Summary
यहां, एक फ्री-हैंड दृष्टिकोण (यानी, स्टीरियोटेक्सिक डिवाइस के बिना) का उपयोग करके चूहों में इनट्रेस्रेब्रोवेंट्रिकुलर इंजेक्शन करने के लिए एक सरल और तेज़ दृष्टिकोण का वर्णन किया गया है।
Abstract
न्यूरोएंडोक्राइन सिस्टम की जांच के लिए अक्सर चूहों के दिमाग में सीधे दवाओं, वायरस या अन्य प्रयोगात्मक एजेंटों के वितरण की आवश्यकता होती है। एक इनट्रेसरेब्रोवेंट्रिकुलर (आईसीवी) इंजेक्शन पूरे मस्तिष्क में प्रयोगात्मक एजेंट के व्यापक वितरण की अनुमति देता है (विशेष रूप से वेंट्रिकल्स के पास संरचनाओं में)। यहां, वयस्क चूहों में फ्री-हैंड आईसीवी इंजेक्शन बनाने के तरीकों का वर्णन किया गया है। चूहों के सिर पर दृश्य और स्पर्श स्थलों का उपयोग करके, पार्श्व वेंट्रिकल्स में इंजेक्शन तेजी से और मज़बूती से बनाया जा सकता है। इंजेक्शन प्रयोगकर्ता के हाथ में पकड़े गए ग्लास सिरिंज के साथ बनाए जाते हैं और लैंडमार्क से अनुमानित दूरी पर रखे जाते हैं। इस प्रकार, इस तकनीक को स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम की आवश्यकता नहीं है। इसके अलावा, इस तकनीक के लिए केवल संक्षिप्त आइसोफ्लुरेन संज्ञाहरण की आवश्यकता होती है, जो जागृत, स्वतंत्र रूप से व्यवहार करने वाले चूहों में माउस व्यवहार और / या शरीर विज्ञान के बाद के मूल्यांकन की अनुमति देता है। फ्री-हैंड आईसीवी इंजेक्शन जीवित चूहों के दिमाग में प्रयोगात्मक एजेंटों के कुशल वितरण के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है और इसे न्यूरोएंडोक्राइन प्रक्रियाओं की जांच के लिए लगातार रक्त नमूनाकरण, तंत्रिका सर्किट हेरफेर या विवो रिकॉर्डिंग जैसी अन्य तकनीकों के साथ जोड़ा जा सकता है।
Introduction
मस्तिष्क में प्रयोगात्मक एजेंटों, जैसे कि ड्रग्स1, वायरस2, या सेल3 का वितरण अक्सर न्यूरोएंडोक्राइन अनुसंधान के लिए आवश्यक होता है। यदि एजेंट आसानी से रक्त-मस्तिष्क बाधा को पार नहीं करता है या प्रयोगात्मक उद्देश्य विशेष रूप से एजेंट के केंद्रीय प्रभावों का परीक्षण करना है, तो मस्तिष्क में इंजेक्शन देने के लिए एक विश्वसनीय विधि होना महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, इनट्रेसेब्रोवेंट्रिकुलर (आईसीवी) अंतरिक्ष में इंजेक्शन मस्तिष्क में एजेंट को व्यापक रूप से वितरित करने का अवसर प्रदान करता है और एक बड़ा लक्ष्य क्षेत्र प्रदान करता है, इस प्रकार सफल इंजेक्शन2 की संभावना बढ़ जाती है।
आईसीवी इंजेक्शन बनाने के लिए एक सामान्य विधि में एक स्थायी निवास कैनुला का प्लेसमेंट शामिल है। इस दृष्टिकोण में, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध या कस्टम-निर्मित कैनुला को स्थान देने के लिए एक स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम आवश्यक है, क्योंकि कैनुला को जगह में चिपकाया या सीमेंट किया जाता है। अक्सर, ठीक होने पर, एंजियोटेंसिन II की एक सुप्राफिजियोलॉजिकल खुराक को कैनुला के माध्यम से प्रशासित किया जाता है, और यदि पीने के व्यवहार को तुरंत देखा जाता है, तो कैनुला को सही ढंगसे रखा जाता है। इस दृष्टिकोण के कई फायदे हैं, जिसमें दीर्घकालिक जलसेक करने की क्षमता और एक ही जानवर को कई बार इंजेक्ट करने की क्षमता शामिल है; इसके अतिरिक्त, यदि एंजियोटेंसिन II नियोजित है, तो प्रयोगात्मक यौगिकों के प्रशासन से पहले सही प्लेसमेंट की पुष्टि की जा सकती है। हालांकि, एक स्थायी प्रवेशनी रखने की कुछ सीमाएं हैं, जिनमें महंगे उपकरण (स्टीरियोटेक्सिक फ्रेम) की आवश्यकता, प्लेसमेंट के बाद कैनुला को नुकसान की संभावना (उदाहरण के लिए, चूहे पिंजरे के साथी के प्रवेशनी पर चबा सकते हैं), और स्थायी प्रवेशनी के आसपास संक्रमण की संभावना शामिल है। एकल आईसीवी इंजेक्शन को स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम3 के उपयोग के साथ बनाया जा सकता है, जो प्रभावी होने के बावजूद, संज्ञाहरण के लिए पर्याप्त जोखिम की आवश्यकता होती है और इस प्रकार, उपचार के कुछ तीव्र शारीरिक और व्यवहार संबंधी प्रभावों को अस्पष्ट कर सकता है। इसके अतिरिक्त, एक स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम में चूहों के प्लेसमेंट को स्थिर प्लेसमेंट प्राप्त करने और कान नहरों के टूटने को रोकने के लिए पर्याप्त प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है।
यहां, चूहों में फ्री-हैंड इंजेक्शन बनाने के लिए एक स्थापित विधि का वर्णन किया गया है। यह विधि पिछली रिपोर्ट 5,6 पर आधारित है। इस तकनीक के फायदे यह हैं कि यह सरल, तेज़ है, और स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम जैसे विशेष उपकरणों की आवश्यकता नहीं है। जैसा कि नीचे वर्णित है, इस प्रक्रिया में इंजेक्शन बनाने के लिए माउस सिर पर लैंडमार्क के सापेक्ष एक ग्लास सिरिंज में हेरफेर करना शामिल है, जिसे तेजी से किया जा सकता है और इस प्रकार, प्रयोगात्मक दिन पर केवल कुछ मिनटों के गैस संज्ञाहरण की आवश्यकता होती है।
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Protocol
सभी प्रक्रियाओं को कोलोराडो स्टेट यूनिवर्सिटी (# 3960) और कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय सैन डिएगो संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समितियों द्वारा अनुमोदित किया गया था, जहां प्रतिनिधि डेटा एकत्र किया गया था (एस 13235, पीआई केली ब्रीन चर्च)। पांच वयस्क महिला और दो वयस्क पुरुष C57 / BL6 चूहों (9-16 सप्ताह पुराने) के डेटा को प्रतिनिधि डेटा अनुभाग में दर्शाया गया है। मादा चूहों को आईसीवी इंजेक्शन और रक्त संग्रह से 3-4 सप्ताह पहले अंडाशय ति किया गया था जैसा कि पहले वर्णितकिया गया था। प्रयोग से पहले, इन चूहों को 12 घंटे के प्रकाश / 12 घंटे के अंधेरे प्रकाश चक्र के साथ रखा गया था और प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड के अनुसार फ़ीड और पानी तक मुफ्त पहुंच थी।
1. क्रैनियोटॉमी का प्रदर्शन
नोट: क्रैनियोटॉमी वास्तविक इंजेक्शन से एक या अधिक दिन पहले किया जा सकता है, जो प्रयोग के दिन इंजेक्शन प्रक्रिया को तेज बनाता है।
- नीचे वर्णित के रूप में क्रैनियोटॉमी के लिए सामग्री तैयार करें।
- काम की सतह पर एक साफ बेंच पैड या ड्रेप सामग्री रखें। एक आइसोफ्लुरेन वेपोराइज़र के नाक शंकु को काम की सतह पर टेप करें (प्रयोगकर्ता के करीब, लेकिन दूर की ओर; चित्र 1 ए देखें)।
- एक बाँझ तेज 18 ग्राम सुई के अंत पर सिलास्टिक टयूबिंग रखें ताकि सुई की नोक का ~ 1 मिमी बाहर निकल जाए। एक बाँझ कुंद सुई के अंत पर सिलास्टिक ट्यूबिंग रखें ताकि सुई की नोक का ~ 1 मिमी बाहर निकल जाए।
नोट: प्रत्येक माउस के लिए अलग और बाँझ पूर्व-पैक की गई सुइयों (तेज और कुंद) का उपयोग किया जाना चाहिए। - इंजेक्शन साइट तैयार करने के लिए एक इलेक्ट्रिक शेवर, आयोडीन स्क्रब, बाँझ धुंध और अल्कोहल पैड इकट्ठा करें।
- नीचे वर्णित सुई को 2 मिमी पार्श्व और 1 मिमी पुच्छल को हिलाने का अभ्यास करें।
- कागज की एक शीट को शुरुआती बिंदु के साथ चिह्नित करने के लिए एक शासक और एक कलम का उपयोग करें (यह ब्रेग्मा होगा), बाएं या दाएं 2 मिमी का निशान, और अंतिम एक के ऊपर 1 मिमी का एक और निशान (यह इंजेक्शन साइट होगी; चित्रा 1 बी देखें)।
- सुई को शुरुआती बिंदु से बिंदु 1 को चिह्नित बिंदु 2 (ब्रेग्मा से इंजेक्शन साइट) तक ले जाने का अभ्यास करें जब तक कि यह विश्वास न हो कि गाइड के बिना आंदोलन दोहराया जा सकता है।
नोट: यहां वर्णित निर्देशांक वयस्क सी 57 / बीएल 6 चूहों में प्रभावी हैं, लेकिन अन्य उपभेदों या आयु समूहों को समायोजन की आवश्यकता हो सकती है।
- नीचे वर्णित के रूप में क्रैनियोटॉमी के लिए माउस तैयार करें।
- माउस को एक प्रेरण कक्ष में रखें और मेडिकल-ग्रेड ऑक्सीजन में 3% -4% आइसोफ्लुरेन के साथ माउस को एनेस्थेटाइज करें। प्रक्रिया के साथ अभ्यास और परिचितता के साथ, क्रानियोटॉमी प्रक्रिया के लिए आइसोफ्लुरेन एक्सपोजर की कुल अवधि को 10 मिनट से कम करें।
सावधानी: आइसोफ्लूरेन एक्सपोजर मानव स्वास्थ्य के लिए खतरनाक है; अपशिष्ट गैसों को साफ करने के साधनों के साथ एक अच्छी तरह हवादार क्षेत्र में एक अनुमोदित और निरीक्षण किए गए आइसोफ्लुरेन वेपोराइज़र का उपयोग करें। - एक बार पैर की अंगुली रिफ्लेक्स अनुपस्थित होने के बाद, जानवर के सिर को शेव करें। आई लुब्रिकेंट लगाएं।
- संज्ञाहरण बनाए रखने के लिए नाक शंकु में सिर के साथ माउस को काम की सतह पर रखें।
- एक एनाल्जेसिक एजेंट का प्रबंधन करें, जैसे कि ब्यूप्रेनोर्फिन (0.6-0.8 मिलीग्राम / किलोग्राम माउस शरीर का वजन, चमड़े के नीचे), जैसा कि आपूर्तिकर्ता द्वारा निर्देशित किया गया है।
- आयोडीन के घोल में डुबोए गए बाँझ धुंध के साथ सिर को पोंछकर इंजेक्शन साइट को साफ करें (तीन स्क्रब करें), और फिर अल्कोहल स्क्रब पैड से पोंछें (तीन बार प्रदर्शन करें)।
नोट: फर को हटा दें और इंजेक्शन साइट के आसपास की त्वचा को साफ करें और संक्रमण को रोकने के लिए अमेरिकन वेटरनरी मेडिकल एसोसिएशन द्वारा अनुशंसित बाँझ उपकरणों और सुइयों का उपयोग करें।
- माउस को एक प्रेरण कक्ष में रखें और मेडिकल-ग्रेड ऑक्सीजन में 3% -4% आइसोफ्लुरेन के साथ माउस को एनेस्थेटाइज करें। प्रक्रिया के साथ अभ्यास और परिचितता के साथ, क्रानियोटॉमी प्रक्रिया के लिए आइसोफ्लुरेन एक्सपोजर की कुल अवधि को 10 मिनट से कम करें।
- गैर-प्रमुख हाथ से माउस के सिर को मजबूती से पकड़ें। सिर को यथासंभव काम की सतह पर सपाट रखें।
- इंजेक्शन की साइट का पता लगाएं।
- पहले ब्रेग्मा की पहचान करने के लिए तैयार तेज 18 ग्राम सुई का उपयोग करें; इसके लिए, सुई को मध्य रेखा के साथ सिर की त्वचा के पार खींचें, रोस्ट्रल-कॉडल प्लेन में घूमें। एक समबाहु त्रिभुज की कल्पना करें जिसमें दो शीर्ष आंखें हैं और तीसरा शीर्ष ब्रेग्मा का अनुमानित स्थान है ( चित्र 1 सी देखें)।
- ब्रेग्मा से, सुई को 2 मिमी पार्श्व और 1 मिमी पुच्छल को इंजेक्शन की साइट पर ले जाएं।
- सुई को लंबवत पकड़ते समय, सुई को त्वचा और हड्डी के माध्यम से दृढ़ता से धक्का दें जब तक कि ट्यूबिंग त्वचा के साथ फ्लश न हो जाए।
- सुई को वापस लें, सुई को घुमाएं, और त्वचा और हड्डी के माध्यम से फिर से दबाएं। प्रक्रिया को तब तक दोहराएं जब तक कि हड्डी में एक छोटा छेद न बन जाए।
- यह जांचने के लिए कुंद सुई का उपयोग करें कि हड्डी में पर्याप्त छेद उत्पन्न हुआ है। कुंद सुई के गुजरने के लिए हड्डी में एक छेद को पर्याप्त बड़ा बनाने का लक्ष्य रखें।
- नाक के शंकु से माउस निकालें, बाँझ धुंध के साथ इंजेक्शन साइट से किसी भी रक्त को साफ करें, और माउस को जागने तक एक पिंजरे वार्मर पर पिंजरे में रखें। चूंकि क्रैनियोटॉमी द्वारा किया गया उद्घाटन छोटा है (18 ग्राम सुई), साइट को सीवन या घाव क्लिप के साथ बंद करने की आवश्यकता नहीं है।
नोट: यहां उत्पादित उद्घाटन छोटा (18 ग्राम) है, इसलिए कई संस्थान इस प्रक्रिया को सर्जरी के विपरीत एक इंजेक्शन मानते हैं। इसके अलावा, हालांकि मस्तिष्क के लिए त्वचा और हड्डी के माध्यम से एक उद्घाटन किया जाता है, त्वचा को तना हुआ रखने से छेद संरेखित नहीं होते हैं, जो संभवतः त्वचा के वनस्पतियों या पिंजरे के बिस्तर को मस्तिष्क से संपर्क करने से रोकने में सहायता करता है।
2. इंजेक्शन बनाना
- नीचे वर्णित इंजेक्शन के लिए सामग्री तैयार करें।
- काम की सतह पर एक साफ बेंच पैड या ड्रेप सामग्री रखें। एक आइसोफ्लुरेन वेपोराइज़र के नाक शंकु को काम की सतह पर टेप करें (प्रयोगकर्ता के करीब, लेकिन दूर की ओर; चित्र 1 ए देखें)।
- 5 μL ग्लास सिरिंज पर 45 ° बेवेल के साथ 10 मिमी लंबी 27 ग्राम सुई संलग्न करें। सुई पर सिलास्टिक टयूबिंग रखें ताकि सुई की नोक का 3.5 मिमी बाहर निकल जाए; सिरिंज शरीर पर टयूबिंग को पकड़ने के लिए प्रयोगशाला टेप का उपयोग करें ( चित्रा 1 डी देखें)।
- एक ट्यूब में इंजेक्शन मीडिया (दवा, वायरस, या इंजेक्शन के लिए अन्य तरल) तैयार करें। इस अध्ययन में प्रतिनिधि परिणामों के लिए, बाँझ आइसोटोनिक खारा इंजेक्शन दिया गया था।
नोट: एक ट्यूब का चयन करें जो ग्लास सिरिंज और सुई द्वारा पहुंच की अनुमति देता है, जैसे कि 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब। - ग्लास सिरिंज में इंजेक्शन मीडिया के 3 μL खींचें। सबसे पहले, वांछित मात्रा से अधिक खींचें, और सिरिंज में 3 μL रहने तक बाहर निकालें।
- इंजेक्शन साइट तैयार करने के लिए आयोडीन स्क्रब, बाँझ धुंध और अल्कोहल पैड इकट्ठा करें।
- काउंट-अप मोड में एक प्रयोगशाला टाइमर शुरू करें और टाइमर रखें ताकि यह इंजेक्शन बनाते समय प्रयोगकर्ता को दिखाई दे।
- पिछले दिन किए गए प्रदर्शन के अनुसार सुई को 2 मिमी पार्श्व और 1 मिमी पुच्छल को हिलाने का अभ्यास करें।
- नीचे वर्णित इंजेक्शन के लिए माउस तैयार करें।
- माउस को प्रेरण कक्ष में रखें और माउस को आइसोफ्लुरेन के साथ एनेस्थेटाइज करें। एक बार पैर की अंगुली रिफ्लेक्स अनुपस्थित होने के बाद, आंखों के स्नेहक को लागू करें, और नाक शंकु में सिर के साथ काम की सतह पर माउस रखें।
- इंजेक्शन साइट को आयोडीन और अल्कोहल के तीन वाइप्स के साथ साफ करें। चरण 1.8 में वर्णित 18 ग्राम सुई (या कुंद सुई) के साथ इंजेक्शन साइट की पहचान करें। क्रैनियोटॉमी के दौरान बनाए गए छेद का पता लगाया जाना चाहिए।
नोट: यदि क्रैनियोटॉमी पहले से नहीं किया गया है, या यदि खोपड़ी में छेद का पता लगाने योग्य नहीं है, तो क्रैनियोटॉमी यहां किया जा सकता है।
- नीचे वर्णित ग्लास सिरिंज के साथ इंजेक्शन करें।
- गैर-प्रमुख हाथ से माउस के सिर को मजबूती से पकड़ें। सिर को यथासंभव काम की सतह पर सपाट रखें।
- कांच की सिरिंज की सुई को खोपड़ी में छेद के माध्यम से तब तक रखें जब तक कि चरण 2.1.2 में तैयार सुई के ऊपर रखी गई टयूबिंग माउस की त्वचा पर न टिकी हो।
- सिरिंज को जितना संभव हो उतना लंबवत रखें, कोरोनल और दोनों विमानों पर ध्यान दें। धीरे-धीरे 1 मिनट की अवधि में मीडिया को इंजेक्ट करें।
- बैकफ्लो को कम करने के लिए इंजेक्शन के पूरा होने के बाद एक और मिनट के लिए सिरिंज और सुई को रखें। धीरे-धीरे माउस के सिर से सुई को पीछे हटाएं।
- नाक के शंकु से माउस निकालें, बाँझ धुंध के साथ इंजेक्शन साइट से किसी भी रक्त को साफ करें (यदि कोई मौजूद है), और माउस को जागने तक एक पिंजरे वार्मर पर पिंजरे में रखें।
3. इंजेक्शन स्थान की पुष्टि
- फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) में खारा और 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ माउस को गहराई से एनेस्थेटाइज और प्रत्यारोपित करें जैसा कि पहले वर्णितहै। मस्तिष्क को पीबीएस में 30% सुक्रोज में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें जब तक कि मस्तिष्क डूब न जाए (आमतौर पर 2 दिन)।
- क्रायोस्टैट पर 20-50 μm कोरोनल सेक्शन काटें जैसा कि पहले वर्णितहै 9. सेक्शनिंग करते समय, ऊतक ब्लॉक में इंजेक्शन पथ का निरीक्षण करें। रिकॉर्ड करें कि क्या इंजेक्शन पथ स्पष्ट रूप से पार्श्व वेंट्रिकल को प्रतिच्छेद करता है।
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Representative Results
जब सफलतापूर्वक प्रदर्शन किया जाता है, तो यह तकनीक वेंट्रिकुलर सिस्टम में एक प्रयोगात्मक एजेंट के तेजी से वितरण की अनुमति देती है। एक अंडाशय युक्त माउस से एक ल्यूटिनाइजिंग हार्मोन (एलएच) पल्स प्रोफाइल जिसे बाँझ आइसोटोनिक खारा के 3 μL का आईसीवी इंजेक्शन प्राप्त हुआ, जो कई औषधीय यौगिकों के लिए वाहन है, चित्र 2 ए में दिखाया गया है। यह उदाहरण दर्शाता है कि गैस संज्ञाहरण के संक्षिप्त संपर्क और अकेले वेंट्रिकुलर सिस्टम में 3 μL तरल पदार्थ के इंजेक्शन ने पल्सेटाइल एलएच स्राव को नहीं बदला। आईसीवी इंजेक्शन के 3 घंटे बाद, जानवर को इच्छामृत्यु दी गई थी, और ताजा जमे हुए तंत्रिका ऊतक को एकत्र किया गया था और क्रायोस्टैट पर काटा गया था; इंजेक्शन पथ स्पष्ट रूप से पार्श्व वेंट्रिकल के साथ प्रतिच्छेद करता है। इंजेक्शन पथ चूहों से तंत्रिका ऊतक में भी दिखाई दे रहा था जो फिक्सेटिव (10 एमएल हेपरिनाइज्ड सेलाइन के बाद फॉस्फेट बफर में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के 20 एमएल) के साथ संक्रमित था। सही ढंग से रखे गए इंजेक्शन के उदाहरण चित्रा 2 बी में दिखाए गए हैं। गलत तरीके से रखे गए इंजेक्शन के दो उदाहरण चित्रा 2 सी में दिखाए गए हैं। भारत स्याही के सही (बाएं) और गलत तरीके से रखे गए इंजेक्शन के उदाहरण चित्र 2 डी में दिखाए गए हैं। भारत स्याही का इंजेक्शन इस तकनीक का अभ्यास करने के लिए उपयोगी है क्योंकि यह इंजेक्शन स्थान के स्पष्ट विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है। पार्श्व वेंट्रिकल और तीसरे वेंट्रिकल दोनों में डाई का प्रवाह सही तरीके से रखे गए इंजेक्शन (चित्रा 2 डी, बाएं) में देखा जा सकता है।
चित्रा 1: उपकरण की तैयारी और फ्री-हैंड आईसीवी इंजेक्शन के लिए इंजेक्शन निर्देशांक को दर्शाने वाली छवियां। (ए) फ्री-हैंड आईसीवी इंजेक्शन के लिए वर्कस्टेशन का कॉन्फ़िगरेशन। (बी) 3-4 महीने की मादा सी 57 / बीएल 6 चूहों में आईसीवी इंजेक्शन लगाने के लिए आवश्यक आंदोलन का अभ्यास करने के लिए स्कीमा। (सी) वयस्क चूहों में ब्रेग्मा का अनुमानित स्थान। (डी) इंजेक्शन के लिए सुई की नोक के 3.5 मिमी को प्रकट करने के लिए टयूबिंग का प्लेसमेंट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: फ्री-हैंड आईसीवी इंजेक्शन से संबंधित प्रतिनिधि ल्यूटिनाइजिंग हार्मोन और हिस्टोलॉजी डेटा। (ए) आईसीवी इंजेक्शन से पहले और बाद में एलएच पल्स प्रोफाइल। ठोस ब्लैक फिल वाले डेटा पॉइंट दालों का प्रतिनिधित्व करते हैं जैसा कि ओवीएक्स माउस के लिए उस संदर्भ में सुझाए गए मापदंडों के साथ पल्सर10 के पुन: निर्माण का उपयोग करके निर्धारित किया गया है और 0.32 एनजी / एमएल का पता लगाने का स्तर है। (बी) सही ढंग से रखे गए आईसीवी इंजेक्शन के साथ माउस मस्तिष्क के एक कोरोनल खंड की तस्वीरें। (सी) गलत तरीके से रखे गए आईसीवी इंजेक्शन के साथ माउस मस्तिष्क के एक कोरोनल खंड की तस्वीरें: वेंट्रिकल (बाएं) के पार्श्व में एक इंजेक्शन ट्रैक्ट, और वेंट्रिकल (दाएं) के लिए एक इंजेक्शन पथ पृष्ठीय। (डी) माउस मस्तिष्क के एक कोरोनल खंड की तस्वीरें, जिसमें भारत स्याही (बाएं) का सही ढंग से रखा गया आईसीवी इंजेक्शन और भारत स्याही (दाएं) का गलत तरीके से रखा गया आईसीवी इंजेक्शन है। नोट: पैनल बी और सी खारा के इंजेक्शन के 3 घंटे बाद एकत्र किए गए पैराफॉर्मलडिहाइड-संक्रमित दिमाग को दर्शाते हैं; पैनल डी में भारत की स्याही के इंजेक्शन के 2 मिनट बाद सूखी बर्फ पर एकत्र किए गए ताजा दिमाग को दर्शाया गया है। स्केल बार = 1 मिमी कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
यहां, चूहों में आईसीवी इंजेक्शन बनाने के लिए एक सरल और प्रभावी साधन का वर्णन किया गया है। चूंकि इस तकनीक को स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम की आवश्यकता नहीं है, इसलिए दवाओं और प्रयोगात्मक एजेंटों के केंद्रीय वितरण के लिए यह दृष्टिकोण अधिक शोधकर्ताओं के लिए सुलभ है। इसके अतिरिक्त, यह दृष्टिकोण अपेक्षाकृत उच्च थ्रूपुट है क्योंकि तैयारी और इंजेक्शन प्रक्रिया जल्दी से की जा सकती है।
चूंकि इस प्रक्रिया में अनुमानित दूरी का उपयोग करके सुइयों और हाथ से एक ग्लास सिरिंज के हेरफेर की आवश्यकता होती है, इसलिए यह सलाह दी जाती है कि नए चिकित्सक जीवित जानवरों के साथ काम करने से पहले आंदोलनों का अभ्यास करने के लिए कुछ समय समर्पित करें। इसके अतिरिक्त, माउस कैडेवर सुई के साथ ब्रेग्मा की पहचान करने का अभ्यास करने के लिए उपयोगी हो सकते हैं। एक बार जब आंदोलन में कुछ आत्मविश्वास प्राप्त हो जाता है, तो समर्पित लाइव अभ्यास जानवरों के साथ अनुभव सहायक होता है। अभ्यास सत्र ों के दौरान, भारत स्याही के 3 μL का इंजेक्शन इंजेक्शन प्लेसमेंट के दृश्य मूल्यांकन को आसान बनाता है। सही ढंग से रखे गए इंजेक्शन के परिणामस्वरूप ऊपरी पार्श्व वेंट्रिकल में और अक्सर तीसरे वेंट्रिकल और विपरीत पार्श्व वेंट्रिकल में काला धुंधलापन होगा। स्याही का इंजेक्शन एक टर्मिनल प्रक्रिया है और चूहों को स्याही इंजेक्शन के बाद संज्ञाहरण से उबरने की अनुमति नहीं दी जानी चाहिए। यहां तक कि अनुभवी चिकित्सकों को इंजेक्शन बनाने से पहले कुछ बार 2 मिमी पार्श्व और 1 मिमी पुच्छल आंदोलन का अभ्यास करने से लाभ हो सकता है। इसके अतिरिक्त, मस्तिष्क में रखे जाने पर ग्लास सिरिंज को ऊर्ध्वाधर पकड़ना महत्वपूर्ण है। अभ्यास के साथ, >75% इंजेक्शन सही ढंग से रखे जाने की उम्मीद की जा सकती है। पूर्ण मात्रा इंजेक्ट किए जाने के बाद ~ 1 मिनट के लिए सुई को पकड़ना मस्तिष्क से तरल के बैकफ्लो को रोकने में मदद कर सकता है। इस समय के दौरान, सुई को बिना किसी आंदोलन के सही स्थिति में पकड़ना आवश्यक है। इस प्रक्रिया के सफल प्रदर्शन के लिए सुई और ग्लास सिरिंज को मज़बूती से हेरफेर करने और पकड़ने में अनुभव की आवश्यकता होती है।
यदि कुछ इंजेक्शन सही तरीके से नहीं रखे गए हैं, तो कई समस्या निवारण विकल्प हैं। सबसे पहले, जांचें कि इंजेक्शन सुई सीधी है (मुड़ी हुई नहीं) और सुई को ग्लास सिरिंज पर कसकर तय किया गया है। इसके बाद, यदि छूटे हुए इंजेक्शन उनके स्थान में परिवर्तनशील हैं, तो ग्लास सिरिंज में हेरफेर करने और पकड़ने का अतिरिक्त अभ्यास आवश्यक है। इंजेक्शन के दौरान सिरिंज को लंबवत रूप से रखा जा रहा है या नहीं, यह पता लगाने के लिए एक अतिरिक्त व्यक्ति होना भी सहायक हो सकता है। सुई के साथ बरकरार त्वचा पर ब्रेग्मा खोजने के लिए भी अभ्यास की आवश्यकता होती है। इंजेक्शन के साथ आगे बढ़ने से पहले आत्मविश्वास से इस लैंडमार्क की पहचान करने के लिए समय निकालना अत्यधिक अनुशंसित है। यदि इंजेक्शन लगातार गलत स्थान पर रखे जाते हैं, तो इंजेक्शन निर्देशांक को बदलना आवश्यक होगा। यहां वर्णित निर्देशांक (±2 मिमी पार्श्व, 1 मिमी पुच्छल से ब्रेग्मा) वयस्क सी 57 / बीएल 6 चूहों में प्रभावी हैं, लेकिन इन निर्देशांकों को अन्य उपभेदों या आयु समूहों के लिए समायोजित करना पड़ सकता है।
हालांकि यह तकनीक तेजी से एजेंटों को केंद्रीय रूप से वितरित करने में अत्यधिक प्रभावी हो सकती है, लेकिन कुछ सीमाएं हैं। चूंकि सिरिंज के प्लंजर को हाथ से स्थानांतरित किया जाता है, इसलिए इंजेक्शन की दर परिवर्तनशील हो सकती है। वेंट्रिकुलर सिस्टम में दबाव के संभावित ऑफ-टारगेट प्रभावों से बचने के लिए इसे अपेक्षाकृत धीरे-धीरे इंजेक्ट करने की सलाह दी जाती है। इस प्रोटोकॉल में 3 μL की एक इंजेक्शन मात्रा की सिफारिश की जाती है; हालांकि, अन्य प्रयोगशालाओं में एक बड़ी इंजेक्शन मात्रा (5 μL) का उपयोग किया गयाहै। मापा परिणाम के आधार पर, इंजेक्शन की मात्रा और दर को समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है। उदाहरण के लिए, किशोर चूहे केवल छोटे इंजेक्शन वॉल्यूम को सहन कर सकते हैं। इस प्रकार, वाहन प्रभावों के परीक्षण के लिए प्रारंभिक प्रयोगों की सिफारिश की जाती है। एक अतिरिक्त सीमा यह है कि सही इंजेक्शन प्लेसमेंट की पुष्टि ऊतक एकत्र होने के बाद इंजेक्शन पथ के कुछ हद तक व्यक्तिपरक मूल्यांकन तक सीमित है। इंजेक्शन पथ आईसीवी इंजेक्शन के कई घंटों बाद एकत्र किए गए ताजा-जमे हुए और पैराफॉर्मलडिहाइड-संक्रमित ऊतक दोनों में दिखाई देता है (प्रतिनिधि परिणामों में छवियां देखें)। यदि कई इंजेक्शन बनाए जाते हैं, तो यह पथ के निशान से स्पष्ट नहीं हो सकता है कि प्रत्येक इंजेक्शन सफलतापूर्वक रखा गया था या नहीं।
आईसीवी इंजेक्शन बनाने के लिए इस फ्री-हैंड दृष्टिकोण के लिए संज्ञाहरण की आवश्यकता होती है। अभ्यास के साथ, इंजेक्शन तेजी से बनाया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप एनेस्थेटिक के लिए संक्षिप्त (3-5 मिनट) जोखिम होता है। माउस के सिर को शेव करके और प्रयोगात्मक दिन से पहले क्रैनियोटॉमी (एक तेज सुई के साथ खोपड़ी को छेदना) करके, प्रयोग के दौरान संज्ञाहरण के तहत समय को कम किया जा सकता है। चूहे आमतौर पर कुछ मिनटों के भीतर संज्ञाहरण के इस संक्षिप्त जोखिम से पूरी तरह से ठीक हो जाते हैं। संज्ञाहरण के तुरंत बाद टेल-टिप रक्त के नमूने एकत्र करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है, इसलिए चूहों में तनाव को कम करने के लिए इंजेक्शन के बाद ~ 30 मिनट के लिए नमूना करण निलंबित किया जा सकता है, हालांकि यह सख्ती से आवश्यक नहीं है। अन्य प्रयोगशालाओं ने भी इस फ्री-हैंड आईसीवी तकनीक 1,12 का उपयोग करके औषधीय एजेंटों के प्रशासन के बाद 30 मिनट बाद एलएच स्राव (वन-ऑफ सैंपल) में परिवर्तन को सफलतापूर्वक मापा है। आईसीवी इंजेक्शन13 के बाद 24 घंटे की अवधि में लोकोमोटर और इंजेटिव व्यवहार में परिवर्तन का भी पता चला है, इसलिए दीर्घकालिक निगरानी की जा सकती है। नमूनाकरण की आसानी और रुचि के परिणामों पर संज्ञाहरण के संभावित प्रभावों को निर्धारित करने के लिए प्रारंभिक परीक्षण करने की सिफारिश की जाती है।
सारांश में, यहां वर्णित फ्री-हैंड आईसीवी इंजेक्शन तकनीक मस्तिष्क में प्रयोगात्मक एजेंटों को पहुंचाने का एक सरल लेकिन शक्तिशाली तरीका है। विशिष्ट लाभ यह है कि दृष्टिकोण त्वरित और तकनीकी रूप से सरल है और सफलतापूर्वक रखे गए इंजेक्शन की उच्च दर को सक्षम बनाता है। इसके अलावा, चूंकि इस तकनीक को संज्ञाहरण के केवल संक्षिप्त जोखिम की आवश्यकता होती है, इसलिए इसे न्यूरोएंडोक्राइन प्रक्रियाओं की जांच के लिए लगातार रक्त नमूनाकरण, तंत्रिका सर्किट हेरफेर या विवो रिकॉर्डिंग जैसी कई अन्य तकनीकों के साथ जोड़ा जा सकता है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
हम प्रतिनिधि परिणामों में दिखाए गए डेटा को एकत्र करने में उनके योगदान के लिए डॉ केली ब्रीन चर्च, श्री माइकल क्रेसमैन और सुश्री जेसिका जंग को धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) आर 00 HD104994 (आरबीएम) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18-gauge blunt needles | SAI Infusion | B18-150 | |
| 18-gauge needles | BD Medical | 305195 | |
| Alcohol pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Bench pad | Fisher Scientific | 14-206-62AC22 | |
| Betadine solution | Fisher Scientific | NC1696484 | |
| Buprenorphine | Patterson Vet Supply | 07-892-5235 | Controlled substance |
| Eyelube | Fisher Scientific | 50-218-8442 | |
| Glass syringe | Hamilton | 7634-01 | |
| Injection needle | Hamilton | 7803-01 | 27 gauge, Small Hub RN needle, point style: 4, Needle length: 10cm, Angle: 45 |
| Isoflurane | Patterson Vet Supply | 07-893-8441 | |
| Isoflurane vaporizer | Vet Equip | V-10 | |
| Laboratory Tape | VWR | 89098-128 | |
| Medical grade oxygen | Airgas | OX USPEA | |
| Paraformaldehyde | Millipore-Sigma | 8.18715.1000 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | J67802.K2 | |
| PulsaR Software | Open source, University of Otago | See ref 9 | |
| Ruler | Fisher Scientific | 12-00-152 | |
| Silastic tubing (0.040" I.D.) | DOW | 508-005 | |
| Silastic tubing (0.078" I.D.) | DOW | 508-009 | |
| Sterile saline | VWR | 101320-574 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 |
References
- Roseweir, A. K., et al. Discovery of potent kisspeptin antagonists delineate physiological mechanisms of gonadotropin regulation. Journal of Neuroscience. 29 (12), 3920-3929 (2009).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments. (91), e51863 (2014).
- Taylor, Z. V., Khand, B., Porgador, A., Monsonego, A., Eremenko, E. An optimized intracerebroventricular injection of CD4(+) T cells into mice. STAR Protocols. 2 (3), 100725 (2021).
- Russo, K. A., et al. Circadian control of the female reproductive axis through gated responsiveness of the RFRP-3 system to VIP signaling. Endocrinology. 156 (7), 2608-2618 (2015).
- Laursen, S. E., Belknap, J. K. Intracerebroventricular injections in mice. Some methodological refinements. Journal of Pharmacological Methods. 16 (4), 355-357 (1986).
- Haley, T. J., McCormick, W. G. Pharmacological effects produced by intracerebral injection of drugs in the conscious mouse. British Journal of Pharmacology and Chemotherapy. 12 (1), 12-15 (1957).
- McCosh, R. B., et al. Insulin-induced hypoglycaemia suppresses pulsatile luteinising hormone secretion and arcuate Kiss1 cell activation in female mice. Journal of Neuroendocrinology. 31 (12), e12813 (2019).
- Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-Protocol. 11 (5), e3988 (2021).
- Comba, A., et al. Laser capture microdissection of glioma subregions for spatial and molecular characterization of intratumoral heterogeneity, oncostreams, and invasion. Journal of Visual Experiments. (158), e60939 (2020).
- Porteous, R., et al. Reformulation of PULSAR for analysis of pulsatile LH secretion and a revised model of estrogen-negative feedback in mice. Endocrinology. 162 (11), (2021).
- Hohmann, J. G., et al. Differential role of melanocortins in mediating leptin's central effects on feeding and reproduction. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 278 (1), R50-R59 (2000).
- Gottsch, M. L., et al. A role for kisspeptins in the regulation of gonadotropin secretion in the mouse. Endocrinology. 145 (9), 4073-4077 (2004).
- Krasnow, S. M., et al. A role for galanin-like peptide in the integration of feeding, body weight regulation, and reproduction in the mouse. Endocrinology. 144 (3), 813-822 (2003).
