Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

تحليل بروتين الخلية المضيفة باستخدام حبات التخصيب إلى جانب الهضم المحدود

Published: January 19, 2024 doi: 10.3791/65544
Automatic Translation
1, 1, 1
1Analytical Chemistry, Regeneron Pharmaceuticals Inc.

Summary

يتم تقديم بروتوكول لإثراء بروتينات الخلايا المضيفة (HCPs) من المنتجات الدوائية (DP) والكشف عن الببتيدات باستخدام حبات إثراء البروتين. يتم عرض الطريقة باستخدام مادة دواء الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (mAb) المصنعة داخليا (DS) ، وهي مادة مرجعية جيدة المواصفات لتقييم ومقارنة الطرق المختلفة من حيث الأداء.

Abstract

بروتينات الخلايا المضيفة (HCPs) هي شوائب يمكن أن تؤثر سلبا على البروتينات العلاجية ، حتى بكميات صغيرة. لتقييم المخاطر المحتملة المرتبطة بالمنتجات الدوائية ، تم تطوير طرق لتحديد HCPs منخفضة الوفرة. يتضمن النهج الحاسم لتطوير طريقة حساسة للكشف عن HCP إثراء HCPs مع إزالة الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (mAbs) في نفس الوقت قبل التحليل ، باستخدام قياس الطيف الكتلي اللوني السائل (LC-MS).

يقدم هذا البروتوكول تعليمات مفصلة لإثراء بروتينات الخلية المضيفة باستخدام حبات تخصيب البروتين المتاحة تجاريا. تحتوي هذه الخرزات على مكتبة متنوعة من روابط سداسي الببتيد ذات صلات محددة للبروتينات المختلفة. يتضمن البروتوكول أيضا الهضم المحدود والكشف اللاحق عن الببتيد باستخدام NANO LC-MS / MS. من خلال استخدام هذه التقنيات ، يمكن إثراء HCPs ذات الوفرة المنخفضة بأكثر من 7000 ضعف ، مما يؤدي إلى حد اكتشاف مثير للإعجاب يصل إلى 0.002 جزء في المليون. بشكل ملحوظ ، يتيح هذا البروتوكول اكتشاف 850 HCPs بمستوى عال من الثقة باستخدام NIST mAb. علاوة على ذلك ، تم تصميمه ليكون سهل الاستخدام ويتضمن عرضا توضيحيا بالفيديو للمساعدة في تنفيذه. باتباع هذه الخطوات ، يمكن للباحثين إثراء واكتشاف HCPs بشكل فعال ، مما يعزز حساسية ودقة تقييم المخاطر للمنتجات الدوائية.

Introduction

بروتينات الخلية المضيفة (HCPs) هي شوائب يتم إطلاقها من زراعة الخلايا للكائن الحي المضيف ويتم تنقيتها بشكل مشترك باستخدام الجسم المضاد وحيد النسيلة (mAb)1،2،3،4. يمكن أن تؤثر مستويات التتبع من HCPs سلبا على جودة منتج الدواء5،6،7،8،9،10،11،12،13،14،15 ، وبالتالي ، فإن طريقة تحليل HCP الحساسة مطلوبة للكشف عن HCPs في مستويات جزء في المليون إلى جزء في المليون.

يمكن تطبيق طرق متعامدة للكشف عن HCPs بوفرة منخفضة. يستخدم مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) بشكل عام لتحديد كمية HCPs الإجمالية ، ويمكنه أيضا اكتشاف وقياس HCPs الفردية إذا كانت الأجسام المضادة المقابلة متوفرة16. ومع ذلك ، فإن إنتاج الأجسام المضادة الخاصة ب HCP يستغرق وقتا طويلا ويتطلب عمالة مكثفة. في المقابل ، يمكن أن توفر الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي (LC-MS) معلومات شاملة حول HCPs الفردية في منتجات الأدوية mAb ويتم تطبيقها على نطاق واسع لتحديد HCP4،7،9،10،12،13،14،15،17،18،19،20 ، 21,22,23,24,25,26,27.

تم تطوير عدة طرق للكشف عن HCPs مع LC-MS / MS ، بما في ذلك الهضمالمحدود 20 ، والترشيح17 ، وحذف البروتين A21 ، والترسيب المناعي (IP) ، وتخصيب ProteoMiner (PM) 18. تهدف معظم الطرق إلى تقليل كمية mAb وإثراء HCPs قبل تحليل LC-MS / MS ، وبالتالي تقليل النطاق الديناميكي بين ببتيدات mAb وببتيدات HCP. يقدم هذا البروتوكول طريقة إثراء عينة بروتينية تجمع بين تقنية ProteoMiner والهضم المحدود (PMLD)28. يتضمن مبدأ إثراء ProteoMiner استخدام حبات إثراء البروتين المتاحة تجاريا والتي تحتوي على مكتبة متنوعة من روابط الببتيد التوافقية. ترتبط هذه الروابط على وجه التحديد بالبروتينات الموجودة على منتجات أدوية الأجسام المضادة ، مما يسمح بإزالة الجزيئات الزائدة مع تركيز بروتينات الخلايا المضيفة منخفضة الوفرة (HCPs) على روابط التقارب الخاصة بها. من ناحية أخرى ، يتضمن مبدأ الهضم المحدود استخدام تركيز منخفض من التربسين. هذا التركيز كاف لهضم HCPs منخفضة الوفرة ولكنه غير كاف لهضم جميع منتجات أدوية الأجسام المضادة. يتيح هذا النهج استعادة وإثراء ببتيدات HCP المهضومة من المحلول.

بالمقارنة مع طرق الترشيح ، لا تقتصر تقنية PMLD على حجم HCPs المكتشفة17. طرق حذف البروتين أ خاصة بالكشف عن HCPs المرتبطة بالأجسام المضادة21 ، بينما يقتصر الترسيب المناعي على HCPs المحددة مسبقا من خط خلية معين (مثل خط خلية مبيض الهامستر الصيني (CHO)) ، حيث تم إنشاء جسم مضاد مضاد ل HCP4. في المقابل ، يمكن تطبيق PMLD للكشف عن HCPs من أي وحدات دوائية وبروتينات الخلايا المضيفة المنقاة بشكل مشترك مع منتجات الأدوية من خطوط الخلايا المختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، يظهر PMLD حساسية أفضل مقارنة بالطرق المذكورة17،18،20،21،24.

يمكن لهذا النهج إثراء تركيز HCP بمقدار 7000 ضعف وخفض حد الكشف إلى 0.002 جزء في المليون28. يوضح الشكل 1 الإعداد التجريبي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

الاختصارات المستخدمة في البروتوكول مدرجة في الجدول التكميلي 1.

1. إعداد الحلول والمخازن المؤقتة

ملاحظة: يتم سرد التفاصيل التجارية لجميع الكواشف في جدول المواد.

  1. قم بإعداد محلول 0.1 M Tris-HCl ، pH 8.0 بإضافة 1 مل من 1 M Tris-HCl ، ودرجة الحموضة 8.0 إلى 9 مل من الماء منزوع الأيونات في قنينة زجاجية ، واخلطها جيدا عن طريق الدوامة. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.
  2. تحضير 24 mM deoxycholate الصوديوم (SDC) عن طريق إذابة 10 ملغ من SDC في 1 مل من 0.1 M Tris-HCl ، درجة الحموضة 8.0.
  3. تحضير 24 مليمتر الصوديوم لورويل ساركوسينات (SLS) عن طريق إذابة 7 ملغ من SLS في 1 مل من 0.1 M Tris-HCl ، درجة الحموضة 8.0.
  4. قم بإعداد المخزن المؤقت للشطف عن طريق خلط 24 mM SDC و 24 mM SLS بنسبة 1: 1 (v / v).
  5. تحضير 50 نانوغرام / ميكرولتر من محلول التربسين بإضافة 400 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات إلى 20 ميكروغرام من التربسين.
  6. تحضير 25 مجم / مل ديثيوثريتول (DTT) بإضافة 308 ميكرولتر من 0.1 متر Tris-HCl ، درجة الحموضة 8.0 ، إلى 7.7 ملغ من DTT.
  7. تحضير 0.25 M iodoacetamide (IAM) بإضافة 1.2 مل من 0.1 M Tris-HCl ، الرقم الهيدروجيني 8.0 ، إلى 56 ملغ من IAM.
  8. تحضير 10٪ TFA بإضافة 1 مل من حمض ثلاثي فلورو أسيتيك (TFA) إلى 9 مل من الماء منزوع الأيونات. دوامة لمدة 4 ثوان وتدور لأسفل. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.
  9. قم بإعداد المخزن المؤقت أ بإضافة 1 مل من 10٪ TFA إلى 99 مل من الماء منزوع الأيونات.
  10. قم بإعداد المخزن المؤقت B بإضافة 1 مل من 10٪ TFA ، و 49 مل من الماء منزوع الأيونات إلى 50 مل من الأسيتونيتريل (ACN).
  11. قم بإعداد 10 مللي متر من محلول الهستيدين بإضافة 37 مجم من L-histidine و 54.8 مجم من L-Histidine أحادي هيدروكلوريد أحادي الهيدرات إلى 50 مل من الماء.

2. تحضير محاليل الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (mAb)

  1. بالنسبة للمنتجات الدوائية ذات التركيزات التي تزيد عن 50 مجم / مل ، قم بتخفيف 15 مجم من الجسم المضاد أحادي النسيلة (mAb) (انظر جدول المواد) بالماء منزوع الأيونات في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل ، مما ينتج عنه حجم إجمالي قدره 300 ميكرولتر ودرجة حموضة نهائية ~ 6. إذا لزم الأمر ، اضبط الرقم الهيدروجيني باستخدام حمض الأسيتيك أو Tris-HCl.
  2. بالنسبة للمنتجات الدوائية ذات التركيزات الأقل من 50 ملغم / مل ، قم بإجراء التبادل المؤقت باتباع الخطوات من 2.2.1 إلى 2.2.5.
    1. انقل 20 مجم من كل عينة إلى جهاز مرشح طرد مركزي 10 كيلو (انظر جدول المواد) وأجهزة طرد مركزي عند 14000 × جم لمدة 25 دقيقة (في درجة حرارة الغرفة ، RT) حتى يتبقى حجم 100 ميكرولتر تقريبا.
    2. أضف 350 ميكرولتر من 10 مللي متر من الهستيدين (انظر جدول المواد) ، ومحلول الأس الهيدروجيني 6.0 في المرشح ، والدوامة ، وأجهزة الطرد المركزي عند 14000 × جم لمدة 25 دقيقة في RT. كرر مرة واحدة.
    3. اقلب المرشح وضعه في أنبوب جمع العينات ، ثم طرد العينات عند 1000 × جم لمدة 5 دقائق في RT لاسترداد الحجم بالكامل في أنبوب التجميع. اغسل الفلتر بمحلول هيستيدين 200 ميكرولتر 10 مللي متر واسحب لأعلى ولأسفل لاستعادة أي عينات بروتين متبقية. انقل المحلول بالكامل إلى نفس أنبوب التجميع ، الدوامة ، وقم بتدويرها.
    4. قم بقياس تركيز العينة بواسطة NanoDrop. اضبط تركيز كل عينة بروتين على 50 مجم / مل عن طريق إضافة محلول الهستيدين قبل الحضانة بخرز التخصيب.
    5. نقل 300 ميكرولتر من العينة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل.

3. إعداد حبات إثراء البروتين

  1. قم بإزالة الغطاء العلوي والسفلي من كل عمود دوران تم الحصول عليه من مجموعة إثراء البروتين التجارية (انظر جدول المواد). لا تتخلص من الأغطية ، حيث سيتم استخدامها لاحقا.
  2. خذ عمود الدوران وضعه في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل بدون غطاء. أجهزة الطرد المركزي الإعداد في درجة حرارة الغرفة و 1000 × غرام لمدة 30-60 ثانية في RT من أجل القضاء على حل التخزين. تخلص من المواد التي تم جمعها خلال هذه الخطوة.
  3. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل إلى حبات التخصيب المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد) وقم بالماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات. ضع عمود الدوران في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل وجهاز طرد مركزي عند 1000 × جم لمدة 30-60 ثانية في RT لإزالة المخزن المؤقت. تجاهل المواد التي تم جمعها.
    ملاحظة: يتم تضمين المخزن المؤقت للغسيل في مجموعة إثراء البروتين التجارية.
  4. كرر الخطوات 3.3 مرتين.
  5. استبدل الغطاء السفلي وأضف 200 ميكرولتر ماء ، ثم استبدل الغطاء العلوي.

4. إثراء البروتين

  1. ماصة لأعلى ولأسفل الملاط (من الخطوة 3.5) ونقل 40 ميكرولتر من الملاط إلى العينة المعدة في الخطوة 2. احتضان وتدوير الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة.
  2. اصنع طرفا باستخدام فريت (انظر جدول المواد) باستخدام إبرة 16 جم للحصول على حجم فريت المناسب ، ثم أدخله في طرف طرف 200 ميكرولتر.
  3. انقل العينة مع الخرز إلى الطرف المعد في الخطوة 4.2. جهاز طرد مركزي الطرف مع أنبوب طرد مركزي دقيق 2 مل عند 200 × جم لمدة 3 دقائق في RT لإزالة المحلول.
  4. اغسل الخرزات عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل إلى الطرف والطرد المركزي للطرف باستخدام أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل عند 200 × جم لمدة دقيقتين في RT لإزالة محلول الغسيل. كرر الخطوة مرتين.
  5. اغسل الخرزات بإضافة 200 ميكرولتر ماء إلى الطرف وطرد مركزي الطرف باستخدام أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل عند 200 × جم لمدة دقيقتين في RT لإزالة الماء.
  6. قم بإزالة البروتينات من الخرز عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من محلول الشطف (الخطوة 1.4) إلى الطرف ، وقم بسحب الملاط عشر مرات في الطرف لضمان نقع الخرزات بمحلول الشطف.
  7. جهاز طرد مركزي الطرف مع أنبوب طرد مركزي صغير جديد سعة 0.5 مل عند 200 × جم لمدة 30 ثانية في RT لجمع المخفف. كرر الخطوات 4.6-4.7 مرتين وادمج كل الشطف في أنبوب طرد مركزي واحد سعة 0.5 مل.
  8. أضف 1.5 ميكرولتر من محلول التربسين (الخطوة 1.5) إلى المحلول للهضم طوال الليل عند 28 درجة مئوية. أضف 1.5 ميكرولتر من 25 مجم / مل DTT (الخطوة 1.6) ، وقم بتسخين العينة عند 90 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  9. أضف 1.5 ميكرولتر من 0.25 M IAM (الخطوة 1.7) واحتضانها في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 20 دقيقة. أضف 3.5 ميكرولتر 10٪ TFA (الخطوة 1.8) ، دوامة لمدة دقيقتين ، وتأكد من أن الرقم الهيدروجيني عند ~ 2-3.
  10. أجهزة الطرد المركزي عند 14400 × جم لمدة 10 دقائق في RT لترسيب SDC و SLS. جمع طاف لتحلية.
  11. قم بإجراء التحلية باتباع الخطوات أدناه.
    1. أضف 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت B (الخطوة 1.10) إلى طرف GC-desaling (انظر جدول المواد). أجهزة الطرد المركزي الطرف مع حامل في 1000 × غرام لمدة 3 دقائق في RT. تجاهل المواد التي تم جمعها.
    2. أضف 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت A (الخطوة 1.9) إلى الحافة. أجهزة الطرد المركزي الطرف مع حامل في 1000 × غرام لمدة 3 دقائق في RT. تجاهل المواد التي تم جمعها.
    3. أضف العينة المحمضة إلى الطرف. جهاز طرد مركزي مع حامل عند 500 × جم لمدة 6 دقائق في RT. تخلص من المواد التي تم جمعها.
    4. اغسل الطرف بإضافة 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت A إلى الحافة. جهاز طرد مركزي الطرف مع الحامل عند 500 × جم لمدة 3 دقائق في RT. تخلص من المواد التي تم جمعها. كرر مرة واحدة.
    5. تخلص من الببتيد من الطرف بإضافة 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت B إلى طرف GC-desalening. جهاز طرد مركزي الطرف بأنبوب جديد عند 500 × جم لمدة 3 دقائق في RT. اجمع المواد. كرر الخطوة مرة واحدة وادمج المخفف.
    6. جفف المحلول باستخدام مكثف فراغ (انظر جدول المواد).
  12. أعد تعليق المحلول المجفف إلى 30 ميكرولتر من محلول حمض الفورميك (FA) بنسبة 0.1٪.
  13. قم بقياس الأشعة فوق البنفسجية لمخاليط الببتيد عند 214 نانومتر بواسطة مقياس الطيف الضوئي (انظر جدول المواد). يجب أن يتراوح تركيز مخاليط الببتيد بين 0.1 و 0.5 مجم / مل.
  14. انقل 10 ميكرولتر من كل عينة مهضومة إلى قنينة عينة LC ، ثم حقن 1 ميكروغرام من كل عينة مهضومة على نانو LC-MS / MS (انظر جدول المواد). قم بإجراء التحليل بعد الخطوة 5. قم بتخزين بقية العينات المهضومة في مجمد بدرجة حرارة -80 درجة مئوية.

5. تحليل نانو LC-MS / MS

  1. حقن خليط الببتيد في نظام nano-LC مقترن بمطياف الكتلة. قم بتحميل مخاليط الببتيد (~ 1 ميكروغرام) على عمود مصيدة C18 مع التدرج الوارد في الجدول 1A للتحلية ثم على عمود تحليلي C18 عند 40 درجة مئوية للفصل.
    ملاحظة: يتكون المخزن المؤقت للمرحلة A المتنقلة من 0.1٪ FA في الماء النقي للغاية ، وتتكون المرحلة المتنقلة B من 0.1٪ FA في 80٪ ACN.
  2. افصل الببتيدات و elute مع التدرج الموضح في الجدول 1B بمعدل تدفق 250 nL / دقيقة.
    ملاحظة: تم تشغيل مطياف الكتلة في الوضع المعتمد على البيانات (DDA) مع وقت دورة قدره 3 ثوان. خضعت الأيونات للتجزئة من خلال التفكك التصادمي عالي الطاقة (HCD) مع طاقة تصادم طبيعية تبلغ 30٪ لكل مسح MS كامل. تم إجراء عمليات المسح بدقة 60000 ، مع هدف التحكم التلقائي في الكسب (AGC) من 3e6 ، ووقت حقن أقصى يبلغ 20 مللي ثانية ، ونطاق m / z من 380-1600. تم إجراء أحداث MS / MS بدقة 15000 ، مع هدف AGC من 1e5 ، والحد الأقصى لوقت الحقن 60 مللي ثانية ، ونطاق m / z من 200-2000. تم تعيين مدة الاستبعاد إلى 45 ثانية. يتم توفير خصائص مصدر الأيونات في الجدول 1C ، ويمكن العثور على معلمات قياس الطيف الكتلي المحددة في الجدول 2A-F.

6. تحليل البيانات

  1. إجراء بحث في الملفات الخام لقياس الطيف الكتلي NISTmAb مقابل قاعدة بيانات UniProt mus + musculus29. بالإضافة إلى ذلك ، ابحث عن الملفات الخام لقياس الطيف الكتلي mAb DS المؤتلف في mAb DS مقابل قاعدة بيانات UniProt CricetulusGriseus 30.
    ملاحظة: تم إجراء عمليات البحث هذه في برنامج Proteome Discoverer (انظر جدول المواد) باستخدام محركات البحث Sequest HT و Mascot. وكانت قواعد البيانات المستخدمة خالية من الإدخالات الزائدة.
  2. بالنسبة لعمليات البحث عن قياس الطيف الكتلي ، قم بتطبيق تفاوت كتلة يبلغ 10 جزء في المليون ، واضبط تحمل كتلة الشظية على 0.02 Da.
    ملاحظة: شملت معايير البحث كرباميدو ميثيل ثابت لبقايا السيستين (+57.0214 دا) وتعديل متغير للأكسدة (+15.9949 دا) على بقايا الميثيونين. بالإضافة إلى ذلك ، تم تطبيق تعديل متغير لإزالة الأمين (+0.984 دا).
  3. قم بإجراء البحث في قاعدة البيانات باستخدام هضم التربسين ، مما يسمح بحد أقصى اثنين من الانقسامات الفائتة. اضبط معدلات الاكتشاف الخاطئ لكل من البروتينات والببتيدات على 0.01.
    ملاحظة: لتحديد بروتينات الخلية المضيفة (HCPs) بشكل إيجابي ، تم تطبيق الحد الأدنى من المتطلبات لاثنين على الأقل من الببتيدات الفريدة. يقدم الجدول 3 ملخصا تمثيليا لمقدمي الرعاية الصحية المحددين المرتبطين ب NIST mAb الذي تم تحليله بواسطة برنامج Proteome Discoverer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

قدم هذا البروتوكول سير عمل لإعداد العينة ، يسمى إثراء البروتين إلى جانب الهضم المحدود (PMLD) ، لتحليل بروتينات الخلية المضيفة (HCPs) في عينة من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (mAb). يوضح الشكل 1 الإجراء التدريجي ل PMLD. قارن الباحثون نتائج تحليل HCP باستخدام الهضم المباشر (كما هو موضح في اللوحة العلوية من الشكل 2) و PMLD (كما هو موضح في اللوحة السفلية من الشكل 2). أشارت ملامح الكروماتوجرام الأيوني الكلي (TIC) إلى أن PMLD قلل بشكل كبير أو أزال ببتيدات mAb الرئيسية مع السماح بمراقبة بعض ببتيدات HCP المماثلة لببتيدات mAb. يتم توفير معلمات مفصلة لتحليلات nano LC (الجدول 1) و MS / MS (الجدول 2). بالإضافة إلى ذلك ، يعرض الجدول 3 ملخصا ل HCPs المحددة المرتبطة ب NIST mAb ، بما في ذلك معلومات مثل رقم الانضمام ، واسم HCP ، والأنواع ، ونسبة التغطية ، و PSMs ، والببتيدات الفريدة ، والوزن الجزيئي ، والنقطة المتساوية الكهربية المتوقعة (pI) ، ودرجة التميمة ، ودرجة Sequest HT ، وعدد الببتيدات التي تم تحديدها بواسطة التميمة و Sequest HT.

Figure 1
الشكل 1: سير عمل تحضير العينة لإثراء البروتين إلى جانب الهضم المحدود (PMLD). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: إجمالي كروماتوجرام الأيونات (TIC) لتحليل HCP ل NIST mAb. اللوحة العلوية: ملف تعريف TIC لتحليل HCP ل NIST mAb باستخدام الهضم المباشر. اللوحة السفلية: ملف تعريف TIC لتحليل HCP ل NIST mAb باستخدام PMLD. يتضح من ملف تعريف TIC أنه بالمقارنة مع الهضم المباشر ، تم تقليل معظم ببتيدات mAb الرئيسية أو القضاء عليها بعد PMLD ، في حين يمكن ملاحظة بعض الببتيدات التي تنتمي إلى HCPs ويمكن مقارنتها بببتيدات mAb. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: معلمات نانو LC. (أ) تدرج مضخة التحميل. (ب) تدرج مضخة NC. ج: خواص مصدر الأيونات. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 2: معلمات MS / MS. ( أ) خصائص المسح الكامل. (ب) خصائص MIPS. ج: خواص الشدة. (د) شحن خصائص الدولة. (ه) الاستبعاد الدينامي. (F) خصائص المسح الضوئي MS2 المعتمدة على البيانات. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 3: جدول ملخص تمثيلي ل HCPs المحددة المرتبطة ب NIST mAb التي تم تحليلها بواسطة برنامج Proteome Discoverer. يتضمن الجدول معلومات مثل رقم الانضمام ، واسم HCP ، والأنواع ، والنسبة المئوية للتغطية ، وعدد مطابقات طيف الببتيد (PSMs) ، وعدد الببتيدات الفريدة ، والوزن الجزيئي ، والنقطة الكهربية المتوقعة (pI) ، ودرجة التميمة ، ودرجة Sequest HT ، وعدد الببتيدات التي تم تحديدها بواسطة Mascot و Sequest HT. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول التكميلي 1: قائمة المختصرات المستخدمة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هناك نسختان من حبات تخصيب البروتين المتاحة تجاريا: واحدة بسعة أصغر والأخرى بسعة أكبر (انظر جدول المواد). يحتوي كلا الإصدارين من حبات التخصيب على عشرة تحضيرات في العبوة. تشير تعليمات الشركة المصنعة إلى أنه يمكن استخدام كل تحضير من مجموعة السعة الصغيرة لإثراء 10 ملغ من البروتين الكلي. ومع ذلك ، للحصول على الأداء الأمثل لتخصيب بروتين الخلية المضيفة (HCP) من DS ، يكون كل إعداد جيدا لخمس عينات DS. لذلك ، يمكن استخدام كل مجموعة لإثراء HCPs من خمسين عينة. لكل إعداد من مجموعة السعة الكبيرة ، من الجيد إثراء HCPs من خمسة وعشرين عينة DS ، مما يسمح باكتشاف HCPs من إجمالي مائتين وخمسين عينة.

تنصح الخطوة 3.1 بعدم التخلص من الأحرف العلوية أو السفلية ، حيث سيتم إعادة استخدامها في جميع أنحاء البروتوكول بأكمله. إذا استقرت الخرزات في الغطاء العلوي ، فاستبدلها بعد إزالة القابس السفلي والطرد المركزي مع الحفاظ على الغطاء العلوي على العمود. لاستخدام الغطاء السفلي كقابس ، اعكسه وضعه بإحكام في أسفل عمود الدوران.

الخطوة الحاسمة في الإجراء هي الخطوة 4.1 ، حيث يستقر ملاط الخرزة في قاع الأنبوب. لذلك ، من الضروري الحفاظ على السحب المستمر لأعلى ولأسفل أثناء نقل الملاط إلى عينات الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (mAb). خطوة أخرى حاسمة هي الخطوة 4.6 ، حيث من الضروري ماصة الملاط عشر مرات داخل الطرف بينما تكون الخرزات مشبعة بمحلول الشطف. قد تختلف مدة الطرد المركزي في الخطوات 4.3-4.5 و 4.7 و 4.10 اعتمادا على كمية بروتينات الخلايا المضيفة المتراكمة (HCPs). لذلك ، من الضروري التحقق والتأكد من أن السوائل الموجودة في الطرف قد تم غزلها بشكل صحيح قبل الانتقال إلى الخطوة التالية. مرة أخرى ، عند البدء بكمية أولية من 15 ملغ من منتج دواء الأجسام المضادة ، يمكن استخلاص ما يقرب من 30 ميكروغرام من الأجسام المضادة وبروتينات الخلايا المضيفة المخصبة (HCPs). لتحقيق نسبة بروتين إلى إنزيم تبلغ 400: 1 للهضم المحدود ، تمت إضافة 75 نانوغرام من التربسين. عند استخدام كمية أقل من مادة الإدخال ، من الضروري قياس تركيز عينة البروتين المستلطخة. يساعد هذا القياس في ضبط كمية التربسين التي يجب إضافتها وفقا لذلك. توضح الخطوة 4.9 راسبا أبيض بعد إضافة 10٪ TFA. لمنع أي تداخل من المواد الخافضة للتوتر السطحي مع إشارة MS ، من الضروري التحقق من درجة الحموضة بعد إضافة حمض ثلاثي فلورو أسيتيك (TFA) لضمان الإزالة الكاملة للمنظف من المادة الطافية.

بعد تجفيف وإعادة تعليق المحلول في الماء ، من الضروري إجراء قياس للأشعة فوق البنفسجية لخليط الببتيد. هذا القياس أمر بالغ الأهمية لأن كمية الببتيدات المحملة على العمود يمكن أن تؤثر على الكشف باستخدام مرض التصلب العصبي المتعدد. بعد التقييم ، وجد أن ما يقرب من 1 ميكروغرام من خليط الببتيد أظهر أفضل أداء في مرض التصلب العصبي المتعدد. وبالتالي ، يجب حقن هذه الكمية المثلى في nano LC-MS / MS لمزيد من التحليل.

يوفر نهج PMLD العديد من المزايا في تحضير العينات ، بما في ذلك تقليل DS الكافي للأجسام المضادة وحيدة النسيلة (mAb) مع الحفاظ على غالبية بروتينات الخلايا المضيفة منخفضة الوفرة (HCPs). على عكس الترسيب المناعي (IP) ، لا تعتمد هذه التقنية على الأجسام المضادة المضادة ل HCP ، وبالتالي القضاء على التحيز المرتبط بالأجسام المضادة المحددة مسبقا وتقليل العمالة والوقت اللازمين لإنتاج الأجسام المضادة ل HCP. علاوة على ذلك ، على عكس طرق الترشيح القائمة على قطع الوزن الجزيئي17 ، يثري PMLD HCPs بغض النظر عن حجمها. يمكن تطبيقه لإثراء HCPs من وحدات الأدوية المختلفة ، مثل الأجسام المضادة وبروتينات الاندماج و ScFv والمزيد ، مما يجعله نهجا متعدد الاستخدامات مقارنة بطرق حذف البروتينأ 21.

بالإضافة إلى هذه المزايا ، يعرض PMLD حدا أقل للكشف ويتيح اكتشاف عدد أكبر من HCPs من NISTmAb ، وهو معيار مرجعي مميز على نطاق واسع ، مقارنة بالطرق الأخرى. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن PMLD يتطلب معدات محلية الصنع ، مما يحد من تطبيقه للأتمتة. لتوسيع قابليتها للاستخدام ، من الممكن استبدال بعض المعدات ، مثل الطرف بفريت ، بالبدائل المتاحة تجاريا. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يؤدي إجراء التحلية على ألواح 96 بئرا إلى تمكين إنتاجية أعلى باستخدام هذا النهج. يمكن أن يكون استكشاف الأتمتة أو شبه الأتمتة في التجارب المستقبلية خطوة منطقية تالية لتوسيع نطاق تطبيق PMLD على نطاق أوسع.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس للمؤلفين مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgments

اي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16 G, Metal Hub Needle, 2 in, point style 3 Hamilton 91016
Acclaim PepMap 100 C18 trap column (20 cm × 0.075 mm) Thermo Fisher 164535
Acetonitrile Fisher-Scientific A955
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade  Fisher-Scientific LS120-4
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit Millipore Sigma UFC5010
C18 analytical column (0.075 mm × 1.7 μm × 30 cm, 100 Å) CoAnn Technologies HEB07503001718I
Centrifuge 5424 Eppendorf 5405000646
Dithiothreitol (DTT)  Thermo Fisher A39255
Frit for SPE cartridges, 9.5 mm, 3 mL, 100/pk Agilent 12131020
GL-Tip GC GL Sciences Inc   7820-11201
in-house mAb Regeneron concentration 200 mg/mL
Iodoacetamide (30 x 9.3 mg) Thermo Fisher A39271
Isopropanol Fisher-Scientific 149320025
L-Histidine Sigma Aldrich H6034
L-Histidine monohydrochloride monohydrate Sigma Aldrich 53370
Methanol Fisher-Scientific A456-4 
Milli-Q Millpore 30035
NanoDrop 2000 Thermo Scientific ND-2000
Orbitrap Exploris 480 Thermo Fisher BRE725539
Protein LoBind Tube 0.5 mL Eppendorf (VWR) 22431064
Protein LoBind Tube 2.0 mL Eppendorf (VWR) 22431102
Proteome Discoverer software 2.4 Thermo Scientific
ProteoMiner Protein Enrichment Large-Capacity Kit Bio-Rad 1633007
ProteoMiner Protein Enrichment Small-Capacity Kit Bio-Rad 1633006
Sodium deoxycholate (SDC) Sigma Aldrich D6750
Sodium lauroyl sarcosinate (SLS)  Sigma Aldrich L5777
SpeedVac Labconco 7970010
Thermomixer R Eppendorf 22670107
Trifluoracetic acid (TFA) Fisher-Scientific 28904
Trypsin (Sequencing Grade Modified)  (5 x 20 ug) Promega V5111
Tube Revolver Rotator Thermo Fisher 88881001
UltiMate 3000 RSLC nano system Thermo Fisher ULTIM3000RSLCNANO
UltraPure 1 M Tris-HCl pH 8.0 Thermo Fisher 15568-025
Vortex Genie 2 VWR 102091-234
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade  Fisher-Scientific LS118-4 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aboulaich, N. A novel approach to monitor clearance of host cell proteins associated with monoclonal antibodies. Biotechnology Progress. 30 (5), 1114-1124 (2014).
  2. Goey, C. H., Alhuthali, S., Kontoravdi, C. Host cell protein removal from biopharmaceutical preparations: Towards the implementation of quality by design. Biotechnology Advances. 36 (4), 1223-1237 (2018).
  3. Levy, N. E., Valente, K. N., Choe, L. H., Lee, K. H., Lenhoff, A. M. Identification and characterization of host cell protein product-associated impurities in monoclonal antibody bioprocessing. Biotechnology and Bioengineering. 111 (5), 904-912 (2014).
  4. Molden, R. Host cell protein profiling of commercial therapeutic protein drugs as a benchmark for monoclonal antibody-based therapeutic protein development. MAbs. 13 (1), 1955811 (2021).
  5. Bee, J. S. Trace levels of the CHO host cell protease cathepsin D caused particle formation in a monoclonal antibody product. Biotechnology Progress. 31 (5), 1360-1369 (2015).
  6. Bracewell, D. G., Francis, R., Smales, C. M. The future of host cell protein (HCP) identification during process development and manufacturing linked to a risk-based management for their control. Biotechnology and Bioengineering. 112 (9), 1727-1737 (2015).
  7. Chiu, J., et al. Knockout of a difficult-to-remove CHO host cell protein, lipoprotein lipase, for improved polysorbate stability in monoclonal antibody formulations. Biotechnology and Bioengineering. 114 (5), 1006-1015 (2017).
  8. Gilgunn, S., et al. Identification and tracking of problematic host cell proteins removed by a synthetic, highly functionalized nonwoven media in downstream bioprocessing of monoclonal antibodies. Journal of Chromatography A. 1595, 28-38 (2019).
  9. Graf, T. Identification and characterization of polysorbate-degrading enzymes in a monoclonal antibody formulation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (11), 3558-3567 (2021).
  10. Hall, T., Sandefur, S. L., Frye, C. C., Tuley, T. L., Huang, L. Polysorbates 20 and 80 degradation by group XV lysosomal phospholipase A2 isomer X1 in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 105 (5), 1633-1642 (2016).
  11. Jones, M. 34;High-risk" host cell proteins (HCPs): A multi-company collaborative view. Biotechnology and Bioengineering. 118 (8), 2870-2885 (2021).
  12. Li, X., et al. Identification and characterization of a residual host cell protein hexosaminidase B associated with N-glycan degradation during the stability study of a therapeutic recombinant monoclonal antibody product. Biotechnology Progress. 37 (3), e3128 (2021).
  13. Zhang, S. Identification of the specific causes of polysorbate 20 degradation in monoclonal antibody formulations containing multiple lipases. Pharmaceutical Research. 39 (1), 75-87 (2022).
  14. Zhang, S., Xiao, H., Li, N. Degradation of polysorbate 20 by Sialate O-Acetylesterase in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (12), 3866-3873 (2021).
  15. Zhang, S., Xiao, H., Molden, R., Qiu, H., Li, N. Rapid polysorbate 80 degradation by liver carboxylesterase in a monoclonal antibody formulated drug substance at early stage development. Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (11), 3300-3307 (2020).
  16. Gunawan, F. Comparison of platform host cell protein ELISA to process-specific host cell protein ELISA. Biotechnology and Bioengineering. 115 (2), 382-389 (2018).
  17. Chen, I. H., Xiao, H., Daly, T., Li, N. Improved host cell protein analysis in monoclonal antibody products through molecular weight cutoff enrichment. Analytical Chemistry. 92 (5), 3751-3757 (2020).
  18. Chen, I. H., Xiao, H., Li, N. Improved host cell protein analysis in monoclonal antibody products through ProteoMiner. Analytical Biochemistry. 610, 113972 (2020).
  19. Doneanu, C. E., et al. Enhanced detection of low-abundance host cell protein impurities in high-purity monoclonal antibodies down to 1 ppm using ion mobility mass spectrometry coupled with multidimensional liquid chromatography. Analytical Chemistry. 87 (20), 10283-10291 (2015).
  20. Huang, L., et al. A Novel sample preparation for shotgun proteomics characterization of HCPs in antibodies. Analytical Chemistry. 89 (10), 5436-5444 (2017).
  21. Johnson, R. O., Greer, T., Cejkov, M., Zheng, X., Li, N. Combination of FAIMS, Protein A depletion, and native digest conditions enables deep proteomic profiling of host cell proteins in monoclonal antibodies. Analytical Chemistry. 92 (15), 10478-10484 (2020).
  22. Kreimer, S. Host cell protein profiling by targeted and untargeted analysis of data independent acquisition mass spectrometry data with parallel reaction monitoring verification. Analytical Chemistry. 89 (10), 5294-5302 (2017).
  23. Madsen, J. A., et al. Toward the complete characterization of host cell proteins in biotherapeutics via affinity depletions, LC-MS/MS, and multivariate analysis. MAbs. 7 (6), 1128-1137 (2015).
  24. Nie, S. Simple and sensitive method for deep profiling of host cell proteins in therapeutic antibodies by combining ultra-low trypsin concentration digestion, long chromatographic gradients, and boxcar mass spectrometry acquisition. Analytical Chemistry. 93 (10), 4383-4390 (2021).
  25. Yang, F. Versatile LC-MS-Based workflow with robust 0.1 ppm sensitivity for identifying residual HCPs in biotherapeutic products. Analytical Chemistry. 94 (2), 723-731 (2022).
  26. Zhang, Q. Comprehensive tracking of host cell proteins during monoclonal antibody purifications using mass spectrometry. MAbs. 6 (3), 659-670 (2014).
  27. Zhang, S., et al. Putative phospholipase B-Like 2 is not responsible for polysorbate degradation in monoclonal antibody drug products. Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (9), 2710-2718 (2020).
  28. Zhang, J., He, J., Smith, K. J. Fatty acids can induce the formation of proteinaceous particles in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 111 (3), 655-662 (2022).
  29. Uniprot1. , https://www.uniprot.org/uniprotkb?query=mus%2Bmusculus (2023).
  30. Uniprot2. , https://www.uniprot.org/uniprotkb (2023).

Tags

هذا الشهر في JoVE ، العدد 203 ، بروتين الخلية المضيفة ، LC-MS ، تقنية ProteoMiner ، الهضم المحدود
تحليل بروتين الخلية المضيفة باستخدام حبات التخصيب إلى جانب الهضم المحدود
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, S., Xiao, H., Li, N. Host… More

Zhang, S., Xiao, H., Li, N. Host Cell Protein Analysis using Enrichment Beads Coupled with Limited Digestion. J. Vis. Exp. (203), e65544, doi:10.3791/65544 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter