Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

ניתוח חלבון התא המארח באמצעות חרוזי העשרה בשילוב עם עיכול מוגבל

Published: January 19, 2024 doi: 10.3791/65544
Automatic Translation
1, 1, 1
1Analytical Chemistry, Regeneron Pharmaceuticals Inc.

Summary

מוצג פרוטוקול להעשרת חלבוני התא המאכסן (HCPs) ממוצרי תרופות (DP) ואיתור פפטידים באמצעות חרוזי העשרת פרוטאום. השיטה מודגמת באמצעות חומר תרופתי נוגדן חד-שבטי (mAb) (DS), שהוא חומר ייחוס מאופיין היטב להערכה והשוואה של שיטות שונות מבחינת ביצועים.

Abstract

חלבוני התא המארח (HCPs) הם זיהומים שיכולים להשפיע לרעה על חלבונים טיפוליים, אפילו בכמויות קטנות. כדי להעריך את הסיכונים הפוטנציאליים הקשורים למוצרי תרופות, פותחו שיטות לזיהוי HCP בשפע נמוך. גישה חיונית לפיתוח שיטת זיהוי HCP רגישה כוללת העשרת HCPs ובו זמנית הסרת נוגדנים חד שבטיים (mAbs) לפני הניתוח, תוך שימוש בספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה נוזלית (LC-MS).

פרוטוקול זה מציע הוראות מפורטות להעשרת חלבוני התא המאכסן באמצעות חרוזי העשרת פרוטאום הזמינים מסחרית. חרוזים אלה מכילים ספרייה מגוונת של ליגנדות הקסה-פפטידים עם זיקות ספציפיות לחלבונים שונים. הפרוטוקול משלב גם עיכול מוגבל וזיהוי פפטידים לאחר מכן באמצעות ננו LC-MS/MS. על ידי שימוש בטכניקות אלה, HCPs עם שפע נמוך ניתן להעשיר מעל 7000 פעמים, וכתוצאה מכך מגבלת זיהוי מרשימה נמוכה כמו 0.002 ppm. באופן משמעותי, פרוטוקול זה מאפשר זיהוי של 850 HCPs עם רמה גבוהה של ביטחון באמצעות NIST mAb. יתר על כן, הוא נועד להיות ידידותי למשתמש וכולל הדגמת וידאו כדי לסייע ביישומו. על ידי ביצוע צעדים אלה, חוקרים יכולים להעשיר ולזהות ביעילות HCPs, לשפר את הרגישות והדיוק של הערכת סיכונים עבור מוצרי תרופות.

Introduction

חלבוני התא המארח (HCPs) הם זיהומים המשתחררים מתרבית התאים של האורגניזם המארח ומטוהרים במשותף עם נוגדן חד-שבטי (mAb)1,2,3,4. רמות עקבות של HCPs יכולות להשפיע לרעה על איכות מוצר התרופה 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15, ולכן, שיטת ניתוח HCP רגישה רצויה כדי לזהות HCPs ברמות sub-ppm ל- ppm.

שיטות אורתוגונליות ניתן ליישם כדי לזהות HCPs בשפע נמוך. בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזימים (ELISA) משמשת בדרך כלל לכימות HCPs כולל, והיא יכולה גם לזהות ולכמת HCPs בודדים אם הנוגדנים המתאימים זמינים16. עם זאת, הייצור של נוגדנים ספציפיים HCP הוא זמן רב ועבודה אינטנסיבית. לעומת זאת, כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטריית מסה (LC-MS) יכולה לספק מידע מקיף על HCPs בודדים במוצרי תרופות mAb והיא מיושמת באופן נרחב לזיהוי HCP 4,7,9,10,12,13,14,15,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,27.

מספר שיטות פותחו כדי לזהות HCPs עם LC-MS/MS, כולל עיכול מוגבל20, סינון17, חלבון A מחיקה21, משקעים חיסוניים (IP), והעשרת ProteoMiner (PM)18. רוב השיטות שואפות להפחית את כמות mAb ולהעשיר HCPs לפני ניתוח LC-MS/MS, ובכך להקטין את הטווח הדינמי בין פפטידים mAb ופפטידים HCP. פרוטוקול זה מציג שיטת העשרת דגימות פרוטאומית המשלבת טכנולוגיית ProteoMiner ועיכול מוגבל (PMLD)28. עקרון ההעשרה של ProteoMiner כולל שימוש בחרוזי העשרת פרוטאום הזמינים מסחרית המכילים ספרייה מגוונת של ליגנדות פפטידים קומבינטוריות. ליגנדות אלה נקשרות באופן ספציפי לחלבונים על תוצרי נוגדנים-תרופות, ומאפשרות הסרה של מולקולות עודפות תוך ריכוז חלבוני תאים מארחים בעלי שפע נמוך (HCPs) בליגנדות הזיקה שלהם. מצד שני, העיקרון של עיכול מוגבל כרוך בשימוש בריכוז נמוך של טריפסין. ריכוז זה מספיק כדי לעכל HCPs בשפע נמוך, אבל לא מספיק כדי לעכל את כל מוצרי התרופות נוגדנים. גישה זו מאפשרת שחזור והעשרה של פפטידי HCP מעוכלים מהתמיסה.

בהשוואה לשיטות סינון, טכניקת PMLD אינה מוגבלת על ידי גודל HCPs17 שזוהו. שיטות המחיקה של חלבון A הן ספציפיות לאיתור HCPs הקשורים לנוגדנים21, בעוד שמשקעים חיסוניים מוגבלים ל- HCPs מוגדרים מראש מקו תאים מסוים (כגון קו תאי השחלה של האוגר הסיני (CHO), שם נוצר נוגדן נגד HCP4. לעומת זאת, PMLD יכול להיות מיושם כדי לזהות HCPs מכל מודולי התרופה וחלבוני התא המארח מטוהרים יחד עם מוצרי תרופות מקווי תאים שונים. בנוסף, PMLD מציג רגישות טובה יותר בהשוואה לשיטות שהוזכרו 17,18,20,21,24.

גישה זו יכולה להעשיר את ריכוז HCP פי 7000 ולהוריד את מגבלת הזיהוי ל 0.002 ppm28. מערך הניסוי מומחש באיור 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הקיצורים המשמשים בפרוטוקול מפורטים בטבלה משלימה 1.

1. הכנת פתרונות ומאגרים

הערה: הפרטים המסחריים של כל הריאגנטים מפורטים בטבלת החומרים.

  1. הכינו תמיסת 0.1 M Tris-HCl, pH 8.0 על ידי הוספת 1 מ"ל של 1 M Tris-HCl, pH 8.0 לתוך 9 מ"ל של מים נטולי יונים, בבקבוקון זכוכית, וערבבו היטב על ידי מערבולת. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C למשך עד 3 חודשים.
  2. הכן 24 mM נתרן deoxycholate (SDC) על ידי המסת 10 מ"ג של SDC ב 1 מ"ל של 0.1 M Tris-HCl, pH 8.0.
  3. הכן 24 mM נתרן lauroyl sarcosinate (SLS) על ידי המסת 7 מ"ג של SLS ב 1 מ"ל של 0.1 M Tris-HCl, pH 8.0.
  4. הכן את מאגר elution על-ידי ערבוב SDC של 24 mM ו- SLS של 24 mM ביחס של 1:1 (v/v).
  5. הכינו 50 נ"ג/מיקרוליטר של תמיסת טריפסין על ידי הוספת 400 מיקרוליטר מים שעברו דה-יוניזציה ל-20 מיקרוגרם טריפסין.
  6. הכן 25 מ"ג / מ"ל dithiothreitol (DTT) על ידי הוספת 308 μL של 0.1 M Tris-HCl, pH 8.0, לתוך 7.7 מ"ג של DTT.
  7. הכינו 0.25 M יודואצטמיד (IAM) על ידי הוספת 1.2 מ"ל של 0.1 M Tris-HCl, pH 8.0, לתוך 56 מ"ג של IAM.
  8. הכינו 10% TFA על ידי הוספת 1 מ"ל של חומצה טריפלואורואצטית (TFA) ל-9 מ"ל מים שעברו דה-יוניזציה. מערבולת במשך 4 שניות ומסתובבת למטה. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C למשך עד 3 חודשים.
  9. הכינו את Buffer A על ידי הוספת 1 מ"ל של 10% TFA ל-99 מ"ל של מים נטולי יונים.
  10. הכינו את Buffer B על ידי הוספת 1 מ"ל של 10% TFA, ו-49 מ"ל של מים נטולי יונים, לתוך 50 מ"ל של אצטוניטריל (ACN).
  11. הכינו חיץ היסטידין של 10 מ"מ על ידי הוספת 37 מ"ג של L-היסטידין ו-54.8 מ"ג של מונוהידרט L-היסטידין מונוהידרוכלוריד לתוך 50 מ"ל מים.

2. הכנת פתרונות נוגדנים חד שבטיים (mAb)

  1. עבור מוצרי תרופות עם ריכוזים מעל 50 מ"ג / מ"ל, לדלל 15 מ"ג של נוגדן חד שבטי (mAb) (ראה טבלה של חומרים) עם מים deionized בצינור מיקרוצנטריפוגה 2 מ"ל, וכתוצאה מכך נפח כולל של 300 μL ו pH סופי של ~ 6. במידת הצורך, התאם את ה- pH באמצעות חומצה אצטית או Tris-HCl.
  2. עבור מוצרי תרופות עם ריכוזים נמוכים מ-50 מ"ג/מ"ל, בצע החלפת חיץ לפי שלבים 2.2.1 עד 2.2.5.
    1. העבירו 20 מ"ג מכל דגימה להתקן מסנן צנטריפוגלי של 10,000 (ראו טבלת חומרים) ולצנטריפוגה במהירות של 14,000 x גרם למשך 25 דקות (בטמפרטורת החדר, RT) עד שיישאר נפח של כ-100 מיקרוליטר.
    2. הוסף 350 μL של 10 mM היסטידין (ראה טבלת חומרים), pH 6.0 חוצץ לתוך המסנן, מערבולת, וצנטריפוגה ב 14,000 x גרם במשך 25 דקות ב RT. חזור על הפעולה פעם אחת.
    3. הפוך את המסנן והנח אותו בצינור איסוף הדגימות, ולאחר מכן בצע צנטריפוגה של הדגימות במהירות של 1000 x גרם למשך 5 דקות ב- RT כדי לאחזר את כל הנפח בצינור האיסוף. שטפו את המסנן עם 200 μLof 10 mM חיץ היסטידין וצינור למעלה ולמטה כדי לשחזר את דגימות החלבון שנותרו. מעבירים את התמיסה כולה לאותו צינור איסוף, מערבולת, ומסתובבים כלפי מטה.
    4. מדוד את ריכוז הדגימה באמצעות NanoDrop. התאימו את הריכוז של כל דגימת חלבון ל-50 מ"ג/מ"ל על ידי הוספת חיץ היסטידין לפני הדגירה עם חרוזי העשרה.
    5. מעבירים 300 μL של הדגימה לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 2 מ"ל.

3. הכנת חרוזי העשרה פרוטאום

  1. הסר את המכסה העליון והתחתון מכל עמודת ספין המתקבלת מערכת העשרת החלבונים המסחרית (ראה טבלת חומרים). אין להשליך את הכובעים, שכן הם ישמשו מאוחר יותר.
  2. קח את עמוד הסחרור ומקם אותו בצינור מיקרוצנטריפוגה של 2 מ"ל ללא מכסה. צנטריפוגה את ההתקנה בטמפרטורת החדר ו-1,000 x גרם למשך 30-60 שניות ב-RT על מנת לחסל את פתרון האחסון. השליכו את החומר שנאסף במהלך שלב זה.
  3. הוסיפו חיץ כביסה של 200 μL לחרוזי ההעשרה הזמינים מסחרית (ראו טבלת חומרים) ופזרו מעלה ומטה מספר פעמים. מקם את עמוד הסחרור בצינור מיקרוצנטריפוגה של 2 מ"ל וצנטריפוגה ב 1,000 x גרם למשך 30-60 שניות ב- RT כדי להסיר את החיץ. השליכו את החומר שנאסף.
    הערה: מאגר השטיפה כלול בערכת העשרת החלבון המסחרית.
  4. חזור על שלבים 3.3 פעמיים.
  5. החלף את המכסה התחתון והוסף 200 מיקרוליטר מים, ולאחר מכן החלף את המכסה העליון.

4. העשרת חלבונים

  1. יש להעלות ולהוריד את הבוצה (משלב 3.5) ולהעביר 40 מיקרוליטר של תרחיף לדגימה שהוכנה בשלב 2. לדגור ולסובב את הצינור בטמפרטורת החדר במשך 2 שעות.
  2. הכינו טיפ עם פריט (ראו טבלת חומרים) באמצעות מחט 16 גרם כדי לקבל את גודל הפריט המתאים, ואז הכניסו אותו לקצה הקצה של קצה 200 מיקרוליטר.
  3. העבר את הדגימה עם חרוזים לקצה שהוכן בשלב 4.2. צנטריפוגה את הקצה עם צינור מיקרוצנטריפוגה 2 מ"ל ב 200 x גרם במשך 3 דקות ב RT כדי להסיר את התמיסה.
  4. שטפו את החרוזים על ידי הוספת חיץ כביסה של 200 μL לקצה וצנטריפוגו את הקצה עם צינור מיקרוצנטריפוגה של 2 מ"ל ב 200 x גרם למשך 2 דקות ב- RT כדי להסיר את תמיסת הכביסה. חזור על השלב פעמיים.
  5. שטפו את החרוזים על ידי הוספת 200 מיקרוליטר מים לקצה וצנטריפוגו את הקצה עם צינור מיקרוצנטריפוגה 2 מ"ל ב 200 x גרם למשך 2 דקות ב- RT כדי להסיר את המים.
  6. מוציאים חלבונים מחרוזים על ידי הוספת 10 μL של חיץ אלוציה (שלב 1.4) לקצה, ומזרימים את הבוצה עשר פעמים בקצה כדי להבטיח שהחרוזים ספוגים בחיץ אלוציה.
  7. צנטריפוגה את הקצה עם צינור מיקרוצנטריפוגה חדש 0.5 מ"ל ב 200 x גרם במשך 30 שניות ב RT כדי לאסוף את eluent. חזור על שלבים 4.6-4.7 פעמיים ושלב את כל האלוציה לצינור מיקרוצנטריפוגה אחד של 0.5 מ"ל.
  8. הוסף 1.5 μL של תמיסת טריפסין (שלב 1.5) לתוך eluent לעיכול לילה ב 28 ° C. הוסף 1.5 μL של 25 מ"ג / מ"ל DTT (שלב 1.6), וחמם את הדגימה ב 90 ° C במשך 20 דקות.
  9. הוסף 1.5 μL של 0.25 M IAM (שלב 1.7) ודגור בטמפרטורת החדר בחושך במשך 20 דקות. הוסף 3.5 μL 10% TFA (שלב 1.8), מערבול במשך 2 דקות, וודא pH הוא ~ 2-3.
  10. צנטריפוגה ב-14,400 × גרם למשך 10 דקות ב-RT כדי לזרז SDC ו-SLS. אספו את הסופרנאטנט להתפלה.
  11. בצע התפלה לפי השלבים הבאים.
    1. הוסף 50 μL של Buffer B (שלב 1.10) לקצה ההתפלה GC (ראה טבלת חומרים). צנטריפוגה את הקצה עם מחזיק ב 1000 x גרם במשך 3 דקות ב RT. יש להשליך את החומר שנאסף.
    2. הוסף 50 μL של Buffer A (שלב 1.9) לקצה. צנטריפוגה את הקצה עם מחזיק ב 1000 x גרם במשך 3 דקות ב RT. יש להשליך את החומר שנאסף.
    3. מוסיפים את הדגימה החומצית לקצה. צנטריפוגה את הקצה עם מחזיק ב 500 x גרם במשך 6 דקות ב RT. להשליך את החומר שנאסף.
    4. שטפו את הקצה על ידי הוספת 50 μL של Buffer A לקצה. צנטריפוגה את הקצה עם המחזיק ב 500 x גרם במשך 3 דקות ב RT. להשליך את החומר שנאסף. חזור על הפעולה פעם אחת.
    5. הוציאו את הפפטיד מהקצה על ידי הוספת 50 μL של Buffer B לקצה ההתפלה GC. צנטריפוגו את הקצה עם צינור חדש ב 500 x גרם במשך 3 דקות ב RT. לאסוף את החומר. חזור על השלב פעם אחת ושלב את ה- eluent.
    6. יבשו את הנוזל בעזרת רכז ואקום (ראו טבלת חומרים).
  12. יש להשהות מחדש את החומר המיובש ל-30 מיקרוליטר של תמיסת 0.1% חומצה פורמית (FA).
  13. מדוד את UV של תערובות פפטידים ב 214 ננומטר על ידי ספקטרופוטומטר (ראה טבלת חומרים). הריכוז של תערובות פפטידים צריך לנוע בין 0.1 ל 0.5 מ"ג / מ"ל.
  14. העבירו 10 מיקרוליטר מכל דגימה מעוכלת לבקבוקון דגימת LC, ולאחר מכן הזריקו 1 מיקרוגרם מכל דגימה מעוכלת לננו LC-MS/MS (ראו טבלת חומרים). בצע את הניתוח לאחר שלב 5. אחסנו את שאר הדגימות המעוכלות במקפיא בטמפרטורה של -80°C.

5. ניתוח ננו LC-MS/MS

  1. הזריקו את תערובת הפפטיד למערכת ננו-LC המצומדת לספקטרומטר מסות. טען את תערובות הפפטידים (~1 מיקרוגרם) על עמודת מלכודת C18 עם השיפוע המסופק בטבלה 1A להתפלה ולאחר מכן על עמודה אנליטית C18 ב- 40 ° C להפרדה.
    הערה: מאגר פאזה A הנייד כלל 0.1% FA במים טהורים במיוחד, ושלב B הנייד כלל 0.1% FA ב-80% ACN.
  2. הפרידו את הפפטידים ובצעו elute בעזרת השיפוע המסופק בטבלה 1B עם קצב זרימה של 250 nL/min.
    הערה: ספקטרומטר המסות הופעל במצב תלוי נתונים (DDA) עם זמן מחזור של 3 שניות. היונים עברו פיצול באמצעות דיסוציאציה התנגשות באנרגיה גבוהה יותר (HCD) עם אנרגיית התנגשות מנורמלת של 30% עבור כל סריקת טרשת נפוצה מלאה. הסריקות בוצעו ברזולוציה של 60,000, עם יעד בקרת רווח אוטומטית (AGC) של 3e6, זמן הזרקה מרבי של 20 מילישניות, וטווח m/z של 380-1600. אירועי MS/MS נערכו ברזולוציה של 15,000, עם יעד AGC של 1e5, זמן הזרקה מקסימלי של 60 מילישניות, וטווח m/z של 200-2000. משך ההרחקה נקבע ל-45 שניות. תכונות מקור היונים מופיעות בטבלה 1C, וניתן למצוא את הפרמטרים הספציפיים של ספקטרומטריית מסות בטבלה 2A-F.

6. ניתוח נתונים

  1. בצע חיפוש בקבצים הגולמיים של ספקטרומטריית המסות NISTmAb מול מסד הנתונים mus+musculus של UniProt29. בנוסף, חפש את הקבצים הגולמיים של ספקטרומטריית המסה mAb DS של חלבון רקומביננטי מול מסד הנתונים UniProt Cricetulus Griseus30.
    הערה: חיפושים אלה נערכו בתוכנת Proteome Discoverer (ראה טבלת חומרים) באמצעות מנועי החיפוש Sequest HT ו-Mascot. מאגרי המידע בהם נעשה שימוש היו נקיים מערכים מיותרים.
  2. עבור חיפושי ספקטרומטריית מסות, החל סובלנות מסה של 10 ppm, והגדר את סובלנות מסת השבר ל- 0.02 Da.
    הערה: קריטריוני החיפוש כללו קרבמידומתילציה סטטית של שאריות ציסטאין (+57.0214 Da) ושינוי משתנה של חמצון (+15.9949 Da) על שאריות מתיונין. בנוסף, הוחל שינוי משתנה של deamination (+0.984 Da).
  3. בצע את החיפוש במסד הנתונים באמצעות עיכול טריפסין, המאפשר מקסימום שני מחשופים שהוחמצו. הגדר את שיעורי גילוי השווא הן עבור חלבונים והן עבור פפטידים על 0.01.
    הערה: כדי לזהות באופן חיובי חלבוני תאים מארחים (HCPs), יושמה דרישת מינימום של לפחות שני פפטידים ייחודיים. טבלה 3 מספקת את הסיכום המייצג של HCPs מזוהים המשויכים ל- NIST mAb שנותחו על-ידי תוכנת Proteome Discoverer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פרוטוקול זה הציג תהליך הכנת דגימה, המכונה העשרת חלבונים יחד עם עיכול מוגבל (PMLD), לניתוח חלבוני התא המארח (HCPs) בדגימת נוגדנים חד-שבטיים (mAb). איור 1 מדגים את התהליך שלב אחר שלב של PMLD. החוקרים השוו את התוצאות של ניתוח HCP באמצעות עיכול ישיר (מוצג בפאנל העליון של איור 2) ו-PMLD (מוצג בפאנל התחתון של איור 2). פרופילי כרומטוגרמת היונים הכוללת (TIC) הצביעו על כך ש-PMLD הפחית או ביטל באופן משמעותי פפטידים עיקריים של mAb תוך שהוא מאפשר תצפית של כמה פפטידים של HCP הדומים לפפטידים של mAb. פרמטרים מפורטים עבור ניתוחי ננו LC (טבלה 1) ו- MS/MS (טבלה 2) מסופקים. בנוסף, טבלה 3 מציגה סיכום של HCPs מזוהים המשויכים ל- NIST mAb, כולל מידע כגון מספר הצטרפות, שם HCP, מין, אחוז כיסוי, PSMs, פפטידים ייחודיים, משקל מולקולרי, נקודה איזואלקטרית צפויה (pI), ציון קמע, ציון Sequest HT ומספר הפפטידים שזוהו על ידי קמע ו- Sequest HT.

Figure 1
איור 1: תהליך הכנת הדגימה של העשרת חלבונים בשילוב עם עיכול מוגבל (PMLD). לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: פרופיל כרומטוגרמת יונים כוללת (TIC) עבור ניתוח HCP של NIST mAb. פאנל עליון: פרופיל TIC לניתוח HCP של NIST mAb באמצעות עיכול ישיר. פאנל תחתון: פרופיל TIC לניתוח HCP של NIST mAb באמצעות PMLD. ניכר מפרופיל TIC כי בהשוואה לעיכול ישיר, רוב פפטידים mAb העיקריים הופחתו או סולקו לאחר PMLD, בעוד כמה פפטידים השייכים HCPs ניתן לראות והם דומים פפטידים mAb. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: פרמטרים עבור ננו LC. (A) שיפוע משאבת העמסה. (B) שיפוע משאבת NC. (C) מאפייני מקור יונים. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 2: פרמטרים עבור MS/MS. (A) מאפייני סריקה מלאה. (B) מאפייני MIPS. (C) תכונות עוצמה. (ד) חיוב נכסי המדינה. (ה) הדרה דינמית. (F) מאפייני סריקת MS2 תלויי נתונים. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 3: טבלת סיכום מייצגת של HCPs מזוהים המשויכים ל- NIST mAb שנותחו על-ידי תוכנת Proteome Discoverer. הטבלה כוללת מידע כגון מספר ההצטרפות, שם HCP, מין, אחוז כיסוי, מספר התאמות ספקטרום פפטידים (PSM), מספר פפטידים ייחודיים, משקל מולקולרי, נקודה איזואלקטרית צפויה (pI), ציון קמע, ציון Sequest HT ומספר הפפטידים שזוהו על ידי Mascot ו- Sequest HT. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה משלימה 1: רשימת הקיצורים שבהם נעשה שימוש. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ישנן שתי גרסאות של חרוזי העשרת חלבון הזמינים באופן מסחרי: אחת עם קיבולת קטנה יותר והשנייה עם קיבולת גדולה יותר (ראה טבלת חומרים). שתי הגרסאות של חרוזי ההעשרה מכילות עשרה פרפים באריזה. הוראות היצרן מציעות כי כל הכנה מתוך ערכת קיבולת קטנה ניתן להשתמש כדי להעשיר 10 מ"ג של חלבון כולל. עם זאת, לביצועים מיטביים של העשרת חלבון התא המארח (HCP) מ-DS, כל הכנה טובה לחמש דגימות DS. לכן, כל ערכה יכולה לשמש להעשרת HCPs מחמישים דגימות. עבור כל הכנה מתוך ערכת קיבולת גדולה, זה טוב להעשרה של HCPs מ עשרים וחמש דגימות DS, המאפשר זיהוי של HCPs מתוך סך של מאתיים וחמישים דגימות.

שלב 3.1 ממליץ לא להשליך את האותיות העליונות או התחתונות, מכיוון שנעשה בהן שימוש חוזר לאורך כל הפרוטוקול. אם החרוזים מתיישבים במכסה העליון, החליפו אותם לאחר הסרת התקע התחתון והצנטריפוגה תוך שמירה על המכסה העליון על העמודה. כדי להשתמש במכסה התחתון כתקע, הפוך אותו ומקם אותו בבטחה בתחתית עמודת הסיבוב.

שלב קריטי בהליך הוא שלב 4.1, שבו תרחיף החרוזים מתיישב בתחתית הצינור. לכן, חשוב לשמור על צנרת רציפה למעלה ולמטה תוך העברת הבוצה לדגימות נוגדנים חד שבטיים (mAb). שלב קריטי נוסף הוא שלב 4.6, שבו חיוני לקלוט את הבוצה עשר פעמים בתוך הקצה בזמן שהחרוזים רוויים בחיץ אלוציה. משך הצנטריפוגה בשלבים 4.3-4.5, 4.7 ו-4.10 עשוי להשתנות בהתאם לכמות חלבוני התא המארח המצטברים (HCPs). לכן, חשוב לבדוק ולוודא שהנוזלים בקצה סובבו כראוי לפני שממשיכים לשלב הבא. שוב, כאשר מתחילים עם כמות התחלתית של 15 מ"ג של מוצר נוגדנים-תרופה, ניתן לאלוט כ-30 מיקרוגרם של נוגדנים וחלבוני תאים מארחים מועשרים (HCPs). כדי להשיג יחס חלבון-אנזים של 400:1 לעיכול מוגבל, נוספו 75 ננוגרם של טריפסין. כאשר משתמשים בכמות נמוכה יותר של חומר קלט, יש צורך למדוד את ריכוז דגימת החלבון המדולל. מדידה זו מסייעת להתאים את כמות הטריפסין שיש להוסיף בהתאם. שלב 4.9 מציג משקע לבן לאחר הוספת TFA של 10%. כדי למנוע הפרעה של חומרים פעילי שטח עם אות הטרשת הנפוצה, חיוני לבדוק את ה- pH לאחר הוספת חומצה טריפלואורואצטית (TFA) כדי להבטיח הסרה מלאה של חומר הניקוי מהסופרנטנט.

לאחר ייבוש והשעיה של המלווה במים, יש צורך לבצע מדידת UV של תערובת הפפטידים. מדידה זו חיונית מכיוון שכמות הפפטידים המוטענת על העמוד יכולה להשפיע על הזיהוי באמצעות טרשת נפוצה. לאחר הערכה, נמצא כי כ -1 מיקרוגרם של תערובת הפפטידים, הציג את הביצועים הטובים ביותר בטרשת נפוצה. כתוצאה מכך, כמות אופטימלית זו צריכה להיות מוזרקת לתוך ננו LC-MS/MS לניתוח נוסף.

גישת PMLD מציעה מספר יתרונות בהכנת הדגימות, כולל הפחתה מספקת של נוגדנים חד-שבטיים (mAb) DS תוך שמירה על רוב חלבוני התא המאכסן (HCPs) בעלי שפע נמוך. שלא כמו משקעים חיסוניים (IP), טכניקה זו אינה מסתמכת על נוגדנים נגד HCP, ובכך מבטלת את ההטיה הקשורה לנוגדנים מוגדרים מראש ומפחיתה את העבודה והזמן הדרושים לייצור נוגדנים נגד HCP. יתר על כן, בניגוד לשיטות סינון המבוססות על חיתוך משקל מולקולרי17, PMLD מעשיר HCPs ללא קשר לגודלם. ניתן ליישם אותו כדי להעשיר HCPs ממודולים שונים של תרופות, כגון נוגדנים, חלבוני היתוך, ScFv ועוד, מה שהופך אותו לגישה מגוונת בהשוואה לשיטות מחיקה של חלבון A21.

בנוסף ליתרונות אלה, PMLD מציג מגבלת זיהוי נמוכה יותר ומאפשר זיהוי של מספר גדול יותר של HCPs מ- NISTmAb, תקן ייחוס מאופיין באופן נרחב, בהשוואה לשיטות אחרות. עם זאת, ראוי לציין כי PMLD דורש ציוד תוצרת בית, אשר מגביל את היישום שלה עבור אוטומציה. כדי להרחיב את השימושיות שלה, החלפת ציוד מסוים, כגון קצה עם frit, עם חלופות זמינות מסחרית אפשרי. בנוסף, ביצוע התפלה על לוחות 96 בארות יכול לאפשר תפוקה גבוהה יותר באמצעות גישה זו. חקירת אוטומציה או אוטומציה למחצה בניסויים עתידיים יכולה להיות הצעד ההגיוני הבא להרחבת היישום הרחב יותר של PMLD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

ללא.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16 G, Metal Hub Needle, 2 in, point style 3 Hamilton 91016
Acclaim PepMap 100 C18 trap column (20 cm × 0.075 mm) Thermo Fisher 164535
Acetonitrile Fisher-Scientific A955
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade  Fisher-Scientific LS120-4
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit Millipore Sigma UFC5010
C18 analytical column (0.075 mm × 1.7 μm × 30 cm, 100 Å) CoAnn Technologies HEB07503001718I
Centrifuge 5424 Eppendorf 5405000646
Dithiothreitol (DTT)  Thermo Fisher A39255
Frit for SPE cartridges, 9.5 mm, 3 mL, 100/pk Agilent 12131020
GL-Tip GC GL Sciences Inc   7820-11201
in-house mAb Regeneron concentration 200 mg/mL
Iodoacetamide (30 x 9.3 mg) Thermo Fisher A39271
Isopropanol Fisher-Scientific 149320025
L-Histidine Sigma Aldrich H6034
L-Histidine monohydrochloride monohydrate Sigma Aldrich 53370
Methanol Fisher-Scientific A456-4 
Milli-Q Millpore 30035
NanoDrop 2000 Thermo Scientific ND-2000
Orbitrap Exploris 480 Thermo Fisher BRE725539
Protein LoBind Tube 0.5 mL Eppendorf (VWR) 22431064
Protein LoBind Tube 2.0 mL Eppendorf (VWR) 22431102
Proteome Discoverer software 2.4 Thermo Scientific
ProteoMiner Protein Enrichment Large-Capacity Kit Bio-Rad 1633007
ProteoMiner Protein Enrichment Small-Capacity Kit Bio-Rad 1633006
Sodium deoxycholate (SDC) Sigma Aldrich D6750
Sodium lauroyl sarcosinate (SLS)  Sigma Aldrich L5777
SpeedVac Labconco 7970010
Thermomixer R Eppendorf 22670107
Trifluoracetic acid (TFA) Fisher-Scientific 28904
Trypsin (Sequencing Grade Modified)  (5 x 20 ug) Promega V5111
Tube Revolver Rotator Thermo Fisher 88881001
UltiMate 3000 RSLC nano system Thermo Fisher ULTIM3000RSLCNANO
UltraPure 1 M Tris-HCl pH 8.0 Thermo Fisher 15568-025
Vortex Genie 2 VWR 102091-234
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade  Fisher-Scientific LS118-4 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aboulaich, N. A novel approach to monitor clearance of host cell proteins associated with monoclonal antibodies. Biotechnology Progress. 30 (5), 1114-1124 (2014).
  2. Goey, C. H., Alhuthali, S., Kontoravdi, C. Host cell protein removal from biopharmaceutical preparations: Towards the implementation of quality by design. Biotechnology Advances. 36 (4), 1223-1237 (2018).
  3. Levy, N. E., Valente, K. N., Choe, L. H., Lee, K. H., Lenhoff, A. M. Identification and characterization of host cell protein product-associated impurities in monoclonal antibody bioprocessing. Biotechnology and Bioengineering. 111 (5), 904-912 (2014).
  4. Molden, R. Host cell protein profiling of commercial therapeutic protein drugs as a benchmark for monoclonal antibody-based therapeutic protein development. MAbs. 13 (1), 1955811 (2021).
  5. Bee, J. S. Trace levels of the CHO host cell protease cathepsin D caused particle formation in a monoclonal antibody product. Biotechnology Progress. 31 (5), 1360-1369 (2015).
  6. Bracewell, D. G., Francis, R., Smales, C. M. The future of host cell protein (HCP) identification during process development and manufacturing linked to a risk-based management for their control. Biotechnology and Bioengineering. 112 (9), 1727-1737 (2015).
  7. Chiu, J., et al. Knockout of a difficult-to-remove CHO host cell protein, lipoprotein lipase, for improved polysorbate stability in monoclonal antibody formulations. Biotechnology and Bioengineering. 114 (5), 1006-1015 (2017).
  8. Gilgunn, S., et al. Identification and tracking of problematic host cell proteins removed by a synthetic, highly functionalized nonwoven media in downstream bioprocessing of monoclonal antibodies. Journal of Chromatography A. 1595, 28-38 (2019).
  9. Graf, T. Identification and characterization of polysorbate-degrading enzymes in a monoclonal antibody formulation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (11), 3558-3567 (2021).
  10. Hall, T., Sandefur, S. L., Frye, C. C., Tuley, T. L., Huang, L. Polysorbates 20 and 80 degradation by group XV lysosomal phospholipase A2 isomer X1 in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 105 (5), 1633-1642 (2016).
  11. Jones, M. 34;High-risk" host cell proteins (HCPs): A multi-company collaborative view. Biotechnology and Bioengineering. 118 (8), 2870-2885 (2021).
  12. Li, X., et al. Identification and characterization of a residual host cell protein hexosaminidase B associated with N-glycan degradation during the stability study of a therapeutic recombinant monoclonal antibody product. Biotechnology Progress. 37 (3), e3128 (2021).
  13. Zhang, S. Identification of the specific causes of polysorbate 20 degradation in monoclonal antibody formulations containing multiple lipases. Pharmaceutical Research. 39 (1), 75-87 (2022).
  14. Zhang, S., Xiao, H., Li, N. Degradation of polysorbate 20 by Sialate O-Acetylesterase in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (12), 3866-3873 (2021).
  15. Zhang, S., Xiao, H., Molden, R., Qiu, H., Li, N. Rapid polysorbate 80 degradation by liver carboxylesterase in a monoclonal antibody formulated drug substance at early stage development. Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (11), 3300-3307 (2020).
  16. Gunawan, F. Comparison of platform host cell protein ELISA to process-specific host cell protein ELISA. Biotechnology and Bioengineering. 115 (2), 382-389 (2018).
  17. Chen, I. H., Xiao, H., Daly, T., Li, N. Improved host cell protein analysis in monoclonal antibody products through molecular weight cutoff enrichment. Analytical Chemistry. 92 (5), 3751-3757 (2020).
  18. Chen, I. H., Xiao, H., Li, N. Improved host cell protein analysis in monoclonal antibody products through ProteoMiner. Analytical Biochemistry. 610, 113972 (2020).
  19. Doneanu, C. E., et al. Enhanced detection of low-abundance host cell protein impurities in high-purity monoclonal antibodies down to 1 ppm using ion mobility mass spectrometry coupled with multidimensional liquid chromatography. Analytical Chemistry. 87 (20), 10283-10291 (2015).
  20. Huang, L., et al. A Novel sample preparation for shotgun proteomics characterization of HCPs in antibodies. Analytical Chemistry. 89 (10), 5436-5444 (2017).
  21. Johnson, R. O., Greer, T., Cejkov, M., Zheng, X., Li, N. Combination of FAIMS, Protein A depletion, and native digest conditions enables deep proteomic profiling of host cell proteins in monoclonal antibodies. Analytical Chemistry. 92 (15), 10478-10484 (2020).
  22. Kreimer, S. Host cell protein profiling by targeted and untargeted analysis of data independent acquisition mass spectrometry data with parallel reaction monitoring verification. Analytical Chemistry. 89 (10), 5294-5302 (2017).
  23. Madsen, J. A., et al. Toward the complete characterization of host cell proteins in biotherapeutics via affinity depletions, LC-MS/MS, and multivariate analysis. MAbs. 7 (6), 1128-1137 (2015).
  24. Nie, S. Simple and sensitive method for deep profiling of host cell proteins in therapeutic antibodies by combining ultra-low trypsin concentration digestion, long chromatographic gradients, and boxcar mass spectrometry acquisition. Analytical Chemistry. 93 (10), 4383-4390 (2021).
  25. Yang, F. Versatile LC-MS-Based workflow with robust 0.1 ppm sensitivity for identifying residual HCPs in biotherapeutic products. Analytical Chemistry. 94 (2), 723-731 (2022).
  26. Zhang, Q. Comprehensive tracking of host cell proteins during monoclonal antibody purifications using mass spectrometry. MAbs. 6 (3), 659-670 (2014).
  27. Zhang, S., et al. Putative phospholipase B-Like 2 is not responsible for polysorbate degradation in monoclonal antibody drug products. Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (9), 2710-2718 (2020).
  28. Zhang, J., He, J., Smith, K. J. Fatty acids can induce the formation of proteinaceous particles in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 111 (3), 655-662 (2022).
  29. Uniprot1. , https://www.uniprot.org/uniprotkb?query=mus%2Bmusculus (2023).
  30. Uniprot2. , https://www.uniprot.org/uniprotkb (2023).

Tags

החודש ב- JoVE גיליון 203 חלבון התא המארח LC-MS טכנולוגיית ProteoMiner עיכול מוגבל
ניתוח חלבון התא המארח באמצעות חרוזי העשרה בשילוב עם עיכול מוגבל
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, S., Xiao, H., Li, N. Host… More

Zhang, S., Xiao, H., Li, N. Host Cell Protein Analysis using Enrichment Beads Coupled with Limited Digestion. J. Vis. Exp. (203), e65544, doi:10.3791/65544 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter