Summary
ここでは、フリーハンドアプローチを用いて(すなわち、脳定位装置なしで)マウスに脳室内注射を行うための簡便かつ迅速なアプローチが記載される。
Abstract
神経内分泌系の調査では、多くの場合、薬物、ウイルス、またはその他の実験薬をマウスの脳に直接送達する必要があります。脳室内(ICV)注射により、実験薬を脳全体(特に心室近くの構造)に広範囲に送達することができます。ここでは、成体マウスにフリーハンドでICV注射を施す方法について説明する。マウスの頭部に視覚的および触覚的なランドマークを使用することにより、側脳室への注射を迅速かつ確実に行うことができます。注射は、実験者の手に持ったガラス注射器で行われ、ランドマークからおおよその距離に置かれます。したがって、この技術は脳定位固定装置フレームを必要としません。さらに、この技術は短時間のイソフルラン麻酔のみを必要とするため、覚醒して自由に行動するマウスのマウスの行動および/または生理機能をその後評価することができます。フリーハンドICV注射は、生きたマウスの脳に実験薬を効率的に送達するための強力なツールであり、頻繁な採血、神経回路操作、または神経内分泌プロセスを調べるための in vivo 記録などの他の技術と組み合わせることができます。
Introduction
神経内分泌研究には、薬物1、ウイルス2、細胞3などの実験薬を脳に送達することがしばしば必要になります。薬剤が血液脳関門を容易に通過しない場合、または実験目的が薬剤の中枢効果を特異的に試験することである場合、脳に注射を送達するための信頼できる方法を持つことが重要です。さらに、脳室内(ICV)腔への注射は、薬剤を脳内に広く分布させる機会を提供し、大きな標的領域を提供するため、注射が成功する可能性が高まります2。
ICV注射を行うための一般的な方法は、永久留置カニューレの留置を含む。このアプローチでは、カニューレが所定の位置に接着またはセメントで固定されるときに、市販またはカスタムメイドのカニューレを位置決めするために脳定位固定装置フレームが必要である。多くの場合、回復時に、超生理学的用量のアンジオテンシンIIがカニューレを通して投与され、飲酒行動がすぐに観察された場合、カニューレは正しく配置されていると見なされます4。このアプローチには、長期注入を行う能力や、同じ動物を複数回注射する能力など、多くの利点があります。さらに、アンジオテンシンIIを採用する場合、実験化合物の投与前に正しい配置を確認できます。しかし、永久カニューレの留置には、高価な機器(脳定位固定装置フレーム)の必要性、留置後のカニューレの損傷の可能性(例えば、マウスがケージメイトのカニューレを噛む可能性がある)、永久カニューレ周辺の感染の可能性など、いくつかの制限があります。単回ICV注射は、脳定位固定装置フレーム3を使用して行うことができるが、これは効果的であるが、麻酔への相当な曝露を必要とするため、治療のいくつかの急性生理学的および行動的影響を不明瞭にする可能性がある。さらに、マウスを脳定位固定装置に留置するには、安定した留置を行い、外耳道の破裂を防ぐために、かなりのトレーニングが必要です。
ここでは、マウスにフリーハンド注射をするための確立された方法が記載される。この方法は、以前のレポート5,6に基づいています。この技術の利点は、シンプルで迅速であり、脳定位固定装置フレームなどの特殊な機器を必要としないことです。後述するように、この手順では、マウスの頭部のランドマークに対してガラス製の注射器を操作して注射を行いますが、これは迅速に行うことができるため、実験当日に数分のガス麻酔で済みます。
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Protocol
すべての手順は、コロラド州立大学(#3960)およびカリフォルニア大学サンディエゴ校の動物実験委員会によって承認され、代表的なデータが収集されました(S13235、PI Kellie Breen Church)。C57/BL6マウス(9-16週齢)の成体雌5匹と成体雄2匹のデータを代表データセクションに示します。雌マウスは、前述のようにICV注射および採血の3〜4週間前に卵巣摘出されました7。実験に先立ち、これらのマウスは12時間の光/12時間の暗光サイクルで飼育され、実験動物のケアと使用のためのガイドに従って飼料と水に自由にアクセスできました。
1.開頭術の実施
注:開頭術は、実際の注射の1日以上前に行うことができるため、実験当日の注射プロセスが速くなります。
- 開頭手術の材料は、以下のように準備します。
- 作業台にクリーンベンチパッドまたはドレープ素材を置きます。イソフルラン気化器のノーズコーンを作業面にテープで固定します(実験台の近くを向いていますが、実験者の反対側を向いています; 図1Aを参照)。
- 滅菌済みの鋭利な18G針の端にシラスティックチューブを置き、針先の~1mmが突き出るようにします。滅菌鈍針の端にシラスティックチューブを置き、針先の~1mmが突き出るようにします。
注:各マウスには、個別に滅菌済みのパッケージ済み針(鋭利な針と鈍い針)を使用する必要があります。 - 注射部位を準備するために、電気シェーバー、ヨウ素スクラブ、滅菌ガーゼ、アルコールパッドを用意します。
- 以下に説明するように、針を横方向に2mm、尾側に1mm動かす練習をします。
- 定規とペンを使用して、開始点(ブレグマ)、左または右に2 mmのマーク、最後のマークの1 mm上に別のマーク(これが注入部位になります; 図1Bを参照)で紙に印を付けます。
- 針をスタート地点からマークポイント1、マークポイント2(ブレグマから注射部位まで)まで、ガイドなしで動きが再現可能であると確信できるまで、練習します。
注:ここに記載されている座標は、成体のC57/BL6マウスでは有効ですが、他の系統または年齢層では調整が必要な場合があります。
- 以下に説明するように、開頭術のためにマウスを準備します。
- マウスを誘導チャンバーに入れ、医療グレードの酸素中で3%〜4%のイソフルランでマウスに麻酔をかけます。練習して手順に慣れたら、開頭術手順のイソフルラン曝露の合計時間を10分未満に減らします。.
注意: イソフルランへの曝露は人間の健康に有害です。承認および検査済みのイソフルラン気化器を換気の良い場所で使用し、廃ガスを除去します。 - つま先反射がなくなったら、動物の頭を剃ります。目の潤滑剤を塗ります。
- 麻酔を維持するために、頭をノーズコーンに入れてマウスを作業台に置きます。
- ブプレノルフィン(0.6〜0.8 mg / kgマウス体重、皮下)などの鎮痛剤を、サプライヤーの指示に従って投与します。.
- ヨウ素溶液に浸した滅菌ガーゼで頭を拭いて注射部位を洗浄し(3回スクラブを実行)、次にアルコールスクラブパッドで拭きます(3回実行)。
注:毛皮を取り除き、注射部位の周りの皮膚をきれいにし、感染を防ぐために米国獣医師会が推奨しているように、滅菌器具と針を使用してください。
- マウスを誘導チャンバーに入れ、医療グレードの酸素中で3%〜4%のイソフルランでマウスに麻酔をかけます。練習して手順に慣れたら、開頭術手順のイソフルラン曝露の合計時間を10分未満に減らします。.
- 利き手ではない方の手でマウスの頭をしっかりと持ちます。ヘッドを作業面上でできるだけ平らに配置します。
- 注入部位を特定します。
- 準備した鋭利な18G針を使用して、最初にブレグマを特定します。このためには、正中線に沿って頭の皮膚を横切って針をドラッグし、吻側尾側面を移動します。2つの頂点が目であり、3番目の頂点がブレグマのおおよその位置である正三角形を想像してください( 図1Cを参照)。
- ブレグマから、針を横方向に2mm、尾側に1mm動かして注射部位に移動します。
- 針を垂直に持ちながら、チューブが皮膚と同じ高さになるまで針を皮膚と骨にしっかりと押し込みます。
- 針を引っ込め、針を回転させ、再び皮膚と骨を押し込みます。骨に小さな穴が開くまで、このプロセスを繰り返します。
- 鈍い針を使用して、骨に十分な穴が開いていることを確認します。鈍い針が通るのに十分な大きさの開口部を骨に開けることを目指します。
- マウスをノーズコーンから外し、注射部位から滅菌ガーゼで血液を洗い流し、マウスをケージウォーマーのケージに入れて、目を覚ますまで置きます。開頭術によって作られた開口部は小さい(18G針)ので、縫合糸や創傷クリップで部位を閉じる必要はありません。
注:ここで生成される開口部は小さい(18 G)ため、多くの施設はこの手順を手術ではなく注射と見なしています。また、皮膚や骨を貫通して脳に通じる開口部が作られているが、皮膚をピンと張ったままにしておくと穴が揃わなくなるため、皮膚フローラやケージの寝具が脳に接触するのを防ぐのに役立っていると考えられます。
2.注射を打つ
- 以下に説明するように、注入用の材料を準備します。
- 作業台にクリーンベンチパッドまたはドレープ素材を置きます。イソフルラン気化器のノーズコーンを作業面にテープで固定します(実験台の近くを向いていますが、実験者の反対側を向いています; 図1Aを参照)。
- 長さ10 mm、開角45°の27 G針を5 μLのガラスシリンジに取り付けます。針先の3.5mmが突き出るように、針にシラスティックチューブを置きます。ラボ用テープを使用して、チューブをシリンジ本体に固定します( 図1Dを参照)。
- 注射用培地(薬剤、ウイルス、その他の注射用液体)をチューブに調製します。この研究の代表的な結果については、滅菌等張生理食塩水を注射しました。
注意: 2 mLの微量遠心チューブなど、ガラス製のシリンジとニードルでアクセスできるチューブを選択してください。 - 3 μLの注入液をガラスシリンジに引き込みます。まず、所望の容量よりも多く吸引し、シリンジ内に3μLが残るまで排出します。
- ヨウ素スクラブ、滅菌ガーゼ、アルコールパッドを集めて、注射部位を準備します。
- ラボタイマーをカウントアップモードで起動し、注射中に実験者に見えるようにタイマーを配置します。
- 前日と同じように針を横に2mm、尾側に1mm動かす練習をします。
- 以下に説明するように、マウスを注射用に準備します。
- マウスを誘導チャンバーに入れ、イソフルランで麻酔をかけます。つま先反射がなくなったら、目の潤滑剤を塗布し、頭をノーズコーンに入れてマウスを作業台に置きます。
- ヨウ素とアルコールをそれぞれ3枚ずつ拭いて注射部位を洗浄します。ステップ1.8の説明に従って、18Gの針(または鈍い針)で注射部位を特定します。開頭術中にできた穴は検出可能であるはずです。
注:開頭術が事前に行われていない場合、または頭蓋骨の穴が検出されない場合は、ここで開頭術を行うことができます。
- 下記のようにガラスシリンジで注入を行う。
- 利き手ではない方の手でマウスの頭をしっかりと持ちます。ヘッドを作業面上でできるだけ平らに配置します。
- ガラス注射器の針を頭蓋骨の穴に通し、ステップ2.1.2で準備した針の上に置かれたチューブがマウスの皮膚に当たるまで置きます。
- シリンジをできるだけ垂直に持ち、冠状面と矢状面の両方に注意を払います。1分間かけて培地をゆっくりと注入します。
- 注射終了後、シリンジとニードルを所定の位置に保持して、逆流を最小限に抑えます。.針をマウスの頭からゆっくりと引っ込めます。
- マウスをノーズコーンから外し、注射部位から滅菌ガーゼ(存在する場合)で血液を洗い流し、マウスをケージウォーマーのケージに入れて、目を覚ますまで置きます。
3. 噴射位置の確認
- 前述のように、生理食塩水と4%パラホルムアルデヒドをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)でマウスに深く麻酔し、灌流します8。脳が沈むまで(通常2日間)、PBS中の30%ショ糖で4°Cで脳を保管します。
- 前述のように、クライオスタットで20〜50μmの冠状切片を切断します9。切片化しながら、組織ブロック内の注射路を観察します。注射路が側脳室と明確に交差しているかどうかを記録します。.
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Representative Results
この技術が首尾よく実行されると、実験薬を心室系に迅速に送達することができます。多くの薬理学的化合物のビヒクルである滅菌等張生理食塩水 3 μL の ICV 注射を受けた卵巣摘出マウスの黄体形成ホルモン(LH)パルスプロファイルを 図 2A に示します。この例は、ガス麻酔への短時間の曝露と心室系への3μLの液体の注入のみでは、拍動性LH分泌が変化しなかったことを示しています。ICV注射の3時間後に、動物を安楽死させ、新鮮に凍結した神経組織を採取し、クライオスタットで切断した。注射路は明らかに側脳室と交差していました。注射管は、固定剤(10 mLのヘパリン化生理食塩水に続いて20 mLの4%パラホルムアルデヒドリン酸緩衝液)で灌流されたマウスの神経組織にも見られました。.正しく配置された注入の例を 図 2B に示します。注入が誤って配置された 2 つの例を 図 2C に示します。図 2D に、墨の注入を正しく行った例(左)と正しく配置しなかった注入の例を示します。墨の射出は、射出場所を明確に視覚化できるため、このテクニックの練習に役立ちます。側脳室と第3脳室の両方への色素の流れは、正しく配置された注射で見ることができます(図2D、左)。
図1:フリーハンドICV注入用の装置の準備と注入座標を示す画像 。 (A)フリーハンドICV注入用のワークステーションの構成。(B)生後3〜4ヶ月の雌のC57/BL6マウスにICV注射を打設するために必要な動作を練習するためのスキーマ。(C)成体マウスにおけるブレグマのおおよその位置。(D)注射用の針の先端の3.5mmが見えるようにチューブを配置します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:フリーハンドICV注射に関連する代表的な黄体形成ホルモンおよび組織学データ。 (A)ICV注入前後のLHパルスプロファイル。黒一色で塗りつぶされたデータポイントは、OVXマウスのリファレンスで提案されているパラメータと0.32 ng/mLの検出レベルを持つPULSAR10 の再定式化を使用して決定されたパルスを表しています。(B)正しく配置されたICV注射によるマウス脳の冠状切片の写真。(C)ICV注射を誤って配置したマウス脳の冠状切片の写真:心室の外側の注射路(左)と心室の背側の注射路(右)。(D)墨のICV注射を正しく配置したマウス脳冠状切片(左)とICV墨を誤って注入したマウス脳の写真(右)。注:パネル B と C は、生理食塩水の注射から3時間後に採取されたパラホルムアルデヒド灌流脳を示しています。パネル D は、墨を注入してから2分後にドライアイスで採取された新鮮な脳を描いています。スケールバー = 1 mm この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、マウスにICV注射を行なうための簡便かつ効果的な手段について説明する。この技術は脳定位固定装置を必要としないため、薬物や実験薬を中央に送達するためのこのアプローチは、より多くの研究者が利用することができます。さらに、このアプローチは、調製と注入手順を迅速に実行できるため、比較的高いスループットです。
この手順では、針とガラス注射器を手でおおよその距離で操作する必要があるため、新しい施術者は、生きた動物を扱う前に、動きの練習に時間を費やすことをお勧めします。さらに、マウスの死体は、針でブレグマを識別する練習に役立ちます。動きにある程度の自信がついたら、専用の生きた練習動物との経験が役に立ちます。練習セッションでは、3μLの墨を注入することで、注入位置の目視評価が容易になります。正しく配置された注射は、同側側脳室に黒色染色をもたらし、多くの場合、第3脳室と対側側脳室に黒色染色をもたらします。インクの注入は終末期の手順であり、マウスはインク注入後に麻酔から回復することを許可してはなりません。経験豊富な施術者でも、注射を行う前に、2mmの横方向と1mmの尾側の動きを数回リハーサルすることで恩恵を受けることができます。さらに、ガラス注射器を脳に入れるときは、垂直に保持することが重要です。練習すれば、注射の>75%が正しく配置されることが期待できます。全量を注入した後、針を所定の位置に~1分間保持すると、脳からの液体の逆流を防ぐことができます。この間、針を動かさずに正しい位置に保持することが不可欠です。この手順を成功させるには、針とガラスシリンジを確実に操作して保持する経験が必要です。
一部の注入が正しく配置されない場合は、いくつかのトラブルシューティングオプションがあります。まず、注射針がまっすぐ(曲がっていない)こと、針がガラスシリンジにしっかりと固定されていることを確認します。次に、逃した注射の位置が異なる場合は、ガラスシリンジを操作して保持する追加の練習が必要です。注射中にシリンジが垂直に保持されているかどうかを見極める追加の担当者がいることも役立ちます。針で無傷の皮膚の上にブレグマを見つけるのも練習が必要です。注射を進める前に、時間をかけてこのランドマークを自信を持って特定することを強くお勧めします。注入が常に誤った位置に配置される場合は、注入座標を変更する必要があります。ここで説明する座標(±2 mmの外側、1 mmの尾側からブレグマ)は、成体のC57/BL6マウスでは有効ですが、これらの座標は他の系統または年齢層に合わせて調整する必要がある場合があります。
この手法は、エージェントを一元的に迅速に配信するのに非常に効果的ですが、いくつかの制限があります。シリンジのプランジャーは手で移動するため、注入速度を可変にすることができます。心室系の圧力の潜在的なオフターゲット効果を避けるために、比較的ゆっくりと注入することをお勧めします。.このプロトコルでは、3 μL の注入量が推奨されます。しかし、より大きな注入量(5μL)が他の実験室で利用されている11。測定された結果によっては、注入量と注入速度を調整する必要がある場合があります。例えば、幼体マウスは、より少ない注入量にしか耐えられないかもしれません。したがって、車両効果をテストするための予備実験が推奨されます。追加の制限は、正しい注射配置の確認が、組織が採取された後の注射管のやや主観的な評価に限定されることである。注射管は、ICV注射の数時間後に採取された新鮮凍結組織とパラホルムアルデヒド灌流組織の両方に見られます(代表的な結果の画像を参照)。複数回の注射を行った場合、各注射が正常に行われたかどうかがトラクトマークから明確でない場合があります。
ICV注射を行うためのこのフリーハンドアプローチには麻酔が必要です。練習すれば、注射を迅速に行うことができ、麻酔薬に短時間(3〜5分)さらされます。実験日の前にマウスの頭を剃り、開頭術(鋭利な針で頭蓋骨を突き刺す)を行うことで、実験中の麻酔時間を短縮することができます。マウスは通常、この麻酔への短時間の曝露から数分以内に完全に回復します。麻酔直後の尾端血液サンプルの採取は困難な場合があるため、マウスのストレスを最小限に抑えるために、注射後~30分間サンプリングを中断することができますが、これは厳密には必須ではありません。他の研究室でも、このフリーハンドICV技術を使用して、薬理学的薬剤の投与から30分後のLH分泌(1回限りのサンプル)の変化を測定することに成功しています1,12。24時間にわたる自発運動および摂取行動の変化も、ICV注射後に検出されている13ので、長期モニタリングを行うことができる。サンプリングの容易さと、関心のあるアウトカムに対する麻酔の潜在的な影響を判断するために、予備検査を実施することが推奨される。
要約すると、ここで説明するフリーハンドICV注入技術は、実験用薬剤を脳に送達する単純かつ強力な方法です。具体的な利点は、このアプローチが迅速かつ技術的に単純であり、高い確率で注入を成功させることができることです。さらに、この技術は麻酔に短時間曝露するだけで済むため、頻繁な採血、神経回路操作、または神経内分泌プロセスを調べるための 生体内 記録など、他のさまざまな技術と組み合わせることができます。
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Disclosures
著者は何も開示していません。
Acknowledgments
Kellie Breen Church博士、Michael Kreisman氏、Jessica Jang氏には、代表的な結果に示されたデータの収集に貢献していただいたことに感謝します。この研究は、米国国立衛生研究所(NIH)R00 HD104994(R.B.M.)の支援を受けた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18-gauge blunt needles | SAI Infusion | B18-150 | |
| 18-gauge needles | BD Medical | 305195 | |
| Alcohol pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Bench pad | Fisher Scientific | 14-206-62AC22 | |
| Betadine solution | Fisher Scientific | NC1696484 | |
| Buprenorphine | Patterson Vet Supply | 07-892-5235 | Controlled substance |
| Eyelube | Fisher Scientific | 50-218-8442 | |
| Glass syringe | Hamilton | 7634-01 | |
| Injection needle | Hamilton | 7803-01 | 27 gauge, Small Hub RN needle, point style: 4, Needle length: 10cm, Angle: 45 |
| Isoflurane | Patterson Vet Supply | 07-893-8441 | |
| Isoflurane vaporizer | Vet Equip | V-10 | |
| Laboratory Tape | VWR | 89098-128 | |
| Medical grade oxygen | Airgas | OX USPEA | |
| Paraformaldehyde | Millipore-Sigma | 8.18715.1000 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | J67802.K2 | |
| PulsaR Software | Open source, University of Otago | See ref 9 | |
| Ruler | Fisher Scientific | 12-00-152 | |
| Silastic tubing (0.040" I.D.) | DOW | 508-005 | |
| Silastic tubing (0.078" I.D.) | DOW | 508-009 | |
| Sterile saline | VWR | 101320-574 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 |
References
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