Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Анализ белка клетки-хозяина с использованием гранул обогащения в сочетании с ограниченным пищеварением

Published: January 19, 2024 doi: 10.3791/65544
Automatic Translation
1, 1, 1
1Analytical Chemistry, Regeneron Pharmaceuticals Inc.

Summary

Представлен протокол обогащения белков клетки-хозяина (ГКП) из лекарственных препаратов (ЛП) и детекции пептидов с помощью гранул обогащения протеома. Метод демонстрируется с использованием лекарственной субстанции (DS) моноклонального антитела (мАТ) собственного производства, которая является хорошо охарактеризованным эталонным материалом для оценки и сравнения различных методов с точки зрения эффективности.

Abstract

Белки клетки-хозяина (HCP) представляют собой примеси, которые могут отрицательно влиять на терапевтические белки даже в небольших количествах. Для оценки потенциальных рисков, связанных с лекарственными препаратами, были разработаны методы выявления медицинских работников с низкой численностью. Важнейший подход к разработке чувствительного метода обнаружения ГКП включает обогащение СГП с одновременным удалением моноклональных антител (мАТ) перед анализом с использованием жидкостной хромато-масс-спектрометрии (ЖХ-МС).

Этот протокол предлагает подробные инструкции по обогащению белков клетки-хозяина с помощью коммерчески доступных гранул обогащения протеома. Эти бусины содержат разнообразную библиотеку гексапептидных лигандов со специфическим сродством к различным белкам. Протокол также включает ограниченное пищеварение и последующее обнаружение пептидов с помощью нано-ЖХ-МС/МС. Используя эти методы, медицинские работники с низкой концентрацией могут быть обогащены более чем в 7000 раз, что приводит к впечатляющему пределу обнаружения до 0,002 ppm. Важно отметить, что этот протокол позволяет обнаруживать 850 медицинских работников с высоким уровнем достоверности с помощью мАТ NIST. Кроме того, он разработан так, чтобы быть удобным для пользователя, и включает в себя видеодемонстрацию, чтобы помочь в его реализации. Выполняя эти шаги, исследователи могут эффективно обогащать и выявлять медицинских работников, повышая чувствительность и точность оценки риска для лекарственных препаратов.

Introduction

Белки клетки-хозяина (HCP) представляют собой примеси, которые высвобождаются из клеточной культуры организма-хозяина и совместно очищаются с моноклональными антителами (mAb)1,2,3,4. Следовые уровни ГКП могут негативно влиять на качество лекарственного препарата 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15, и поэтому для выявления СГП в уровнях от менее ppm до ppm необходим чувствительный метод анализа HCP.

Ортогональные методы могут быть применены для выявления СГП в низкой численности. Иммуноферментный анализ (ИФА) обычно используется для количественного определения общего количества ГЧП, а также может выявлять и количественно определять отдельных СГП при наличии соответствующих антител16. Однако выработка HCP-специфических антител является трудоемкой и трудоемкой. В отличие от этого, жидкостная хроматография в сочетании с масс-спектрометрией (ЖХ-МС) может предоставить исчерпывающую информацию об отдельных ГКП в лекарственных препаратах мАТ и широко применяется для идентификации ГКП 4,7,9,10,12,13,14,15,17,18,19,20. 21,22,23,24,25,26,27.

Для выявления ГКП с ЖХ-МС/МС было разработано несколько методов, включая ограниченное пищеварение20, фильтрацию17, делецию белка А21, иммунопреципитацию (IP) и обогащение ProteoMiner (PM)18. Большинство методов направлены на уменьшение количества мАТ и обогащение ГКП перед анализом ЖХ-МС/МС, тем самым уменьшая динамический диапазон между пептидами мАТ и пептидами ГКП. Этот протокол представляет собой метод обогащения протеомных образцов, который сочетает в себе технологию ProteoMiner и ограниченное разложение (PMLD)28. Принцип обогащения ProteoMiner включает в себя использование коммерчески доступных гранул обогащения протеома, содержащих разнообразную библиотеку комбинаторных пептидных лигандов. Эти лиганды специфически связываются с белками на антителах-лекарственных продуктах, позволяя удалять избыточные молекулы, концентрируя белки клеток-хозяев с низкой численностью (HCP) на соответствующих аффинных лигандах. С другой стороны, принцип ограниченного пищеварения предполагает использование низкой концентрации трипсина. Эта концентрация достаточна для переваривания медицинских работников с низким содержанием, но недостаточна для переваривания всех лекарственных препаратов на основе антител. Такой подход позволяет извлекать и обогащать из раствора переваренные пептиды HCP.

По сравнению с методами фильтрации, методика PMLD не ограничена размером обнаруживаемых СГП17. Методы делеции белка А специфичны для выявления ГКП, ассоциированных с антителами21, в то время как иммунопреципитация ограничена заранее определенными ГКП из определенной клеточной линии (например, клеточной линии яичника китайского хомяка (СНО), где было выработано антитело к ГКП4. В отличие от этого, PMLD может быть применен для обнаружения HCP из любых лекарственных модулей и белков клетки-хозяина, совместно очищенных с лекарственными препаратами из различных клеточных линий. Кроме того, PMLD проявляет лучшую чувствительность по сравнению с упомянутыми методами 17,18,20,21,24.

Такой подход позволяет обогатить концентрацию ГКП в 7000 раз и снизить предел обнаружения до 0,002 ppm28. Экспериментальная установка показана на рисунке 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Аббревиатуры, используемые в протоколе, приведены в дополнительной таблице 1.

1. Приготовление растворов и буферов

ПРИМЕЧАНИЕ: Коммерческие данные всех реагентов указаны в таблице материалов.

  1. Приготовьте 0,1 М раствора Tris-HCl, pH 8,0, добавив 1 мл 1 M Tris-HCl, pH 8,0 в 9 мл деионизированной воды в стеклянном флаконе, и хорошо перемешайте путем вихряния. Хранить при температуре 4 °C до 3 месяцев.
  2. Приготовьте 24 мМ дезоксихолата натрия (SDC), растворив 10 мг SDC в 1 мл 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0.
  3. Приготовьте 24 мМ лауроилсаркозината натрия (SLS), растворив 7 мг SLS в 1 мл 0,1 М Tris-HCl, pH 8,0.
  4. Приготовьте элюирующий буфер, смешав 24 мМ SDC и 24 мМ SLS в соотношении 1:1 (v/v).
  5. Приготовьте 50 нг/мкл раствора трипсина, добавив 400 мкл деионизированной воды в 20 мкг трипсина.
  6. Приготовьте 25 мг/мл дитиотрейтола (ДТТ), добавив 308 мкл 0,1 М трис-HCl, рН 8,0, в 7,7 мг ДТТ.
  7. Приготовьте 0,25 М йодоацетамида (IAM), добавив 1,2 мл 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0, в 56 мг IAM.
  8. Приготовьте 10% ТЖК, добавив 1 мл трифторуксусной кислоты (ТЖК) в 9 мл деионизированной воды. Вихрь в течение 4 с и вращение вниз. Хранить при температуре 4 °C до 3 месяцев.
  9. Приготовьте буфер А, добавив 1 мл 10% ТЖК в 99 мл деионизированной воды.
  10. Приготовьте буфер B, добавив 1 мл 10% ТЖК и 49 мл деионизированной воды в 50 мл ацетонитрила (ACN).
  11. Приготовьте 10 мМ гистидинового буфера, добавив 37 мг L-гистидина и 54,8 мг L-гистидина моногидрохлорида моногидрата в 50 мл воды.

2. Приготовление растворов моноклональных антител (мАТ)

  1. Для лекарственных препаратов с концентрациями выше 50 мг/мл разбавляют 15 мг моноклонального антитела (мАТ) (см. таблицу материалов) деионизированной водой в пробирке микроцентрифуги объемом 2 мл, в результате чего общий объем составляет 300 мкл, а конечный рН составляет ~6. При необходимости отрегулируйте рН с помощью уксусной кислоты или Tris-HCl.
  2. Для лекарственных препаратов с концентрациями ниже 50 мг/мл проводят буферную замену, следуя шагам 2.2.1 - 2.2.5.
    1. Переложите 20 мг каждого образца в центробежный фильтр 10k (см. таблицу материалов) и центрифугу при 14 000 x g в течение 25 минут (при комнатной температуре, RT) до тех пор, пока не останется объем примерно 100 мкл.
    2. Добавьте 350 мкл 10 мМ гистидина (см. Таблицу материалов), буфера pH 6,0 в фильтр, вихрь и центрифугу при 14 000 x g в течение 25 мин при RT. Повторите один раз.
    3. Переверните фильтр и поместите его в пробирку для сбора проб, затем центрифугируйте образцы при 1000 x g в течение 5 минут при RT, чтобы извлечь весь объем в пробирке для сбора. Промойте фильтр гистидиновым буфером объемом 200 мкл 10 мМ и пипетируйте вверх и вниз, чтобы собрать оставшиеся образцы белка. Перелейте весь раствор в ту же сборную трубку, закрутите и открутите вниз.
    4. Измерьте концентрацию образца с помощью NanoDrop. Отрегулируйте концентрацию каждого образца белка до 50 мг/мл, добавив гистидиновый буфер перед инкубацией с гранулами для обогащения.
    5. Перелейте 300 мкл образца в пробирку для микроцентрифуги объемом 2 мл.

3. Приготовление гранул обогащения протеома

  1. Снимите верхнюю и нижнюю крышки с каждой колонки для отжима, полученной из коммерческого набора для обогащения белка (см. Таблицу материалов). Не выбрасывайте колпачки, так как они будут использоваться позже.
  2. Возьмите спин-колонку и поместите ее в пробирку для микроцентрифуги объемом 2 мл без крышки. Центрифугируйте установку при комнатной температуре и 1 000 x g в течение 30-60 с при RT, чтобы исключить решение для хранения. Утилизируйте материал, собранный на этом этапе.
  3. Добавьте 200 мкл промывочного буфера к имеющимся в продаже гранулам обогащения (см. таблицу материалов) и несколько раз пропитывайте вверх и вниз. Поместите спиновую колонку в пробирку для микроцентрифуги объемом 2 мл и центрифугируйте при 1,000 x g в течение 30-60 с при RT, чтобы удалить буфер. Выбросьте собранный материал.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Промывочный буфер входит в коммерческий набор для обогащения белка.
  4. Повторите шаги 3.3 дважды.
  5. Установите нижний колпачок на место и добавьте 200 мкл воды, затем установите верхний колпачок.

4. Обогащение белком

  1. Пипетируйте суспензию вверх и вниз (начиная с шага 3,5) и перенесите 40 мкл суспензии в образец, подготовленный на шаге 2. Инкубируйте и вращайте пробирку при комнатной температуре в течение 2 ч.
  2. Сделайте наконечник с фритвой (см. Таблицу материалов) с помощью иглы 16 G, чтобы получить подходящий размер фритты, затем вставьте его в конец наконечника наконечника объемом 200 мкл.
  3. Перенесите образец с бисером на наконечник, подготовленный на шаге 4.2. Центрифугируйте наконечник с помощью микроцентрифужной пробирки объемом 2 мл при 200 x g в течение 3 мин при RT для удаления раствора.
  4. Промойте шарики, добавив 200 мкл промывочного буфера к наконечнику, и центрифугируйте наконечник с помощью микроцентрифужной пробирки объемом 2 мл при 200 x g в течение 2 минут при RT для удаления моющего раствора. Повторите шаг дважды.
  5. Промойте шарики, добавив 200 мкл воды в наконечник, и центрифугируйте наконечник с помощью пробирки микроцентрифуги объемом 2 мл при 200 x g в течение 2 минут при RT, чтобы удалить воду.
  6. Элюируйте белки из шариков, добавив 10 мкл элюирующего буфера (шаг 1.4) в наконечник, и пипетируйте суспензию десять раз в наконечнике, чтобы убедиться, что гранулы пропитаны элюирующим буфером.
  7. Центрифугируйте наконечник с помощью новой микроцентрифужной пробирки объемом 0,5 мл при 200 x g в течение 30 с при RT для сбора элюента. Повторите шаги 4,6-4,7 дважды и смешайте все элюирование в одну пробирку для микроцентрифуги объемом 0,5 мл.
  8. Добавьте 1,5 мкл раствора трипсина (шаг 1,5) в элюент для ночного разложения при 28 °C. Добавьте 1,5 мкл 25 мг/мл DTT (шаг 1,6) и нагрейте образец при 90 °C в течение 20 мин.
  9. Добавьте 1,5 мкл 0,25 М IAM (шаг 1,7) и инкубируйте при комнатной температуре в темноте в течение 20 мин. Добавьте 3,5 мкл 10% TFA (шаг 1,8), перемешайте в течение 2 мин и убедитесь, что pH составляет ~2-3.
  10. Центрифугу при 14 400 × г в течение 10 мин при RT для осаждения SDC и SLS. Соберите надосадочную жидкость для обессоливания.
  11. Выполните обессоливание, выполнив следующие действия.
    1. Добавьте 50 мкл буфера B (шаг 1.10) в наконечник для обессоливания GC (см. таблицу материалов). Центрифугируйте наконечник с держателем при 1000 x g в течение 3 мин при RT. Выбросьте собранный материал.
    2. Добавьте 50 мкл буфера А (шаг 1,9) к наконечнику. Центрифугируйте наконечник с держателем при 1000 x g в течение 3 мин при RT. Выбросьте собранный материал.
    3. Добавьте подкисленный образец к кончику. Центрифугируйте наконечник с держателем при 500 x g в течение 6 мин при RT. Выбросьте собранный материал.
    4. Вымойте наконечник, добавив в него 50 мкл буфера А. Центрифугируйте наконечник с держателем при 500 x g в течение 3 мин при RT. Выбросьте собранный материал. Повторите один раз.
    5. Элюируйте пептид из наконечника, добавив 50 мкл буфера B в наконечник для обессоливания GC. Центрифугируйте наконечник с новой пробиркой при 500 x g в течение 3 мин при RT. Соберите материал. Повторите этот шаг один раз и смешайте элюент.
    6. Высушите элюент с помощью вакуумного концентратора (см. Таблицу материалов).
  12. Высушенный элюент повторно суспендировать в 30 мкл 0,1% раствора муравьиной кислоты (ЖК).
  13. Измеряют УФ пептидных смесей на длине волны 214 нм спектрофотометром (см. таблицу материалов). Концентрация пептидных смесей должна колебаться от 0,1 до 0,5 мг/мл.
  14. Перелейте 10 мкл каждого переваренного образца во флакон с образцом LC, затем введите 1 мкг каждого расщепленного образца в nano LC-MS/MS (см. таблицу материалов). Выполните анализ, выполнив шаг 5. Остальные переваренные образцы храните в морозильной камере при температуре -80 °C.

5. Нано-ЖХ-МС/МС анализ

  1. Введите пептидную смесь в нано-LC-систему, соединенную с масс-спектрометром. Загрузите пептидные смеси (~1 мкг) в колонку-ловушку C18 с градиентом, указанным в таблице 1A для обессоливания, а затем в аналитическую колонку C18 при 40 °C для разделения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер подвижной фазы А состоял из 0,1% ЖК в сверхчистой воде, а подвижная фаза В состояла из 0,1% ЖК в 80% АКН.
  2. Разделяют пептиды и элюируют с градиентом, приведенным в таблице 1B , со скоростью потока 250 нл/мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Масс-спектрометр эксплуатировался в информационно-зависимом режиме (ДДА) с временем цикла 3 с. Ионы подвергались фрагментации с помощью высокоэнергетической сударной диссоциации (HCD) с нормированной энергией столкновения 30% для каждого полного МС-сканирования. Сканирование проводилось с разрешением 60 000, с автоматической регулировкой усиления (АРУ) 3e6, максимальным временем впрыска 20 мс и диапазоном m/z 380-1600. События MS/MS проводились с разрешением 15 000, с целью AGC 1e5, максимальным временем впрыска 60 мс и диапазоном m/z 200-2000. Длительность исключения была установлена равной 45 с. Свойства источника ионов приведены в таблице 1C, а конкретные параметры масс-спектрометрии можно найти в таблице 2A-F.

6. Анализ данных

  1. Выполните поиск необработанных файлов масс-спектрометрии NISTmAb по базе данных UniProt mus+musculus29. Кроме того, выполните поиск необработанных файлов масс-спектрометрии рекомбинантного белка mAb DS в базе данных UniProt Cricetulus Griseus30.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти поиски проводились в программном обеспечении Proteome Discoverer (см. Таблицу материалов) с использованием поисковых систем Sequest HT и Mascot. Используемые базы данных не содержали избыточных записей.
  2. Для масс-спектрометрического поиска примените допуск массы 10 ppm и установите допуск массы фрагмента равным 0,02 Da.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Критерии поиска включали статическое карбамидометилирование остатков цистеина (+57,0214 Да) и вариабельную модификацию окисления (+15,9949 Да) на остатках метионина. Дополнительно применялась переменная модификация дезаминирования (+0,984 Да).
  3. Выполнить поиск в базе данных с помощью расщепления трипсина, допуская максимум два пропущенных расщепления. Установите частоту ложных открытий как для белков, так и для пептидов на уровне 0,01.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для положительной идентификации белков клетки-хозяина (HCP) применялось минимальное требование не менее двух уникальных пептидов. В таблице 3 приведена репрезентативная сводка идентифицированных HCP, ассоциированных с NIST mAb, проанализированных с помощью программного обеспечения Proteome Discoverer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В этом протоколе представлен рабочий процесс подготовки образцов, называемый обогащением белка в сочетании с ограниченным пищеварением (PMLD), для анализа белков клетки-хозяина (HCP) в образце моноклонального антитела (mAb). На рисунке 1 показана пошаговая процедура PMLD. Исследователи сравнили результаты анализа HCP с использованием прямого сбраживания (показано на верхней панели рисунка 2) и PMLD (показано на нижней панели рисунка 2). Профили общей ионной хроматограммы (TIC) показали, что PMLD значительно снижает или устраняет основные пептиды мАТ, в то же время позволяя наблюдать некоторые пептиды HCP, сопоставимые с пептидами мАТ. Приведены подробные параметры для анализа nano LC (табл. 1) и MS/MS (табл. 2). Кроме того, в таблице 3 приведена сводная информация об идентифицированных медицинских работниках, ассоциированных с NIST mAb, включая такую информацию, как номер образца, название HCP, вид, процент покрытия, PSM, уникальные пептиды, молекулярная масса, ожидаемая изоэлектрическая точка (pI), оценка Mascot, оценка Sequest HT и количество пептидов, идентифицированных Mascot и Sequest HT.

Figure 1
Рисунок 1: Рабочий процесс пробоподготовки обогащения белка в сочетании с ограниченным пищеварением (PMLD). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Профиль общей ионной хроматограммы (TIC) для HCP-анализа NIST mAb. Верхняя панель: Профиль TIC для HCP-анализа мАТ NIST с использованием прямого расщепления. Нижняя панель: Профиль TIC для HCP-анализа NIST mAb с использованием PMLD. Из профиля TIC видно, что по сравнению с прямым пищеварением, большинство основных пептидов мАТ были восстановлены или удалены после PMLD, в то время как некоторые пептиды, принадлежащие HCP, можно наблюдать и сопоставимы с пептидами mAb. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Параметры для nano LC. (A) Градиент нагрузочного насоса. (B) Градиент насоса NC. (C) Свойства источника ионов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 2: Параметры для MS/MS. (A) Свойства полного сканирования. (B) Свойства MIPS. (C) Свойства интенсивности. (D) Свойства состояния заряда. (E) Динамическое исключение. (F) Свойства сканирования MS2, зависящие от данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 3: Репрезентативная сводная таблица идентифицированных медицинских работников, ассоциированных с NIST mAb, проанализированная с помощью программного обеспечения Proteome Discoverer. Таблица включает в себя такую информацию, как номер образца, название HCP, вид, процент покрытия, количество совпадений пептидного спектра (PSM), количество уникальных пептидов, молекулярная масса, ожидаемая изоэлектрическая точка (pI), оценка Mascot, оценка Sequest HT и количество пептидов, идентифицированных Mascot и Sequest HT. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Дополнительная таблица 1: Список используемых сокращений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Существует две версии коммерчески доступных гранул для обогащения белком: одна с меньшей емкостью, а другая с большей емкостью (см. Таблицу материалов). Обе версии бусин для обогащения содержат в упаковке по десять препов. Инструкция производителя предполагает, что каждый препарат из набора небольшой емкости можно использовать для обогащения 10 мг общего белка. Тем не менее, для оптимальной эффективности обогащения белка клетки-хозяина (HCP) из DS каждый препарат подходит для пяти образцов DS. Таким образом, каждый набор может быть использован для обогащения медицинских работников из пятидесяти образцов. Для каждого препарата из набора большой емкости он хорош для обогащения медицинских работников из двадцати пяти образцов DS, что позволяет обнаруживать медицинских работников из двухсот пятидесяти образцов.

В шаге 3.1 не рекомендуется выбрасывать верхние или нижние крышки, так как они будут повторно использоваться на протяжении всего протокола. Если шарики оседают в верхней крышке, замените их после снятия нижней пробки и центрифугирования, сохраняя верхнюю крышку на колонке. Чтобы использовать нижнюю крышку в качестве заглушки, переверните ее и надежно расположите в нижней части колонки отжима.

Критическим этапом процедуры является этап 4.1, на котором суспензия гранул оседает на дне трубки. Поэтому крайне важно поддерживать непрерывное пипетирование вверх и вниз при переносе суспензии в образцы моноклональных антител (мАТ). Еще одним важным этапом является этап 4.6, на котором необходимо десять раз пипетировать суспензию в пределах наконечника, пока шарики пропитываются элюирующим буфером. Продолжительность центрифугирования на стадиях 4.3-4.5, 4.7 и 4.10 может варьироваться в зависимости от количества накопленных белков клетки-хозяина (ГКП). Поэтому очень важно проверить и убедиться, что жидкости в наконечнике были правильно раскручены, прежде чем переходить к следующему шагу. Опять же, начиная с начального количества в 15 мг антитело-лекарственный препарат, можно элюировать примерно 30 мкг антител и обогащенных белков клетки-хозяина (HCP). Для достижения соотношения белка к ферменту 400:1 при ограниченном переваривании добавляли 75 нг трипсина. При использовании меньшего количества входного материала необходимо измерять концентрацию элюированного образца белка. Это измерение помогает скорректировать количество трипсина, которое должно быть добавлено соответствующим образом. На шаге 4.9 показан белый осадок после добавления 10% TFA. Чтобы предотвратить любые помехи от поверхностно-активных веществ с сигналом MS, крайне важно проверить pH после добавления трифторуксусной кислоты (ТЖК), чтобы обеспечить полное удаление моющего средства из надосадочной жидкости.

После сушки и повторного суспендирования элюента в воде необходимо провести УФ-измерение пептидной смеси. Это измерение имеет решающее значение, потому что количество пептидов, загруженных в колонку, может повлиять на обнаружение с помощью МС. После оценки было обнаружено, что примерно 1 мкг пептидной смеси показал наилучшие показатели при РС. Следовательно, это оптимальное количество должно быть введено в nano LC-MS/MS для дальнейшего анализа.

Подход PMLD предлагает ряд преимуществ при подготовке образцов, включая достаточное снижение DS моноклональных антител (мАТ) при сохранении большинства белков клетки-хозяина (ГКП) с низкой численностью. В отличие от иммунопреципитации (ИП), этот метод не полагается на антитела к СГЧ, что устраняет систематическую ошибку, связанную с заранее определенными антителами, и сокращает трудозатраты и время, необходимые для выработки антител к ГКП. Кроме того, в отличие от методов фильтрации, основанных на молекулярно-массовом отсечке17, PMLD обогащает ГКП независимо от их размера. Его можно применять для обогащения медицинских работников из различных лекарственных модулей, таких как антитела, слияния белков, ScFv и т. д., что делает его универсальным подходом по сравнению с методами делеции белка А21.

В дополнение к этим преимуществам, PMLD демонстрирует более низкий предел обнаружения и позволяет обнаруживать большее количество HCP из NISTmAb, широко известного эталонного стандарта, по сравнению с другими методами. Однако стоит отметить, что ПМЛД требует самодельного оборудования, что ограничивает его применение для автоматизации. Чтобы расширить его удобство использования, возможна замена определенного оборудования, например, наконечника с фриттой, на коммерчески доступные альтернативы. Кроме того, выполнение обессоливания на 96-луночных планшетах может обеспечить более высокую пропускную способность при использовании этого подхода. Изучение автоматизации или полуавтоматизации в будущих экспериментах может стать логическим следующим шагом для расширения более широкого применения PMLD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Никакой.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16 G, Metal Hub Needle, 2 in, point style 3 Hamilton 91016
Acclaim PepMap 100 C18 trap column (20 cm × 0.075 mm) Thermo Fisher 164535
Acetonitrile Fisher-Scientific A955
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade  Fisher-Scientific LS120-4
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit Millipore Sigma UFC5010
C18 analytical column (0.075 mm × 1.7 μm × 30 cm, 100 Å) CoAnn Technologies HEB07503001718I
Centrifuge 5424 Eppendorf 5405000646
Dithiothreitol (DTT)  Thermo Fisher A39255
Frit for SPE cartridges, 9.5 mm, 3 mL, 100/pk Agilent 12131020
GL-Tip GC GL Sciences Inc   7820-11201
in-house mAb Regeneron concentration 200 mg/mL
Iodoacetamide (30 x 9.3 mg) Thermo Fisher A39271
Isopropanol Fisher-Scientific 149320025
L-Histidine Sigma Aldrich H6034
L-Histidine monohydrochloride monohydrate Sigma Aldrich 53370
Methanol Fisher-Scientific A456-4 
Milli-Q Millpore 30035
NanoDrop 2000 Thermo Scientific ND-2000
Orbitrap Exploris 480 Thermo Fisher BRE725539
Protein LoBind Tube 0.5 mL Eppendorf (VWR) 22431064
Protein LoBind Tube 2.0 mL Eppendorf (VWR) 22431102
Proteome Discoverer software 2.4 Thermo Scientific
ProteoMiner Protein Enrichment Large-Capacity Kit Bio-Rad 1633007
ProteoMiner Protein Enrichment Small-Capacity Kit Bio-Rad 1633006
Sodium deoxycholate (SDC) Sigma Aldrich D6750
Sodium lauroyl sarcosinate (SLS)  Sigma Aldrich L5777
SpeedVac Labconco 7970010
Thermomixer R Eppendorf 22670107
Trifluoracetic acid (TFA) Fisher-Scientific 28904
Trypsin (Sequencing Grade Modified)  (5 x 20 ug) Promega V5111
Tube Revolver Rotator Thermo Fisher 88881001
UltiMate 3000 RSLC nano system Thermo Fisher ULTIM3000RSLCNANO
UltraPure 1 M Tris-HCl pH 8.0 Thermo Fisher 15568-025
Vortex Genie 2 VWR 102091-234
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade  Fisher-Scientific LS118-4 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aboulaich, N. A novel approach to monitor clearance of host cell proteins associated with monoclonal antibodies. Biotechnology Progress. 30 (5), 1114-1124 (2014).
  2. Goey, C. H., Alhuthali, S., Kontoravdi, C. Host cell protein removal from biopharmaceutical preparations: Towards the implementation of quality by design. Biotechnology Advances. 36 (4), 1223-1237 (2018).
  3. Levy, N. E., Valente, K. N., Choe, L. H., Lee, K. H., Lenhoff, A. M. Identification and characterization of host cell protein product-associated impurities in monoclonal antibody bioprocessing. Biotechnology and Bioengineering. 111 (5), 904-912 (2014).
  4. Molden, R. Host cell protein profiling of commercial therapeutic protein drugs as a benchmark for monoclonal antibody-based therapeutic protein development. MAbs. 13 (1), 1955811 (2021).
  5. Bee, J. S. Trace levels of the CHO host cell protease cathepsin D caused particle formation in a monoclonal antibody product. Biotechnology Progress. 31 (5), 1360-1369 (2015).
  6. Bracewell, D. G., Francis, R., Smales, C. M. The future of host cell protein (HCP) identification during process development and manufacturing linked to a risk-based management for their control. Biotechnology and Bioengineering. 112 (9), 1727-1737 (2015).
  7. Chiu, J., et al. Knockout of a difficult-to-remove CHO host cell protein, lipoprotein lipase, for improved polysorbate stability in monoclonal antibody formulations. Biotechnology and Bioengineering. 114 (5), 1006-1015 (2017).
  8. Gilgunn, S., et al. Identification and tracking of problematic host cell proteins removed by a synthetic, highly functionalized nonwoven media in downstream bioprocessing of monoclonal antibodies. Journal of Chromatography A. 1595, 28-38 (2019).
  9. Graf, T. Identification and characterization of polysorbate-degrading enzymes in a monoclonal antibody formulation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (11), 3558-3567 (2021).
  10. Hall, T., Sandefur, S. L., Frye, C. C., Tuley, T. L., Huang, L. Polysorbates 20 and 80 degradation by group XV lysosomal phospholipase A2 isomer X1 in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 105 (5), 1633-1642 (2016).
  11. Jones, M. 34;High-risk" host cell proteins (HCPs): A multi-company collaborative view. Biotechnology and Bioengineering. 118 (8), 2870-2885 (2021).
  12. Li, X., et al. Identification and characterization of a residual host cell protein hexosaminidase B associated with N-glycan degradation during the stability study of a therapeutic recombinant monoclonal antibody product. Biotechnology Progress. 37 (3), e3128 (2021).
  13. Zhang, S. Identification of the specific causes of polysorbate 20 degradation in monoclonal antibody formulations containing multiple lipases. Pharmaceutical Research. 39 (1), 75-87 (2022).
  14. Zhang, S., Xiao, H., Li, N. Degradation of polysorbate 20 by Sialate O-Acetylesterase in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (12), 3866-3873 (2021).
  15. Zhang, S., Xiao, H., Molden, R., Qiu, H., Li, N. Rapid polysorbate 80 degradation by liver carboxylesterase in a monoclonal antibody formulated drug substance at early stage development. Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (11), 3300-3307 (2020).
  16. Gunawan, F. Comparison of platform host cell protein ELISA to process-specific host cell protein ELISA. Biotechnology and Bioengineering. 115 (2), 382-389 (2018).
  17. Chen, I. H., Xiao, H., Daly, T., Li, N. Improved host cell protein analysis in monoclonal antibody products through molecular weight cutoff enrichment. Analytical Chemistry. 92 (5), 3751-3757 (2020).
  18. Chen, I. H., Xiao, H., Li, N. Improved host cell protein analysis in monoclonal antibody products through ProteoMiner. Analytical Biochemistry. 610, 113972 (2020).
  19. Doneanu, C. E., et al. Enhanced detection of low-abundance host cell protein impurities in high-purity monoclonal antibodies down to 1 ppm using ion mobility mass spectrometry coupled with multidimensional liquid chromatography. Analytical Chemistry. 87 (20), 10283-10291 (2015).
  20. Huang, L., et al. A Novel sample preparation for shotgun proteomics characterization of HCPs in antibodies. Analytical Chemistry. 89 (10), 5436-5444 (2017).
  21. Johnson, R. O., Greer, T., Cejkov, M., Zheng, X., Li, N. Combination of FAIMS, Protein A depletion, and native digest conditions enables deep proteomic profiling of host cell proteins in monoclonal antibodies. Analytical Chemistry. 92 (15), 10478-10484 (2020).
  22. Kreimer, S. Host cell protein profiling by targeted and untargeted analysis of data independent acquisition mass spectrometry data with parallel reaction monitoring verification. Analytical Chemistry. 89 (10), 5294-5302 (2017).
  23. Madsen, J. A., et al. Toward the complete characterization of host cell proteins in biotherapeutics via affinity depletions, LC-MS/MS, and multivariate analysis. MAbs. 7 (6), 1128-1137 (2015).
  24. Nie, S. Simple and sensitive method for deep profiling of host cell proteins in therapeutic antibodies by combining ultra-low trypsin concentration digestion, long chromatographic gradients, and boxcar mass spectrometry acquisition. Analytical Chemistry. 93 (10), 4383-4390 (2021).
  25. Yang, F. Versatile LC-MS-Based workflow with robust 0.1 ppm sensitivity for identifying residual HCPs in biotherapeutic products. Analytical Chemistry. 94 (2), 723-731 (2022).
  26. Zhang, Q. Comprehensive tracking of host cell proteins during monoclonal antibody purifications using mass spectrometry. MAbs. 6 (3), 659-670 (2014).
  27. Zhang, S., et al. Putative phospholipase B-Like 2 is not responsible for polysorbate degradation in monoclonal antibody drug products. Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (9), 2710-2718 (2020).
  28. Zhang, J., He, J., Smith, K. J. Fatty acids can induce the formation of proteinaceous particles in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 111 (3), 655-662 (2022).
  29. Uniprot1. , https://www.uniprot.org/uniprotkb?query=mus%2Bmusculus (2023).
  30. Uniprot2. , https://www.uniprot.org/uniprotkb (2023).

Tags

В этом месяце в JoVE выпуск 203 Белок клетки-хозяина LC-MS технология ProteoMiner ограниченное пищеварение
Анализ белка клетки-хозяина с использованием гранул обогащения в сочетании с ограниченным пищеварением
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, S., Xiao, H., Li, N. Host… More

Zhang, S., Xiao, H., Li, N. Host Cell Protein Analysis using Enrichment Beads Coupled with Limited Digestion. J. Vis. Exp. (203), e65544, doi:10.3791/65544 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter