Summary
Aqui, uma abordagem simples e rápida para a realização de injeções intracerebroventriculares em camundongos usando uma abordagem à mão livre (ou seja, sem um dispositivo estereotáxico) é descrita.
Abstract
A investigação de sistemas neuroendócrinos muitas vezes requer a entrega de drogas, vírus ou outros agentes experimentais diretamente no cérebro de camundongos. Uma injeção intracerebroventricular (ICV) permite a entrega generalizada do agente experimental em todo o cérebro (particularmente nas estruturas próximas aos ventrículos). Aqui, métodos para fazer injeções de ICV à mão livre em camundongos adultos são descritos. Usando pontos de referência visuais e táteis nas cabeças de camundongos, as injeções nos ventrículos laterais podem ser feitas de forma rápida e confiável. As injeções são feitas com uma seringa de vidro mantida na mão do experimentador e colocada a distâncias aproximadas dos pontos de referência. Assim, esta técnica não requer um quadro estereotáxico. Além disso, essa técnica requer apenas uma breve anestesia com isoflurano, o que permite a avaliação subsequente do comportamento e/ou fisiologia de camundongos em camundongos acordados e com comportamento livre. A injeção de ICV à mão livre é uma ferramenta poderosa para a entrega eficiente de agentes experimentais no cérebro de camundongos vivos e pode ser combinada com outras técnicas, como amostragem frequente de sangue, manipulação de circuitos neurais ou gravação in vivo para investigar processos neuroendócrinos.
Introduction
A entrega de agentes experimentais, como drogas1, vírus2 ou células3, ao cérebro é muitas vezes necessária para a pesquisa neuroendócrina. Se o agente não atravessar prontamente a barreira hematoencefálica ou o objetivo experimental for testar especificamente os efeitos centrais do agente, é importante ter um método confiável para administrar injeções no cérebro. Além disso, a injeção no espaço intracerebroventricular (ICV) oferece a oportunidade de distribuir amplamente o agente no cérebro e fornece uma grande área alvo, aumentando assim a probabilidade de injeção bem-sucedida2.
Um método comum para fazer injeções de ICV envolve a colocação de uma cânula de permanência permanente. Nesta abordagem, uma estrutura estereotáxica é necessária para posicionar a cânula comercialmente disponível ou feita sob medida, pois a cânula é colada ou cimentada no lugar. Muitas vezes, após a recuperação, uma dose suprafisiológica de angiotensina II é administrada através da cânula e, se o comportamento de beber for imediatamente observado, a cânula é considerada corretamente colocada4. Esta abordagem tem muitas vantagens, incluindo a capacidade de realizar infusão a longo prazo e a capacidade de injetar o mesmo animal várias vezes; além disso, se a angiotensina II for empregada, o posicionamento correto pode ser confirmado antes da administração de compostos experimentais. No entanto, existem algumas limitações para a colocação de uma cânula permanente, incluindo a necessidade de equipamentos caros (estrutura estereotáxica), a possibilidade de danos à cânula após a colocação (por exemplo, ratos podem mastigar a cânula de um companheiro de gaiola) e a possibilidade de infecções ao redor da cânula permanente. Injeções únicas de VCI podem ser feitas com o uso de um quadro estereotáxico3, que, embora eficaz, requer exposição substancial à anestesia e, portanto, pode obscurecer alguns efeitos fisiológicos e comportamentais agudos do tratamento. Além disso, a colocação de camundongos em um quadro estereotáxico requer treinamento substancial para alcançar uma colocação estável e evitar o rompimento dos canais auditivos.
Aqui, um método estabelecido para fazer injeções à mão livre em camundongos é descrito. Esse método é baseado em relatos anteriores 5,6. As vantagens dessa técnica são que ela é simples, rápida e não requer equipamentos especializados, como uma armação estereotáxica. Como descrito a seguir, esse procedimento envolve a manipulação de uma seringa de vidro em relação a pontos na cabeça do camundongo para fazer as injeções, o que pode ser feito rapidamente e, portanto, requer apenas alguns minutos de anestesia gasosa no dia do experimento.
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Protocol
Todos os procedimentos foram aprovados pelos Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais da Colorado State University (#3960) e da University of California San Diego, onde os dados representativos foram coletados (S13235, PI Kellie Breen Church). Os dados de cinco camundongos adultos fêmeas e dois machos adultos C57/BL6 (9-16 semanas de idade) são mostrados na seção de dados representativos. Camundongos fêmeas foram ovariectomizados 3-4 semanas antes da injeção de ICV e coleta de sangue, como descrito anteriormente7. Antes da experimentação, esses camundongos foram alojados com um ciclo de luz de 12 h / 12 h de luz escura e tiveram livre acesso a ração e água de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.
1. Realização de craniotomia
NOTA: A craniotomia pode ser realizada um ou mais dias antes da injeção real, o que torna o processo de injeção mais rápido no dia do experimento.
- Preparar os materiais para a craniotomia conforme descrito abaixo.
- Coloque uma almofada de bancada limpa ou material de drape na superfície de trabalho. Colar o cone nasal de um vaporizador de isoflurano na superfície de trabalho (próximo, mas virado para longe, do experimentador; ver Figura 1A).
- Coloque a tubulação de silicone na extremidade de uma agulha estéril afiada de 18 G de modo que ~1 mm da ponta da agulha se projete. Coloque a tubulação de silastic na extremidade de uma agulha romba estéril de modo que ~1 mm da ponta da agulha se projete.
NOTA: Agulhas pré-embaladas separadas e estéreis (afiadas e rombas) devem ser usadas para cada mouse. - Reúna um barbeador elétrico, esfoliante de iodo, gaze estéril e almofadas de álcool para preparar o local de injeção.
- Pratique a movimentação de uma agulha 2 mm lateral e 1 mm caudal conforme descrito abaixo.
- Use uma régua e uma caneta para marcar uma folha de papel com um ponto de partida (este será bregma), uma marca de 2 mm à esquerda ou à direita e outra marca 1 mm acima da última (este será o local de injeção; ver Figura 1B).
- Pratique mover a agulha do ponto de partida para marcar o ponto 1 para marcar o ponto 2 (bregma para o local da injeção) até ter certeza de que o movimento é repetível sem guias.
NOTA: As coordenadas descritas aqui são eficazes em camundongos adultos C57/BL6, mas outras cepas ou grupos etários podem exigir ajuste.
- Prepare o mouse para craniotomia conforme descrito abaixo.
- Coloque o camundongo em uma câmara de indução e anestesiar o camundongo com isoflurano a 3%-4% em oxigênio de grau médico. Com prática e familiaridade com o procedimento, reduzir o tempo total de exposição ao isoflurano para menos de 10 min para o procedimento de craniotomia.
CUIDADO: A exposição ao isoflurano é perigosa para a saúde humana; Use um vaporizador de isoflurano aprovado e inspecionado em uma área bem ventilada com meios de remoção de gases residuais. - Quando o reflexo do dedo estiver ausente, raspe a cabeça do animal. Aplique lubrificante ocular.
- Coloque o mouse na superfície de trabalho com a cabeça no cone do nariz para manter a anestesia.
- Administrar um agente analgésico, como a buprenorfina (0,6-0,8 mg/kg de peso corporal de camundongo, por via subcutânea), conforme orientação do fornecedor.
- Limpe o local de injeção limpando a cabeça com gaze estéril mergulhada em uma solução de iodo (execute três esfoliações) e, em seguida, limpe com uma compressa de álcool (execute três vezes).
NOTA: Remova o pelo e limpe a pele ao redor do local da injeção e use instrumentos e agulhas estéreis, conforme recomendado pela Associação Médica Veterinária Americana para prevenir infecções.
- Coloque o camundongo em uma câmara de indução e anestesiar o camundongo com isoflurano a 3%-4% em oxigênio de grau médico. Com prática e familiaridade com o procedimento, reduzir o tempo total de exposição ao isoflurano para menos de 10 min para o procedimento de craniotomia.
- Segure firmemente a cabeça do mouse com a mão não dominante. Posicione a cabeça o mais plana possível na superfície de trabalho.
- Localize o local da injeção.
- Use a agulha afiada preparada 18 G para identificar primeiro o bregma; Para isso, arraste a agulha pela pele da cabeça ao longo da linha média, movendo-se no plano rostral-caudal. Imagine um triângulo equilátero em que os dois vértices são os olhos e o terceiro vértice é a localização aproximada do bregma (ver Figura 1C).
- A partir do bregma, mover a agulha 2 mm lateral e 1 mm caudal até o local da injeção.
- Ao segurar a agulha verticalmente, empurre firmemente a agulha através da pele e do osso até que a tubulação esteja nivelada com a pele.
- Retraia a agulha, gire a agulha e pressione a pele e o osso novamente. Repita o processo até que um pequeno orifício seja criado no osso.
- Use a agulha romba para verificar se um orifício suficiente foi produzido no osso. Procure fazer uma abertura no osso grande o suficiente para a agulha romba passar.
- Retire o rato do cone do nariz, limpe qualquer sangue do local de injeção com gaze estéril e coloque o rato numa gaiola num aquecedor de gaiola até ficar acordado. Como a abertura feita pela craniotomia é pequena (agulha 18G), o local não precisa ser fechado com sutura ou clipes da ferida.
NOTA: A abertura produzida aqui é pequena (18 G), por isso muitas instituições consideram este procedimento uma injeção em oposição a uma cirurgia. Além disso, embora seja feita uma abertura através da pele e dos ossos para o cérebro, segurar a pele tensa resulta no não alinhamento dos orifícios, o que provavelmente ajuda a evitar que a flora da pele ou a cama da gaiola entrem em contato com o cérebro.
2. Fazer a injeção
- Prepare os materiais para a injeção conforme descrito abaixo.
- Coloque uma almofada de bancada limpa ou material de drape na superfície de trabalho. Colar o cone nasal de um vaporizador de isoflurano na superfície de trabalho (próximo, mas virado para longe, do experimentador; ver Figura 1A).
- Ligue uma agulha de 27 G de 10 mm de comprimento com um bisel de 45° a uma seringa de vidro de 5 μL. Colocar tubos de silicone na agulha de modo que 3,5 mm da ponta da agulha se projetem; usar fita adesiva de laboratório para prender a tubulação ao corpo da seringa (ver Figura 1D).
- Prepare o meio de injeção (medicamento, vírus ou outro líquido injetável) em um tubo. Para os resultados representativos deste estudo, foi injetada solução salina isotônica estéril.
NOTA: Selecione um tubo que permita o acesso pela seringa de vidro e agulha, como um tubo de microcentrífuga de 2 mL. - Introduzir 3 μL de meio de injeção na seringa de vidro. Primeiro, retire mais do que o volume desejado e ejete até que 3 μL permaneçam na seringa.
- Reúna esfoliação de iodo, gaze estéril e almofadas de álcool para preparar o local de injeção.
- Inicie um temporizador de laboratório no modo de contagem regressiva e coloque o temporizador de modo a que fique visível para o experimentador durante as injeções.
- Pratique a movimentação de uma agulha 2 mm lateral e 1 mm caudal como realizado no dia anterior.
- Prepare o rato para injeção conforme descrito abaixo.
- Coloque o rato na câmara de indução e anestesiar o rato com isoflurano. Quando o reflexo do dedo estiver ausente, aplique lubrificante ocular e coloque o mouse na superfície de trabalho com a cabeça no cone do nariz.
- Limpe o local de injeção com três toalhetes cada de iodo e álcool. Identifique o local de injeção com uma agulha 18 G (ou agulha embotada), conforme descrito no passo 1.8. O orifício criado durante a craniotomia deve ser detectável.
NOTA: Se a craniotomia não tiver sido realizada com antecedência, ou se o orifício no crânio não for detectável, a craniotomia pode ser realizada aqui.
- Efetue a injeção com uma seringa de vidro conforme descrito abaixo.
- Segure firmemente a cabeça do mouse com a mão não dominante. Posicione a cabeça o mais plana possível na superfície de trabalho.
- Coloque a agulha da seringa de vidro através do orifício no crânio até que o tubo colocado sobre a agulha preparado no passo 2.1.2 repousa sobre a pele do rato.
- Segure a seringa o mais verticalmente possível, prestando atenção aos planos coronal e sagital. Injete lentamente o meio durante um período de 1 min.
- Segure a seringa e a agulha no lugar por mais um minuto após a conclusão da injeção para minimizar o refluxo. Retraia lentamente a agulha da cabeça do rato.
- Retire o rato do cone do nariz, limpe qualquer sangue do local de injeção com gaze estéril (se houver alguma) e coloque o rato numa gaiola num aquecedor de gaiola até estar acordado.
3. Confirmação do local de injeção
- Anestesiar profundamente e perfundir o camundongo com solução salina e paraformaldeído a 4% em solução salina tamponada com fosfato (PBS), conforme descrito anteriormente8. Armazenar o cérebro em sacarose a 30% em PBS a 4 °C até que o cérebro afunde (normalmente 2 dias).
- Cortar cortes coronais de 20-50 μm em criostato como descrito anteriormente9. Durante a secção, observe o trato de injeção no bloco de tecido. Registre se a via de injeção cruza claramente o ventrículo lateral.
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Representative Results
Quando realizada com sucesso, essa técnica permite a rápida liberação de um agente experimental no sistema ventricular. Um perfil de pulso do hormônio luteinizante (LH) de uma camundongo ovariectomizada que recebeu uma injeção ICV de 3 μL de solução salina isotônica estéril, o veículo para muitos compostos farmacológicos, é mostrado na Figura 2A. Este exemplo demonstra que a breve exposição à anestesia gasosa e a injeção isolada de 3 μL de líquido no sistema ventricular não alteraram a secreção pulsátil de LH. Aos 3 h após a injeção do ICV, o animal foi eutanasiado, e o tecido neural fresco congelado foi coletado e cortado em criostato; a via de injeção cruzava-se claramente com o ventrículo lateral. O trato de injeção também foi visível no tecido neural de camundongos perfundidos com fixador (10 mL de solução salina heparinizada seguida de 20 mL de paraformaldeído a 4% em tampão fosfato). Exemplos de injeções corretamente colocadas são mostrados na Figura 2B. Dois exemplos de injeções colocadas incorretamente são mostrados na Figura 2C. Exemplos de injeções de tinta da Índia colocadas corretamente (à esquerda) e incorretamente são mostrados na Figura 2D. A injeção de tinta da Índia é útil para a prática desta técnica, pois permite a visualização clara do local de injeção. O fluxo de corante para ambos os ventrículos laterais e para o terceiro ventrículo pode ser visto em injeções corretamente colocadas (Figura 2D, esquerda).
Figura 1: Imagens que mostram o preparo do equipamento e as coordenadas de injeção para injeções de ICV à mão livre. (A) Configuração da estação de trabalho para injeções de ICV à mão livre. (B) Esquema para praticar o movimento necessário para colocar a injeção de ICV em camundongos fêmeas C57/BL6 de 3-4 meses de idade. (C) Localização aproximada do bregma em camundongos adultos. (D) Colocação da tubulação para revelar 3,5 mm da ponta da agulha para a injeção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Dados representativos do hormônio luteinizante e histologia relacionados às injeções de VCI à mão livre. (A) Perfil de pulso de LH antes e após a injeção do ICV. Os pontos de dados com preenchimento preto sólido representam pulsos determinados usando uma reformulação do PULSAR10 com os parâmetros sugeridos nessa referência para um camundongo OVX e um nível de detecção de 0,32 ng/mL. (B) Fotografias de uma secção coronal do cérebro de ratinhos com uma injeção de ICV corretamente colocada. (C) Fotografias de uma seção coronal do cérebro de camundongos com uma injeção de ICV colocada incorretamente: uma via de injeção lateral ao ventrículo (esquerda) e uma via de injeção dorsal ao ventrículo (direita). (D) Fotografias de uma seção coronal do cérebro de camundongos com uma injeção ICV corretamente colocada de tinta da Índia (esquerda) e uma injeção ICV incorretamente colocada de tinta da Índia (direita). Nota: os painéis B e C retratam cérebros perfundidos com paraformaldeído coletados 3 h após a injeção de soro fisiológico; O painel D retrata cérebros frescos coletados em gelo seco 2 minutos após a injeção de tinta da Índia. Barra de escala = 1 mm Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui, um meio simples e eficaz para fazer injeções de ICV em camundongos é descrito. Uma vez que esta técnica não requer uma estrutura estereotáxica, esta abordagem para a entrega central de drogas e agentes experimentais é acessível a mais pesquisadores. Além disso, essa abordagem é relativamente alta, uma vez que o procedimento de preparação e injeção pode ser realizado rapidamente.
Como esse procedimento requer a manipulação manual de agulhas e seringas de vidro utilizando distâncias aproximadas, recomenda-se que o novo praticante dedique algum tempo para praticar os movimentos antes de trabalhar com animais vivos. Além disso, cadáveres de camundongos podem ser úteis para a prática da identificação de bregma com a agulha. Uma vez que alguma confiança no movimento é adquirida, a experiência com animais de prática ao vivo dedicados é útil. Durante as sessões de treino, a injeção de 3 μL de tinta da Índia facilita a avaliação visual da colocação da injeção. Injeções corretamente colocadas resultarão em coloração preta no ventrículo lateral ipsilateral e, muitas vezes, no terceiro ventrículo e no ventrículo contralateral. A injeção de tinta é um procedimento terminal e os ratos não devem ser autorizados a se recuperar da anestesia após a injeção de tinta. Mesmo praticantes experientes podem se beneficiar de ensaiar o movimento lateral de 2 mm e caudal de 1 mm algumas vezes antes de fazer uma injeção. Além disso, é importante manter a seringa de vidro vertical quando colocada no cérebro. Com a prática, pode-se esperar que >75% das injeções sejam colocadas corretamente. Segurar a agulha no lugar por ~1 min após o volume total ter sido injetado pode ajudar a evitar o refluxo do líquido para fora do cérebro. Durante esse tempo, é essencial segurar a agulha na posição correta, sem movimento. A realização bem-sucedida deste procedimento requer experiência na manipulação e retenção confiáveis da agulha e da seringa de vidro.
Se algumas injeções não forem colocadas corretamente, há várias opções de solução de problemas. Primeiro, verifique se a agulha de injeção está reta (não dobrada) e se a agulha está firmemente fixada à seringa de vidro. Em seguida, se as injeções perdidas forem variáveis em sua localização, é necessária prática adicional de manipulação e retenção da seringa de vidro. Ter uma pessoa adicional para identificar se a seringa está sendo mantida verticalmente durante a injeção também pode ser útil. Encontrar bregma sobre a pele intacta com a agulha também requer prática. Levar tempo para identificar com confiança este marco antes de prosseguir com a injeção é altamente recomendado. Se as injeções forem consistentemente colocadas em um local incorreto, será necessário alterar as coordenadas de injeção. As coordenadas aqui descritas (±2 mm lateral, 1 mm caudal a bregma) são eficazes em camundongos adultos C57/BL6, mas essas coordenadas podem ter que ser ajustadas para outras cepas ou grupos etários.
Embora essa técnica possa ser altamente eficaz na entrega rápida de agentes centralmente, existem algumas limitações. Como o êmbolo da seringa é movido manualmente, a taxa de injeção pode ser variável. Recomenda-se injetá-lo relativamente lentamente para evitar potenciais efeitos fora do alvo da pressão no sistema ventricular. Um volume de injeção de 3 μL é recomendado neste protocolo; entretanto, um volume de injeção maior (5 μL) tem sido utilizado em outros laboratórios11. Dependendo do resultado medido, o volume e a taxa de injeção podem precisar ser ajustados. Por exemplo, camundongos juvenis só podem tolerar volumes de injeção menores. Assim, experimentos preliminares para testar os efeitos do veículo são recomendados. Uma limitação adicional é que a confirmação do posicionamento correto da injeção é limitada a uma avaliação um tanto subjetiva do trato de injeção após a coleta do tecido. O trato de injeção é visível tanto no tecido fresco congelado quanto no tecido perfundido com paraformaldeído coletado várias horas após a injeção de ICV (veja imagens em resultados representativos). Se várias injeções forem feitas, pode não ser claro a partir das marcas do trato se cada injeção foi colocada com sucesso.
Essa abordagem à mão livre para fazer injeções de VCI requer anestesia. Com a prática, as injeções podem ser feitas rapidamente, resultando em breve (3-5 min) exposição ao anestésico. Ao raspar a cabeça do camundongo e realizar a craniotomia (perfurar o crânio com uma agulha afiada) antes do dia do experimento, o tempo sob anestesia durante o experimento pode ser reduzido. Os ratos normalmente se recuperam totalmente dessa breve exposição à anestesia em poucos minutos. Coletar amostras de sangue da ponta da cauda imediatamente após a anestesia pode ser um desafio, então a amostragem pode ser suspensa por ~30 minutos após a injeção para minimizar o estresse nos camundongos, embora isso não seja estritamente necessário. Outros laboratórios também mediram com sucesso as alterações na secreção de LH (amostras únicas) 30 min após a administração de agentes farmacológicos usando essa técnica de VCI à mão livre 1,12. Mudanças no comportamento locomotor e ingestivo durante um período de 24 h também foram detectadas após a injeção de VCI13, para que o monitoramento em longo prazo possa ser realizado. Recomenda-se a realização de testes preliminares para determinar a facilidade de amostragem e os potenciais efeitos da anestesia sobre os desfechos de interesse.
Em resumo, a técnica de injeção de ICV à mão livre descrita aqui é um método simples, mas poderoso, de entregar agentes experimentais no cérebro. As vantagens específicas são que a abordagem é rápida e tecnicamente simples e permite uma alta taxa de injeções colocadas com sucesso. Além disso, como essa técnica requer apenas uma breve exposição à anestesia, ela pode ser combinada com uma variedade de outras técnicas, como amostragem frequente de sangue, manipulação de circuitos neurais ou gravação in vivo para investigar processos neuroendócrinos.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer à Dra. Kellie Breen Church, ao Sr. Michael Kreisman e à Sra. Jessica Jang por suas contribuições para a coleta dos dados mostrados nos resultados representativos. Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health (NIH) R00 HD104994 (R.B.M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18-gauge blunt needles | SAI Infusion | B18-150 | |
| 18-gauge needles | BD Medical | 305195 | |
| Alcohol pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Bench pad | Fisher Scientific | 14-206-62AC22 | |
| Betadine solution | Fisher Scientific | NC1696484 | |
| Buprenorphine | Patterson Vet Supply | 07-892-5235 | Controlled substance |
| Eyelube | Fisher Scientific | 50-218-8442 | |
| Glass syringe | Hamilton | 7634-01 | |
| Injection needle | Hamilton | 7803-01 | 27 gauge, Small Hub RN needle, point style: 4, Needle length: 10cm, Angle: 45 |
| Isoflurane | Patterson Vet Supply | 07-893-8441 | |
| Isoflurane vaporizer | Vet Equip | V-10 | |
| Laboratory Tape | VWR | 89098-128 | |
| Medical grade oxygen | Airgas | OX USPEA | |
| Paraformaldehyde | Millipore-Sigma | 8.18715.1000 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | J67802.K2 | |
| PulsaR Software | Open source, University of Otago | See ref 9 | |
| Ruler | Fisher Scientific | 12-00-152 | |
| Silastic tubing (0.040" I.D.) | DOW | 508-005 | |
| Silastic tubing (0.078" I.D.) | DOW | 508-009 | |
| Sterile saline | VWR | 101320-574 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 |
References
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