Summary
İlaç ürünlerinden (DP) konak hücre proteinlerini (HCP'ler) zenginleştirmek ve proteom zenginleştirme boncukları kullanarak peptitleri tespit etmek için bir protokol sunulmaktadır. Yöntem, performans açısından farklı yöntemleri değerlendirmek ve karşılaştırmak için iyi karakterize edilmiş bir referans materyal olan, kurum içinde üretilmiş bir monoklonal antikor (mAb) ilaç maddesi (DS) kullanılarak gösterilmiştir.
Abstract
Konak hücre proteinleri (HCP'ler), küçük miktarlarda bile terapötik proteinleri olumsuz yönde etkileyebilen safsızlıklardır. İlaç ürünleriyle ilişkili potansiyel riskleri değerlendirmek için, düşük bolluğa sahip HCP'leri belirlemeye yönelik yöntemler geliştirilmiştir. Hassas bir HCP tespit yöntemi geliştirmek için çok önemli bir yaklaşım, sıvı kromatografisi-kütle spektrometrisi (LC-MS) kullanılarak analizden önce monoklonal antikorları (mAb'ler) giderirken aynı anda HCP'leri zenginleştirmeyi içerir.
Bu protokol, ticari olarak temin edilebilen proteom zenginleştirme boncuklarını kullanarak konak hücre proteinlerini zenginleştirmek için ayrıntılı talimatlar sunar. Bu boncuklar, farklı proteinler için spesifik afinitelere sahip çeşitli hekzapeptid ligandları kütüphanesi içerir. Protokol ayrıca nano LC-MS/MS kullanılarak sınırlı sindirim ve müteakip peptit tespitini içerir. Bu teknikler kullanılarak, düşük bolluğa sahip HCP'ler 7000 kattan fazla zenginleştirilebilir ve bu da 0,002 ppm gibi etkileyici bir tespit limiti ile sonuçlanır. Önemli bir şekilde, bu protokol bir NIST mAb kullanarak 850 HCP'nin yüksek düzeyde güvenle tespit edilmesini sağlar. Ayrıca, kullanıcı dostu olacak şekilde tasarlanmıştır ve uygulanmasına yardımcı olacak bir video gösterimi içerir. Araştırmacılar bu adımları izleyerek, HCP'leri etkili bir şekilde zenginleştirebilir ve tespit edebilir, ilaç ürünleri için risk değerlendirmesinin hassasiyetini ve doğruluğunu artırabilir.
Introduction
Konak hücre proteinleri (HCP'ler), konakçı organizmanın hücre kültüründen salınan ve monoklonal antikor (mAb) ile birlikte saflaştırılan safsızlıklardır1,2,3,4. HCP'lerin eser seviyeleri, ilaç ürünü 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 kalitesini olumsuz etkileyebilir ve bu nedenle, HCP'leri ppm'nin altında ve ppm seviyelerinde tespit etmek için hassas bir HCP analiz yöntemi istenmektedir.
Düşük bolluktaki HCP'leri tespit etmek için ortogonal yöntemler uygulanabilir. Enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) genellikle genel HCP'leri ölçmek için kullanılır ve ayrıca karşılık gelen antikorlar mevcutsa bireysel HCP'leri tespit edebilir ve ölçebilir16. Bununla birlikte, HCP'ye özgü antikorların üretimi zaman alıcı ve emek yoğundur. Buna karşılık, kütle spektrometrisi (LC-MS) ile birleştirilmiş sıvı kromatografisi, mAb ilaç ürünlerindeki bireysel HCP'ler hakkında kapsamlı bilgi sağlayabilir ve HCP tanımlaması için yaygın olarak uygulanır 4,7,9,10,12,13,14,15,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,27.
Sınırlı sindirim20, filtrasyon17, Protein A delesyonu21, immünopresipitasyon (IP) ve ProteoMiner zenginleştirme (PM)18 dahil olmak üzere LC-MS/MS'li HCP'leri tespit etmek için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Çoğu yöntem, LC-MS/MS analizinden önce mAb miktarını azaltmayı ve HCP'leri zenginleştirmeyi, böylece mAb peptitleri ile HCP peptitleri arasındaki dinamik aralığı azaltmayı amaçlar. Bu protokol, ProteoMiner teknolojisini ve sınırlı sindirimi (PMLD)28 birleştiren bir proteomik numune zenginleştirme yöntemi sunar. ProteoMiner zenginleştirme prensibi, çeşitli kombinatoryal peptit ligandları kütüphanesi içeren ticari olarak temin edilebilen proteom zenginleştirme boncuklarının kullanılmasını içerir. Bu ligandlar, antikor-ilaç ürünlerindeki proteinlere spesifik olarak bağlanarak, düşük bolluktaki konakçı hücre proteinlerini (HCP'ler) ilgili afinite ligandlarına konsantre ederken fazla moleküllerin uzaklaştırılmasına izin verir. Öte yandan, sınırlı sindirim ilkesi, düşük konsantrasyonda tripsin kullanmayı içerir. Bu konsantrasyon, düşük bolluktaki HCP'leri sindirmek için yeterlidir, ancak tüm antikor ilaç ürünlerini sindirmek için yeterli değildir. Bu yaklaşım, sindirilmiş HCP peptitlerinin çözeltiden geri kazanılmasını ve zenginleştirilmesini sağlar.
Filtrasyon yöntemleriyle karşılaştırıldığında, PMLD tekniği tespit edilen HCP'lerin büyüklüğü ile sınırlı değildir17. Protein A delesyon yöntemleri, antikorlar21 ile ilişkili HCP'leri tespit etmeye özgüdür, immünopresipitasyon, bir anti-HCP antikorunun üretildiği belirli bir hücre hattından (Çin Hamster Yumurtalık (CHO) hücre hattı gibi) önceden tanımlanmış HCP'lerle sınırlıdır4. Buna karşılık, PMLD, herhangi bir ilaç modülünden HCP'leri ve çeşitli hücre hatlarından ilaç ürünleri ile birlikte saflaştırılmış konak hücre proteinlerini tespit etmek için uygulanabilir. Ek olarak, PMLD belirtilen yöntemlere kıyasla daha iyi duyarlılık gösterir 17,18,20,21,24.
Bu yaklaşım, HCP konsantrasyonunu 7000 kat zenginleştirebilir ve tespit sınırını 0,002 ppm28'e düşürebilir. Deney düzeneği Şekil 1'de gösterilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokolde kullanılan kısaltmalar Ek Tablo 1'de listelenmiştir.
1. Çözeltilerin ve tamponların hazırlanması
NOT: Tüm reaktiflerin ticari detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
- Bir cam şişede 9 mL deiyonize suya 1 mL 1 M Tris-HCl, pH 8.0 ekleyerek 0.1 M Tris-HCl, pH 8.0 çözeltisi hazırlayın ve vorteksleyerek iyice karıştırın. 4 °C'de 3 aya kadar saklayın.
- 10 mg SDC'yi 1 mL 0.1 M Tris-HCl, pH 8.0 içinde çözerek 24 mM sodyum deoksikolat (SDC) hazırlayın.
- 7 mg SLS'yi 1 mL 0.1 M Tris-HCl, pH 8.0 içinde çözerek 24 mM sodyum lauroil sarkozinat (SLS) hazırlayın.
- 24 mM SDC ve 24 mM SLS'yi 1:1 (h/v) oranında karıştırarak elüsyon tamponu hazırlayın.
- 20 μg tripsin içine 400 μL deiyonize su ekleyerek 50 ng/μL tripsin çözeltisi hazırlayın.
- 7.7 mg DTT'ye 308 μL 0.1 M Tris-HCl, pH 8.0 ekleyerek 25 mg / mL ditiyotreitol (DTT) hazırlayın.
- 56 mg IAM'ye 1.2 mL 0.1 M Tris-HCl, pH 8.0 ekleyerek 0.25 M iyodoasetamid (IAM) hazırlayın.
- 9 mL deiyonize suya 1 mL trifloroasetik asit (TFA) ekleyerek %10 TFA hazırlayın. 4 saniye boyunca girdap yapın ve aşağı doğru döndürün. 4 °C'de 3 aya kadar saklayın.
- 99 mL deiyonize suya 1 mL %10 TFA ekleyerek Tampon A'yı hazırlayın.
- 50 mL asetonitril (ACN) içine 1 mL %10 TFA ve 49 mL deiyonize su ekleyerek Tampon B'yi hazırlayın.
- 50 mL suya 37 mg L-histidin ve 54.8 mg L-Histidin monohidroklorür monohidrat ekleyerek 10 mM Histidin tamponu hazırlayın.
2. Monoklonal antikor (mAb) çözeltilerinin hazırlanması
- Konsantrasyonları 50 mg/mL'nin üzerinde olan ilaç ürünleri için, 15 mg monoklonal antikoru (mAb) (bkz. Malzeme Tablosu) 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde deiyonize su ile seyreltin, bu da toplam 300 μL hacim ve ~6 nihai pH ile sonuçlanır. Gerekirse, asetik asit veya Tris-HCl kullanarak pH'ı ayarlayın.
- Konsantrasyonları 50 mg/mL'nin altında olan ilaç ürünleri için, 2.2.1 ila 2.2.5 arasındaki adımları izleyerek tampon değişimi gerçekleştirin.
- Her numunenin 20 mg'ını 10k santrifüj filtre cihazına aktarın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve yaklaşık 100 μL hacim kalana kadar 25 dakika (oda sıcaklığında, RT) 14.000 x g'da santrifüjleyin.
- Filtreye 350 μL 10 mM Histidin ( Malzeme Tablosuna bakınız), pH 6.0 tamponu, girdap ve RT'de 25 dakika boyunca 14.000 x g'da santrifüj ekleyin.
- Filtreyi ters çevirin ve numune toplama tüpüne yerleştirin, ardından toplama tüpündeki tüm hacmi almak için numuneleri RT'de 5 dakika boyunca 1000 x g'de santrifüjleyin. Kalan protein örneklerini geri kazanmak için filtreyi 200 μLof 10 mM Histidin tamponu ve pipet ile yukarı ve aşağı yıkayın. Tüm çözeltiyi aynı toplama tüpüne, girdaba aktarın ve döndürün.
- NanoDrop ile numune konsantrasyonunu ölçün. Zenginleştirme boncukları ile inkübasyondan önce Histidin tamponu ekleyerek her protein örneğinin konsantrasyonunu 50 mg / mL'ye ayarlayın.
- 300 μL numuneyi 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
3. Proteom zenginleştirme boncuklarının hazırlanması
- Ticari protein zenginleştirme kitinden elde edilen her bir döndürme kolonundan üst ve alt kapağı çıkarın (Malzeme Tablosuna bakınız). Daha sonra kullanılacakları için kapakları atmayın.
- Döndürme kolonunu alın ve kapaksız 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Depolama çözümünü ortadan kaldırmak için kurulumu oda sıcaklığında ve RT'de 30-60 s boyunca 1.000 x g'da santrifüjleyin. Bu adımda toplanan malzemeyi atın.
- Piyasada bulunan zenginleştirme boncuklarına 200 μL yıkama tamponu ekleyin (Malzeme Tablosuna bakın) ve birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Döndürme kolonunu 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve tamponu çıkarmak için RT'de 30-60 s boyunca 1.000 x g'de santrifüjleyin. Toplanan malzemeyi atın.
NOT: Yıkama tamponu, ticari protein zenginleştirme kitine dahildir. - Adım 3.3'ü iki kez tekrarlayın.
- Alt kapağı değiştirin ve 200 μL su ekleyin, ardından üst kapağı değiştirin.
4. Protein zenginleştirme
- Bulamacı yukarı ve aşağı pipetleyin (adım 3.5'ten itibaren) ve 40 μL bulamacı adım 2'de hazırlanan numuneye aktarın. Tüpü oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin ve döndürün.
- Uygun frit boyutunu elde etmek için 16 G iğneyi kullanarak frit ile bir uç yapın ( Malzeme Tablosuna bakın), ardından 200 μL'lik ucun uç ucuna yerleştirin.
- Numuneyi boncuklarla birlikte adım 4.2'de hazırlanan uca aktarın. Çözeltiyi çıkarmak için ucu 2 mL mikrosantrifüj tüpü ile 200 x g'de RT'de 3 dakika santrifüjleyin.
- Uca 200 μL yıkama tamponu ekleyerek boncukları yıkayın ve yıkama solüsyonunu çıkarmak için ucu RT'de 2 dakika boyunca 200 x g'de 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpü ile santrifüjleyin. Bu adımı iki kez tekrarlayın.
- Uca 200 μL su ekleyerek boncukları yıkayın ve suyu çıkarmak için ucu RT'de 2 dakika boyunca 200 x g'de 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpü ile santrifüjleyin.
- Uca 10 μL elüsyon tamponu (adım 1.4) ekleyerek boncuklardan proteinleri elute edin ve boncukların elüsyon tamponu ile ıslandığından emin olmak için bulamacı uçta on kez pipetleyin.
- Eluent'i toplamak için ucu RT'de 30 saniye boyunca 200 x g'de yeni bir 0,5 mL mikrosantrifüj tüpü ile santrifüjleyin. 4.6-4.7 adımlarını iki kez tekrarlayın ve tüm elüsyonları bir 0.5 mL mikrosantrifüj tüpünde birleştirin.
- 28 ° C'de gece boyunca sindirim için eluent içine 1.5 μL tripsin çözeltisi (adım 1.5) ekleyin. 1.5 μL 25 mg/mL DTT ekleyin (adım 1.6) ve numuneyi 90 °C'de 20 dakika ısıtın.
- 1,5 μL 0,25 M IAM (adım 1,7) ekleyin ve oda sıcaklığında karanlıkta 20 dakika inkübe edin. 3,5 μL %10 TFA (adım 1,8) ekleyin, 2 dakika vorteks yapın ve pH'ın ~2-3'te olduğundan emin olun.
- SDC ve SLS'yi çökeltmek için RT'de 10 dakika boyunca 14.400 × g'da santrifüjleyin. Tuzdan arındırmak için süpernatanı toplayın.
- Aşağıdaki adımları izleyerek tuzdan arındırma işlemini gerçekleştirin.
- GC tuzdan arındırma ucuna 50 μL Tampon B (adım 1.10) ekleyin (Malzeme Tablosuna bakın). Ucu RT'de 3 dakika boyunca 1000 x g'de bir tutucu ile santrifüjleyin. Toplanan malzemeyi atın.
- Uca 50 μL Tampon A (adım 1.9) ekleyin. Ucu RT'de 3 dakika boyunca 1000 x g'de bir tutucu ile santrifüjleyin. Toplanan malzemeyi atın.
- Asitlenmiş numuneyi uca ekleyin. Ucu RT'de 6 dakika boyunca 500 x g'de bir tutucu ile santrifüjleyin. Toplanan malzemeyi atın.
- Uca 50 μL Tampon A ekleyerek ucu yıkayın. Ucu tutucu ile RT'de 3 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin. Toplanan malzemeyi atın. Bir kez tekrarlayın.
- GC tuzdan arındırma ucuna 50 μL Tampon B ekleyerek peptidi uçtan çıkarın. Ucu RT'de 3 dakika boyunca 500 x g'de yeni bir tüp ile santrifüjleyin. Adımı bir kez tekrarlayın ve eluent'i birleştirin.
- Eluent'i bir vakum yoğunlaştırıcı ile kurutun (Malzeme Tablosuna bakın).
- Kurutulmuş eluenti 30 μL% 0.1 formik asit (FA) çözeltisine yeniden süspanse edin.
- Peptit karışımlarının UV'sini 214 nm'de bir spektrofotometre ile ölçün (bkz. Peptit karışımlarının konsantrasyonu 0.1 ila 0.5 mg / mL arasında olmalıdır.
- Sindirilmiş her numunenin 10 μL'sini bir LC numune şişesine aktarın, ardından her sindirilmiş numunenin 1 μg'ını nano LC-MS/MS üzerine enjekte edin (bkz. 5. adımı izleyerek analizi gerçekleştirin. Sindirilmiş numunelerin geri kalanını -80 °C'lik bir dondurucuda saklayın.
5. Nano LC-MS/MS analizi
- Peptit karışımını bir kütle spektrometresine bağlı bir nano-LC sistemine enjekte edin. Peptit karışımlarını (~1 μg), tuzdan arındırma için Tablo 1A'da verilen gradyanlı bir C18 tuzak kolonuna ve ardından ayırma için 40 °C'de bir C18 analitik kolonuna yükleyin.
NOT: Mobil faz A tamponu, ultra saf suda% 0.1 FA'dan oluşuyordu ve mobil faz B,% 80 ACN'de% 0.1 FA'dan oluşuyordu. - Peptitleri ayırın ve 250 nL / dak'lık bir akış hızıyla Tablo 1B'de verilen gradyan ile elüte edin.
NOT: Kütle spektrometresi, 3 s'lik bir döngü süresi ile veriye bağlı modda (DDA) çalıştırılmıştır. İyonlar, her tam MS taraması için %30'luk normalleştirilmiş bir çarpışma enerjisi ile daha yüksek enerjili çarpışma ayrışması (HCD) yoluyla parçalanmaya uğradı. Taramalar, 3e6 otomatik kazanç kontrolü (AGC) hedefi, maksimum 20 ms enjeksiyon süresi ve 380-1600 m/z aralığı ile 60.000 çözünürlükte gerçekleştirildi. MS/MS olayları, 15.000 çözünürlükte, AGC hedefi 1e5, maksimum enjeksiyon süresi 60 ms ve m/z aralığı 200-2000 arasında gerçekleştirildi. Hariç tutma süresi 45 s olarak ayarlandı. İyon kaynağı özellikleri Tablo 1C'de verilmiştir ve spesifik kütle spektrometrisi parametreleri Tablo 2A-F'de bulunabilir.
6. Veri analizi
- NISTmAb kütle spektrometresi ham dosyalarında UniProt mus+musculus veritabanında bir arama gerçekleştirin29. Ek olarak, UniProt Cricetulus Griseus veritabanı30'a karşı rekombinant protein çivili mAb DS kütle spektrometrisi ham dosyalarını arayın.
NOT: Bu aramalar, Sequest HT ve Mascot arama motorları kullanılarak Proteome Discoverer yazılımında (Malzeme Tablosuna bakınız) gerçekleştirilmiştir. Kullanılan veritabanlarında gereksiz girişler yoktu. - Kütle spektrometresi aramaları için 10 ppm'lik bir kütle toleransı uygulayın ve parça kütle toleransını 0,02 Da'ya ayarlayın.
NOT: Arama kriterleri, sistein kalıntılarının statik karbamidometilasyonunu (+57.0214 Da) ve metiyonin kalıntıları üzerinde oksidasyonun (+15.9949 Da) değişken modifikasyonunu kapsıyordu. Ek olarak, değişken bir deaminasyon modifikasyonu (+0.984 Da) uygulandı. - Tripsin sindirimini kullanarak veritabanı aramasını gerçekleştirin ve en fazla iki kaçırılan bölünmeye izin verin. Hem proteinler hem de peptitler için yanlış keşif oranlarını 0.01 olarak ayarlayın.
NOT: Konak hücre proteinlerini (HCP'ler) pozitif olarak tanımlamak için, en az iki benzersiz peptitin minimum gereksinimi uygulanmıştır. Tablo 3 , Proteome Discoverer yazılımı tarafından analiz edilen NIST mAb ile ilişkili tanımlanmış HCP'lerin temsili özetini sunmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol, bir monoklonal antikor (mAb) örneğinde konak hücre proteinlerinin (HCP'ler) analizi için sınırlı sindirim (PMLD) ile birleştirilmiş protein zenginleştirme olarak adlandırılan bir numune hazırlama iş akışı sundu. Şekil 1, PMLD'nin adım adım prosedürünü göstermektedir. Araştırmacılar, doğrudan sindirim (Şekil 2'nin üst panelinde gösterilmiştir) ve PMLD (Şekil 2'nin alt panelinde gösterilmiştir) kullanarak HCP analizinin sonuçlarını karşılaştırdılar. Toplam İyon Kromatogramı (TIC) profilleri, PMLD'nin mAb peptitleriyle karşılaştırılabilir bazı HCP peptitlerinin gözlemlenmesine izin verirken, ana mAb peptitlerini önemli ölçüde azalttığını veya ortadan kaldırdığını gösterdi. Nano LC (Tablo 1) ve MS/MS (Tablo 2) analizleri için ayrıntılı parametreler verilmiştir. Ek olarak, Tablo 3, erişim numarası, HCP adı, türler, kapsama yüzdesi, PSM'ler, benzersiz peptitler, moleküler ağırlık, beklenen izoelektrik nokta (pI), Maskot skoru, Sequest HT skoru ve Maskot ve Sequest HT tarafından tanımlanan peptitlerin sayısı gibi bilgiler dahil olmak üzere NIST mAb ile ilişkili tanımlanmış HCP'lerin bir özetini göstermektedir.
Şekil 1: Sınırlı sindirim (PMLD) ile birleştirilmiş protein zenginleştirmenin numune hazırlama iş akışı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: NIST mAb'nin HCP analizi için Toplam İyon Kromatogramı (TIC) profili. Üst panel: Doğrudan sindirim kullanarak NIST mAb'nin HCP analizi için TIC profili. Alt panel: PMLD kullanılarak NIST mAb'nin HCP analizi için TIC profili. TIC profilinden, doğrudan sindirimle karşılaştırıldığında, ana mAb peptitlerinin çoğunun PMLD'den sonra azaltıldığı veya elimine edildiği, HCP'lere ait bazı peptitlerin gözlemlenebildiği ve mAb peptitleriyle karşılaştırılabilir olduğu açıktır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: Nano LC için parametreler. (A) Yükleme pompası gradyanı. (B) NC pompa gradyanı. (C) İyon kaynağı özellikleri. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 2: MS/MS için parametreler. (A) Tam tarama özellikleri. (B) MIPS özellikleri. (C) Yoğunluk özellikleri. (D) Şarj durumu özellikleri. (E) Dinamik dışlama. (F) Veriye bağlı MS2 tarama özellikleri. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 3: Proteome Discoverer yazılımı tarafından analiz edilen NIST mAb ile ilişkili tanımlanmış HCP'lerin temsili özet tablosu. Tablo, erişim numarası, HCP adı, türler, kapsama yüzdesi, peptit spektrum eşleşmelerinin (PSM'ler) sayısı, benzersiz peptitlerin sayısı, moleküler ağırlık, beklenen izoelektrik nokta (pI), Maskot skoru, Sequest HT skoru ve Maskot ve Sequest HT tarafından tanımlanan peptitlerin sayısı gibi bilgileri içerir. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Tablo 1: Kullanılan kısaltmaların listesi. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ticari olarak temin edilebilen protein zenginleştirme boncuklarının iki versiyonu vardır: biri daha küçük kapasiteli, diğeri daha büyük kapasiteli (bkz. Zenginleştirme boncuklarının her iki versiyonu da pakette on hazırlık içerir. Üreticinin talimatları, küçük kapasiteli kitten elde edilen her bir hazırlığın 10 mg toplam proteini zenginleştirmek için kullanılabileceğini göstermektedir. Bununla birlikte, DS'den konak hücre proteini (HCP) zenginleştirmesinin optimum performansı için, her hazırlık beş DS örneği için iyidir. Bu nedenle, her bir kit elli numuneden HCP'leri zenginleştirmek için kullanılabilir. Büyük kapasiteli kitten elde edilen her bir hazırlık için, yirmi beş DS örneğinden HCP'lerin zenginleştirilmesi için iyidir ve toplam iki yüz elli numuneden HCP'lerin tespit edilmesine olanak tanır.
Adım 3.1, tüm protokol boyunca yeniden kullanılacakları için üst veya alt kapakların atılmamasını tavsiye eder. Boncuklar üst kapağa yerleşirse, alt tapayı çıkardıktan ve üst kapağı kolon üzerinde tutarken santrifüjledikten sonra değiştirin. Alt kapağı tapa olarak kullanmak için ters çevirin ve döndürme kolonunun altına güvenli bir şekilde yerleştirin.
Prosedürdeki kritik bir adım, boncuk bulamacının tüpün dibine yerleştiği adım 4.1'dir. Bu nedenle, bulamacı monoklonal antikor (mAb) numunelerine aktarırken sürekli pipetlemeyi yukarı ve aşağı sürdürmek çok önemlidir. Diğer bir kritik adım, boncuklar elüsyon tamponu ile doyurulurken bulamacın uç içinde on kez pipetlenmesinin gerekli olduğu adım 4.6'dır. Adım 4.3-4.5, 4.7 ve 4.10'daki santrifüjleme süresi, biriken konak hücre proteinlerinin (HCP'ler) miktarına bağlı olarak değişebilir. Bu nedenle, bir sonraki adıma geçmeden önce uçtaki sıvıların düzgün bir şekilde döndürüldüğünden emin olmak ve kontrol etmek çok önemlidir. Yine, başlangıç miktarı 15 mg antikor-ilaç ürünü ile başlandığında, yaklaşık 30 μg antikor ve zenginleştirilmiş konak hücre proteinleri (HCP'ler) ayrıştırılabilir. Sınırlı sindirim için 400:1'lik bir protein-enzim oranı elde etmek için 75 ng tripsin ilave edildi. Daha düşük miktarda girdi materyali kullanıldığında, ayrıştırılmış protein numunesinin konsantrasyonunun ölçülmesi gereklidir. Bu ölçüm, buna göre eklenmesi gereken tripsin miktarının ayarlanmasına yardımcı olur. Adım 4.9, %10 TFA eklendikten sonra beyaz bir çökelti gösterir. Yüzey aktif maddelerin MS sinyaline herhangi bir müdahalesini önlemek için, deterjanın süpernatanttan tamamen çıkarılmasını sağlamak için trifloroasetik asit (TFA) ekledikten sonra pH'ı kontrol etmek çok önemlidir.
Eluentin suda kurutulması ve yeniden süspansiyonunun ardından, peptit karışımının UV ölçümünün yapılması gerekir. Bu ölçüm çok önemlidir, çünkü kolona yüklenen peptitlerin miktarı MS kullanılarak tespiti etkileyebilir. Değerlendirmeden sonra, yaklaşık 1 μg peptit karışımının MS'de en iyi performansı sergilediği bulundu. Sonuç olarak, bu optimal miktarın daha fazla analiz için nano LC-MS/MS'ye enjekte edilmesi gerekir.
PMLD yaklaşımı, düşük bolluktaki konak hücre proteinlerinin (HCP'ler) çoğunu korurken yeterli monoklonal antikor (mAb) DS azaltımı dahil olmak üzere numune hazırlamada çeşitli avantajlar sunar. İmmünopresipitasyondan (IP) farklı olarak, bu teknik anti-HCP antikorlarına dayanmaz, böylece önceden tanımlanmış antikorlarla ilişkili önyargıyı ortadan kaldırır ve anti-HCP antikorları üretmek için gereken emek ve zamanı azaltır. Ayrıca, moleküler ağırlık kesme17'ye dayalı filtrasyon yöntemlerinden farklı olarak, PMLD, boyutlarından bağımsız olarak HCP'leri zenginleştirir. Antikorlar, füzyon proteinleri, ScFv ve daha fazlası gibi çeşitli ilaç modüllerinden HCP'leri zenginleştirmek için uygulanabilir, bu da onu Protein A delesyon yöntemlerine kıyasla çok yönlü bir yaklaşım haline getirir21.
Bu avantajlara ek olarak, PMLD daha düşük bir tespit limiti sergiler ve diğer yöntemlere kıyasla yaygın olarak karakterize edilen bir referans standart olan NISTmAb'den daha fazla sayıda HCP'nin tespit edilmesini sağlar. Bununla birlikte, PMLD'nin otomasyon uygulamasını sınırlayan ev yapımı ekipman gerektirdiğini belirtmekte fayda var. Kullanılabilirliğini genişletmek için, fritli uç gibi belirli ekipmanların piyasada bulunan alternatiflerle değiştirilmesi mümkündür. Ek olarak, 96 oyuklu plakalarda tuzdan arındırma gerçekleştirmek, bu yaklaşımı kullanarak daha yüksek verim sağlayabilir. Gelecekteki deneylerde otomasyonu veya yarı otomasyonu keşfetmek, PMLD'nin daha geniş uygulamasını genişletmek için mantıklı bir sonraki adım olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların rekabet eden hiçbir mali çıkarı yoktur.
Acknowledgments
Hiç kimse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16 G, Metal Hub Needle, 2 in, point style 3 | Hamilton | 91016 | |
| Acclaim PepMap 100 C18 trap column (20 cm × 0.075 mm) | Thermo Fisher | 164535 | |
| Acetonitrile | Fisher-Scientific | A955 | |
| Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade | Fisher-Scientific | LS120-4 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC5010 | |
| C18 analytical column (0.075 mm × 1.7 μm × 30 cm, 100 Å) | CoAnn Technologies | HEB07503001718I | |
| Centrifuge 5424 | Eppendorf | 5405000646 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher | A39255 | |
| Frit for SPE cartridges, 9.5 mm, 3 mL, 100/pk | Agilent | 12131020 | |
| GL-Tip GC | GL Sciences Inc | 7820-11201 | |
| in-house mAb | Regeneron | concentration 200 mg/mL | |
| Iodoacetamide (30 x 9.3 mg) | Thermo Fisher | A39271 | |
| Isopropanol | Fisher-Scientific | 149320025 | |
| L-Histidine | Sigma Aldrich | H6034 | |
| L-Histidine monohydrochloride monohydrate | Sigma Aldrich | 53370 | |
| Methanol | Fisher-Scientific | A456-4 | |
| Milli-Q | Millpore | 30035 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Orbitrap Exploris 480 | Thermo Fisher | BRE725539 | |
| Protein LoBind Tube 0.5 mL | Eppendorf (VWR) | 22431064 | |
| Protein LoBind Tube 2.0 mL | Eppendorf (VWR) | 22431102 | |
| Proteome Discoverer software 2.4 | Thermo Scientific | ||
| ProteoMiner Protein Enrichment Large-Capacity Kit | Bio-Rad | 1633007 | |
| ProteoMiner Protein Enrichment Small-Capacity Kit | Bio-Rad | 1633006 | |
| Sodium deoxycholate (SDC) | Sigma Aldrich | D6750 | |
| Sodium lauroyl sarcosinate (SLS) | Sigma Aldrich | L5777 | |
| SpeedVac | Labconco | 7970010 | |
| Thermomixer R | Eppendorf | 22670107 | |
| Trifluoracetic acid (TFA) | Fisher-Scientific | 28904 | |
| Trypsin (Sequencing Grade Modified) (5 x 20 ug) | Promega | V5111 | |
| Tube Revolver Rotator | Thermo Fisher | 88881001 | |
| UltiMate 3000 RSLC nano system | Thermo Fisher | ULTIM3000RSLCNANO | |
| UltraPure 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Thermo Fisher | 15568-025 | |
| Vortex Genie 2 | VWR | 102091-234 | |
| Water with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade | Fisher-Scientific | LS118-4 |
References
- Aboulaich, N. A novel approach to monitor clearance of host cell proteins associated with monoclonal antibodies. Biotechnology Progress. 30 (5), 1114-1124 (2014).
- Goey, C. H., Alhuthali, S., Kontoravdi, C. Host cell protein removal from biopharmaceutical preparations: Towards the implementation of quality by design. Biotechnology Advances. 36 (4), 1223-1237 (2018).
- Levy, N. E., Valente, K. N., Choe, L. H., Lee, K. H., Lenhoff, A. M. Identification and characterization of host cell protein product-associated impurities in monoclonal antibody bioprocessing. Biotechnology and Bioengineering. 111 (5), 904-912 (2014).
- Molden, R. Host cell protein profiling of commercial therapeutic protein drugs as a benchmark for monoclonal antibody-based therapeutic protein development. MAbs. 13 (1), 1955811 (2021).
- Bee, J. S. Trace levels of the CHO host cell protease cathepsin D caused particle formation in a monoclonal antibody product. Biotechnology Progress. 31 (5), 1360-1369 (2015).
- Bracewell, D. G., Francis, R., Smales, C. M. The future of host cell protein (HCP) identification during process development and manufacturing linked to a risk-based management for their control. Biotechnology and Bioengineering. 112 (9), 1727-1737 (2015).
- Chiu, J., et al. Knockout of a difficult-to-remove CHO host cell protein, lipoprotein lipase, for improved polysorbate stability in monoclonal antibody formulations. Biotechnology and Bioengineering. 114 (5), 1006-1015 (2017).
- Gilgunn, S., et al. Identification and tracking of problematic host cell proteins removed by a synthetic, highly functionalized nonwoven media in downstream bioprocessing of monoclonal antibodies. Journal of Chromatography A. 1595, 28-38 (2019).
- Graf, T. Identification and characterization of polysorbate-degrading enzymes in a monoclonal antibody formulation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (11), 3558-3567 (2021).
- Hall, T., Sandefur, S. L., Frye, C. C., Tuley, T. L., Huang, L. Polysorbates 20 and 80 degradation by group XV lysosomal phospholipase A2 isomer X1 in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 105 (5), 1633-1642 (2016).
- Jones, M. 34;High-risk" host cell proteins (HCPs): A multi-company collaborative view. Biotechnology and Bioengineering. 118 (8), 2870-2885 (2021).
- Li, X., et al. Identification and characterization of a residual host cell protein hexosaminidase B associated with N-glycan degradation during the stability study of a therapeutic recombinant monoclonal antibody product. Biotechnology Progress. 37 (3), e3128 (2021).
- Zhang, S. Identification of the specific causes of polysorbate 20 degradation in monoclonal antibody formulations containing multiple lipases. Pharmaceutical Research. 39 (1), 75-87 (2022).
- Zhang, S., Xiao, H., Li, N. Degradation of polysorbate 20 by Sialate O-Acetylesterase in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (12), 3866-3873 (2021).
- Zhang, S., Xiao, H., Molden, R., Qiu, H., Li, N. Rapid polysorbate 80 degradation by liver carboxylesterase in a monoclonal antibody formulated drug substance at early stage development. Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (11), 3300-3307 (2020).
- Gunawan, F. Comparison of platform host cell protein ELISA to process-specific host cell protein ELISA. Biotechnology and Bioengineering. 115 (2), 382-389 (2018).
- Chen, I. H., Xiao, H., Daly, T., Li, N. Improved host cell protein analysis in monoclonal antibody products through molecular weight cutoff enrichment. Analytical Chemistry. 92 (5), 3751-3757 (2020).
- Chen, I. H., Xiao, H., Li, N. Improved host cell protein analysis in monoclonal antibody products through ProteoMiner. Analytical Biochemistry. 610, 113972 (2020).
- Doneanu, C. E., et al. Enhanced detection of low-abundance host cell protein impurities in high-purity monoclonal antibodies down to 1 ppm using ion mobility mass spectrometry coupled with multidimensional liquid chromatography. Analytical Chemistry. 87 (20), 10283-10291 (2015).
- Huang, L., et al. A Novel sample preparation for shotgun proteomics characterization of HCPs in antibodies. Analytical Chemistry. 89 (10), 5436-5444 (2017).
- Johnson, R. O., Greer, T., Cejkov, M., Zheng, X., Li, N. Combination of FAIMS, Protein A depletion, and native digest conditions enables deep proteomic profiling of host cell proteins in monoclonal antibodies. Analytical Chemistry. 92 (15), 10478-10484 (2020).
- Kreimer, S. Host cell protein profiling by targeted and untargeted analysis of data independent acquisition mass spectrometry data with parallel reaction monitoring verification. Analytical Chemistry. 89 (10), 5294-5302 (2017).
- Madsen, J. A., et al. Toward the complete characterization of host cell proteins in biotherapeutics via affinity depletions, LC-MS/MS, and multivariate analysis. MAbs. 7 (6), 1128-1137 (2015).
- Nie, S. Simple and sensitive method for deep profiling of host cell proteins in therapeutic antibodies by combining ultra-low trypsin concentration digestion, long chromatographic gradients, and boxcar mass spectrometry acquisition. Analytical Chemistry. 93 (10), 4383-4390 (2021).
- Yang, F. Versatile LC-MS-Based workflow with robust 0.1 ppm sensitivity for identifying residual HCPs in biotherapeutic products. Analytical Chemistry. 94 (2), 723-731 (2022).
- Zhang, Q. Comprehensive tracking of host cell proteins during monoclonal antibody purifications using mass spectrometry. MAbs. 6 (3), 659-670 (2014).
- Zhang, S., et al. Putative phospholipase B-Like 2 is not responsible for polysorbate degradation in monoclonal antibody drug products. Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (9), 2710-2718 (2020).
- Zhang, J., He, J., Smith, K. J. Fatty acids can induce the formation of proteinaceous particles in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 111 (3), 655-662 (2022).
- Uniprot1. , https://www.uniprot.org/uniprotkb?query=mus%2Bmusculus (2023).
- Uniprot2. , https://www.uniprot.org/uniprotkb (2023).
