Summary
En este trabajo se describe un método sencillo y rápido para realizar inyecciones intracerebroventriculares en ratones mediante un abordaje a mano alzada (es decir, sin dispositivo estereotáxico).
Abstract
La investigación de los sistemas neuroendocrinos a menudo requiere la administración de fármacos, virus u otros agentes experimentales directamente en el cerebro de los ratones. Una inyección intracerebroventricular (ICV) permite la administración generalizada del agente experimental en todo el cerebro (particularmente en las estructuras cercanas a los ventrículos). Aquí, se describen los métodos para realizar inyecciones de ICV a mano alzada en ratones adultos. Mediante el uso de puntos de referencia visuales y táctiles en las cabezas de los ratones, las inyecciones en los ventrículos laterales se pueden realizar de forma rápida y fiable. Las inyecciones se realizan con una jeringa de vidrio sostenida en la mano del experimentador y colocada a distancias aproximadas de los puntos de referencia. Por lo tanto, esta técnica no requiere un marco estereotáxico. Además, esta técnica solo requiere una breve anestesia con isoflurano, lo que permite la evaluación posterior del comportamiento y/o la fisiología del ratón en ratones despiertos y de comportamiento libre. La inyección de ICV a mano alzada es una herramienta poderosa para la administración eficiente de agentes experimentales en el cerebro de ratones vivos y se puede combinar con otras técnicas como la toma frecuente de muestras de sangre, la manipulación de circuitos neuronales o el registro in vivo para investigar procesos neuroendocrinos.
Introduction
La administración de agentes experimentales, como fármacos1, virus2 o células3, al cerebro suele ser necesaria para la investigación neuroendocrina. Si el agente no cruza fácilmente la barrera hematoencefálica o el objetivo experimental es probar específicamente los efectos centrales del agente, es importante tener un método confiable para administrar inyecciones en el cerebro. Además, la inyección en el espacio intracerebroventricular (VCI) brinda la oportunidad de distribuir el agente ampliamente en el cerebro y proporciona una gran área diana, lo que aumenta la probabilidad de éxito de la inyección2.
Un método común para hacer inyecciones de ICV implica la colocación de una cánula permanente permanente. En este enfoque, es necesario un marco estereotáxico para colocar la cánula disponible comercialmente o hecha a medida, ya que la cánula se pega o cementa en su lugar. A menudo, en el momento de la recuperación, se administra una dosis suprafisiológica de angiotensina II a través de la cánula, y si se observa inmediatamente el comportamiento de la bebida, entonces la cánula se considera correctamente colocada4. Este enfoque tiene muchas ventajas, incluida la capacidad de realizar una infusión a largo plazo y la capacidad de inyectar al mismo animal varias veces; además, si se emplea angiotensina II, se puede confirmar la correcta colocación antes de la administración de compuestos experimentales. Sin embargo, existen algunas limitaciones para colocar una cánula permanente, incluyendo el requisito de un equipo costoso (marco estereotáxico), la posibilidad de daño a la cánula después de la colocación (p. ej., los ratones pueden masticar la cánula de un compañero de jaula) y la posibilidad de infecciones alrededor de la cánula permanente. Las inyecciones únicas de ICV se pueden realizar con el uso de un marco estereotáxico3, que, aunque efectivo, requiere una exposición sustancial a la anestesia y, por lo tanto, puede oscurecer algunos efectos fisiológicos y conductuales agudos del tratamiento. Además, la colocación de ratones en un marco estereotáxico requiere un entrenamiento sustancial para lograr una colocación estable y evitar la ruptura de los canales auditivos.
Aquí, se describe un método establecido para hacer inyecciones a mano alzada en ratones. Este método se basa en informes anteriores 5,6. Las ventajas de esta técnica son que es sencilla, rápida y no requiere de un equipo especializado como un marco estereotáxico. Como se describe a continuación, este procedimiento consiste en manipular una jeringa de vidrio en relación con los puntos de referencia en la cabeza del ratón para realizar las inyecciones, lo que se puede hacer rápidamente y, por lo tanto, requiere solo unos minutos de anestesia con gas el día experimental.
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Protocol
Todos los procedimientos fueron aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Colorado (#3960) y de la Universidad de California en San Diego, donde se recolectaron los datos representativos (S13235, PI Kellie Breen Church). Los datos de cinco ratones hembra adulta y dos machos adultos C57/BL6 (9-16 semanas de edad) se muestran en la sección de datos representativos. Los ratones hembra fueron ovariectomizados 3-4 semanas antes de la inyección del ICV y la extracción de sangre como se describió anteriormente7. Antes de la experimentación, estos ratones fueron alojados con un ciclo de luz de 12 h / 12 h de luz oscura y tenían libre acceso a alimento y agua de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.
1. Realización de craneotomía
NOTA: La craneotomía se puede realizar uno o más días antes de la inyección real, lo que hace que el proceso de inyección sea más rápido el día del experimento.
- Prepare los materiales para la craneotomía como se describe a continuación.
- Coloque una almohadilla de banco limpia o material de cortina sobre la superficie de trabajo. Pegue con cinta adhesiva el cono de la nariz de un vaporizador de isoflurano a la superficie de trabajo (cerca del experimentador, pero de espaldas a él; consulte la Figura 1A).
- Coloque el tubo de silástica en el extremo de una aguja estéril afilada de 18 G de modo que sobresalga ~ 1 mm de la punta de la aguja. Coloque el tubo de silástica en el extremo de una aguja roma estéril de modo que sobresalga ~ 1 mm de la punta de la aguja.
NOTA: Se deben usar agujas preempaquetadas separadas y estériles (afiladas y romas) para cada ratón. - Reúna una afeitadora eléctrica, un exfoliante de yodo, una gasa estéril y almohadillas con alcohol para preparar el lugar de la inyección.
- Practique moviendo una aguja 2 mm lateral y 1 mm caudal como se describe a continuación.
- Utilice una regla y un bolígrafo para marcar una hoja de papel con un punto de partida (será bregma), una marca de 2 mm a la izquierda o a la derecha, y otra marca de 1 mm por encima de la última (este será el lugar de la inyección; véase la figura 1B).
- Practique mover la aguja desde el punto de partida hasta el punto de marca 1 hasta el punto 2 (bregma al lugar de la inyección) hasta que esté seguro de que el movimiento es repetible sin guías.
NOTA: Las coordenadas descritas aquí son efectivas en ratones adultos C57/BL6, pero otras cepas o grupos de edad pueden requerir ajustes.
- Prepare al ratón para la craneotomía como se describe a continuación.
- Coloque al ratón en una cámara de inducción y anestesie al ratón con isoflurano al 3%-4% en oxígeno de grado médico. Con la práctica y la familiaridad con el procedimiento, reduzca la duración total de la exposición al isoflurano a menos de 10 minutos para el procedimiento de craneotomía.
PRECAUCIÓN: La exposición al isoflurano es peligrosa para la salud humana; Utilice un vaporizador de isoflurano aprobado e inspeccionado en un área bien ventilada con medios para eliminar los gases residuales. - Una vez que el reflejo del dedo del pie esté ausente, afeite la cabeza del animal. Aplícate lubricante para los ojos.
- Coloque el ratón sobre la superficie de trabajo con la cabeza en el cono de la nariz para mantener la anestesia.
- Administrar un agente analgésico, como buprenorfina (0,6-0,8 mg/kg de peso corporal del ratón, por vía subcutánea), según las indicaciones del proveedor.
- Limpie el lugar de la inyección limpiando el cabezal con una gasa estéril humedecida en una solución de yodo (realice tres exfoliaciones) y luego limpie con una almohadilla con alcohol (realice tres veces).
NOTA: Retire el pelaje y limpie la piel alrededor del sitio de la inyección y use instrumentos y agujas estériles, según lo recomendado por la Asociación Americana de Medicina Veterinaria para prevenir infecciones.
- Coloque al ratón en una cámara de inducción y anestesie al ratón con isoflurano al 3%-4% en oxígeno de grado médico. Con la práctica y la familiaridad con el procedimiento, reduzca la duración total de la exposición al isoflurano a menos de 10 minutos para el procedimiento de craneotomía.
- Sostenga firmemente la cabeza del mouse con la mano no dominante. Coloque el cabezal lo más plano posible sobre la superficie de trabajo.
- Localice el sitio de la inyección.
- Utilice la aguja afilada de 18 G preparada para identificar primero el bregma; Para ello, arrastra la aguja por la piel de la cabeza a lo largo de la línea media, moviéndote en el plano rostral-caudal. Imaginemos un triángulo equilátero en el que los dos vértices son los ojos y el tercer vértice es la ubicación aproximada del bregma (véase la figura 1C).
- A partir de bregma, mueva la aguja 2 mm lateral y 1 mm caudal al lugar de la inyección.
- Mientras sostiene la aguja verticalmente, empuje firmemente la aguja a través de la piel y el hueso hasta que el tubo quede al ras de la piel.
- Retraiga la aguja, gírela y vuelva a presionar a través de la piel y el hueso. Repite el proceso hasta que se cree un pequeño agujero en el hueso.
- Utilice la aguja roma para comprobar que se ha producido un orificio suficiente en el hueso. Trata de hacer una abertura en el hueso lo suficientemente grande como para que pase la aguja roma.
- Retire al ratón del cono de la nariz, limpie la sangre del lugar de la inyección con una gasa estéril y colóquelo en una jaula sobre un calentador de jaulas hasta que se despierte. Dado que la abertura realizada por la craneotomía es pequeña (aguja de 18 G), no es necesario cerrar el sitio con una sutura o clips para heridas.
NOTA: La abertura que se produce aquí es pequeña (18 G), por lo que muchas instituciones consideran este procedimiento como una inyección en lugar de una cirugía. Además, aunque se hace una abertura a través de la piel y el hueso hacia el cerebro, mantener la piel tensa hace que los orificios no se alineen, lo que probablemente ayuda a evitar que la flora de la piel o la ropa de cama de la jaula entren en contacto con el cerebro.
2. Realización de la inyección
- Prepare los materiales para la inyección como se describe a continuación.
- Coloque una almohadilla de banco limpia o material de cortina sobre la superficie de trabajo. Pegue con cinta adhesiva el cono de la nariz de un vaporizador de isoflurano a la superficie de trabajo (cerca del experimentador, pero de espaldas a él; consulte la Figura 1A).
- Coloque una aguja de 10 mm de largo y 27 G con un bisel de 45° en una jeringa de vidrio de 5 μL. Coloque el tubo de silástica en la aguja de modo que sobresalgan 3,5 mm de la punta de la aguja; use cinta de laboratorio para sujetar el tubo al cuerpo de la jeringa (véase la figura 1D).
- Prepare el medio de inyección (medicamento, virus u otro líquido para la inyección) en un tubo. Para los resultados representativos de este estudio, se inyectó suero fisiológico isotónico estéril.
NOTA: Seleccione un tubo que permita el acceso de la jeringa y la aguja de vidrio, como un tubo de microcentrífuga de 2 ml. - Extraer 3 μL de medio de inyección en la jeringa de vidrio. Primero, extraiga más del volumen deseado y expulse hasta que queden 3 μL en la jeringa.
- Reúna un exfoliante de yodo, una gasa estéril y almohadillas con alcohol para preparar el sitio de la inyección.
- Inicie un temporizador de laboratorio en modo de cuenta regresiva y colóquelo de modo que sea visible para el experimentador mientras realiza las inyecciones.
- Practique moviendo una aguja 2 mm lateral y 1 mm caudal como lo hizo el día anterior.
- Prepare el ratón para la inyección como se describe a continuación.
- Coloque al ratón en la cámara de inducción y anestesie al ratón con isoflurano. Una vez que el reflejo del dedo del pie esté ausente, aplique lubricante ocular y coloque el mouse sobre la superficie de trabajo con la cabeza en el cono de la nariz.
- Limpie el sitio de la inyección con tres toallitas de yodo y tres toallitas de alcohol. Identifique el lugar de la inyección con una aguja de 18 G (o aguja desafilada) como se describe en el paso 1.8. El orificio creado durante la craneotomía debe ser detectable.
NOTA: Si la craneotomía no se ha realizado con anticipación, o si el orificio en el cráneo no es detectable, la craneotomía se puede realizar aquí.
- Realice la inyección con una jeringa de vidrio como se describe a continuación.
- Sostenga firmemente la cabeza del mouse con la mano no dominante. Coloque el cabezal lo más plano posible sobre la superficie de trabajo.
- Coloque la aguja de la jeringa de vidrio a través del orificio en el cráneo hasta que el tubo colocado sobre la aguja preparada en el paso 2.1.2 descanse sobre la piel del ratón.
- Sostenga la jeringa lo más verticalmente posible, prestando atención a los planos coronal y sagital. Inyecte lentamente el medio durante un período de 1 min.
- Mantenga la jeringa y la aguja en su lugar durante otro minuto después de completar la inyección para minimizar el reflujo. Retraiga lentamente la aguja de la cabeza del ratón.
- Retire al ratón del cono de la nariz, limpie la sangre del sitio de la inyección con una gasa estéril (si hay alguna) y coloque al ratón en una jaula sobre un calentador de jaulas hasta que se despierte.
3. Confirmación del lugar de inyección
- Anestesiar profundamente y perfundir al ratón con solución salina y paraformaldehído al 4% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) como se describió anteriormente8. Almacene el cerebro en sacarosa al 30% en PBS a 4 °C hasta que el cerebro se hunda (generalmente 2 días).
- Corte secciones coronales de 20-50 μm en un criostato como se describió anteriormente9. Durante la sección, observe el tracto de inyección en el bloque de tejido. Registre si el tracto de inyección se cruza claramente con el ventrículo lateral.
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Representative Results
Cuando se realiza con éxito, esta técnica permite la administración rápida de un agente experimental en el sistema ventricular. En la Figura 2A se muestra un perfil de pulso de hormona luteinizante (LH) de un ratón ovariectomizado que recibió una inyección de ICV de 3 μL de solución salina isotónica estéril, el vehículo de muchos compuestos farmacológicos. Este ejemplo demuestra que la exposición breve a la anestesia gaseosa y la inyección de 3 μL de líquido en el sistema ventricular por sí solas no alteraron la secreción pulsátil de LH. A las 3 h después de la inyección de ICV, el animal fue sacrificado y se recolectó tejido neural fresco congelado y se cortó en un criostato; El tracto de inyección se cruzaba claramente con el ventrículo lateral. El tracto de inyección también fue visible en el tejido neural de ratones perfundidos con fijador (10 mL de solución salina heparinizada seguidos de 20 mL de paraformaldehído al 4% en tampón fosfato). En la Figura 2B se muestran ejemplos de inyecciones colocadas correctamente. En la Figura 2C se muestran dos ejemplos de inyecciones colocadas incorrectamente. En la Figura 2D se muestran ejemplos de inyecciones de tinta china colocadas correctamente (izquierda) e incorrectamente. La inyección de tinta china es útil para practicar esta técnica, ya que permite una visualización clara del lugar de la inyección. El flujo de tinte tanto en los ventrículos laterales como en el tercer ventrículo se puede ver en las inyecciones colocadas correctamente (Figura 2D, izquierda).
Figura 1: Imágenes que muestran la preparación del equipo y las coordenadas de inyección para las inyecciones de ICV a mano alzada. (A) Configuración de la estación de trabajo para inyecciones de ICV a mano alzada. (B) Esquema para practicar el movimiento necesario para colocar la inyección de ICV en ratones hembra C57/BL6 de 3-4 meses de edad. (C) Localización aproximada de bregma en ratones adultos. (D) Colocación del tubo para revelar 3,5 mm de la punta de la aguja para la inyección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Datos representativos de la hormona luteinizante y de la histología relacionados con las inyecciones de ICV a mano alzada. (A) Perfil de pulso de LH antes y después de la inyección de ICV. Los puntos de datos con relleno negro sólido representan pulsos determinados mediante una reformulación de PULSAR10 con los parámetros sugeridos en esa referencia para un ratón OVX y un nivel de detección de 0,32 ng/mL. (B) Fotografías de una sección coronal del cerebro de ratón con una inyección de ICV correctamente colocada. (C) Fotografías de una sección coronal del cerebro de ratón con una inyección de ICV colocada incorrectamente: un tracto de inyección lateral al ventrículo (izquierda) y un tracto de inyección dorsal al ventrículo (derecha). (D) Fotografías de una sección coronal del cerebro de ratón con una inyección ICV de tinta china correctamente colocada (izquierda) y una inyección ICV de tinta china colocada incorrectamente (derecha). Nota: los paneles B y C representan cerebros perfundidos con paraformaldehído recolectados 3 h después de la inyección de solución salina; El panel D muestra cerebros frescos recogidos en hielo seco 2 minutos después de la inyección de tinta china. Barra de escala = 1 mm Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aquí, se describe un medio simple y efectivo para hacer inyecciones de ICV en ratones. Dado que esta técnica no requiere un marco estereotáxico, este enfoque para la administración central de fármacos y agentes experimentales es accesible para más investigadores. Además, este enfoque tiene un rendimiento relativamente alto, ya que el procedimiento de preparación e inyección se puede realizar rápidamente.
Dado que este procedimiento requiere la manipulación manual de agujas y una jeringa de vidrio utilizando distancias aproximadas, se aconseja que el nuevo practicante dedique algún tiempo a practicar los movimientos antes de trabajar con animales vivos. Además, los cadáveres de ratón pueden ser útiles para practicar la identificación de bregma con la aguja. Una vez que se gana algo de confianza en el movimiento, es útil tener experiencia con animales de práctica vivos dedicados. Durante las sesiones de práctica, la inyección de 3 μL de tinta china facilita la evaluación visual de la colocación de la inyección. Las inyecciones colocadas correctamente darán lugar a una tinción negra en el ventrículo lateral ipsilateral y, a menudo, en el tercer ventrículo y el ventrículo lateral contralateral. La inyección de tinta es un procedimiento terminal y no se debe permitir que los ratones se recuperen de la anestesia después de la inyección de tinta. Incluso los practicantes experimentados pueden beneficiarse de ensayar el movimiento lateral de 2 mm y caudal de 1 mm varias veces antes de realizar una inyección. Además, es importante mantener la jeringa de vidrio vertical cuando se coloca en el cerebro. Con la práctica, se puede esperar que el >75% de las inyecciones se coloquen correctamente. Mantener la aguja en su lugar durante ~ 1 minuto después de que se haya inyectado el volumen completo puede ayudar a prevenir el reflujo del líquido fuera del cerebro. Durante este tiempo, es esencial mantener la aguja en la posición correcta sin movimiento. La realización exitosa de este procedimiento requiere experiencia en la manipulación y sujeción confiables de la aguja y la jeringa de vidrio.
Si algunas inyecciones no se colocan correctamente, hay varias opciones de solución de problemas. Primero, verifique que la aguja de inyección esté recta (no doblada) y que la aguja esté bien fijada a la jeringa de vidrio. A continuación, si las inyecciones omitidas son variables en su ubicación, se justifica la práctica adicional de manipular y sostener la jeringa de vidrio. También puede ser útil tener una persona adicional para detectar si la jeringa se sostiene verticalmente durante la inyección. Encontrar bregma sobre la piel intacta con la aguja también requiere práctica. Se recomienda encarecidamente tomarse el tiempo para identificar con confianza este punto de referencia antes de proceder con la inyección. Si las inyecciones se colocan constantemente en un lugar incorrecto, será necesario alterar las coordenadas de la inyección. Las coordenadas descritas aquí (±2 mm lateral, 1 mm caudal a bregma) son efectivas en ratones adultos C57/BL6, pero es posible que estas coordenadas deban ajustarse para otras cepas o grupos de edad.
Aunque esta técnica puede ser muy eficaz para entregar rápidamente agentes de forma centralizada, existen algunas limitaciones. Dado que el émbolo de la jeringa se mueve a mano, la velocidad de inyección puede ser variable. Se aconseja inyectarlo con relativa lentitud para evitar posibles efectos fuera del objetivo de la presión en el sistema ventricular. En este protocolo se recomienda un volumen de inyección de 3 μL; sin embargo, un mayor volumen de inyección (5 μL) ha sido utilizado en otros laboratorios11. Dependiendo del resultado medido, es posible que sea necesario ajustar el volumen y la velocidad de inyección. Por ejemplo, es posible que los ratones jóvenes solo toleren volúmenes de inyección más pequeños. Por lo tanto, se recomiendan experimentos preliminares para probar los efectos de los vehículos. Una limitación adicional es que la confirmación de la colocación correcta de la inyección se limita a una evaluación algo subjetiva del tracto de inyección después de que se haya recolectado el tejido. El tracto de inyección es visible tanto en el tejido fresco congelado como en el tejido perfundido con paraformaldehído recogido varias horas después de la inyección de ICV (ver imágenes en resultados representativos). Si se realizan varias inyecciones, es posible que no quede claro en las marcas del tracto si cada inyección se colocó correctamente.
Este enfoque a mano alzada para hacer inyecciones de ICV requiere anestesia. Con la práctica, las inyecciones se pueden hacer rápidamente, lo que resulta en una exposición breve (3-5 min) al anestésico. Al afeitar la cabeza del ratón y realizar la craneotomía (perforar el cráneo con una aguja afilada) antes del día experimental, se puede reducir el tiempo bajo anestesia durante el experimento. Por lo general, los ratones se recuperan por completo de esta breve exposición a la anestesia en unos pocos minutos. La recolección de muestras de sangre de la punta de la cola inmediatamente después de la anestesia puede ser un desafío, por lo que el muestreo se puede suspender durante ~ 30 minutos después de la inyección para minimizar el estrés en los ratones, aunque esto no es estrictamente necesario. Otros laboratorios también han medido con éxito los cambios en la secreción de LH (muestras únicas) 30 min después de la administración de agentes farmacológicos utilizando esta técnica de ICV a mano alzada 1,12. También se han detectado cambios en el comportamiento locomotor e ingestivo durante un período de 24 h después de las inyecciones de ICV13, por lo que se puede realizar un seguimiento a largo plazo. Se recomienda realizar pruebas preliminares para determinar la facilidad de muestreo y los posibles efectos de la anestesia en los resultados de interés.
En resumen, la técnica de inyección de ICV a mano alzada descrita aquí es un método simple pero poderoso para administrar agentes experimentales en el cerebro. Las ventajas específicas son que el enfoque es rápido y técnicamente simple y permite una alta tasa de inyecciones colocadas con éxito. Además, dado que esta técnica requiere solo una breve exposición a la anestesia, se puede combinar con una variedad de otras técnicas, como la toma frecuente de muestras de sangre, la manipulación de circuitos neuronales o el registro in vivo para investigar procesos neuroendocrinos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer a la Dra. Kellie Breen Church, al Sr. Michael Kreisman y a la Sra. Jessica Jang por sus contribuciones a la recopilación de los datos que se muestran en los resultados representativos. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH, por sus siglas en inglés) R00 HD104994 (R.B.M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18-gauge blunt needles | SAI Infusion | B18-150 | |
| 18-gauge needles | BD Medical | 305195 | |
| Alcohol pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Bench pad | Fisher Scientific | 14-206-62AC22 | |
| Betadine solution | Fisher Scientific | NC1696484 | |
| Buprenorphine | Patterson Vet Supply | 07-892-5235 | Controlled substance |
| Eyelube | Fisher Scientific | 50-218-8442 | |
| Glass syringe | Hamilton | 7634-01 | |
| Injection needle | Hamilton | 7803-01 | 27 gauge, Small Hub RN needle, point style: 4, Needle length: 10cm, Angle: 45 |
| Isoflurane | Patterson Vet Supply | 07-893-8441 | |
| Isoflurane vaporizer | Vet Equip | V-10 | |
| Laboratory Tape | VWR | 89098-128 | |
| Medical grade oxygen | Airgas | OX USPEA | |
| Paraformaldehyde | Millipore-Sigma | 8.18715.1000 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | J67802.K2 | |
| PulsaR Software | Open source, University of Otago | See ref 9 | |
| Ruler | Fisher Scientific | 12-00-152 | |
| Silastic tubing (0.040" I.D.) | DOW | 508-005 | |
| Silastic tubing (0.078" I.D.) | DOW | 508-009 | |
| Sterile saline | VWR | 101320-574 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 |
References
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