Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Värdcellsproteinanalys med hjälp av berikningspärlor i kombination med begränsad matsmältning

Published: January 19, 2024 doi: 10.3791/65544
Automatic Translation
1, 1, 1
1Analytical Chemistry, Regeneron Pharmaceuticals Inc.

Summary

Ett protokoll presenteras för att berika värdcellsproteiner (HCP) från läkemedelsprodukter (DP) och detektera peptider med hjälp av proteomanrikningspärlor. Metoden demonstreras med hjälp av en egentillverkad monoklonal antikropp (mAb) läkemedelssubstans (DS), som är ett välkarakteriserat referensmaterial för att utvärdera och jämföra olika metoder med avseende på prestanda.

Abstract

Värdcellsproteiner (HCP) är föroreningar som kan påverka terapeutiska proteiner negativt, även i små mängder. För att utvärdera de potentiella riskerna i samband med läkemedelsprodukter har metoder utvecklats för att identifiera hälso- och sjukvårdspersonal med låg förekomst. Ett viktigt tillvägagångssätt för att utveckla en känslig HCP-detektionsmetod är att berika HCP:er och samtidigt avlägsna monoklonala antikroppar (mAbs) före analys, med hjälp av vätskekromatografi-masspektrometri (LC-MS).

Detta protokoll erbjuder detaljerade instruktioner för anrikning av värdcellsproteiner med hjälp av kommersiellt tillgängliga proteomanrikningspärlor. Dessa pärlor innehåller ett varierat bibliotek av hexapeptidligander med specifika affiniteter för olika proteiner. Protokollet innehåller också begränsad matsmältning och efterföljande peptiddetektion med hjälp av nano LC-MS/MS. Genom att använda dessa tekniker kan HCP:er med låg förekomst anrikas över 7000 gånger, vilket resulterar i en imponerande detektionsgräns så låg som 0,002 ppm. Betecknande nog möjliggör detta protokoll detektering av 850 hälso- och sjukvårdspersonal med en hög konfidensnivå med hjälp av en NIST-mAb. Dessutom är den utformad för att vara användarvänlig och innehåller en videodemonstration för att hjälpa till med implementeringen. Genom att följa dessa steg kan forskare effektivt berika och upptäcka hälso- och sjukvårdspersonal, vilket ökar känsligheten och noggrannheten i riskbedömningen av läkemedelsprodukter.

Introduction

Värdcellsproteiner (HCP) är föroreningar som frigörs från värdorganismens cellkultur och samrenas med monoklonala antikroppar (mAb)1,2,3,4. Spårnivåer av hälso- och sjukvårdspersonal kan ha en negativ inverkan på kvaliteten på läkemedlet 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15, och därför är en känslig HCP-analysmetod önskvärd för att detektera HCP:er i sub-ppm- till ppm-nivåer.

Ortogonala metoder kan användas för att detektera hälso- och sjukvårdspersonal i låg förekomst. Enzymkopplad immunadsorberande analys (ELISA) används i allmänhet för att kvantifiera den totala hälso- och sjukvårdspersonalen, och den kan också detektera och kvantifiera enskilda hälso- och sjukvårdspersonal om motsvarande antikroppar finns tillgängliga16. Produktionen av HCP-specifika antikroppar är dock tidskrävande och arbetskrävande. Däremot kan vätskekromatografi i kombination med masspektrometri (LC-MS) ge omfattande information om enskilda hälso- och sjukvårdspersonal i mAb-läkemedelsprodukter och används i stor utsträckning för HCP-identifiering 4,7,9,10,12,13,14,15,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,27.

Flera metoder har utvecklats för att detektera hälso- och sjukvårdspersonal med LC-MS/MS, inklusive begränsad nedbrytning20, filtrering17, protein A-deletion21, immunoprecipitering (IP) och ProteoMiner-anrikning (PM)18. De flesta metoder syftar till att minska mängden mAb och berika hälso- och sjukvårdspersonal före LC-MS/MS-analys, och därigenom minska det dynamiska intervallet mellan mAb-peptider och HCP-peptider. Detta protokoll presenterar en proteomisk provanrikningsmetod som kombinerar ProteoMiner-teknik och begränsad nedbrytning (PMLD)28. ProteoMiner-anrikningsprincipen innebär att man använder kommersiellt tillgängliga proteomanrikningspärlor som innehåller ett varierat bibliotek av kombinatoriska peptidligander. Dessa ligander binder specifikt till proteiner på antikroppsprodukter, vilket gör det möjligt att avlägsna överflödiga molekyler samtidigt som värdcellsproteiner (HCP) med låg förekomst koncentreras på deras respektive affinitetsligander. Å andra sidan innebär principen om begränsad matsmältning att man använder en låg koncentration av trypsin. Denna koncentration är tillräcklig för att smälta hälso- och sjukvårdspersonal med låg förekomst, men inte tillräcklig för att smälta alla antikroppsläkemedel. Detta tillvägagångssätt möjliggör återvinning och anrikning av smälta HCP-peptider från lösningen.

Jämfört med filtreringsmetoder är PMLD-tekniken inte begränsad av storleken på de detekterade hälso- och sjukvårdspersonalen17. Deletionsmetoder för protein A är specifika för att detektera HCP associerade med antikroppar21, medan immunprecipitering är begränsad till fördefinierade HCP:er från en viss cellinje (t.ex. cellinjen Chinese Hamster Ovary (CHO), där en anti-HCP-antikropp genererades4. Däremot kan PMLD användas för att detektera HCP:er från alla läkemedelsmoduler och värdcellsproteiner som samrenats med läkemedelsprodukter från olika cellinjer. Dessutom uppvisar PMLD bättre känslighet jämfört med de nämnda metoderna 17,18,20,21,24.

Detta tillvägagångssätt kan berika HCP-koncentrationen med 7000 gånger och sänka detektionsgränsen till 0,002 ppm28. Den experimentella uppställningen illustreras i figur 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Förkortningar som används i protokollet anges i tilläggstabell 1.

1. Beredning av lösningar och buffertar

OBS: De kommersiella detaljerna för alla reagenser listas i materialtabellen.

  1. Bered 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0-lösning genom att tillsätta 1 ml 1 M Tris-HCl, pH 8,0 till 9 ml avjoniserat vatten i en glasflaska och blanda väl genom att virvla. Förvaras vid 4 °C i upp till 3 månader.
  2. Bered 24 mM natriumdeoxikolat (SDC) genom att lösa 10 mg SDC i 1 ml 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0.
  3. Bered 24 mM natriumlauroylsarkosinat, SLS, genom att lösa upp 7 mg SLS i 1 ml 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0.
  4. Bered elueringsbufferten genom att blanda 24 mM SDC och 24 mM SLS i förhållandet 1:1 (v/v).
  5. Bered 50 ng/μl trypsinlösning genom att tillsätta 400 μl avjoniserat vatten till 20 μg trypsin.
  6. Bered 25 mg/ml ditiotreitol (DTT) genom att tillsätta 308 μl 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0, till 7,7 mg DTT.
  7. Bered 0,25 M jodacetamid (IAM) genom att tillsätta 1,2 ml 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0, till 56 mg IAM.
  8. Bered 10 % TFA genom att tillsätta 1 ml trifluorättiksyra (TFA) i 9 ml avjoniserat vatten. Virvla i 4 s och snurra ner. Förvaras vid 4 °C i upp till 3 månader.
  9. Förbered buffert A genom att tillsätta 1 ml 10 % TFA i 99 ml avjoniserat vatten.
  10. Förbered buffert B genom att tillsätta 1 ml 10 % TFA och 49 ml avjoniserat vatten till 50 ml acetonitril (ACN).
  11. Bered 10 mM histidinbuffert genom att tillsätta 37 mg L-histidin och 54,8 mg L-histidinmonohydrokloridmonohydrat i 50 ml vatten.

2. Beredning av lösningar med monoklonala antikroppar (mAb)

  1. För läkemedelsprodukter med koncentrationer över 50 mg/ml, späd 15 mg av den monoklonala antikroppen (mAb) (se materialtabell) med avjoniserat vatten i ett 2 ml mikrocentrifugrör, vilket resulterar i en total volym på 300 μL och ett slutligt pH på ~6. Justera vid behov pH-värdet med ättiksyra eller Tris-HCl.
  2. För läkemedel med koncentrationer under 50 mg/ml, utför buffertbyte enligt steg 2.2.1 till 2.2.5.
    1. Överför 20 mg av varje prov till en 10k centrifugalfilteranordning (se materialtabell) och centrifugera vid 14 000 x g i 25 minuter (vid rumstemperatur, RT) tills cirka 100 μL volym återstår.
    2. Tillsätt 350 μL 10 mM histidin (se materialtabell), pH 6,0 buffert i filtret, virvla och centrifugera vid 14 000 x g i 25 minuter vid RT. Upprepa en gång.
    3. Vänd upp och ner på filtret och placera det i provtagningsröret, centrifugera sedan proverna vid 1000 x g i 5 minuter vid RT för att hämta hela volymen i uppsamlingsröret. Tvätta filtret med 200 μL 10 mM histidinbuffert och pipett upp och ner för att återvinna eventuella kvarvarande proteinprover. Överför hela lösningen till samma uppsamlingsrör, virvla och snurra ner.
    4. Mät provkoncentrationen med NanoDrop. Justera koncentrationen av varje proteinprov till 50 mg/ml genom att tillsätta histidinbufferten före inkubation med berikningspärlor.
    5. Överför 300 μL av provet till ett 2 ml mikrocentrifugrör.

3. Beredning av proteomanrikningspärlor

  1. Ta bort topp- och bottenlocket från varje spinspelare som erhållits från den kommersiella proteinberikningssatsen (se materialförteckning). Släng inte locken, eftersom de kommer att användas senare.
  2. Ta centrifugkolonnen och placera den i ett 2 ml mikrocentrifugrör utan lock. Centrifugera installationen vid rumstemperatur och 1 000 x g i 30-60 s vid RT för att eliminera lagringslösningen. Kassera det material som samlats in under detta steg.
  3. Tillsätt 200 μL tvättbuffert till de kommersiellt tillgängliga berikningspärlorna (se materialtabell) och pipettera upp och ner flera gånger. Placera centrifugkolonnen i ett 2 ml mikrocentrifugrör och centrifugera vid 1 000 x g i 30-60 s vid RT för att ta bort bufferten. Kassera insamlat material.
    OBS: Tvättbufferten ingår i det kommersiella proteinberikningssatsen.
  4. Upprepa steg 3.3 två gånger.
  5. Sätt tillbaka bottenlocket och tillsätt 200 μL vatten, sätt sedan tillbaka topplocket.

4. Berikning av protein

  1. Pipettera upp och ner i flytgödseln (från steg 3.5) och överför 40 μl flytgödsel till det prov som beretts i steg 2. Inkubera och rotera röret i rumstemperatur i 2 timmar.
  2. Gör en spets med fritta (se Materialtabell) med hjälp av 16 G-nålen för att få lämplig frittastorlek och sätt sedan in den i spetsänden av 200 μL-spetsen.
  3. Överför provet med pärlor till spetsen som beretts i steg 4.2. Centrifugera spetsen med 2 ml mikrocentrifugrör vid 200 x g i 3 minuter vid RT för att avlägsna lösningen.
  4. Tvätta pärlorna genom att tillsätta 200 μL tvättbuffert till spetsen och centrifugera spetsen med ett 2 ml mikrocentrifugrör vid 200 x g i 2 minuter vid RT för att avlägsna tvättlösningen. Upprepa steget två gånger.
  5. Tvätta pärlorna genom att tillsätta 200 μL vatten till spetsen och centrifugera spetsen med ett 2 ml mikrocentrifugrör vid 200 x g i 2 minuter vid RT för att ta bort vattnet.
  6. Eluera proteiner från pärlor genom att tillsätta 10 μL elueringsbuffert (steg 1.4) i spetsen och pipettera slurryn tio gånger i spetsen för att säkerställa att kulorna är indränkta med elueringsbuffert.
  7. Centrifugera spetsen med ett nytt 0,5 ml mikrocentrifugrör vid 200 x g i 30 s vid RT för att samla upp elueringsmedlet. Upprepa steg 4.6-4.7 två gånger och kombinera all eluering i ett 0.5 ml mikrocentrifugrör.
  8. Tillsätt 1,5 μl trypsinlösning (steg 1,5) till elueringsmedlet för uppslutning över natten vid 28 °C. Tillsätt 1,5 μl 25 mg/ml DTT (steg 1.6) och värm provet vid 90 °C i 20 minuter.
  9. Tillsätt 1,5 μL 0,25 M IAM (steg 1,7) och inkubera i rumstemperatur i mörker i 20 min. Tillsätt 3,5 μL 10 % TFA (steg 1,8), virvla i 2 min och se till att pH ligger på ~2-3.
  10. Centrifugera vid 14 400 × g i 10 minuter vid RT för att fälla ut SDC och SLS. Samla upp supernatanten för avsaltning.
  11. Utför avsaltning genom att följa stegen nedan.
    1. Tillsätt 50 μL buffert B (steg 1.10) till GC-avsaltningsspetsen (se materialförteckning). Centrifugera spetsen med en hållare på 1000 x g i 3 minuter vid RT. Kassera det uppsamlade materialet.
    2. Tillsätt 50 μL buffert A (steg 1.9) till spetsen. Centrifugera spetsen med en hållare på 1000 x g i 3 minuter vid RT. Kassera det uppsamlade materialet.
    3. Tillsätt det surgjorda provet i spetsen. Centrifugera spetsen med en hållare på 500 x g i 6 minuter vid RT. Kassera det uppsamlade materialet.
    4. Tvätta spetsen genom att tillsätta 50 μL buffert A till spetsen. Centrifugera spetsen med hållaren vid 500 x g i 3 minuter vid RT. Kassera det uppsamlade materialet. Upprepa en gång.
    5. Eluera peptiden från spetsen genom att tillsätta 50 μL buffert B till GC-avsaltningsspetsen. Centrifugera spetsen med ett nytt rör vid 500 x g i 3 minuter vid RT. Samla upp materialet. Upprepa steget en gång och kombinera elueringsmedlet.
    6. Torka elueringsmedlet med en vakuumkoncentrator (se materialförteckning).
  12. Återsuspendera det torkade elueringsmedlet i 30 μl 0,1 % myrsyralösning (FA).
  13. Mät UV-strålningen hos peptidblandningar vid 214 nm med en spektrofotometer (se materialförteckning). Koncentrationen av peptidblandningar bör ligga mellan 0,1 och 0,5 mg/ml.
  14. Överför 10 μl av varje upplöst prov till en LC-provflaska och injicera sedan 1 μg av varje upplöst prov på nano LC-MS/MS (se materialförteckning). Utför analysen enligt steg 5. Förvara resten av de smälta proverna i en frys på -80 °C.

5. Nano LC-MS/MS-analys

  1. Injicera peptidblandningen i ett nano-LC-system kopplat till en masspektrometer. Fyll peptidblandningarna (~1 μg) på en C18-fällkolonn med den gradient som anges i tabell 1A för avsaltning och sedan på en C18-analyskolonn vid 40 °C för separering.
    OBS: Den mobila fas A-bufferten bestod av 0,1 % FA i ultrarent vatten, och den mobila fasen B bestod av 0,1 % FA i 80 % ACN.
  2. Separera peptiderna och eluera med gradienten i tabell 1B med en flödeshastighet på 250 nL/min.
    OBS: Masspektrometern kördes i databeroende läge (DDA) med en cykeltid på 3 s. Joner genomgick fragmentering genom kollisionsdissociation med högre energi (HCD) med en normaliserad kollisionsenergi på 30 % för varje fullständig MS-skanning. Skanningarna utfördes med en upplösning på 60 000, med ett mål för automatisk förstärkningskontroll (AGC) på 3e6, en maximal injektionstid på 20 ms och ett m/z-intervall på 380-1600. MS/MS-händelser genomfördes med en upplösning på 15 000, med ett AGC-mål på 1e5, en maximal injektionstid på 60 ms och ett m/z-intervall på 200-2000. Uteslutningstiden var satt till 45 s. Jonkällans egenskaper anges i tabell 1C, och de specifika masspektrometriparametrarna finns i tabell 2A-F.

6. Analys av data

  1. Utför en sökning i NISTmAbs masspektrometri råfiler mot UniProt mus+musculus-databasen29. Sök dessutom efter de rekombinanta proteinspikade mAb DS-masspektrometriråfilerna mot UniProt Cricetulus Griseus-databasen30.
    OBS: Dessa sökningar utfördes i programvaran Proteome Discoverer (se materialförteckning) med hjälp av sökmotorerna Sequest HT och Mascot. De databaser som användes var fria från överflödiga poster.
  2. För masspektrometrisökningarna, använd en masstolerans på 10 ppm och ställ in fragmentmasstoleransen till 0,02 Da.
    OBS: Sökkriterierna omfattade statisk karbamidometylering av cysteinrester (+57,0214 Da) och variabel modifiering av oxidation (+15,9949 Da) på metioninrester. Dessutom tillämpades en variabel modifiering av deaminering (+0,984 Da).
  3. Utför databassökningen med hjälp av trypsinuppslutning, vilket möjliggör maximalt två missade klyvningar. Sätt de falska upptäcktsfrekvenserna för både proteiner och peptider till 0,01.
    OBS: För att positivt identifiera värdcellsproteiner (HCP) tillämpades ett minimikrav på minst två unika peptider. Tabell 3 ger en representativ sammanfattning av identifierade hälso- och sjukvårdspersonal associerade med NIST mAb analyserade av programvaran Proteome Discoverer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Detta protokoll presenterade ett arbetsflöde för provberedning, kallat proteinberikning i kombination med begränsad nedbrytning (PMLD), för analys av värdcellsproteiner (HCP) i ett monoklonalt antikroppsprov (mAb). Figur 1 illustrerar den stegvisa proceduren för PMLD. Forskarna jämförde resultaten av HCP-analys med hjälp av direktuppslutning (visas i den övre panelen i figur 2) och PMLD (visas i den nedre panelen i figur 2). Profilerna för total jonkromatogram (TIC) indikerade att PMLD signifikant reducerade eller eliminerade viktiga mAb-peptider samtidigt som det var möjligt att observera vissa HCP-peptider som är jämförbara med mAb-peptider. Detaljerade parametrar för nano LC (tabell 1) och MS/MS (tabell 2) analyser tillhandahålls. Dessutom visar tabell 3 en sammanfattning av identifierade hälso- och sjukvårdspersonal som är associerade med NIST-mAb, inklusive information som anslutningsnummer, HCP-namn, art, täckningsprocent, PSM, unika peptider, molekylvikt, förväntad isoelektrisk punkt (pI), Mascot-poäng, Sequest HT-poäng och antalet peptider som identifierats av Mascot och Sequest HT.

Figure 1
Figur 1: Arbetsflöde för provberedning av proteinberikning i kombination med begränsad nedbrytning (PMLD). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Profil för totalt jonkromatogram (TIC) för HCP-analys av NIST mAb. Övre panel: TIC-profil för HCP-analys av NIST mAb med hjälp av direktuppslutning. Bottenpanel: TIC-profil för HCP-analys av NIST mAb med PMLD. Det framgår tydligt av TIC-profilen att jämfört med direkt nedbrytning har de flesta av de viktigaste mAb-peptiderna reducerats eller eliminerats efter PMLD, medan vissa peptider som tillhör HCP kan observeras och är jämförbara med mAb-peptider. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Tabell 1: Parametrar för nano LC. (A) Lastning av pumpens lutning. (B) NC-pumpens lutning. (C) Egenskaper hos jonkällor. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 2: Parametrar för MS/MS. (A) Fullständiga skanningsegenskaper. (B) MIPS-egenskaper. (C) Egenskaper för intensitet. (D) Avgiftsstatens egenskaper. (E) Dynamisk uteslutning. (F) Databeroende MS2-skanningsegenskaper. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 3: Representativ sammanfattande tabell över identifierade hälso- och sjukvårdspersonal associerade med NIST mAb analyserad av programvaran Proteome Discoverer. Tabellen innehåller information som anslutningsnummer, HCP-namn, art, täckningsprocent, antal peptidspektrummatchningar (PSM), antal unika peptider, molekylvikt, förväntad isoelektrisk punkt (pI), maskotpoäng, Sequest HT-poäng och antalet peptider som identifierats av Mascot och Sequest HT. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tilläggstabell 1: Förteckning över förkortningar som används. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det finns två versioner av kommersiellt tillgängliga proteinberikande pärlor: en med mindre kapacitet och den andra med större kapacitet (se materialtabell). Båda versionerna av berikningspärlorna innehåller tio förberedelser i förpackningen. Tillverkarens instruktioner föreslår att varje förberedelse från det lilla kapacitetspaketet kan användas för att berika 10 mg totalt protein. Men för optimal prestanda för anrikning av värdcellsprotein (HCP) från DS är varje förberedelse bra för fem DS-prover. Därför kan varje kit användas för att berika hälso- och sjukvårdspersonal från femtio prover. För varje förberedelse från satsen med stor kapacitet är den bra för anrikning av hälso- och sjukvårdspersonal från tjugofem DS-prover, vilket gör det möjligt att detektera hälso- och sjukvårdspersonal från totalt tvåhundrafemtio prover.

Steg 3.1 avråder från att kassera topp- eller bottenlocken, eftersom de kommer att återanvändas under hela protokollet. Om pärlor sätter sig i topplocket, byt ut dem efter att ha tagit bort bottenpluggen och centrifugerat samtidigt som du behåller topplocket på kolonnen. För att använda bottenlocket som en plugg, vänd på det och placera det säkert längst ner på spinnkolonnen.

Ett kritiskt steg i proceduren är steg 4.1, där pärlslammet lägger sig i botten av röret. Därför är det viktigt att upprätthålla kontinuerlig pipettering upp och ner samtidigt som uppslamningen överförs till de monoklonala antikroppsproverna (mAb). Ett annat kritiskt steg är steg 4.6, där det är viktigt att pipettera flytgödseln tio gånger i spetsen medan kulorna är mättade med elueringsbuffert. Centrifugeringstiden i steg 4.3-4.5, 4.7 och 4.10 kan variera beroende på mängden ackumulerade värdcellsproteiner (HCP). Därför är det viktigt att kontrollera och se till att vätskorna i spetsen har snurrats ner ordentligt innan du går vidare till nästa steg. Återigen, när man börjar med en initial mängd på 15 mg antikroppsprodukt kan cirka 30 μg antikroppar och anrikade värdcellsproteiner (HCP) elueras. För att uppnå ett protein-enzym-förhållande på 400:1 för begränsad matsmältning tillsattes 75 ng trypsin. När en mindre mängd insatsmaterial används är det nödvändigt att mäta koncentrationen av det eluerade proteinprovet. Denna mätning hjälper till att justera mängden trypsin som måste tillsättas i enlighet med detta. Steg 4.9 visar en vit fällning efter tillsats av 10 % TFA. För att förhindra interferens från ytaktiva ämnen med MS-signalen är det viktigt att kontrollera pH-värdet efter tillsats av trifluorättiksyra (TFA) för att säkerställa att rengöringsmedlet avlägsnas helt från supernatanten.

Efter torkning och återblandning av elueringsmedlet i vatten är det nödvändigt att utföra en UV-mätning av peptidblandningen. Denna mätning är avgörande eftersom mängden peptider som laddas på kolonnen kan påverka detektionen med hjälp av MS. Efter utvärdering visade det sig att cirka 1 μg av peptidblandningen uppvisade den bästa prestandan vid MS. Följaktligen måste denna optimala mängd injiceras i nano LC-MS/MS för vidare analys.

PMLD-metoden erbjuder flera fördelar vid provberedning, inklusive tillräcklig minskning av monoklonala antikroppar (mAb) DS samtidigt som majoriteten av värdcellsproteiner (HCP) med låg förekomst bevaras. Till skillnad från immunoprecipitering (IP) är denna teknik inte beroende av anti-HCP-antikroppar, vilket eliminerar den bias som är förknippad med fördefinierade antikroppar och minskar det arbete och den tid som krävs för att producera anti-HCP-antikroppar. Dessutom, till skillnad från filtreringsmetoder baserade på molekylviktsgräns17, berikar PMLD HCP oavsett storlek. Det kan användas för att berika hälso- och sjukvårdspersonal från olika läkemedelsmoduler, såsom antikroppar, fusionsproteiner, ScFv med mera, vilket gör det till ett mångsidigt tillvägagångssätt jämfört med protein-A-deletionsmetoder21.

Utöver dessa fördelar uppvisar PMLD en lägre detektionsgräns och möjliggör detektion av ett större antal HCP:er från NISTmAb, en allmänt karakteriserad referensstandard, jämfört med andra metoder. Det är dock värt att notera att PMLD kräver hemmagjord utrustning, vilket begränsar dess tillämpning för automatisering. För att utöka dess användbarhet är det möjligt att ersätta viss utrustning, såsom spetsen med fritta, med kommersiellt tillgängliga alternativ. Dessutom kan avsaltning på 96-brunnars plattor möjliggöra högre genomströmning med den här metoden. Att utforska automatisering eller halvautomatisering i framtida experiment kan vara ett logiskt nästa steg för att utöka den bredare tillämpningen av PMLD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Ingen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16 G, Metal Hub Needle, 2 in, point style 3 Hamilton 91016
Acclaim PepMap 100 C18 trap column (20 cm × 0.075 mm) Thermo Fisher 164535
Acetonitrile Fisher-Scientific A955
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade  Fisher-Scientific LS120-4
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit Millipore Sigma UFC5010
C18 analytical column (0.075 mm × 1.7 μm × 30 cm, 100 Å) CoAnn Technologies HEB07503001718I
Centrifuge 5424 Eppendorf 5405000646
Dithiothreitol (DTT)  Thermo Fisher A39255
Frit for SPE cartridges, 9.5 mm, 3 mL, 100/pk Agilent 12131020
GL-Tip GC GL Sciences Inc   7820-11201
in-house mAb Regeneron concentration 200 mg/mL
Iodoacetamide (30 x 9.3 mg) Thermo Fisher A39271
Isopropanol Fisher-Scientific 149320025
L-Histidine Sigma Aldrich H6034
L-Histidine monohydrochloride monohydrate Sigma Aldrich 53370
Methanol Fisher-Scientific A456-4 
Milli-Q Millpore 30035
NanoDrop 2000 Thermo Scientific ND-2000
Orbitrap Exploris 480 Thermo Fisher BRE725539
Protein LoBind Tube 0.5 mL Eppendorf (VWR) 22431064
Protein LoBind Tube 2.0 mL Eppendorf (VWR) 22431102
Proteome Discoverer software 2.4 Thermo Scientific
ProteoMiner Protein Enrichment Large-Capacity Kit Bio-Rad 1633007
ProteoMiner Protein Enrichment Small-Capacity Kit Bio-Rad 1633006
Sodium deoxycholate (SDC) Sigma Aldrich D6750
Sodium lauroyl sarcosinate (SLS)  Sigma Aldrich L5777
SpeedVac Labconco 7970010
Thermomixer R Eppendorf 22670107
Trifluoracetic acid (TFA) Fisher-Scientific 28904
Trypsin (Sequencing Grade Modified)  (5 x 20 ug) Promega V5111
Tube Revolver Rotator Thermo Fisher 88881001
UltiMate 3000 RSLC nano system Thermo Fisher ULTIM3000RSLCNANO
UltraPure 1 M Tris-HCl pH 8.0 Thermo Fisher 15568-025
Vortex Genie 2 VWR 102091-234
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade  Fisher-Scientific LS118-4 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aboulaich, N. A novel approach to monitor clearance of host cell proteins associated with monoclonal antibodies. Biotechnology Progress. 30 (5), 1114-1124 (2014).
  2. Goey, C. H., Alhuthali, S., Kontoravdi, C. Host cell protein removal from biopharmaceutical preparations: Towards the implementation of quality by design. Biotechnology Advances. 36 (4), 1223-1237 (2018).
  3. Levy, N. E., Valente, K. N., Choe, L. H., Lee, K. H., Lenhoff, A. M. Identification and characterization of host cell protein product-associated impurities in monoclonal antibody bioprocessing. Biotechnology and Bioengineering. 111 (5), 904-912 (2014).
  4. Molden, R. Host cell protein profiling of commercial therapeutic protein drugs as a benchmark for monoclonal antibody-based therapeutic protein development. MAbs. 13 (1), 1955811 (2021).
  5. Bee, J. S. Trace levels of the CHO host cell protease cathepsin D caused particle formation in a monoclonal antibody product. Biotechnology Progress. 31 (5), 1360-1369 (2015).
  6. Bracewell, D. G., Francis, R., Smales, C. M. The future of host cell protein (HCP) identification during process development and manufacturing linked to a risk-based management for their control. Biotechnology and Bioengineering. 112 (9), 1727-1737 (2015).
  7. Chiu, J., et al. Knockout of a difficult-to-remove CHO host cell protein, lipoprotein lipase, for improved polysorbate stability in monoclonal antibody formulations. Biotechnology and Bioengineering. 114 (5), 1006-1015 (2017).
  8. Gilgunn, S., et al. Identification and tracking of problematic host cell proteins removed by a synthetic, highly functionalized nonwoven media in downstream bioprocessing of monoclonal antibodies. Journal of Chromatography A. 1595, 28-38 (2019).
  9. Graf, T. Identification and characterization of polysorbate-degrading enzymes in a monoclonal antibody formulation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (11), 3558-3567 (2021).
  10. Hall, T., Sandefur, S. L., Frye, C. C., Tuley, T. L., Huang, L. Polysorbates 20 and 80 degradation by group XV lysosomal phospholipase A2 isomer X1 in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 105 (5), 1633-1642 (2016).
  11. Jones, M. 34;High-risk" host cell proteins (HCPs): A multi-company collaborative view. Biotechnology and Bioengineering. 118 (8), 2870-2885 (2021).
  12. Li, X., et al. Identification and characterization of a residual host cell protein hexosaminidase B associated with N-glycan degradation during the stability study of a therapeutic recombinant monoclonal antibody product. Biotechnology Progress. 37 (3), e3128 (2021).
  13. Zhang, S. Identification of the specific causes of polysorbate 20 degradation in monoclonal antibody formulations containing multiple lipases. Pharmaceutical Research. 39 (1), 75-87 (2022).
  14. Zhang, S., Xiao, H., Li, N. Degradation of polysorbate 20 by Sialate O-Acetylesterase in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (12), 3866-3873 (2021).
  15. Zhang, S., Xiao, H., Molden, R., Qiu, H., Li, N. Rapid polysorbate 80 degradation by liver carboxylesterase in a monoclonal antibody formulated drug substance at early stage development. Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (11), 3300-3307 (2020).
  16. Gunawan, F. Comparison of platform host cell protein ELISA to process-specific host cell protein ELISA. Biotechnology and Bioengineering. 115 (2), 382-389 (2018).
  17. Chen, I. H., Xiao, H., Daly, T., Li, N. Improved host cell protein analysis in monoclonal antibody products through molecular weight cutoff enrichment. Analytical Chemistry. 92 (5), 3751-3757 (2020).
  18. Chen, I. H., Xiao, H., Li, N. Improved host cell protein analysis in monoclonal antibody products through ProteoMiner. Analytical Biochemistry. 610, 113972 (2020).
  19. Doneanu, C. E., et al. Enhanced detection of low-abundance host cell protein impurities in high-purity monoclonal antibodies down to 1 ppm using ion mobility mass spectrometry coupled with multidimensional liquid chromatography. Analytical Chemistry. 87 (20), 10283-10291 (2015).
  20. Huang, L., et al. A Novel sample preparation for shotgun proteomics characterization of HCPs in antibodies. Analytical Chemistry. 89 (10), 5436-5444 (2017).
  21. Johnson, R. O., Greer, T., Cejkov, M., Zheng, X., Li, N. Combination of FAIMS, Protein A depletion, and native digest conditions enables deep proteomic profiling of host cell proteins in monoclonal antibodies. Analytical Chemistry. 92 (15), 10478-10484 (2020).
  22. Kreimer, S. Host cell protein profiling by targeted and untargeted analysis of data independent acquisition mass spectrometry data with parallel reaction monitoring verification. Analytical Chemistry. 89 (10), 5294-5302 (2017).
  23. Madsen, J. A., et al. Toward the complete characterization of host cell proteins in biotherapeutics via affinity depletions, LC-MS/MS, and multivariate analysis. MAbs. 7 (6), 1128-1137 (2015).
  24. Nie, S. Simple and sensitive method for deep profiling of host cell proteins in therapeutic antibodies by combining ultra-low trypsin concentration digestion, long chromatographic gradients, and boxcar mass spectrometry acquisition. Analytical Chemistry. 93 (10), 4383-4390 (2021).
  25. Yang, F. Versatile LC-MS-Based workflow with robust 0.1 ppm sensitivity for identifying residual HCPs in biotherapeutic products. Analytical Chemistry. 94 (2), 723-731 (2022).
  26. Zhang, Q. Comprehensive tracking of host cell proteins during monoclonal antibody purifications using mass spectrometry. MAbs. 6 (3), 659-670 (2014).
  27. Zhang, S., et al. Putative phospholipase B-Like 2 is not responsible for polysorbate degradation in monoclonal antibody drug products. Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (9), 2710-2718 (2020).
  28. Zhang, J., He, J., Smith, K. J. Fatty acids can induce the formation of proteinaceous particles in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 111 (3), 655-662 (2022).
  29. Uniprot1. , https://www.uniprot.org/uniprotkb?query=mus%2Bmusculus (2023).
  30. Uniprot2. , https://www.uniprot.org/uniprotkb (2023).

Tags

Denna månad i JoVE Värdcellsprotein LC-MS ProteoMiner-teknik begränsad matsmältning
Värdcellsproteinanalys med hjälp av berikningspärlor i kombination med begränsad matsmältning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, S., Xiao, H., Li, N. Host… More

Zhang, S., Xiao, H., Li, N. Host Cell Protein Analysis using Enrichment Beads Coupled with Limited Digestion. J. Vis. Exp. (203), e65544, doi:10.3791/65544 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter