschränkungen bei der Platzierung einer permanenten Kanüle, einschließlich der Notwendigkeit einer teuren Ausrüstung (stereotaktischer Rahmen), der Möglichkeit einer Beschädigung der Kanüle nach dem Einsetzen (z. B. können Mäuse auf der Kanüle eines Käfiggefährten kauen) und der Möglichkeit von Infektionen um die permanente Kanüle herum. Einzelne ICV-Injektionen können unter Verwendung eines stereotaktischen Rahmens3 durchgeführt werden, der zwar wirksam ist, jedoch eine erhebliche Exposition gegenüber Anästhesie erfordert und daher einige akute physiologische und verhaltensbezogene Wirkungen der Behandlung verschleiern kann. Darüber hinaus erfordert die Platzierung von Mäusen in einem stereotaktischen Rahmen ein erhebliches Training, um eine stabile Platzierung zu erreichen und das Reißen der Gehörgänge zu verhindern.
Hier wird eine etablierte Methode zur Herstellung von Freihandinjektionen bei Mäusen beschrieben. Diese Methode basiert auf früheren Berichten 5,6. Die Vorteile dieser Technik sind, dass sie einfach und schnell ist und keine spezielle Ausrüstung wie einen stereotaktischen Rahmen erfordert. Wie unten beschrieben, beinhaltet dieses Verfahren die Manipulation einer Glasspritze in Bezug auf Landmarken auf dem Mauskopf, um die Injektionen durchzuführen, was schnell durchgeführt werden kann und daher nur wenige Minuten Gasanästhesie am Versuchstag erfordert.
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Protocol
Alle Verfahren wurden von der Colorado State University (#3960) und der University of California San Diego Institutional Animal Care and Use Committees genehmigt, wo die repräsentativen Daten erhoben wurden (S13235, PI Kellie Breen Church). Die Daten von fünf erwachsenen weiblichen und zwei erwachsenen männlichen C57/BL6-Mäusen (9-16 Wochen alt) sind im Abschnitt "Repräsentative Daten" dargestellt. Weibliche Mäuse wurden 3-4 Wochen vor der ICV-Injektion und der Blutentnahme ovariektomiert, wie zuvor beschrieben7. Vor den Experimenten wurden diese Mäuse mit einem 12-stündigen Licht-/12-Stunden-Dunkellichtzyklus gehalten und hatten freien Zugang zu Futter und Wasser gemäß dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren.
1. Durchführung einer Kraniotomie
HINWEIS: Die Kraniotomie kann einen oder mehrere Tage vor der eigentlichen Injektion durchgeführt werden, wodurch der Injektionsprozess am Tag des Experiments beschleunigt wird.
- Bereiten Sie die Materialien für die Kraniotomie wie unten beschrieben vor.
- Legen Sie eine saubere Bankunterlage oder ein Abdeckmaterial auf die Arbeitsfläche. Klebe den Nasenkonus eines Isofluran-Vaporizers auf die Arbeitsfläche (in der Nähe des Experimentators, aber von ihm abgewandt; siehe Abbildung 1A).
- Legen Sie den Silastikschlauch auf das Ende einer sterilen, scharfen 18-G-Nadel, so dass ~1 mm der Nadelspitze herausragt. Legen Sie einen Silastikschlauch auf das Ende einer sterilen stumpfen Nadel, so dass ~1 mm der Nadelspitze herausragt.
HINWEIS: Für jede Maus sollten separate und sterile, vorverpackte Nadeln (scharf und stumpf) verwendet werden. - Besorge dir einen elektrischen Rasierer, ein Jodpeeling, sterile Gaze und Alkoholpads, um die Injektionsstelle vorzubereiten.
- Üben Sie, eine Nadel 2 mm seitlich und 1 mm kaudal zu bewegen, wie unten beschrieben.
- Markieren Sie mit einem Lineal und einem Stift ein Blatt Papier mit einem Startpunkt (dies ist Bregma), einer Markierung 2 mm links oder rechts und einer weiteren Markierung 1 mm über der letzten Markierung (dies ist die Injektionsstelle; siehe Abbildung 1B).
- Üben Sie, die Nadel vom Startpunkt über den Markierungspunkt 1 bis zum Markierungspunkt 2 (Bregma bis zur Injektionsstelle) zu bewegen, bis Sie sicher sind, dass die Bewegung ohne Führungen wiederholbar ist.
HINWEIS: Die hier beschriebenen Koordinaten sind bei erwachsenen C57/BL6-Mäusen wirksam, aber andere Stämme oder Altersgruppen müssen möglicherweise angepasst werden.
- Bereiten Sie die Maus wie unten beschrieben auf die Kraniotomie vor.
- Legen Sie die Maus in eine Induktionskammer und betäuben Sie die Maus mit 3%-4% Isofluran in medizinischem Sauerstoff. Reduzieren Sie mit Übung und Vertrautheit mit dem Verfahren die Gesamtdauer der Isofluran-Exposition auf weniger als 10 Minuten für das Kraniotomieverfahren.
VORSICHT: Die Exposition gegenüber Isofluran ist gefährlich für die menschliche Gesundheit; Verwenden Sie einen zugelassenen und geprüften Isofluran-Verdampfer in einem gut belüfteten Bereich mit Mitteln zum Absaugen von Abgasen. - Sobald der Zehenreflex fehlt, rasieren Sie den Kopf des Tieres. Tragen Sie Gleitmittel für die Augen auf.
- Legen Sie die Maus mit dem Kopf im Nasenkonus auf die Arbeitsfläche, um die Anästhesie aufrechtzuerhalten.
- Verabreichen Sie ein Analgetikum wie Buprenorphin (0,6-0,8 mg/kg Körpergewicht der Maus, subkutan), wie vom Lieferanten angegeben.
- Reinigen Sie die Injektionsstelle, indem Sie den Kopf mit steriler Gaze abwischen, die in eine Jodlösung getaucht ist (drei Peelings durchführen) und dann mit einem Alkohol-Peeling-Pad abwischen (dreimal durchführen).
HINWEIS: Entfernen Sie das Fell und reinigen Sie die Haut um die Injektionsstelle herum und verwenden Sie sterile Instrumente und Nadeln, wie von der American Veterinary Medical Association empfohlen, um Infektionen zu vermeiden.
- Legen Sie die Maus in eine Induktionskammer und betäuben Sie die Maus mit 3%-4% Isofluran in medizinischem Sauerstoff. Reduzieren Sie mit Übung und Vertrautheit mit dem Verfahren die Gesamtdauer der Isofluran-Exposition auf weniger als 10 Minuten für das Kraniotomieverfahren.
- Halten Sie den Kopf der Maus mit der nicht dominanten Hand fest. Positionieren Sie den Kopf so flach wie möglich auf der Arbeitsfläche.
- Lokalisieren Sie die Injektionsstelle.
- Verwenden Sie die vorbereitete scharfe 18-G-Nadel, um zunächst Bregma zu identifizieren; Ziehen Sie dazu die Nadel entlang der Mittellinie über die Haut des Kopfes und bewegen Sie sich dabei in der rostral-kaudalen Ebene. Stellen Sie sich ein gleichseitiges Dreieck vor, in dem die beiden Eckpunkte die Augen und der dritte Scheitelpunkt die ungefähre Position des Bregmas darstellt (siehe Abbildung 1C).
- Bewegen Sie die Nadel von Bregma aus 2 mm lateral und 1 mm kaudal zur Injektionsstelle.
- Während Sie die Nadel senkrecht halten, stoßen Sie die Nadel fest durch Haut und Knochen, bis der Schlauch bündig mit der Haut abschließt.
- Ziehen Sie die Nadel zurück, drehen Sie die Nadel und drücken Sie erneut durch Haut und Knochen. Wiederholen Sie den Vorgang, bis ein kleines Loch im Knochen entsteht.
- Prüfen Sie mit der stumpfen Nadel, ob ein ausreichendes Loch in den Knochen gebohrt wurde. Versuchen Sie, eine Öffnung in den Knochen zu machen, die groß genug ist, damit die stumpfe Nadel hindurchgehen kann.
- Nehmen Sie die Maus aus dem Nasenkegel, entfernen Sie jegliches Blut von der Injektionsstelle mit steriler Gaze und legen Sie die Maus in einen Käfig auf einen Käfigwärmer, bis sie wach ist. Da die durch die Kraniotomie entstandene Öffnung klein ist (18-G-Nadel), muss die Stelle nicht mit einer Naht oder Wundclips verschlossen werden.
HINWEIS: Die hier erzeugte Öffnung ist klein (18 G), so dass viele Institutionen dieses Verfahren als Injektion und nicht als Operation betrachten. Obwohl eine Öffnung durch Haut und Knochen zum Gehirn gemacht wird, führt das Anspannen der Haut dazu, dass die Löcher nicht ausgerichtet sind, was wahrscheinlich dazu beiträgt, dass die Hautflora oder die Käfigeinstreu nicht mit dem Gehirn in Kontakt kommt.
2. Durchführung der Injektion
- Bereiten Sie die Materialien für die Injektion wie unten beschrieben vor.
- Legen Sie eine saubere Bankunterlage oder ein Abdeckmaterial auf die Arbeitsfläche. Klebe den Nasenkonus eines Isofluran-Vaporizers auf die Arbeitsfläche (in der Nähe des Experimentators, aber von ihm abgewandt; siehe Abbildung 1A).
- Befestigen Sie eine 10 mm lange 27-G-Nadel mit einer 45°-Abschrägung auf einer 5-μl-Glasspritze. Legen Sie den Silastikschlauch so auf die Nadel, dass 3,5 mm der Nadelspitze herausragen; Verwenden Sie Laborklebeband, um den Schlauch am Spritzenkörper zu befestigen (siehe Abbildung 1D).
- Bereiten Sie das Injektionsmedium (Medikament, Virus oder andere Injektionsflüssigkeit) in einem Röhrchen vor. Für die repräsentativen Ergebnisse in dieser Studie wurde sterile isotonische Kochsalzlösung injiziert.
HINWEIS: Wählen Sie ein Röhrchen, das den Zugang durch die Glasspritze und die Nadel ermöglicht, z. B. ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. - Ziehen Sie 3 μl Injektionsmedium in die Glasspritze. Ziehen Sie zunächst mehr als das gewünschte Volumen und werfen Sie es aus, bis noch 3 μl in der Spritze verbleiben.
- Sammeln Sie Jodpeeling, sterile Gaze und Alkoholpads zur Vorbereitung der Injektionsstelle.
- Starten Sie einen Labor-Timer im Count-up-Modus und platzieren Sie den Timer so, dass er für den Versuchsleiter sichtbar ist, während er Injektionen vornimmt.
- Üben Sie, eine Nadel 2 mm seitlich und 1 mm kaudal zu bewegen, wie sie am Vortag durchgeführt wurde.
- Bereiten Sie die Maus wie unten beschrieben auf die Injektion vor.
- Legen Sie die Maus in die Induktionskammer und betäuben Sie die Maus mit Isofluran. Sobald der Zehenreflex fehlt, tragen Sie Augengleitmittel auf und legen Sie die Maus mit dem Kopf im Nasenkonus auf die Arbeitsfläche.
- Reinigen Sie die Injektionsstelle mit je drei Tüchern Jod und Alkohol. Die Injektionsstelle ist mit einer 18-G-Nadel (oder einer stumpfen Nadel) zu identifizieren, wie in Schritt 1.8 beschrieben. Das Loch, das bei der Kraniotomie entsteht, sollte erkennbar sein.
HINWEIS: Wenn die Kraniotomie nicht im Voraus durchgeführt wurde oder wenn das Loch im Schädel nicht nachweisbar ist, kann die Kraniotomie hier durchgeführt werden.
- Führen Sie die Injektion mit einer Glasspritze wie unten beschrieben durch.
- Halten Sie den Kopf der Maus mit der nicht dominanten Hand fest. Positionieren Sie den Kopf so flach wie möglich auf der Arbeitsfläche.
- Die Nadel der Glasspritze wird durch das Loch im Schädel gestochen, bis der Schlauch, der über die in Schritt 2.1.2 vorbereitete Nadel gelegt wurde, auf der Haut der Maus aufliegt.
- Halten Sie die Spritze so senkrecht wie möglich und achten Sie dabei sowohl auf die koronale als auch auf die sagittale Ebene. Injizieren Sie das Medium langsam über einen Zeitraum von 1 Minute.
- Halten Sie die Spritze und die Nadel nach Abschluss der Injektion für eine weitere Minute an Ort und Stelle, um den Rückfluss zu minimieren. Ziehen Sie die Nadel langsam vom Kopf der Maus zurück.
- Entfernen Sie die Maus aus dem Nasenkegel, entfernen Sie jegliches Blut von der Injektionsstelle mit steriler Gaze (falls vorhanden) und legen Sie die Maus in einen Käfig auf einen Käfigwärmer, bis sie wach ist.
3. Bestätigung der Injektionsstelle
- Die Maus wird wie zuvor beschrieben mit Kochsalzlösung und 4 % Paraformaldehyd in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gründlich betäubt und perfundiert8. Lagern Sie das Gehirn in 30%iger Saccharose in PBS bei 4 °C, bis das Gehirn absinkt (typischerweise 2 Tage).
- Schneiden Sie 20-50 μm koronale Schnitte auf einem Kryostaten, wie zuvor beschrieben9. Beobachten Sie beim Schneiden den Injektionstrakt im Gewebeblock. Erfassen Sie, ob der Injektionstrakt den Seitenventrikel deutlich schneidet.
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Representative Results
Wenn diese Technik erfolgreich durchgeführt wird, ermöglicht sie die schnelle Verabreichung eines experimentellen Wirkstoffs in das ventrikuläre System. Ein luteinisierendes Hormon (LH)-Pulsprofil einer ovariektomierten Maus, die eine ICV-Injektion von 3 μl steriler isotonischer Kochsalzlösung, dem Vehikel für viele pharmakologische Verbindungen, erhielt, ist in Abbildung 2A dargestellt. Dieses Beispiel zeigt, dass eine kurze Gasanästhesie und die Injektion von 3 μl Flüssigkeit in das ventrikuläre System allein die pulsierende LH-Sekretion nicht veränderten. 3 Stunden nach der ICV-Injektion wurde das Tier euthanasiert, und frisch gefrorenes Nervengewebe wurde entnommen und auf einem Kryostaten geschnitten. Der Injektionstrakt schnitt deutlich mit dem Seitenventrikel zusammen. Der Injektionstrakt war auch im Nervengewebe von Mäusen sichtbar, die mit einem Fixiermittel perfundiert wurden (10 ml heparinisierte Kochsalzlösung, gefolgt von 20 ml 4%igem Paraformaldehyd in Phosphatpuffer). Beispiele für korrekt platzierte Injektionen sind in Abbildung 2B dargestellt. Zwei Beispiele für falsch platzierte Injektionen sind in Abbildung 2C dargestellt. Beispiele für korrekt (links) und falsch platzierte Injektionen von Tusche sind in Abbildung 2D dargestellt. Das Einspritzen von Tusche ist nützlich, um diese Technik zu üben, da es eine klare Visualisierung der Injektionsstelle ermöglicht. Der Fluss des Farbstoffs sowohl in die lateralen Ventrikel als auch in den dritten Ventrikel ist bei korrekt platzierten Injektionen zu sehen (Abbildung 2D, links).
Abbildung 1: Bilder mit der Vorbereitung der Ausrüstung und den Injektionskoordinaten für Freihand-ICV-Injektionen. (A) Konfiguration des Arbeitsplatzes für Freihand-ICV-Injektionen. (B) Schema zum Üben der Bewegung, die notwendig ist, um die ICV-Injektion bei 3-4 Monate alten weiblichen C57/BL6-Mäusen zu platzieren. (C) Ungefähre Lokalisation von Bregma bei erwachsenen Mäusen. (D) Platzierung des Schlauchs, um 3,5 mm der Nadelspitze für die Injektion freizulegen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Repräsentative luteinisierende Hormon- und Histologiedaten im Zusammenhang mit Freihand-ICV-Injektionen. (A) LH-Pulsprofil vor und nach der ICV-Injektion. Die Datenpunkte mit durchgehend schwarzer Füllung stellen Pulse dar, die mit einer Neuformulierung von PULSAR10 mit den in dieser Referenz vorgeschlagenen Parametern für eine OVX-Maus und einem Detektionsgrad von 0,32 ng/ml bestimmt wurden. (B) Fotografien eines koronalen Schnitts des Mäusegehirns mit einer korrekt platzierten ICV-Injektion. (C) Fotografien eines koronalen Schnitts des Mäusegehirns mit einer falsch platzierten ICV-Injektion: ein Injektionstrakt lateral des Ventrikels (links) und ein Injektionstrakt dorsal des Ventrikels (rechts). (D) Fotografien eines koronalen Schnitts des Mäusegehirns mit einer korrekt platzierten ICV-Injektion von Tusche (links) und einer falsch platzierten ICV-Injektion von Tusche (rechts). Anmerkung: Die Tafeln B und C zeigen mit Paraformaldehyd durchblutete Gehirne, die 3 Stunden nach der Injektion von Kochsalzlösung entnommen wurden. Tafel D zeigt frische Gehirne, die 2 Minuten nach der Injektion von Tusche auf Trockeneis gesammelt wurden. Maßstabsleiste = 1 mm Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Hier wird ein einfaches und effektives Mittel zur Herstellung von ICV-Injektionen bei Mäusen beschrieben. Da diese Technik keinen stereotaktischen Rahmen benötigt, ist dieser Ansatz für die zentrale Verabreichung von Medikamenten und experimentellen Wirkstoffen für mehr Forscher zugänglich. Darüber hinaus bietet dieser Ansatz einen relativ hohen Durchsatz, da das Präparations- und Injektionsverfahren schnell durchgeführt werden kann.
Da dieses Verfahren die Handhabung von Nadeln und einer Glasspritze von Hand mit ungefähren Abständen erfordert, wird empfohlen, dass der neue Praktiker einige Zeit dem Üben der Bewegungen widmet, bevor er mit lebenden Tieren arbeitet. Darüber hinaus können Mäusekadaver nützlich sein, um die Identifizierung von Bregma mit der Nadel zu üben. Sobald ein gewisses Vertrauen in die Bewegung gewonnen ist, sind Erfahrungen mit engagierten lebenden Übungstieren hilfreich. Während der Übungssitzungen erleichtert die Injektion von 3 μl Tusche die visuelle Beurteilung der Injektionsplatzierung. Richtig platzierte Injektionen führen zu einer schwarzen Verfärbung im ipsilateralen lateralen Ventrikel und oft auch im dritten Ventrikel und im kontralateralen lateralen Ventrikel. Die Injektion von Tinte ist ein endgültiges Verfahren, und Mäuse sollten sich nach der Tinteninjektion nicht von der Narkose erholen. Selbst erfahrene Praktiker können davon profitieren, die 2 mm laterale und 1 mm kaudale Bewegung einige Male zu üben, bevor sie eine Injektion vornehmen. Darüber hinaus ist es wichtig, die Glasspritze senkrecht zu halten, wenn sie in das Gehirn eingeführt wird. Mit etwas Übung kann davon ausgegangen werden, dass >75 % der Injektionen korrekt platziert werden. Das Halten der Nadel für ~1 Minute nach der Injektion des vollen Volumens kann dazu beitragen, den Rückfluss der Flüssigkeit aus dem Gehirn zu verhindern. Während dieser Zeit ist es wichtig, die Nadel in der richtigen Position zu halten, ohne sich zu bewegen. Die erfolgreiche Durchführung dieses Verfahrens erfordert Erfahrung in der zuverlässigen Handhabung und dem sicheren Halten von Nadel und Glasspritze.
Wenn einige Injektionen nicht richtig platziert werden, gibt es mehrere Möglichkeiten zur Fehlerbehebung. Überprüfen Sie zunächst, ob die Injektionsnadel gerade (nicht gebogen) ist und ob die Nadel fest an der Glasspritze befestigt ist. Wenn die versäumten Injektionen in ihrer Position variabel sind, ist zusätzliches Üben der Handhabung und des Haltens der Glasspritze erforderlich. Es kann auch hilfreich sein, eine zusätzliche Person zu haben, die erkennt, ob die Spritze während der Injektion senkrecht gehalten wird. Auch das Auffinden von Bregma auf intakter Haut mit der Nadel erfordert Übung. Es wird dringend empfohlen, sich Zeit zu nehmen, um diesen Meilenstein sicher zu identifizieren, bevor Sie mit der Injektion fortfahren. Wenn Injektionen immer an einer falschen Stelle platziert werden, müssen die Injektionskoordinaten geändert werden. Die hier beschriebenen Koordinaten (±2 mm lateral, 1 mm kaudal zu Bregma) sind bei adulten C57/BL6-Mäusen wirksam, müssen aber möglicherweise für andere Stämme oder Altersgruppen angepasst werden.
Obwohl diese Technik bei der schnellen zentralen Bereitstellung von Agenten sehr effektiv sein kann, gibt es einige Einschränkungen. Da der Kolben der Spritze von Hand bewegt wird, kann die Injektionsrate variabel sein. Es wird empfohlen, es relativ langsam zu injizieren, um mögliche Off-Target-Druckeffekte im ventrikulären System zu vermeiden. In diesem Protokoll wird ein Injektionsvolumen von 3 μl empfohlen; In anderen Laboratorien wurde jedoch ein größeres Injektionsvolumen (5 μl) verwendet11. Je nach gemessenem Ergebnis müssen möglicherweise das Injektionsvolumen und die Injektionsrate angepasst werden. Zum Beispiel vertragen juvenile Mäuse möglicherweise nur kleinere Injektionsvolumina. Daher werden Vorversuche empfohlen, um Fahrzeugeffekte zu testen. Eine weitere Einschränkung besteht darin, dass sich die Bestätigung der korrekten Injektionsplatzierung auf eine etwas subjektive Beurteilung des Injektionstraktes nach der Entnahme des Gewebes beschränkt. Der Injektionstrakt ist sowohl in frisch gefrorenem als auch in paraformaldehydperfundiertem Gewebe sichtbar, das mehrere Stunden nach der ICV-Injektion entnommen wurde (siehe Bilder in repräsentativen Ergebnissen). Wenn mehrere Injektionen durchgeführt werden, ist anhand der Traktmarkierungen möglicherweise nicht ersichtlich, ob jede Injektion erfolgreich platziert wurde.
Diese freihändige Herangehensweise an ICV-Injektionen erfordert eine Anästhesie. Mit etwas Übung können die Injektionen schnell durchgeführt werden, was zu einer kurzen (3-5 min) Exposition gegenüber dem Anästhetikum führt. Durch das Rasieren des Kopfes der Maus und die Durchführung der Kraniotomie (Durchstechen des Schädels mit einer scharfen Nadel) vor dem Versuchstag kann die Zeit unter Narkose während des Experiments verkürzt werden. Mäuse erholen sich in der Regel innerhalb weniger Minuten vollständig von dieser kurzen Narkose. Die Entnahme von Blutproben an der Schwanzspitze unmittelbar nach der Anästhesie kann eine Herausforderung sein, so dass die Probenentnahme nach der Injektion für ~30 Minuten unterbrochen werden kann, um den Stress bei den Mäusen zu minimieren, obwohl dies nicht unbedingt erforderlich ist. Andere Laboratorien haben auch erfolgreich Veränderungen der LH-Sekretion (einmalige Proben) 30 Minuten nach der Verabreichung pharmakologischer Wirkstoffe mit dieser Freihand-ICV-Technik gemessen 1,12. Veränderungen des Bewegungs- und Aufnahmeverhaltens über einen Zeitraum von 24 Stunden wurden auch nach ICV-Injektionenfestgestellt 13, so dass eine Langzeitüberwachung durchgeführt werden kann. Es wird empfohlen, Voruntersuchungen durchzuführen, um die Leichtigkeit der Probenahme und die möglichen Auswirkungen der Anästhesie auf die interessierenden Ergebnisse zu bestimmen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die hier beschriebene Freihand-ICV-Injektionstechnik eine einfache, aber leistungsstarke Methode ist, um experimentelle Wirkstoffe in das Gehirn einzubringen. Die spezifischen Vorteile liegen darin, dass der Ansatz schnell und technisch einfach ist und eine hohe Rate an erfolgreich platzierten Injektionen ermöglicht. Da diese Technik nur eine kurze Anästhesie erfordert, kann sie außerdem mit einer Vielzahl anderer Techniken kombiniert werden, wie z. B. häufige Blutentnahmen, Manipulation neuronaler Schaltkreise oder In-vivo-Aufzeichnungen , um neuroendokrine Prozesse zu untersuchen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Kellie Breen Church, Michael Kreisman und Jessica Jang für ihre Beiträge zur Erhebung der in den repräsentativen Ergebnissen gezeigten Daten. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (NIH) R00 HD104994 (R.B.M.) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18-gauge blunt needles | SAI Infusion | B18-150 | |
| 18-gauge needles | BD Medical | 305195 | |
| Alcohol pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Bench pad | Fisher Scientific | 14-206-62AC22 | |
| Betadine solution | Fisher Scientific | NC1696484 | |
| Buprenorphine | Patterson Vet Supply | 07-892-5235 | Controlled substance |
| Eyelube | Fisher Scientific | 50-218-8442 | |
| Glass syringe | Hamilton | 7634-01 | |
| Injection needle | Hamilton | 7803-01 | 27 gauge, Small Hub RN needle, point style: 4, Needle length: 10cm, Angle: 45 |
| Isoflurane | Patterson Vet Supply | 07-893-8441 | |
| Isoflurane vaporizer | Vet Equip | V-10 | |
| Laboratory Tape | VWR | 89098-128 | |
| Medical grade oxygen | Airgas | OX USPEA | |
| Paraformaldehyde | Millipore-Sigma | 8.18715.1000 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | J67802.K2 | |
| PulsaR Software | Open source, University of Otago | See ref 9 | |
| Ruler | Fisher Scientific | 12-00-152 | |
| Silastic tubing (0.040" I.D.) | DOW | 508-005 | |
| Silastic tubing (0.078" I.D.) | DOW | 508-009 | |
| Sterile saline | VWR | 101320-574 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 |
References
- Roseweir, A. K., et al. Discovery of potent kisspeptin antagonists delineate physiological mechanisms of gonadotropin regulation. Journal of Neuroscience. 29 (12), 3920-3929 (2009).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments. (91), e51863 (2014).
- Taylor, Z. V., Khand, B., Porgador, A., Monsonego, A., Eremenko, E. An optimized intracerebroventricular injection of CD4(+) T cells into mice. STAR Protocols. 2 (3), 100725 (2021).
- Russo, K. A., et al. Circadian control of the female reproductive axis through gated responsiveness of the RFRP-3 system to VIP signaling. Endocrinology. 156 (7), 2608-2618 (2015).
- Laursen, S. E., Belknap, J. K. Intracerebroventricular injections in mice. Some methodological refinements. Journal of Pharmacological Methods. 16 (4), 355-357 (1986).
- Haley, T. J., McCormick, W. G. Pharmacological effects produced by intracerebral injection of drugs in the conscious mouse. British Journal of Pharmacology and Chemotherapy. 12 (1), 12-15 (1957).
- McCosh, R. B., et al. Insulin-induced hypoglycaemia suppresses pulsatile luteinising hormone secretion and arcuate Kiss1 cell activation in female mice. Journal of Neuroendocrinology. 31 (12), e12813 (2019).
- Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-Protocol. 11 (5), e3988 (2021).
- Comba, A., et al. Laser capture microdissection of glioma subregions for spatial and molecular characterization of intratumoral heterogeneity, oncostreams, and invasion. Journal of Visual Experiments. (158), e60939 (2020).
- Porteous, R., et al. Reformulation of PULSAR for analysis of pulsatile LH secretion and a revised model of estrogen-negative feedback in mice. Endocrinology. 162 (11), (2021).
- Hohmann, J. G., et al. Differential role of melanocortins in mediating leptin's central effects on feeding and reproduction. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 278 (1), R50-R59 (2000).
- Gottsch, M. L., et al. A role for kisspeptins in the regulation of gonadotropin secretion in the mouse. Endocrinology. 145 (9), 4073-4077 (2004).
- Krasnow, S. M., et al. A role for galanin-like peptide in the integration of feeding, body weight regulation, and reproduction in the mouse. Endocrinology. 144 (3), 813-822 (2003).
