Summary
Her beskrives en enkel og hurtig tilgang til udførelse af intracerebroventrikulære injektioner hos mus ved hjælp af en frihåndstilgang (det vil sige uden stereotaksisk enhed).
Abstract
Undersøgelsen af neuroendokrine systemer kræver ofte levering af lægemidler, vira eller andre eksperimentelle midler direkte ind i hjernen hos mus. En intracerebroventrikulær (ICV) injektion tillader udbredt levering af det eksperimentelle middel i hele hjernen (især i strukturerne nær ventriklerne). Her beskrives metoder til fremstilling af frihånds ICV-injektioner hos voksne mus. Ved at bruge visuelle og taktile landemærker på musenes hoveder kan injektioner i laterale ventrikler foretages hurtigt og pålideligt. Injektionerne er lavet med en glassprøjte holdt i eksperimentatorens hånd og placeret i omtrentlige afstande fra landemærkerne. Således kræver denne teknik ikke en stereotaksisk ramme. Desuden kræver denne teknik kun kort isofluranbedøvelse, som muliggør efterfølgende vurdering af museadfærd og/eller fysiologi hos vågne, frit opførte mus. Frihånds ICV-injektion er et kraftfuldt værktøj til effektiv levering af eksperimentelle midler i hjernen hos levende mus og kan kombineres med andre teknikker såsom hyppig blodprøvetagning, neurale kredsløbsmanipulation eller in vivo-optagelse for at undersøge neuroendokrine processer.
Introduction
Levering af eksperimentelle midler, såsom medicin1, vira2 eller celler3, til hjernen er ofte nødvendig for neuroendokrin forskning. Hvis midlet ikke let krydser blod-hjerne-barrieren, eller det eksperimentelle mål er specifikt at teste de centrale virkninger af midlet, er det vigtigt at have en pålidelig metode til at levere injektioner i hjernen. Desuden giver injektion i det intracerebroventrikulære (ICV) rum mulighed for at distribuere midlet bredt i hjernen og giver et stort målområde, hvilket øger sandsynligheden for vellykket injektion2.
En almindelig metode til fremstilling af ICV-injektioner involverer placering af en permanent indlagt kanyle. I denne tilgang er en stereotaksisk ramme nødvendig for at placere den kommercielt tilgængelige eller specialfremstillede kanyle, da kanylen limes eller cementeres på plads. Ofte administreres en suprafysiologisk dosis angiotensin II ved genopretning gennem kanylen, og hvis drikkeadfærd straks observeres, betragtes kanylen som korrekt placeret4. Denne tilgang har mange fordele, herunder evnen til at udføre langvarig infusion og evnen til at injicere det samme dyr flere gange; Derudover, hvis angiotensin II anvendes, kan korrekt placering bekræftes før administration af eksperimentelle forbindelser. Der er dog nogle begrænsninger for placering af en permanent kanyle, herunder kravet om dyrt udstyr (stereotaksisk ramme), muligheden for beskadigelse af kanylen efter placering (f.eks. Mus kan tygge på kanylen på en burkammerat) og muligheden for infektioner omkring den permanente kanyle. Enkelt ICV-injektioner kan foretages ved brug af en stereotaksisk ramme3, som, selvom den er effektiv, kræver betydelig eksponering for anæstesi og dermed kan skjule nogle akutte fysiologiske og adfærdsmæssige virkninger af behandlingen. Derudover kræver placeringen af mus i en stereotaksisk ramme betydelig træning for at opnå stabil placering og forhindre brud på øregangene.
Her beskrives en etableret metode til fremstilling af frihåndsinjektioner hos mus. Denne metode er baseret på tidligere rapporter 5,6. Fordelene ved denne teknik er, at den er enkel, hurtig og ikke kræver specialudstyr såsom en stereotaksisk ramme. Som beskrevet nedenfor involverer denne procedure manipulation af en glassprøjte i forhold til landemærker på musehovedet for at foretage injektionerne, hvilket kan gøres hurtigt og dermed kun kræver et par minutters gasbedøvelse på forsøgsdagen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer blev godkendt af Colorado State University (#3960) og University of California San Diego Institutional Animal Care and Use Committees, hvor de repræsentative data blev indsamlet (S13235, PI Kellie Breen Church). Data fra fem voksne hunmus og to voksne C57/BL6-hanmus (9-16 uger gamle) er afbildet i afsnittet om repræsentative data. Hunmus blev ovariektomiseret 3-4 uger før ICV-injektion og blodtapning som beskrevet tidligere7. Før forsøgene var disse mus opstaldet med en 12 timers lys/12 timers mørk lyscyklus og havde fri adgang til foder og vand i overensstemmelse med vejledningen for pasning og brug af forsøgsdyr.
1. Udførelse af kraniotomi
BEMÆRK: Kraniotomi kan udføres en eller flere dage før selve injektionen, hvilket gør injektionsprocessen hurtigere på forsøgsdagen.
- Forbered materialerne til kraniotomien som beskrevet nedenfor.
- Placer en ren bænkpude eller drapermateriale på arbejdsfladen. Næsekeglen på en isofluranfordamper tapes til arbejdsfladen (tæt på, men vendt væk fra, eksperimentatoren; se figur 1A).
- Silastisk slange anbringes for enden af en steril skarp 18 G kanyle, så ~1 mm af kanylespidsen stikker ud. Placer silastisk slange på enden af en steril stump nål, så ~ 1 mm af nålespidsen stikker ud.
BEMÆRK: Der skal anvendes separate og sterile færdigpakkede nåle (skarpe og stump) til hver mus. - Saml en elektrisk barbermaskine, jodskrubbe, sterilt gaze og alkoholpuder til forberedelse af injektionsstedet.
- Øv dig i at flytte en nål 2 mm lateral og 1 mm kaudal som beskrevet nedenfor.
- Brug en lineal og en pen til at markere et ark papir med et startpunkt (dette vil være bregma), et mærke 2 mm til enten venstre eller højre og et andet mærke 1 mm over det sidste (dette vil være injektionsstedet; se figur 1B).
- Øv dig i at flytte nålen fra startpunktet til punkt 1 til punkt 2 (bregma til injektionsstedet), indtil du er sikker på, at bevægelsen kan gentages uden vejledninger.
BEMÆRK: Koordinaterne beskrevet her er effektive hos voksne C57/BL6-mus, men andre stammer eller aldersgrupper kan kræve justering.
- Forbered musen på kraniotomi som beskrevet nedenfor.
- Placer musen i et induktionskammer og bedøvelse musen med 3% -4% isofluran i ilt af medicinsk kvalitet. Med øvelse og fortrolighed med proceduren reduceres den samlede varighed af isofluraneksponering til mindre end 10 minutter for kraniotomiproceduren.
FORSIGTIG: Eksponering for isofluran er sundhedsfarlig for mennesker. Brug en godkendt og inspiceret isofluranfordamper i et godt ventileret område med midler til rensning af spildgasser. - Når tårefleksen er fraværende, barberer du dyrets hoved. Påfør øjensmøremiddel.
- Placer musen på arbejdsfladen med hovedet i næsekeglen for at opretholde anæstesi.
- Administrer et smertestillende middel, såsom buprenorphin (0,6-0,8 mg/kg legemsvægt hos mus, subkutant), som anvist af leverandøren.
- Rengør injektionsstedet ved at tørre hovedet af med sterilt gasbind dyppet i en iodopløsning (udfør tre skrubber), og tør derefter af med en alkoholskrubbepude (udfør tre gange).
BEMÆRK: Fjern pelsen og rengør huden omkring injektionsstedet og brug sterile instrumenter og nåle, som anbefalet af American Veterinary Medical Association for at forhindre infektioner.
- Placer musen i et induktionskammer og bedøvelse musen med 3% -4% isofluran i ilt af medicinsk kvalitet. Med øvelse og fortrolighed med proceduren reduceres den samlede varighed af isofluraneksponering til mindre end 10 minutter for kraniotomiproceduren.
- Hold fast i musens hoved med den ikke-dominerende hånd. Placer hovedet så fladt på arbejdsfladen som muligt.
- Find injektionsstedet.
- Brug den forberedte skarpe 18 G nål til først at identificere bregma; Til dette skal du trække nålen over hovedets hud langs midterlinjen og bevæge dig i det rostraal-kaudale plan. Forestil dig en ligesidet trekant, hvor de to hjørner er øjnene, og det tredje toppunkt er den omtrentlige placering af bregma (se figur 1C).
- Fra bregma flyttes nålen 2 mm lateralt og 1 mm kaudal til injektionsstedet.
- Mens nålen holdes lodret, skubbes nålen fast gennem huden og knoglen, indtil slangen flugter med huden.
- Træk nålen tilbage, drej nålen, og tryk gennem huden og knoglen igen. Gentag processen, indtil der er skabt et lille hul i knoglen.
- Brug den stumpe nål til at kontrollere, at der er produceret et tilstrækkeligt hul i knoglen. Målet er at lave en åbning i knoglen, der er stor nok til, at den stumpe nål kan passere igennem.
- Fjern musen fra næsekeglen, rengør blod fra injektionsstedet med sterilt gasbind, og placer musen i et bur på et burvarmere, indtil den er vågen. Da åbningen foretaget af kraniotomien er lille (18 G nål), behøver stedet ikke lukkes med en sutur eller sårklip.
BEMÆRK: Åbningen, der produceres her, er lille (18 G), så mange institutioner betragter denne procedure som en injektion i modsætning til en operation. Selvom der er lavet en åbning gennem hud og knogle til hjernen, resulterer det i hullerne ikke at justere, hvilket sandsynligvis hjælper med at forhindre hudflora eller burstrøelse i at komme i kontakt med hjernen.
2. Foretagelse af injektionen
- Forbered materialerne til injektionen som beskrevet nedenfor.
- Placer en ren bænkpude eller drapermateriale på arbejdsfladen. Næsekeglen på en isofluranfordamper tapes til arbejdsfladen (tæt på, men vendt væk fra, eksperimentatoren; se figur 1A).
- Sæt en 10 mm lang 27 G kanyle med en 45° facet på en 5 μL glassprøjte. Anbring silastisk slange på nålen, så 3,5 mm af nålespidsen stikker ud; Brug laboratorietape til at holde slangen fast til sprøjtekroppen (se figur 1D).
- Klargør injektionsmediet (medicin, virus eller anden væske til injektion) i et rør. For de repræsentative resultater i denne undersøgelse blev sterilt isotonisk saltvand injiceret.
BEMÆRK: Vælg et rør, der tillader adgang for glassprøjten og kanylen, såsom et 2 ml mikrocentrifugerør. - Træk 3 μL injektionsmiddel ind i glassprøjten. Træk først mere end det ønskede volumen, og skub ud, indtil der er 3 μL tilbage i sprøjten.
- Saml jodskrubbe, sterilt gasbind og alkoholpuder til forberedelse af injektionsstedet.
- Start en laboratorietimer i optællingstilstand, og placer timeren, så den er synlig for eksperimentatoren, mens du foretager injektioner.
- Øv dig i at flytte en nål 2 mm lateral og 1 mm kaudal som udført den foregående dag.
- Klargør musen til injektion som beskrevet nedenfor.
- Placer musen i induktionskammeret og bedøm musen med isofluran. Når tårefleksen er fraværende, skal du anvende øjensmøremiddel og placere musen på arbejdsfladen med hovedet i næsekeglen.
- Rengør injektionsstedet med tre vådservietter hver af jod og alkohol. Identificer injektionsstedet med en 18 G kanyle (eller afstumpet kanyle) som beskrevet i trin 1.8. Hullet skabt under kraniotomi skal kunne detekteres.
BEMÆRK: Hvis kraniotomien ikke er udført på forhånd, eller hvis hullet i kraniet ikke kan detekteres, kan kraniotomien udføres her.
- Udfør injektionen med en glassprøjte som beskrevet nedenfor.
- Hold fast i musens hoved med den ikke-dominerende hånd. Placer hovedet så fladt på arbejdsfladen som muligt.
- Glassprøjtens kanyle anbringes gennem hullet i kraniet, indtil slangen, der er anbragt over kanylen, og som er fremstillet i trin 2.1.2, hviler på musens hud.
- Hold sprøjten så lodret som muligt, og vær opmærksom på både koronale og sagittale planer. Injicer langsomt mediet over en periode på 1 min.
- Hold sprøjten og kanylen på plads i endnu et minut efter injektionens afslutning for at minimere tilbageløb. Træk langsomt nålen tilbage fra musens hoved.
- Fjern musen fra næsekeglen, rengør blod fra injektionsstedet med sterilt gaze (hvis der er nogen til stede), og placer musen i et bur på et burvarmere, indtil den er vågen.
3. Bekræftelse af injektionsstedet
- Bedøvelse og perfus musen dybt med saltvand og 4% paraformaldehyd i fosfatbufret saltvand (PBS) som tidligere beskrevet8. Opbevar hjernen i 30% saccharose i PBS ved 4 °C, indtil hjernen synker (typisk 2 dage).
- Skær 20-50 μm koronale sektioner på en kryostat som beskrevet tidligere9. Under sektionering skal du observere injektionskanalen i vævsblokken. Optag, om injektionskanalen tydeligt skærer den laterale ventrikel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Når den udføres med succes, tillader denne teknik hurtig levering af et eksperimentelt middel i ventrikelsystemet. En luteiniserende hormon (LH) pulsprofil fra en ovariektomiseret mus, der modtog en ICV-injektion på 3 μL steril isotonisk saltvand, bærestoffet for mange farmakologiske forbindelser, er vist i figur 2A. Dette eksempel viser, at kortvarig eksponering for gasbedøvelse og injektion af 3 μL væske i ventrikelsystemet alene ikke ændrede den pulserende LH-sekretion. 3 timer efter ICV-injektionen blev dyret aflivet, og friskfrosset neuralt væv blev opsamlet og skåret på en kryostat; Injektionskanalen skærer tydeligt med den laterale ventrikel. Injektionskanalen var også synlig i neuralt væv fra mus, der var perfuseret med fikseringsmiddel (10 ml hepariniseret saltvand efterfulgt af 20 ml 4% paraformaldehyd i fosfatbuffer). Eksempler på korrekt placerede injektioner er vist i figur 2B. To eksempler på forkert placerede injektioner er vist i figur 2C. Eksempler på korrekt (venstre) og forkert placerede injektioner af indisk blæk er vist i figur 2D. Injektionen af indisk blæk er nyttig til at praktisere denne teknik, da det giver mulighed for klar visualisering af injektionsstedet. Strømmen af farvestof ind i både laterale ventrikler og tredje ventrikel kan ses i korrekt placerede injektioner (figur 2D, venstre).
Figur 1: Billeder, der viser klargøringen af udstyret og injektionskoordinaterne for ICV-injektioner med frihånd. A) Konfiguration af arbejdsstationen til ICV-frihåndsinjektioner. (B) Skema til øvelse af den bevægelse, der er nødvendig for at placere ICV-injektionen i 3-4 måneder gamle C57/BL6-hunmus. (C) Omtrentlig placering af bregma hos voksne mus. (D) Anbringelse af slangen således, at 3,5 mm af kanylespidsen afsløres til injektionen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Repræsentative luteiniserende hormon- og histologidata relateret til ICV-injektioner med fri hånd. A) LH-pulsprofil før og efter ICV-injektionen. Datapunkterne med konstant sort fyld repræsenterer impulser som bestemt ved hjælp af en omformulering af PULSAR10 med de parametre, der er foreslået i denne reference for en OVX-mus og et detektionsniveau på 0,32 ng/ml. (B) Fotografier af en koronal del af musehjernen med en korrekt placeret ICV-injektion. (C) Fotografier af en koronal del af musehjernen med en forkert placeret ICV-injektion: en injektionskanal lateralt til ventriklen (venstre) og en injektionskanal dorsal til ventriklen (højre). (D) Fotografier af en koronal del af musehjernen med en korrekt placeret ICV-injektion af indisk blæk (venstre) og en forkert placeret ICV-injektion af indisk blæk (højre). Bemærk: panel B og C viser paraformaldehyd-perfunderede hjerner opsamlet 3 timer efter injektion af saltvand; panel D viser friske hjerner indsamlet på tøris 2 minutter efter injektionen af indisk blæk. Vægtbjælke = 1 mm Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskrives et enkelt og effektivt middel til fremstilling af ICV-injektioner hos mus. Da denne teknik ikke kræver en stereotaxisk ramme, er denne tilgang til central levering af lægemidler og eksperimentelle midler tilgængelig for flere forskere. Derudover er denne tilgang relativt høj gennemstrømning, da forberedelses- og injektionsproceduren kan udføres hurtigt.
Da denne procedure kræver manipulation af nåle og en glassprøjte i hånden ved hjælp af omtrentlige afstande, anbefales det, at den nye praktiserende læge afsætter lidt tid til at øve bevægelserne, før han arbejder med levende dyr. Derudover kan musekadavere være nyttige til at øve sig i at identificere bregma med nålen. Når en vis tillid til bevægelsen er opnået, er erfaring med dedikerede levende praksis dyr nyttig. Under øvelsessessionerne gør injektionen af 3 μL indisk blæk den visuelle vurdering af injektionsplaceringen lettere. Korrekt placerede injektioner vil resultere i sort farvning i den ipsilaterale laterale ventrikel og ofte i den tredje ventrikel og kontralaterale laterale ventrikel. Injektion af blæk er en terminal procedure, og mus bør ikke have lov til at komme sig efter anæstesi efter blækinjektion. Selv erfarne udøvere kan drage fordel af at øve 2 mm laterale og 1 mm kaudale bevægelser et par gange, før de foretager en injektion. Derudover er det vigtigt at holde glassprøjten lodret, når den placeres i hjernen. Med praksis kan >75% af injektionerne forventes at blive placeret korrekt. Hvis nålen holdes på plads i ~1 minut efter, at det fulde volumen er injiceret, kan det hjælpe med at forhindre tilbagestrømning af væsken ud af hjernen. I løbet af denne tid er det vigtigt at holde nålen i den rigtige position uden bevægelse. Den vellykkede udførelse af denne procedure kræver erfaring med pålidelig manipulation og fastholdelse af nålen og glassprøjten.
Hvis nogle injektioner ikke placeres korrekt, er der flere fejlfindingsmuligheder. Kontroller først, at kanylen er lige (ikke bøjet), og at kanylen er stramt fastgjort til glassprøjten. Dernæst, hvis de glemte injektioner er variable i deres placering, er yderligere praksis med at manipulere og holde glassprøjten berettiget. Det kan også være nyttigt at have en ekstra person til at se, om sprøjten holdes lodret under injektionen. At finde bregma over intakt hud med nålen kræver også øvelse. Det anbefales stærkt at tage sig tid til med sikkerhed at identificere dette vartegn, før du fortsætter med injektionen. Hvis injektioner konsekvent placeres på et forkert sted, er det nødvendigt at ændre injektionskoordinaterne. Koordinaterne beskrevet her (±2 mm lateral, 1 mm kaudal til bregma) er effektive hos voksne C57/BL6-mus, men disse koordinater skal muligvis justeres for andre stammer eller aldersgrupper.
Selvom denne teknik kan være yderst effektiv til hurtigt at levere agenter centralt, er der nogle begrænsninger. Da sprøjtens stempel bevæges manuelt, kan injektionshastigheden variere. Det anbefales at injicere det relativt langsomt for at undgå potentielle off-target virkninger af tryk i ventrikelsystemet. Et injektionsvolumen på 3 μL anbefales i denne protokol; et større injektionsvolumen (5 μL) er imidlertid blevet udnyttet i andre laboratorier11. Afhængigt af det målte udfald kan det være nødvendigt at justere injektionsvolumen og -hastighed. For eksempel kan unge mus kun tåle mindre injektionsvolumener. Det anbefales derfor at foretage indledende forsøg med henblik på at teste for køretøjseffekter. En yderligere begrænsning er, at bekræftelsen af korrekt injektionsplacering er begrænset til en noget subjektiv vurdering af injektionskanalen, efter at vævet er blevet opsamlet. Injektionskanalen er synlig i både friskfrosset og paraformaldehyd-perfunderet væv indsamlet flere timer efter ICV-injektionen (se billeder i repræsentative resultater). Hvis der foretages flere injektioner, kan det ikke tydeligt fremgå af kanalmærkerne, om hver injektion blev placeret korrekt.
Denne frihåndstilgang til fremstilling af ICV-injektioner kræver anæstesi. Med øvelse kan injektionerne foretages hurtigt, hvilket resulterer i kort (3-5 min) eksponering for bedøvelsesmidlet. Ved at barbere musens hoved og udføre kraniotomien (gennemboring af kraniet med en skarp nål) inden forsøgsdagen kan tiden under anæstesi under eksperimentet reduceres. Mus kommer sig typisk helt efter denne korte eksponering for anæstesi inden for få minutter. Indsamling af halespidsblodprøver umiddelbart efter anæstesi kan være udfordrende, så prøveudtagning kan suspenderes i ~ 30 minutter efter injektionen for at minimere stress hos musene, selvom dette ikke er strengt nødvendigt. Andre laboratorier har også med succes målt ændringer i LH-sekretion (engangsprøver) 30 minutter efter administration af farmakologiske midler ved hjælp af denne frihånds ICV-teknik 1,12. Ændringer i bevægelses- og indtagelsesadfærd over en periode på 24 timer er også blevet påvist efter ICV-injektioner13, så langtidsovervågning kan udføres. Det anbefales at udføre foreløbige tests for at bestemme den lette prøveudtagning og de potentielle virkninger af anæstesi på resultater af interesse.
Sammenfattende er den frihånds ICV-injektionsteknik, der er beskrevet her, en enkel, men kraftfuld metode til at levere eksperimentelle midler ind i hjernen. De specifikke fordele er, at fremgangsmåden er hurtig og teknisk enkel og muliggør en høj grad af vellykkede injektioner. Da denne teknik kun kræver kort eksponering for anæstesi, kan den desuden kombineres med en række andre teknikker såsom hyppig blodprøvetagning, neurale kredsløbsmanipulation eller in vivo-optagelse for at undersøge neuroendokrine processer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Dr. Kellie Breen Church, Mr. Michael Kreisman og Jessica Jang for deres bidrag til at indsamle de data, der vises i de repræsentative resultater. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NIH) R00 HD104994 (R.B.M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18-gauge blunt needles | SAI Infusion | B18-150 | |
| 18-gauge needles | BD Medical | 305195 | |
| Alcohol pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Bench pad | Fisher Scientific | 14-206-62AC22 | |
| Betadine solution | Fisher Scientific | NC1696484 | |
| Buprenorphine | Patterson Vet Supply | 07-892-5235 | Controlled substance |
| Eyelube | Fisher Scientific | 50-218-8442 | |
| Glass syringe | Hamilton | 7634-01 | |
| Injection needle | Hamilton | 7803-01 | 27 gauge, Small Hub RN needle, point style: 4, Needle length: 10cm, Angle: 45 |
| Isoflurane | Patterson Vet Supply | 07-893-8441 | |
| Isoflurane vaporizer | Vet Equip | V-10 | |
| Laboratory Tape | VWR | 89098-128 | |
| Medical grade oxygen | Airgas | OX USPEA | |
| Paraformaldehyde | Millipore-Sigma | 8.18715.1000 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | J67802.K2 | |
| PulsaR Software | Open source, University of Otago | See ref 9 | |
| Ruler | Fisher Scientific | 12-00-152 | |
| Silastic tubing (0.040" I.D.) | DOW | 508-005 | |
| Silastic tubing (0.078" I.D.) | DOW | 508-009 | |
| Sterile saline | VWR | 101320-574 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 |
References
- Roseweir, A. K., et al. Discovery of potent kisspeptin antagonists delineate physiological mechanisms of gonadotropin regulation. Journal of Neuroscience. 29 (12), 3920-3929 (2009).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments. (91), e51863 (2014).
- Taylor, Z. V., Khand, B., Porgador, A., Monsonego, A., Eremenko, E. An optimized intracerebroventricular injection of CD4(+) T cells into mice. STAR Protocols. 2 (3), 100725 (2021).
- Russo, K. A., et al. Circadian control of the female reproductive axis through gated responsiveness of the RFRP-3 system to VIP signaling. Endocrinology. 156 (7), 2608-2618 (2015).
- Laursen, S. E., Belknap, J. K. Intracerebroventricular injections in mice. Some methodological refinements. Journal of Pharmacological Methods. 16 (4), 355-357 (1986).
- Haley, T. J., McCormick, W. G. Pharmacological effects produced by intracerebral injection of drugs in the conscious mouse. British Journal of Pharmacology and Chemotherapy. 12 (1), 12-15 (1957).
- McCosh, R. B., et al. Insulin-induced hypoglycaemia suppresses pulsatile luteinising hormone secretion and arcuate Kiss1 cell activation in female mice. Journal of Neuroendocrinology. 31 (12), e12813 (2019).
- Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-Protocol. 11 (5), e3988 (2021).
- Comba, A., et al. Laser capture microdissection of glioma subregions for spatial and molecular characterization of intratumoral heterogeneity, oncostreams, and invasion. Journal of Visual Experiments. (158), e60939 (2020).
- Porteous, R., et al. Reformulation of PULSAR for analysis of pulsatile LH secretion and a revised model of estrogen-negative feedback in mice. Endocrinology. 162 (11), (2021).
- Hohmann, J. G., et al. Differential role of melanocortins in mediating leptin's central effects on feeding and reproduction. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 278 (1), R50-R59 (2000).
- Gottsch, M. L., et al. A role for kisspeptins in the regulation of gonadotropin secretion in the mouse. Endocrinology. 145 (9), 4073-4077 (2004).
- Krasnow, S. M., et al. A role for galanin-like peptide in the integration of feeding, body weight regulation, and reproduction in the mouse. Endocrinology. 144 (3), 813-822 (2003).
