Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Vertscelleproteinanalyse ved hjelp av anrikningsperler kombinert med begrenset fordøyelse

Published: January 19, 2024 doi: 10.3791/65544
Automatic Translation
1, 1, 1
1Analytical Chemistry, Regeneron Pharmaceuticals Inc.

Summary

En protokoll presenteres for berikelse av vertscelleproteiner (HCP) fra legemiddelprodukter (DP) og påvisning av peptider ved bruk av proteomanrikningsperler. Metoden er demonstrert ved hjelp av et egenprodusert monoklonalt antistoff (mAb) legemiddelstoff (DS), som er et godt karakterisert referansemateriale for å evaluere og sammenligne ulike metoder med hensyn til ytelse.

Abstract

Vertscelleproteiner (HCP) er urenheter som kan påvirke terapeutiske proteiner negativt, selv i små mengder. For å evaluere den potensielle risikoen forbundet med narkotikaprodukter, er det utviklet metoder for å identifisere helsepersonell med lav overflod. En avgjørende tilnærming for å utvikle en sensitiv HCP-deteksjonsmetode innebærer å berike helsepersonell samtidig som monoklonale antistoffer (mAbs) fjernes før analyse, ved bruk av væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS).

Denne protokollen gir detaljerte instruksjoner for berikelse av vertscelleproteiner ved bruk av kommersielt tilgjengelige proteomanrikningsperler. Disse perlene inneholder et mangfoldig bibliotek av heksapeptidligander med spesifikke affiniteter for forskjellige proteiner. Protokollen inneholder også begrenset fordøyelse og påfølgende peptiddeteksjon ved bruk av nano LC-MS / MS. Ved å bruke disse teknikkene kan helsepersonell med lav overflod berikes over 7000 ganger, noe som resulterer i en imponerende deteksjonsgrense så lav som 0,002 ppm. Denne protokollen gjør det mulig å oppdage 850 helsepersonell med høy grad av sikkerhet ved hjelp av en NIST mAb. Videre er den designet for å være brukervennlig og inkluderer en videodemonstrasjon for å hjelpe til med implementeringen. Ved å følge disse trinnene kan forskere effektivt berike og oppdage helsepersonell, noe som øker følsomheten og nøyaktigheten av risikovurdering for legemidler.

Introduction

Vertscelleproteiner (HCP) er urenheter som frigjøres fra vertsorganismens cellekultur og renses sammen med monoklonalt antistoff (mAb)1,2,3,4. Spornivåer av helsepersonell kan negativt påvirke kvaliteten på legemiddelproduktet 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15, og derfor er det ønskelig med en sensitiv HCP-analysemetode for å oppdage helsepersonell i sub-ppm til ppm-nivåer.

Ortogonale metoder kan brukes til å oppdage helsepersonell i lav overflod. Enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) brukes vanligvis til å kvantifisere generelle helsepersonell, og det kan også oppdage og kvantifisere individuelle helsepersonell hvis de tilsvarende antistoffene er tilgjengelige16. Produksjonen av HCP-spesifikke antistoffer er imidlertid tidkrevende og arbeidskrevende. I motsetning til dette kan væskekromatografi kombinert med massespektrometri (LC-MS) gi omfattende informasjon om individuelle helsepersonell i mAb-legemiddelprodukter og er mye brukt for HCP-identifikasjon 4,7,9,10,12,13,14,15,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,27.

Flere metoder er utviklet for å oppdage helsepersonell med LC-MS/MS, inkludert begrenset fordøyelse20, filtrering17, protein A-delesjon21, immunutfelling (IP) og ProteoMiner-anrikning (PM)18. De fleste metoder tar sikte på å redusere mengden mAb og berike helsepersonell før LC-MS / MS-analyse, og dermed redusere det dynamiske området mellom mAb-peptider og HCP-peptider. Denne protokollen presenterer en proteomisk prøveanrikningsmetode som kombinerer ProteoMiner-teknologi og begrenset fordøyelse (PMLD)28. ProteoMiner-anrikningsprinsippet innebærer bruk av kommersielt tilgjengelige proteomberikelsesperler som inneholder et mangfoldig bibliotek med kombinatoriske peptidligander. Disse ligandene binder seg spesifikt til proteiner på antistoff-legemiddelprodukter, noe som muliggjør fjerning av overskytende molekyler mens de konsentrerer vertscelleproteiner med lav overflod (HCP) på deres respektive affinitetsligander. På den annen side innebærer prinsippet om begrenset fordøyelse å bruke en lav konsentrasjon av trypsin. Denne konsentrasjonen er tilstrekkelig til å fordøye helsepersonell med lav overflod, men ikke nok til å fordøye alle antistoffmedikamenter. Denne tilnærmingen muliggjør utvinning og anrikning av fordøyde HCP-peptider fra løsningen.

Sammenlignet med filtreringsmetoder er PMLD-teknikken ikke begrenset av størrelsen på de påviste helsepersonell17. Protein A-delesjonsmetoder er spesifikke for påvisning av helsepersonell assosiert med antistoffer21, mens immunutfelling er begrenset til forhåndsdefinerte helsepersonell fra en bestemt cellelinje (for eksempel den kinesiske hamsterovarien (CHO) cellelinje), hvor et anti-HCP-antistoff ble generert4. I motsetning til dette kan PMLD brukes til å oppdage helsepersonell fra alle legemiddelmoduler og vertscelleproteiner som er renset sammen med legemiddelprodukter fra forskjellige cellelinjer. I tillegg viser PMLD bedre sensitivitet sammenlignet med de nevnte metodene 17,18,20,21,24.

Denne tilnærmingen kan berike HCP-konsentrasjonen med 7000 ganger og senke deteksjonsgrensen til 0,002 ppm28. Det eksperimentelle oppsettet er illustrert i figur 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Forkortelser brukt i protokollen er listet opp i tilleggstabell 1.

1. Klargjøring av løsninger og buffere

MERK: De kommersielle detaljene for alle reagensene er oppført i materialfortegnelsen.

  1. Forbered 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0-oppløsning ved å tilsette 1 ml 1 M Tris-HCl, pH 8,0 i 9 ml avionisert vann i et hetteglass, og bland godt ved vortexing. Oppbevares ved 4 °C i opptil 3 måneder.
  2. Klargjør 24 mM natriumdeoksykolat (SDC) ved å oppløse 10 mg SDC i 1 ml 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0.
  3. Tilbered 24 mM natriumlauroylsarkosinat (SLS) ved å løse opp 7 mg SLS i 1 ml 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0.
  4. Forbered elueringsbuffer ved å blande 24 mM SDC og 24 mM SLS i forholdet 1:1 (v/v).
  5. Forbered 50 ng / μL trypsinoppløsning ved å tilsette 400 μL avionisert vann i 20 μg trypsin.
  6. Forbered 25 mg / ml dithiothreitol (DTT) ved å tilsette 308 μL 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0, til 7,7 mg DTT.
  7. Klargjør 0,25 M jodoacetamid (IAM) ved å tilsette 1,2 ml 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0, til 56 mg IAM.
  8. Forbered 10% TFA ved å tilsette 1 ml trifluoreddiksyre (TFA) i 9 ml avionisert vann. Vortex i 4 s og spinn ned. Oppbevares ved 4 °C i opptil 3 måneder.
  9. Forbered buffer A ved å tilsette 1 ml 10% TFA i 99 ml avionisert vann.
  10. Forbered buffer B ved å tilsette 1 ml 10 % TFA og 49 ml avionisert vann i 50 ml acetonitril (ACN).
  11. Forbered 10 mM histidinbuffer ved å tilsette 37 mg L-histidin og 54,8 mg L-histidinmonohydrokloridmonohydrat i 50 ml vann.

2. Fremstilling av monoklonale antistoff (mAb) løsninger

  1. For legemidler med konsentrasjoner over 50 mg/ml, fortynn 15 mg av det monoklonale antistoffet (mAb) (se materialtabellen) med avionisert vann i et 2 ml mikrosentrifugerør, noe som resulterer i et totalvolum på 300 μL og en endelig pH på ~6. Juster om nødvendig pH ved hjelp av eddiksyre eller Tris-HCl.
  2. For legemidler med konsentrasjoner under 50 mg/ml, utfør bufferbytte etter trinn 2.2.1 til 2.2.5.
    1. Overfør 20 mg av hver prøve til en 10k sentrifugalfilteranordning (se materialfortegnelse) og sentrifuge ved 14 000 x g i 25 minutter (ved romtemperatur, RT) til ca. 100 μL volum gjenstår.
    2. Tilsett 350 μL 10 mM histidin (se materialfortegnelse), pH 6,0 buffer i filteret, virvel og sentrifuge ved 14 000 x g i 25 minutter ved RT. Gjenta én gang.
    3. Inverter filteret og plasser det i prøveoppsamlingsrøret, sentrifuge deretter prøvene ved 1000 x g i 5 minutter ved RT for å hente hele volumet i oppsamlingsrøret. Vask filteret med 200 μLof 10 mM histidinbuffer og pipett opp og ned for å gjenvinne eventuelle gjenværende proteinprøver. Overfør hele løsningen til samme oppsamlingsrør, virvel og spinn ned.
    4. Mål prøvekonsentrasjonen med NanoDrop. Juster konsentrasjonen av hver proteinprøve til 50 mg/ml ved å tilsette histidinbufferen før inkubering med anrikningskuler.
    5. Overfør 300 μL av prøven til et 2 ml mikrosentrifugerør.

3. Fremstilling av proteomberikelsesperler

  1. Fjern topp- og bunnhetten fra hver spinnkolonne hentet fra det kommersielle proteinanrikningssettet (se materialfortegnelse). Ikke kast hettene, da de vil bli brukt senere.
  2. Ta sentrifugeringskolonnen og plasser den i et 2 ml mikrosentrifugerør uten hette. Sentrifuger oppsettet ved romtemperatur og 1000 x g i 30-60 s ved RT for å eliminere lagringsløsningen. Kast materialet som er samlet inn i løpet av dette trinnet.
  3. Tilsett 200 μL vaskebuffer til de kommersielt tilgjengelige anrikningskulene (se materialfortegnelse) og pipet opp og ned flere ganger. Plasser sentrifugeringskolonnen i et 2 ml mikrosentrifugerør og sentrifuge ved 1000 x g i 30-60 s ved RT for å fjerne bufferen. Kast innsamlet materiale.
    MERK: Vaskebufferen er inkludert i det kommersielle proteinberikelsessettet.
  4. Gjenta trinn 3.3 to ganger.
  5. Sett bunnhetten på igjen og tilsett 200 μL vann, og sett deretter på topplokket.

4. Proteinberikelse

  1. Piper opp og ned slammet (fra trinn 3.5) og overfør 40 mikrol slam til prøven klargjort i trinn 2. Inkuber og roter røret ved romtemperatur i 2 timer.
  2. Lag et tips med frit (se materialfortegnelse) ved hjelp av 16 G kanylen for å få riktig frit størrelse, og sett den deretter inn i spissenden av 200 μL spissen.
  3. Overfør prøven med perler til spissen som ble utarbeidet i trinn 4.2. Sentrifuger spissen med 2 ml mikrosentrifugerør ved 200 x g i 3 minutter ved RT for å fjerne oppløsningen.
  4. Vask kulene ved å tilsette 200 μL vaskebuffer på spissen og sentrifuger spissen med et 2 ml mikrosentrifugerør ved 200 x g i 2 minutter ved RT for å fjerne vaskeoppløsningen. Gjenta trinnet to ganger.
  5. Vask perlene ved å tilsette 200 μL vann til spissen og sentrifuger spissen med et 2 ml mikrosentrifugerør ved 200 x g i 2 minutter ved RT for å fjerne vannet.
  6. Eluer proteiner fra perler ved å tilsette 10 μL elueringsbuffer (trinn 1.4) i spissen, og pipe slammet ti ganger i spissen for å sikre at perlene er gjennomvåt med elueringsbuffer.
  7. Sentrifuger spissen med et nytt 0,5 ml mikrosentrifugerør ved 200 x g i 30 s ved RT for å samle opp eluenten. Gjenta trinn 4,6-4,7 to ganger og bland all eluering i ett 0,5 ml mikrosentrifugerør.
  8. Tilsett 1,5 mikrol trypsinoppløsning (trinn 1,5) i eluent for fordøyelse over natten ved 28 °C. Tilsett 1,5 μL 25 mg/ml DTT (trinn 1,6), og varm prøven ved 90 °C i 20 minutter.
  9. Tilsett 1,5 μL på 0,25 M IAM (trinn 1,7) og rug ved romtemperatur i mørket i 20 minutter. Tilsett 3,5 μL 10% TFA (trinn 1,8), virvel i 2 min, og sørg for at pH er på ~ 2-3.
  10. Sentrifuge ved 14 400 × g i 10 min ved RT for å utfelle SDC og SLS. Samle supernatanten for avsalting.
  11. Utfør avsalting ved å følge trinnene nedenfor.
    1. Tilsett 50 μL buffer B (trinn 1,10) til GC-avsaltingsspissen (se materialtabellen). Sentrifuger spissen med en holder på 1000 x g i 3 min ved RT. Kast det innsamlede materialet.
    2. Tilsett 50 μL buffer A (trinn 1.9) til spissen. Sentrifuger spissen med en holder på 1000 x g i 3 min ved RT. Kast det innsamlede materialet.
    3. Tilsett den syrlige prøven på spissen. Sentrifuger spissen med en holder på 500 x g i 6 min ved RT. Kast det oppsamlede materialet.
    4. Vask spissen ved å tilsette 50 μL buffer A på spissen. Sentrifuger spissen med holderen på 500 x g i 3 min ved RT. Kast det oppsamlede materialet. Gjenta én gang.
    5. Fjern peptidet fra spissen ved å tilsette 50 μL buffer B til GC-avsaltingsspissen. Sentrifuger spissen med et nytt rør på 500 x g i 3 min ved RT. Samle materialet. Gjenta trinnet én gang og kombiner eluenten.
    6. Tørk eluenten med en vakuumkonsentrator (se materialfortegnelse).
  12. Gjenta det tørkede eluenten i 30 mikrol 0,1 % maursyreoppløsning (FA).
  13. Mål UV av peptidblandinger ved 214 nm med et spektrofotometer (se materialtabell). Konsentrasjonen av peptidblandinger bør variere mellom 0,1 og 0,5 mg/ml.
  14. Overfør 10 μL av hver fordøyd prøve til et LC-prøveglass, injiser deretter 1 μg av hver fordøyd prøve på nano LC-MS / MS (se materialtabellen). Utfør analysen etter trinn 5. Oppbevar resten av fordøyde prøver i fryser ved -80 °C.

5. Nano LC-MS / MS-analyse

  1. Injiser peptidblandingen i et nano-LC-system koblet til et massespektrometer. Legg peptidblandingene (~1 μg) på en C18-fellekolonne med gradienten gitt i tabell 1A for avsalting og deretter på en C18-analytisk kolonne ved 40 °C for separasjon.
    MERK: Den mobile fase A-bufferen besto av 0,1 % FA i ultrarent vann, og den mobile fase B besto av 0,1 % FA i 80 % ACN.
  2. Separer peptidene og eluer med gradienten gitt i tabell 1B med en strømningshastighet på 250 nL/min.
    MERK: Massespektrometeret ble operert i dataavhengig modus (DDA) med en syklustid på 3 s. Ioner gjennomgikk fragmentering gjennom høyere energi kollisjonell dissosiasjon (HCD) med en normalisert kollisjonsenergi på 30% for hver full MS-skanning. Skanningene ble utført med en oppløsning på 60 000, med et AGC-mål (automatic gain control) på 3e6, en maksimal injeksjonstid på 20 ms og et m/z-område på 380-1600. MS/MS-hendelser ble gjennomført med en oppløsning på 15 000, med et AGC-mål på 1e5, en maksimal injeksjonstid på 60 ms og et m/z-område på 200-2000. Eksklusjonsvarigheten ble satt til 45 s. Ionekildeegenskapene er angitt i tabell 1C, og de spesifikke massespektrometriparametrene finnes i tabell 2A-F.

6. Dataanalyse

  1. Utfør et søk i NISTmAb massespektrometri råfiler mot UniProt mus + musculus database29. I tillegg kan du søke etter de rekombinante proteinpiggene i mAb DS-massespektrometri-råfilene mot UniProt Cricetulus Griseus-databasen30.
    MERK: Disse søkene ble utført i Proteome Discoverer-programvaren (se Materialfortegnelse) ved hjelp av søkemotorene Sequest HT og Mascot. Databasene som ble brukt var fri for overflødige oppføringer.
  2. For massespektrometrisøk, bruk en massetoleranse på 10 ppm, og sett fragmentmassetoleransen til 0,02 Da.
    MERK: Søkekriteriene omfattet statisk karbamidometylering av cysteinrester (+57,0214 Da) og variabel modifisering av oksidasjon (+15,9949 Da) på metioninrester. I tillegg ble en variabel modifikasjon av deaminering (+0,984 Da) brukt.
  3. Utfør databasesøket ved hjelp av trypsinfordøyelse, noe som gir maksimalt to tapte spaltninger. Sett falske oppdagelseshastigheter for både proteiner og peptider til 0,01.
    MERK: For å identifisere vertscelleproteiner (HCP) positivt, ble det brukt et minimumskrav på minst to unike peptider. Tabell 3 gir det representative sammendraget av identifiserte helsepersonell assosiert med NIST mAb analysert av Proteome Discoverer-programvare.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne protokollen presenterte en arbeidsflyt for prøvepreparering, kalt proteinberikelse kombinert med begrenset fordøyelse (PMLD), for analyse av vertscelleproteiner (HCP) i en monoklonalt antistoff (mAb) prøve. Figur 1 illustrerer den trinnvise prosedyren for PMLD. Forskerne sammenlignet resultatene av HCP-analyse ved hjelp av direkte fordøyelse (vist i topppanelet i figur 2) og PMLD (vist i bunnpanelet i figur 2). TIC-profilene (Total Ion Chromatogram) indikerte at PMLD signifikant reduserte eller eliminerte store mAb-peptider, samtidig som det var mulig å observere noen HCP-peptider som var sammenlignbare med mAb-peptider. Detaljerte parametere for nano LC (tabell 1) og MS/MS (tabell 2) analyser er gitt. I tillegg viser tabell 3 et sammendrag av identifiserte helsepersonell assosiert med NIST mAb, inkludert informasjon som tiltredelsesnummer, HCP-navn, art, dekningsprosent, PSM, unike peptider, molekylvekt, forventet isoelektrisk punkt (pI), Mascot-score, Sequest HT-score og antall peptider identifisert av Mascot og Sequest HT.

Figure 1
Figur 1: Prøveprepareringsarbeidsflyt for proteinberikelse kombinert med begrenset fordøyelse (PMLD). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Total ionekromatogram (TIC)-profil for HCP-analyse av NIST mAb. Øverste panel: TIC-profil for HCP-analyse av NIST mAb ved direkte fordøyelse. Nederste panel: TIC-profil for HCP-analyse av NIST mAb ved bruk av PMLD. Det fremgår av TIC-profilen at sammenlignet med direkte fordøyelse, har de fleste av de viktigste mAb-peptidene blitt redusert eller eliminert etter PMLD, mens noen peptider som tilhører helsepersonell kan observeres og er sammenlignbare med mAb-peptider. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1: Parametere for nano LC. (A) Lasting av pumpegradient. (B) NC pumpegradient. (C) Ionkildeegenskaper. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 2: Parametere for MS/MS. (A) Full skanning egenskaper. (B) MIPS-egenskaper. (C) Intensitetsegenskaper. (D) Egenskaper for ladetilstand. (E) Dynamisk ekskludering. (F) Dataavhengige MS2-skanneegenskaper. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 3: Representativ sammendragstabell over identifiserte helsepersonell assosiert med NIST mAb analysert av Proteome Discoverer-programvare. Tabellen inneholder informasjon som tiltredelsesnummer, HCP-navn, art, prosentandel av dekning, antall peptidspektrumtreff (PSM), antall unike peptider, molekylvekt, forventet isoelektrisk punkt (pI), Mascot-score, Sequest HT-score og antall peptider identifisert av Mascot og Sequest HT. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tilleggstabell 1: Liste over brukte forkortelser. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det finnes to versjoner av kommersielt tilgjengelige proteinberikelsesperler: en med mindre kapasitet og den andre med større kapasitet (se materialfortegnelse). Begge versjonene av anrikningsperlene inneholder ti preps i pakken. Produsentens instruksjoner antyder at hver prep fra det lille kapasitetssettet kan brukes til å berike 10 mg totalt protein. For optimal ytelse av anrikning av vertscelleprotein (HCP) fra DS, er imidlertid hver forberedelse god for fem DS-prøver. Derfor kan hvert sett brukes til å berike helsepersonell fra femti prøver. For hver forberedelse fra settet med stor kapasitet er det bra for anrikning av helsepersonell fra tjuefem DS-prøver, slik at det kan påvises helsepersonell fra totalt to hundre og femti prøver.

Trinn 3.1 fraråder å kaste topp- eller bunnstykkene, da de vil bli gjenbrukt gjennom hele protokollen. Hvis perler setter seg i topphetten, bytter du dem ut etter at du har fjernet bunnpluggen og sentrifugert mens du holder topphetten på kolonnen. For å bruke bunnhetten som en plugg, snu den og plasser den sikkert nederst i sentrifugeringskolonnen.

Et kritisk trinn i prosedyren er trinn 4.1, hvor perleoppslemmingen legger seg i bunnen av røret. Derfor er det avgjørende å opprettholde kontinuerlig pipettering opp og ned mens slammet overføres til monoklonale antistoffprøver (mAb). Et annet kritisk trinn er trinn 4.6, der det er viktig å pipette slammet ti ganger innenfor spissen mens kulene er mettet med elueringsbuffer. Varigheten av sentrifugeringen i trinn 4.3-4.5, 4.7 og 4.10 kan variere avhengig av mengden akkumulerte vertscelleproteiner (HCP). Derfor er det viktig å sjekke og sikre at væskene i spissen er riktig spunnet ned før du går videre til neste trinn. Igjen, når du starter med en innledende mengde på 15 mg antistoff-legemiddelprodukt, kan ca. 30 μg antistoff og berikede vertscelleproteiner (HCP) elueres. For å oppnå et protein-til-enzym-forhold på 400:1 for begrenset fordøyelse ble 75 ng trypsin tilsatt. Når en lavere mengde inngangsmateriale brukes, er det nødvendig å måle konsentrasjonen av den eluerte proteinprøven. Denne målingen bidrar til å justere mengden trypsin som må tilsettes tilsvarende. Trinn 4.9 viser et hvitt bunnfall etter tilsetning av 10% TFA. For å forhindre interferens fra overflateaktive midler med MS-signalet, er det avgjørende å kontrollere pH etter tilsetning av trifluoreddiksyre (TFA) for å sikre fullstendig fjerning av vaskemiddelet fra supernatanten.

Etter tørking og resuspensjon av eluenten i vann, er det nødvendig å utføre en UV-måling av peptidblandingen. Denne målingen er avgjørende fordi mengden peptider lastet på kolonnen kan påvirke deteksjonen ved hjelp av MS. Etter evaluering ble det funnet at ca. 1 μg av peptidblandingen viste best ytelse ved MS. Følgelig må denne optimale mengden injiseres i nano LC-MS / MS for videre analyse.

PMLD-tilnærmingen gir flere fordeler ved prøvepreparering, inkludert tilstrekkelig monoklonalt antistoff (mAb) DS-reduksjon samtidig som flertallet av vertscelleproteiner (HCP) med lav overflod bevares. I motsetning til immunoprecipitation (IP), er denne teknikken ikke avhengig av anti-HCP-antistoffer, og eliminerer dermed skjevheten forbundet med forhåndsdefinerte antistoffer og reduserer arbeidskraft og tid som kreves for å produsere anti-HCP-antistoffer. Videre, i motsetning til filtreringsmetoder basert på molekylvektgrense17, beriker PMLD helsepersonell uavhengig av størrelse. Det kan brukes til å berike helsepersonell fra ulike legemiddelmoduler, for eksempel antistoffer, fusjonsproteiner, ScFv og mer, noe som gjør det til en allsidig tilnærming sammenlignet med protein A-delesjonsmetoder21.

I tillegg til disse fordelene har PMLD en lavere deteksjonsgrense og muliggjør påvisning av et større antall helsepersonell fra NISTmAb, en bredt karakterisert referansestandard, sammenlignet med andre metoder. Det er imidlertid verdt å merke seg at PMLD krever hjemmelaget utstyr, noe som begrenser applikasjonen for automatisering. For å utvide brukervennligheten er det mulig å erstatte bestemt utstyr, for eksempel spissen med frit, med kommersielt tilgjengelige alternativer. I tillegg kan avsalting på 96-brønnsplater muliggjøre høyere gjennomstrømning ved hjelp av denne tilnærmingen. Å utforske automatisering eller halvautomatisering i fremtidige eksperimenter kan være et logisk neste skritt for å utvide den bredere anvendelsen av PMLD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Ingen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16 G, Metal Hub Needle, 2 in, point style 3 Hamilton 91016
Acclaim PepMap 100 C18 trap column (20 cm × 0.075 mm) Thermo Fisher 164535
Acetonitrile Fisher-Scientific A955
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade  Fisher-Scientific LS120-4
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit Millipore Sigma UFC5010
C18 analytical column (0.075 mm × 1.7 μm × 30 cm, 100 Å) CoAnn Technologies HEB07503001718I
Centrifuge 5424 Eppendorf 5405000646
Dithiothreitol (DTT)  Thermo Fisher A39255
Frit for SPE cartridges, 9.5 mm, 3 mL, 100/pk Agilent 12131020
GL-Tip GC GL Sciences Inc   7820-11201
in-house mAb Regeneron concentration 200 mg/mL
Iodoacetamide (30 x 9.3 mg) Thermo Fisher A39271
Isopropanol Fisher-Scientific 149320025
L-Histidine Sigma Aldrich H6034
L-Histidine monohydrochloride monohydrate Sigma Aldrich 53370
Methanol Fisher-Scientific A456-4 
Milli-Q Millpore 30035
NanoDrop 2000 Thermo Scientific ND-2000
Orbitrap Exploris 480 Thermo Fisher BRE725539
Protein LoBind Tube 0.5 mL Eppendorf (VWR) 22431064
Protein LoBind Tube 2.0 mL Eppendorf (VWR) 22431102
Proteome Discoverer software 2.4 Thermo Scientific
ProteoMiner Protein Enrichment Large-Capacity Kit Bio-Rad 1633007
ProteoMiner Protein Enrichment Small-Capacity Kit Bio-Rad 1633006
Sodium deoxycholate (SDC) Sigma Aldrich D6750
Sodium lauroyl sarcosinate (SLS)  Sigma Aldrich L5777
SpeedVac Labconco 7970010
Thermomixer R Eppendorf 22670107
Trifluoracetic acid (TFA) Fisher-Scientific 28904
Trypsin (Sequencing Grade Modified)  (5 x 20 ug) Promega V5111
Tube Revolver Rotator Thermo Fisher 88881001
UltiMate 3000 RSLC nano system Thermo Fisher ULTIM3000RSLCNANO
UltraPure 1 M Tris-HCl pH 8.0 Thermo Fisher 15568-025
Vortex Genie 2 VWR 102091-234
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade  Fisher-Scientific LS118-4 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aboulaich, N. A novel approach to monitor clearance of host cell proteins associated with monoclonal antibodies. Biotechnology Progress. 30 (5), 1114-1124 (2014).
  2. Goey, C. H., Alhuthali, S., Kontoravdi, C. Host cell protein removal from biopharmaceutical preparations: Towards the implementation of quality by design. Biotechnology Advances. 36 (4), 1223-1237 (2018).
  3. Levy, N. E., Valente, K. N., Choe, L. H., Lee, K. H., Lenhoff, A. M. Identification and characterization of host cell protein product-associated impurities in monoclonal antibody bioprocessing. Biotechnology and Bioengineering. 111 (5), 904-912 (2014).
  4. Molden, R. Host cell protein profiling of commercial therapeutic protein drugs as a benchmark for monoclonal antibody-based therapeutic protein development. MAbs. 13 (1), 1955811 (2021).
  5. Bee, J. S. Trace levels of the CHO host cell protease cathepsin D caused particle formation in a monoclonal antibody product. Biotechnology Progress. 31 (5), 1360-1369 (2015).
  6. Bracewell, D. G., Francis, R., Smales, C. M. The future of host cell protein (HCP) identification during process development and manufacturing linked to a risk-based management for their control. Biotechnology and Bioengineering. 112 (9), 1727-1737 (2015).
  7. Chiu, J., et al. Knockout of a difficult-to-remove CHO host cell protein, lipoprotein lipase, for improved polysorbate stability in monoclonal antibody formulations. Biotechnology and Bioengineering. 114 (5), 1006-1015 (2017).
  8. Gilgunn, S., et al. Identification and tracking of problematic host cell proteins removed by a synthetic, highly functionalized nonwoven media in downstream bioprocessing of monoclonal antibodies. Journal of Chromatography A. 1595, 28-38 (2019).
  9. Graf, T. Identification and characterization of polysorbate-degrading enzymes in a monoclonal antibody formulation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (11), 3558-3567 (2021).
  10. Hall, T., Sandefur, S. L., Frye, C. C., Tuley, T. L., Huang, L. Polysorbates 20 and 80 degradation by group XV lysosomal phospholipase A2 isomer X1 in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 105 (5), 1633-1642 (2016).
  11. Jones, M. 34;High-risk" host cell proteins (HCPs): A multi-company collaborative view. Biotechnology and Bioengineering. 118 (8), 2870-2885 (2021).
  12. Li, X., et al. Identification and characterization of a residual host cell protein hexosaminidase B associated with N-glycan degradation during the stability study of a therapeutic recombinant monoclonal antibody product. Biotechnology Progress. 37 (3), e3128 (2021).
  13. Zhang, S. Identification of the specific causes of polysorbate 20 degradation in monoclonal antibody formulations containing multiple lipases. Pharmaceutical Research. 39 (1), 75-87 (2022).
  14. Zhang, S., Xiao, H., Li, N. Degradation of polysorbate 20 by Sialate O-Acetylesterase in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (12), 3866-3873 (2021).
  15. Zhang, S., Xiao, H., Molden, R., Qiu, H., Li, N. Rapid polysorbate 80 degradation by liver carboxylesterase in a monoclonal antibody formulated drug substance at early stage development. Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (11), 3300-3307 (2020).
  16. Gunawan, F. Comparison of platform host cell protein ELISA to process-specific host cell protein ELISA. Biotechnology and Bioengineering. 115 (2), 382-389 (2018).
  17. Chen, I. H., Xiao, H., Daly, T., Li, N. Improved host cell protein analysis in monoclonal antibody products through molecular weight cutoff enrichment. Analytical Chemistry. 92 (5), 3751-3757 (2020).
  18. Chen, I. H., Xiao, H., Li, N. Improved host cell protein analysis in monoclonal antibody products through ProteoMiner. Analytical Biochemistry. 610, 113972 (2020).
  19. Doneanu, C. E., et al. Enhanced detection of low-abundance host cell protein impurities in high-purity monoclonal antibodies down to 1 ppm using ion mobility mass spectrometry coupled with multidimensional liquid chromatography. Analytical Chemistry. 87 (20), 10283-10291 (2015).
  20. Huang, L., et al. A Novel sample preparation for shotgun proteomics characterization of HCPs in antibodies. Analytical Chemistry. 89 (10), 5436-5444 (2017).
  21. Johnson, R. O., Greer, T., Cejkov, M., Zheng, X., Li, N. Combination of FAIMS, Protein A depletion, and native digest conditions enables deep proteomic profiling of host cell proteins in monoclonal antibodies. Analytical Chemistry. 92 (15), 10478-10484 (2020).
  22. Kreimer, S. Host cell protein profiling by targeted and untargeted analysis of data independent acquisition mass spectrometry data with parallel reaction monitoring verification. Analytical Chemistry. 89 (10), 5294-5302 (2017).
  23. Madsen, J. A., et al. Toward the complete characterization of host cell proteins in biotherapeutics via affinity depletions, LC-MS/MS, and multivariate analysis. MAbs. 7 (6), 1128-1137 (2015).
  24. Nie, S. Simple and sensitive method for deep profiling of host cell proteins in therapeutic antibodies by combining ultra-low trypsin concentration digestion, long chromatographic gradients, and boxcar mass spectrometry acquisition. Analytical Chemistry. 93 (10), 4383-4390 (2021).
  25. Yang, F. Versatile LC-MS-Based workflow with robust 0.1 ppm sensitivity for identifying residual HCPs in biotherapeutic products. Analytical Chemistry. 94 (2), 723-731 (2022).
  26. Zhang, Q. Comprehensive tracking of host cell proteins during monoclonal antibody purifications using mass spectrometry. MAbs. 6 (3), 659-670 (2014).
  27. Zhang, S., et al. Putative phospholipase B-Like 2 is not responsible for polysorbate degradation in monoclonal antibody drug products. Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (9), 2710-2718 (2020).
  28. Zhang, J., He, J., Smith, K. J. Fatty acids can induce the formation of proteinaceous particles in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 111 (3), 655-662 (2022).
  29. Uniprot1. , https://www.uniprot.org/uniprotkb?query=mus%2Bmusculus (2023).
  30. Uniprot2. , https://www.uniprot.org/uniprotkb (2023).

Tags

Denne måneden i JoVE utgave 203 vertscelleprotein LC-MS ProteoMiner-teknologi begrenset fordøyelse
Vertscelleproteinanalyse ved hjelp av anrikningsperler kombinert med begrenset fordøyelse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, S., Xiao, H., Li, N. Host… More

Zhang, S., Xiao, H., Li, N. Host Cell Protein Analysis using Enrichment Beads Coupled with Limited Digestion. J. Vis. Exp. (203), e65544, doi:10.3791/65544 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter