Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Gastheerceleiwitanalyse met behulp van verrijkingsparels in combinatie met beperkte spijsvertering

Published: January 19, 2024 doi: 10.3791/65544
Automatic Translation
1, 1, 1
1Analytical Chemistry, Regeneron Pharmaceuticals Inc.

Summary

Er wordt een protocol gepresenteerd voor het verrijken van gastheerceleiwitten (HCP's) uit geneesmiddelen (DP) en het detecteren van peptiden met behulp van proteoomverrijkingskorrels. De methode wordt gedemonstreerd met behulp van een in-house vervaardigde monoklonale antilichaam (mAb) geneesmiddelsubstantie (DS), die een goed gekarakteriseerd referentiemateriaal is voor het evalueren en vergelijken van verschillende methoden in termen van prestaties.

Abstract

Gastheerceleiwitten (HCP's) zijn onzuiverheden die therapeutische eiwitten nadelig kunnen beïnvloeden, zelfs in kleine hoeveelheden. Om de potentiële risico's van geneesmiddelen te evalueren, zijn methoden ontwikkeld om HCP's met een lage abundantie te identificeren. Een cruciale benadering voor het ontwikkelen van een gevoelige HCP-detectiemethode is het verrijken van HCP's en tegelijkertijd het verwijderen van monoklonale antilichamen (mAbs) vóór analyse, met behulp van vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS).

Dit protocol biedt gedetailleerde instructies voor het verrijken van gastheerceleiwitten met behulp van in de handel verkrijgbare proteoomverrijkingskorrels. Deze kralen bevatten een gevarieerde bibliotheek van hexapeptideliganden met specifieke affiniteiten voor verschillende eiwitten. Het protocol omvat ook beperkte vertering en daaropvolgende peptidedetectie met behulp van nano LC-MS/MS. Door gebruik te maken van deze technieken kunnen HCP's met een lage abundantie meer dan 7000 keer worden verrijkt, wat resulteert in een indrukwekkende detectielimiet van slechts 0,002 ppm. Belangrijk is dat dit protocol de detectie van 850 HCP's met een hoge mate van betrouwbaarheid mogelijk maakt met behulp van een NIST-mAb. Bovendien is het ontworpen om gebruiksvriendelijk te zijn en bevat het een videodemonstratie om te helpen bij de implementatie ervan. Door deze stappen te volgen, kunnen onderzoekers HCP's effectief verrijken en detecteren, waardoor de gevoeligheid en nauwkeurigheid van de risicobeoordeling voor geneesmiddelen wordt verbeterd.

Introduction

Gastheerceleiwitten (HCP's) zijn onzuiverheden die vrijkomen uit de celkweek van het gastheerorganisme en samen met monoklonaal antilichaam (mAb) worden gezuiverd1,2,3,4. Sporenniveaus van HCP's kunnen een negatieve invloed hebben op de kwaliteit van het geneesmiddel 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15, en daarom is een gevoelige HCP-analysemethode gewenst om HCP's te detecteren in sub-ppm tot ppm-niveaus.

Orthogonale methoden kunnen worden toegepast om HCP's in lage hoeveelheden te detecteren. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) wordt over het algemeen gebruikt om het totale aantal HCP's te kwantificeren, en het kan ook individuele HCP's detecteren en kwantificeren als de overeenkomstige antilichamen beschikbaar zijn16. De productie van HCP-specifieke antilichamen is echter tijdrovend en arbeidsintensief. Vloeistofchromatografie in combinatie met massaspectrometrie (LC-MS) kan daarentegen uitgebreide informatie verschaffen over individuele HCP's in mAb-geneesmiddelen en wordt veel toegepast voor HCP-identificatie 4,7,9,10,12,13,14,15,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,27.

Er zijn verschillende methoden ontwikkeld om HCP's met LC-MS/MS te detecteren, waaronder beperkte spijsvertering20, filtratie17, proteïne A-deletie21, immunoprecipitatie (IP) en ProteoMiner-verrijking (PM)18. De meeste methoden zijn gericht op het verminderen van de hoeveelheid mAb en het verrijken van HCP's voorafgaand aan LC-MS/MS-analyse, waardoor het dynamische bereik tussen mAb-peptiden en HCP-peptiden wordt verkleind. Dit protocol presenteert een proteomische monsterverrijkingsmethode die ProteoMiner-technologie combineert met beperkte vertering (PMLD)28. Het ProteoMiner-verrijkingsprincipe omvat het gebruik van in de handel verkrijgbare proteoomverrijkingskorrels die een gevarieerde bibliotheek van combinatorische peptideliganden bevatten. Deze liganden binden zich specifiek aan eiwitten op antilichaam-geneesmiddelen, waardoor overtollige moleculen kunnen worden verwijderd terwijl gastheerceleiwitten met een lage abundantie (HCP's) worden geconcentreerd op hun respectievelijke affiniteitsliganden. Aan de andere kant omvat het principe van beperkte spijsvertering het gebruik van een lage concentratie trypsine. Deze concentratie is voldoende om HCP's met een lage abundantie te verteren, maar niet genoeg om alle antilichaamgeneesmiddelen te verteren. Deze aanpak maakt het mogelijk om verteerde HCP-peptiden uit de oplossing terug te winnen en te verrijken.

In vergelijking met filtratiemethoden wordt de PMLD-techniek niet beperkt door de grootte van de gedetecteerde HCP's17. Proteïne A-deletiemethoden zijn specifiek voor het detecteren van HCP's geassocieerd met antilichamen21, terwijl immunoprecipitatie beperkt is tot vooraf gedefinieerde HCP's van een bepaalde cellijn (zoals de cellijn van de Chinese hamstereierstok (CHO), waar een anti-HCP-antilichaam werd gegenereerd4. PMLD daarentegen kan worden toegepast om HCP's te detecteren van alle geneesmiddelmodules en gastheerceleiwitten die samen met geneesmiddelen uit verschillende cellijnen zijn gezuiverd. Bovendien vertoont PMLD een betere gevoeligheid in vergelijking met de genoemde methoden 17,18,20,21,24.

Deze aanpak kan de HCP-concentratie met een factor 7000 verrijken en de detectielimiet verlagen tot 0,002 ppm28. De experimentele opzet wordt geïllustreerd in figuur 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De afkortingen die in het protocol worden gebruikt, zijn vermeld in aanvullende tabel 1.

1. Bereiding van oplossingen en buffers

OPMERKING: De commerciële details van alle reagentia staan vermeld in de materiaaltabel.

  1. Bereid 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0-oplossing door 1 ml 1 M Tris-HCl, pH 8,0 toe te voegen aan 9 ml gedeïoniseerd water in een glazen injectieflacon en meng goed door vortexen. Maximaal 3 maanden bewaren bij 4 °C.
  2. Bereid 24 mM natriumdeoxycholaat (SDC) door 10 mg SDC op te lossen in 1 ml 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0.
  3. Bereid 24 mM natriumlauroylsarcosinaat (SLS) door 7 mg SLS op te lossen in 1 ml 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0.
  4. Bereid de elutiebuffer voor door 24 mM SDC en 24 mM SLS te mengen in een verhouding van 1:1 (v/v).
  5. Bereid 50 ng/μL trypsineoplossing door 400 μL gedeïoniseerd water toe te voegen aan 20 μg trypsine.
  6. Bereid 25 mg/ml dithiothreitol (DTT) door 308 μl 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0, toe te voegen aan 7,7 mg DTT.
  7. Bereid 0,25 M jodoacetamide (IAM) door 1,2 ml 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0, toe te voegen aan 56 mg IAM.
  8. Bereid 10% TFA door 1 ml trifluorazijnzuur (TFA) toe te voegen aan 9 ml gedeïoniseerd water. Draai 4 s en draai naar beneden. Maximaal 3 maanden bewaren bij 4 °C.
  9. Bereid buffer A voor door 1 ml 10% TFA toe te voegen aan 99 ml gedeïoniseerd water.
  10. Bereid buffer B voor door 1 ml 10% TFA en 49 ml gedeïoniseerd water toe te voegen aan 50 ml acetonitril (ACN).
  11. Bereid 10 mM Histidinebuffer door 37 mg L-histidine en 54,8 mg L-Histidine monohydrochloride monohydraat toe te voegen aan 50 ml water.

2. Bereiding van oplossingen voor monoklonale antilichamen (mAb)

  1. Voor geneesmiddelen met concentraties hoger dan 50 mg/ml, verdun 15 mg van het monoklonale antilichaam (mAb) (zie materiaaltabel) met gedeïoniseerd water in een microcentrifugebuisje van 2 ml, wat resulteert in een totaal volume van 300 μL en een uiteindelijke pH van ~6. Pas indien nodig de pH aan met azijnzuur of Tris-HCl.
  2. Voor geneesmiddelen met concentraties lager dan 50 mg/ml voert u bufferuitwisseling uit volgens de stappen 2.2.1 tot en met 2.2.5.
    1. Breng 20 mg van elk monster over naar een centrifugaalfilterapparaat van 10 k (zie materiaaltabel) en centrifugeer gedurende 25 minuten bij 14.000 x g (bij kamertemperatuur, RT) totdat er ongeveer 100 μL volume overblijft.
    2. Voeg 350 μL 10 mM Histidine (zie Materiaaltabel), pH 6.0 buffer toe aan het filter, de vortex en centrifugeer bij 14.000 x g gedurende 25 minuten bij RT. Herhaal dit eens.
    3. Keer het filter om en plaats het in de monsterafnamebuis, centrifugeer de monsters vervolgens gedurende 5 minuten bij 1000 x g bij RT om het volledige volume in de afnamebuis op te nemen. Was het filter met 200 μL 10 mM Histidinebuffer en pipetteer op en neer om eventuele resterende eiwitmonsters op te vangen. Breng de hele oplossing over in dezelfde opvangbuis, vortex en spin-down.
    4. Meet de monsterconcentratie met NanoDrop. Pas de concentratie van elk eiwitmonster aan tot 50 mg/ml door de histidinebuffer toe te voegen voorafgaand aan de incubatie met verrijkingskorrels.
    5. Breng 300 μL van het monster over in een microcentrifugebuis van 2 ml.

3. Bereiding van proteoomverrijkingsparels

  1. Verwijder de boven- en onderkap van elke spinkolom die is verkregen uit de in de handel verkrijgbare eiwitverrijkingskit (zie Materiaaltabel). Gooi de doppen niet weg, want ze zullen later worden gebruikt.
  2. Neem de centrifugekolom en plaats deze in een microcentrifugebuisje van 2 ml zonder dop. Centrifugeer de opstelling bij kamertemperatuur en 1.000 x g gedurende 30-60 s bij RT om de opslagoplossing te elimineren. Gooi het materiaal dat tijdens deze stap is verzameld weg.
  3. Voeg 200 μL wasbuffer toe aan de in de handel verkrijgbare verrijkingskorrels (zie Materiaaltabel) en pipetter meerdere keren op en neer. Plaats de centrifugekolom in een microcentrifugebuis van 2 ml en centrifugeer gedurende 30-60 s bij RT op 1.000 x g om de buffer te verwijderen. Gooi het ingezamelde materiaal weg.
    NOTITIE: De wasbuffer is inbegrepen in de commerciële eiwitverrijkingskit.
  4. Herhaal stap 3.3 twee keer.
  5. Plaats de onderste dop terug en voeg 200 μL water toe, plaats vervolgens de bovenste dop terug.

4. Eiwitverrijking

  1. Pipetter de drijfmest op en neer (vanaf stap 3.5) en breng 40 μL drijfmest over naar het in stap 2 bereide monster. Incubeer en draai de buis gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
  2. Maak een punt met fritte (zie Materiaaltabel) met behulp van de naald van 16 G om de juiste frittenmaat te krijgen en steek deze vervolgens in het uiteinde van de tip van 200 μL.
  3. Breng het monster met de parels over naar de in stap 4.2 voorbereide punt. Centrifugeer de punt met een microcentrifugebuisje van 2 ml bij 200 x g gedurende 3 minuten bij RT om de oplossing te verwijderen.
  4. Was de korrels door 200 μL wasbuffer aan de punt toe te voegen en centrifugeer de punt met een microcentrifugebuis van 2 ml op 200 x g gedurende 2 minuten bij RT om de wasoplossing te verwijderen. Herhaal de stap twee keer.
  5. Was de korrels door 200 μL water aan de punt toe te voegen en centrifugeer de punt met een microcentrifugebuisje van 2 ml op 200 x g gedurende 2 minuten bij RT om het water te verwijderen.
  6. Elute eiwitten uit korrels door 10 μL elutiebuffer (stap 1.4) in de punt toe te voegen en de slurry tien keer in de punt te spuiten om ervoor te zorgen dat de korrels doordrenkt zijn met elutiebuffer.
  7. Centrifugeer de punt met een nieuwe microcentrifugebuis van 0,5 ml bij 200 x g gedurende 30 s bij RT om het eluens op te vangen. Herhaal stap 4.6-4.7 twee keer en combineer alle elutie in één microcentrifugebuisje van 0,5 ml.
  8. Voeg 1,5 μl trypsineoplossing (stap 1,5) toe aan het eluent voor een nachtelijke vergisting bij 28 °C. Voeg 1,5 μl 25 mg/ml DTT toe (stap 1.6) en verwarm het monster gedurende 20 minuten bij 90 °C.
  9. Voeg 1,5 μL 0,25 M IAM toe (stap 1,7) en incubeer 20 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Voeg 3,5 μL 10% TFA toe (stap 1.8), draai gedurende 2 minuten en zorg ervoor dat de pH ~2-3 is.
  10. Centrifugeer bij 14.400 × g gedurende 10 minuten bij RT om SDC en SLS neer te slaan. Vang het supernatans op om te ontzouten.
  11. Voer het ontzouten uit volgens de onderstaande stappen.
    1. Voeg 50 μL Buffer B (stap 1.10) toe aan de GC-ontzouttip (zie Materiaaltabel). Centrifugeer de punt met een houder op 1000 x g gedurende 3 minuten bij RT. Gooi het verzamelde materiaal weg.
    2. Voeg 50 μL buffer A (stap 1.9) toe aan de punt. Centrifugeer de punt met een houder op 1000 x g gedurende 3 minuten bij RT. Gooi het verzamelde materiaal weg.
    3. Voeg het aangezuurde monster toe aan de punt. Centrifugeer de punt met een houder op 500 x g gedurende 6 minuten bij RT. Gooi het verzamelde materiaal weg.
    4. Was de punt door 50 μL buffer A aan de punt toe te voegen. Centrifugeer de punt met de houder op 500 x g gedurende 3 minuten bij RT. Gooi het verzamelde materiaal weg. Herhaal dit een keer.
    5. Eliueer het peptide uit de tip door 50 μL Buffer B toe te voegen aan de GC-ontzoutende tip. Centrifugeer de punt met een nieuw buisje op 500 x g gedurende 3 minuten bij RT. Verzamel het materiaal. Herhaal de stap één keer en combineer de eluent.
    6. Droog het eluent af met een vacuümconcentrator (zie Tabel met materialen).
  12. Resuspendeer het gedroogde eluent in 30 μl 0,1% mierenzuur (FA)-oplossing.
  13. Meet de UV van peptidemengsels bij 214 nm met een spectrofotometer (zie Tabel met materialen). De concentratie van peptidemengsels moet tussen 0,1 en 0,5 mg/ml liggen.
  14. Breng 10 μL van elk verteerd monster over in een injectieflacon met LC-monsters en injecteer vervolgens 1 μg van elk verteerd monster in nano LC-MS/MS (zie Tabel met materialen). Voer de analyse uit volgens stap 5. Bewaar de rest van de verteerde monsters in een vriezer van -80 °C.

5. Nano LC-MS/MS-analyse

  1. Injecteer het peptidemengsel in een nano-LC-systeem dat is gekoppeld aan een massaspectrometer. Laad de peptidemengsels (~1 μg) op een C18-valkolom met de gradiënt in tabel 1A voor ontzouting en vervolgens op een C18-analysekolom bij 40 °C voor scheiding.
    OPMERKING: De mobiele fase A-buffer bestond uit 0,1% FA in ultrazuiver water en de mobiele fase B bestond uit 0,1% FA in 80% ACN.
  2. Scheid de peptiden en elute met de gradiënt in tabel 1B met een debiet van 250 nL/min.
    OPMERKING: De massaspectrometer werd gebruikt in data-afhankelijke modus (DDA) met een cyclustijd van 3 s. Ionen ondergingen fragmentatie door hoogenergetische botsingsdissociatie (HCD) met een genormaliseerde botsingsenergie van 30% voor elke volledige MS-scan. De scans werden uitgevoerd met een resolutie van 60.000, met een automatic gain control (AGC)-doel van 3e6, een maximale injectietijd van 20 ms en een m/z-bereik van 380-1600. MS/MS-voorvallen werden uitgevoerd met een resolutie van 15.000, met een AGC-doel van 1e5, een maximale injectietijd van 60 ms en een m/z-bereik van 200-2000. De uitsluitingsduur werd vastgesteld op 45 s. De eigenschappen van de ionenbron zijn opgenomen in tabel 1C en de specifieke parameters voor massaspectrometrie zijn te vinden in tabel 2A-F.

6. Data-analyse

  1. Voer een zoekopdracht uit in de NISTmAb massaspectrometrie raw-bestanden met de UniProt mus+musculus-database29. Zoek daarnaast naar de recombinante eiwit-spiked-in mAb DS massaspectrometrie ruwe bestanden met de UniProt Cricetulus Griseus-database30.
    OPMERKING: Deze zoekopdrachten zijn uitgevoerd in Proteome Discoverer-software (zie Tabel met materialen) met behulp van de zoekmachines Sequest HT en Mascot. De gebruikte databanken waren vrij van overbodige vermeldingen.
  2. Pas voor de zoekopdrachten naar massaspectrometrie een massatolerantie van 10 ppm toe en stel de massatolerantie van het fragment in op 0,02 Da.
    OPMERKING: De zoekcriteria omvatten statische carbamidomethylering van cysteïneresiduen (+57,0214 Da) en variabele modificatie van oxidatie (+15,9949 Da) op methionineresiduen. Daarnaast werd een variabele modificatie van deaminatie (+0,984 Da) toegepast.
  3. Voer de databasezoekopdracht uit met behulp van trypsinevertering, waarbij u maximaal twee gemiste splitsingen toestaat. Stel de valse-ontdekkingspercentages voor zowel eiwitten als peptiden in op 0,01.
    OPMERKING: Om gastheerceleiwitten (HCP's) positief te identificeren, werd een minimumvereiste van ten minste twee unieke peptiden toegepast. Tabel 3 geeft de representatieve samenvatting van geïdentificeerde HCP's geassocieerd met NIST mAb geanalyseerd door Proteome Discoverer-software.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dit protocol presenteerde een workflow voor monstervoorbereiding, eiwitverrijking in combinatie met beperkte vertering (PMLD) genoemd, voor de analyse van gastheerceleiwitten (HCP's) in een monoklonaal antilichaam (mAb)-monster. Figuur 1 illustreert de stapsgewijze procedure van PMLD. De onderzoekers vergeleken de resultaten van HCP-analyse met behulp van directe vertering (weergegeven in het bovenste paneel van figuur 2) en PMLD (weergegeven in het onderste paneel van figuur 2). De Total Ion Chromatogram (TIC)-profielen gaven aan dat PMLD belangrijke mAb-peptiden aanzienlijk verminderde of elimineerde, terwijl de observatie van sommige HCP-peptiden vergelijkbaar met mAb-peptiden mogelijk was. Gedetailleerde parameters voor nano-LC-analyses (tabel 1) en MS/MS (tabel 2) worden verstrekt. Daarnaast geeft tabel 3 een samenvatting van geïdentificeerde HCP's die zijn geassocieerd met de NIST mAb, inclusief informatie zoals toetredingsnummer, HCP-naam, soort, dekkingspercentage, PSM's, unieke peptiden, molecuulgewicht, verwacht iso-elektrisch punt (pI), mascottescore, Sequest HT-score en het aantal peptiden geïdentificeerd door Mascot en Sequest HT.

Figure 1
Figuur 1: Workflow voor monstervoorbereiding van eiwitverrijking in combinatie met beperkte vertering (PMLD). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Totaal ionenchromatogram (TIC)-profiel voor HCP-analyse van NIST-mAb. Bovenste paneel: TIC-profiel voor HCP-analyse van NIST-mAb met behulp van directe vertering. Onderste paneel: TIC-profiel voor HCP-analyse van NIST-mAb met behulp van PMLD. Uit het TIC-profiel blijkt duidelijk dat in vergelijking met directe vertering de meeste van de belangrijkste mAb-peptiden zijn verminderd of geëlimineerd na PMLD, terwijl sommige peptiden die tot HCP's behoren, kunnen worden waargenomen en vergelijkbaar zijn met mAb-peptiden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Parameters voor nano LC. (A) Helling van de laadpomp. (B) NC-pomphelling. (C) Eigenschappen van de ionenbron. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Parameters voor MS/MS. (A) Volledige scaneigenschappen. (B) MIPS-eigenschappen. (C) Intensiteitseigenschappen. (D) Eigenschappen van de laadstatus. (E) Dynamische uitsluiting. (F) Gegevensafhankelijke MS2-scaneigenschappen. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 3: Representatieve overzichtstabel van geïdentificeerde HCP's geassocieerd met NIST mAb geanalyseerd door Proteome Discoverer-software. De tabel bevat informatie zoals het toetredingsnummer, HCP-naam, soort, dekkingspercentage, aantal peptidespectrumovereenkomsten (PSM's), aantal unieke peptiden, molecuulgewicht, verwacht iso-elektrisch punt (pI), mascottescore, Sequest HT-score en het aantal peptiden geïdentificeerd door Mascot en Sequest HT. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende tabel 1: Lijst van gebruikte afkortingen. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Er zijn twee versies van in de handel verkrijgbare eiwitverrijkingskorrels: een met een kleinere capaciteit en de andere met een grotere capaciteit (zie Materiaaltabel). Beide versies van de verrijkingskralen bevatten tien preps in de verpakking. De instructies van de fabrikant suggereren dat elke prep uit de kit met kleine capaciteit kan worden gebruikt om 10 mg totaal eiwit te verrijken. Voor optimale prestaties van de verrijking van gastheerceleiwit (HCP) van DS is elke prep echter goed voor vijf DS-monsters. Daarom kan elke kit worden gebruikt om HCP's te verrijken op basis van vijftig monsters. Voor elke prep uit de kit met grote capaciteit is het goed voor de verrijking van HCP's uit vijfentwintig DS-monsters, waardoor HCP's kunnen worden gedetecteerd uit in totaal tweehonderdvijftig monsters.

Stap 3.1 raadt af om de boven- of onderkappen weg te gooien, omdat deze in het hele protocol worden hergebruikt. Als er kralen in de bovendop nestelen, vervang ze dan na het verwijderen van de onderste plug en centrifugeren terwijl u de bovendop op de kolom houdt. Om de bodemdop als plug te gebruiken, keert u deze om en plaatst u deze stevig op de bodem van de spinkolom.

Een cruciale stap in de procedure is stap 4.1, waarbij de hielslurry zich op de bodem van de buis nestelt. Daarom is het van cruciaal belang om continu op en neer pipetteren te handhaven terwijl de drijfmest wordt overgebracht naar de monoklonale antilichaammonsters (mAb). Een andere cruciale stap is stap 4.6, waarbij het essentieel is om de slurry tien keer in de punt te pipetteren terwijl de korrels verzadigd zijn met elutiebuffer. De duur van centrifugeren in de stappen 4.3-4.5, 4.7 en 4.10 kan variëren, afhankelijk van de hoeveelheid geaccumuleerde gastheerceleiwitten (HCP's). Daarom is het van cruciaal belang om te controleren en ervoor te zorgen dat de vloeistoffen in de punt goed zijn gecentrifugeerd voordat u doorgaat naar de volgende stap. Nogmaals, bij het starten met een initiële hoeveelheid van 15 mg antilichaam-geneesmiddel, kan ongeveer 30 μg antilichaam en verrijkte gastheerceleiwitten (HCP's) worden geëlueerd. Om een eiwit-enzymverhouding van 400:1 te bereiken voor een beperkte vertering, werd 75 ng trypsine toegevoegd. Wanneer een lagere hoeveelheid inputmateriaal wordt gebruikt, is het meten van de concentratie van het geëlueerde eiwitmonster noodzakelijk. Deze meting helpt bij het aanpassen van de hoeveelheid trypsine die dienovereenkomstig moet worden toegevoegd. Stap 4.9 toont een witte neerslag na het toevoegen van de 10% TFA. Om interferentie van oppervlakteactieve stoffen met het MS-signaal te voorkomen, is het van cruciaal belang om de pH te controleren na toevoeging van trifluorazijnzuur (TFA) om ervoor te zorgen dat het reinigingsmiddel volledig uit het supernatant wordt verwijderd.

Na het drogen en resuspenseren van het eluent in water, is het noodzakelijk om een UV-meting van het peptidemengsel uit te voeren. Deze meting is cruciaal omdat de hoeveelheid peptiden die op de kolom wordt geladen, de detectie met MS kan beïnvloeden. Na evaluatie bleek dat ongeveer 1 μg van het peptidemengsel de beste prestaties vertoonde bij MS. Bijgevolg moet deze optimale hoeveelheid in nano LC-MS/MS worden geïnjecteerd voor verdere analyse.

De PMLD-benadering biedt verschillende voordelen bij de monstervoorbereiding, waaronder voldoende monoklonale antilichamen (mAb) DS-reductie met behoud van de meerderheid van gastheerceleiwitten (HCP's) met een lage abundantie. In tegenstelling tot immunoprecipitatie (IP) is deze techniek niet afhankelijk van anti-HCP-antilichamen, waardoor de vooringenomenheid die gepaard gaat met vooraf gedefinieerde antilichamen wordt geëlimineerd en de arbeid en tijd die nodig zijn voor het produceren van anti-HCP-antilichamen wordt verminderd. Bovendien verrijkt PMLD, in tegenstelling tot filtratiemethoden op basis van molecuulgewichtgrens17, HCP's, ongeacht hun grootte. Het kan worden toegepast om HCP's te verrijken met verschillende geneesmiddelmodules, zoals antilichamen, fusie-eiwitten, ScFv en meer, waardoor het een veelzijdige benadering is in vergelijking met proteïne A-deletiemethoden21.

Naast deze voordelen vertoont PMLD een lagere detectielimiet en maakt het de detectie mogelijk van een groter aantal HCP's van NISTmAb, een algemeen gekarakteriseerde referentiestandaard, in vergelijking met andere methoden. Het is echter vermeldenswaard dat PMLD zelfgemaakte apparatuur vereist, wat de toepassing ervan voor automatisering beperkt. Om de bruikbaarheid uit te breiden, is het mogelijk om bepaalde apparatuur, zoals de punt met frit, te vervangen door in de handel verkrijgbare alternatieven. Bovendien kan het uitvoeren van ontzouting op platen met 96 putjes een hogere doorvoer mogelijk maken met behulp van deze aanpak. Het verkennen van automatisering of semi-automatisering in toekomstige experimenten kan een logische volgende stap zijn om de bredere toepassing van PMLD uit te breiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgments

Geen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16 G, Metal Hub Needle, 2 in, point style 3 Hamilton 91016
Acclaim PepMap 100 C18 trap column (20 cm × 0.075 mm) Thermo Fisher 164535
Acetonitrile Fisher-Scientific A955
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade  Fisher-Scientific LS120-4
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit Millipore Sigma UFC5010
C18 analytical column (0.075 mm × 1.7 μm × 30 cm, 100 Å) CoAnn Technologies HEB07503001718I
Centrifuge 5424 Eppendorf 5405000646
Dithiothreitol (DTT)  Thermo Fisher A39255
Frit for SPE cartridges, 9.5 mm, 3 mL, 100/pk Agilent 12131020
GL-Tip GC GL Sciences Inc   7820-11201
in-house mAb Regeneron concentration 200 mg/mL
Iodoacetamide (30 x 9.3 mg) Thermo Fisher A39271
Isopropanol Fisher-Scientific 149320025
L-Histidine Sigma Aldrich H6034
L-Histidine monohydrochloride monohydrate Sigma Aldrich 53370
Methanol Fisher-Scientific A456-4 
Milli-Q Millpore 30035
NanoDrop 2000 Thermo Scientific ND-2000
Orbitrap Exploris 480 Thermo Fisher BRE725539
Protein LoBind Tube 0.5 mL Eppendorf (VWR) 22431064
Protein LoBind Tube 2.0 mL Eppendorf (VWR) 22431102
Proteome Discoverer software 2.4 Thermo Scientific
ProteoMiner Protein Enrichment Large-Capacity Kit Bio-Rad 1633007
ProteoMiner Protein Enrichment Small-Capacity Kit Bio-Rad 1633006
Sodium deoxycholate (SDC) Sigma Aldrich D6750
Sodium lauroyl sarcosinate (SLS)  Sigma Aldrich L5777
SpeedVac Labconco 7970010
Thermomixer R Eppendorf 22670107
Trifluoracetic acid (TFA) Fisher-Scientific 28904
Trypsin (Sequencing Grade Modified)  (5 x 20 ug) Promega V5111
Tube Revolver Rotator Thermo Fisher 88881001
UltiMate 3000 RSLC nano system Thermo Fisher ULTIM3000RSLCNANO
UltraPure 1 M Tris-HCl pH 8.0 Thermo Fisher 15568-025
Vortex Genie 2 VWR 102091-234
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade  Fisher-Scientific LS118-4 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aboulaich, N. A novel approach to monitor clearance of host cell proteins associated with monoclonal antibodies. Biotechnology Progress. 30 (5), 1114-1124 (2014).
  2. Goey, C. H., Alhuthali, S., Kontoravdi, C. Host cell protein removal from biopharmaceutical preparations: Towards the implementation of quality by design. Biotechnology Advances. 36 (4), 1223-1237 (2018).
  3. Levy, N. E., Valente, K. N., Choe, L. H., Lee, K. H., Lenhoff, A. M. Identification and characterization of host cell protein product-associated impurities in monoclonal antibody bioprocessing. Biotechnology and Bioengineering. 111 (5), 904-912 (2014).
  4. Molden, R. Host cell protein profiling of commercial therapeutic protein drugs as a benchmark for monoclonal antibody-based therapeutic protein development. MAbs. 13 (1), 1955811 (2021).
  5. Bee, J. S. Trace levels of the CHO host cell protease cathepsin D caused particle formation in a monoclonal antibody product. Biotechnology Progress. 31 (5), 1360-1369 (2015).
  6. Bracewell, D. G., Francis, R., Smales, C. M. The future of host cell protein (HCP) identification during process development and manufacturing linked to a risk-based management for their control. Biotechnology and Bioengineering. 112 (9), 1727-1737 (2015).
  7. Chiu, J., et al. Knockout of a difficult-to-remove CHO host cell protein, lipoprotein lipase, for improved polysorbate stability in monoclonal antibody formulations. Biotechnology and Bioengineering. 114 (5), 1006-1015 (2017).
  8. Gilgunn, S., et al. Identification and tracking of problematic host cell proteins removed by a synthetic, highly functionalized nonwoven media in downstream bioprocessing of monoclonal antibodies. Journal of Chromatography A. 1595, 28-38 (2019).
  9. Graf, T. Identification and characterization of polysorbate-degrading enzymes in a monoclonal antibody formulation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (11), 3558-3567 (2021).
  10. Hall, T., Sandefur, S. L., Frye, C. C., Tuley, T. L., Huang, L. Polysorbates 20 and 80 degradation by group XV lysosomal phospholipase A2 isomer X1 in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 105 (5), 1633-1642 (2016).
  11. Jones, M. 34;High-risk" host cell proteins (HCPs): A multi-company collaborative view. Biotechnology and Bioengineering. 118 (8), 2870-2885 (2021).
  12. Li, X., et al. Identification and characterization of a residual host cell protein hexosaminidase B associated with N-glycan degradation during the stability study of a therapeutic recombinant monoclonal antibody product. Biotechnology Progress. 37 (3), e3128 (2021).
  13. Zhang, S. Identification of the specific causes of polysorbate 20 degradation in monoclonal antibody formulations containing multiple lipases. Pharmaceutical Research. 39 (1), 75-87 (2022).
  14. Zhang, S., Xiao, H., Li, N. Degradation of polysorbate 20 by Sialate O-Acetylesterase in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (12), 3866-3873 (2021).
  15. Zhang, S., Xiao, H., Molden, R., Qiu, H., Li, N. Rapid polysorbate 80 degradation by liver carboxylesterase in a monoclonal antibody formulated drug substance at early stage development. Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (11), 3300-3307 (2020).
  16. Gunawan, F. Comparison of platform host cell protein ELISA to process-specific host cell protein ELISA. Biotechnology and Bioengineering. 115 (2), 382-389 (2018).
  17. Chen, I. H., Xiao, H., Daly, T., Li, N. Improved host cell protein analysis in monoclonal antibody products through molecular weight cutoff enrichment. Analytical Chemistry. 92 (5), 3751-3757 (2020).
  18. Chen, I. H., Xiao, H., Li, N. Improved host cell protein analysis in monoclonal antibody products through ProteoMiner. Analytical Biochemistry. 610, 113972 (2020).
  19. Doneanu, C. E., et al. Enhanced detection of low-abundance host cell protein impurities in high-purity monoclonal antibodies down to 1 ppm using ion mobility mass spectrometry coupled with multidimensional liquid chromatography. Analytical Chemistry. 87 (20), 10283-10291 (2015).
  20. Huang, L., et al. A Novel sample preparation for shotgun proteomics characterization of HCPs in antibodies. Analytical Chemistry. 89 (10), 5436-5444 (2017).
  21. Johnson, R. O., Greer, T., Cejkov, M., Zheng, X., Li, N. Combination of FAIMS, Protein A depletion, and native digest conditions enables deep proteomic profiling of host cell proteins in monoclonal antibodies. Analytical Chemistry. 92 (15), 10478-10484 (2020).
  22. Kreimer, S. Host cell protein profiling by targeted and untargeted analysis of data independent acquisition mass spectrometry data with parallel reaction monitoring verification. Analytical Chemistry. 89 (10), 5294-5302 (2017).
  23. Madsen, J. A., et al. Toward the complete characterization of host cell proteins in biotherapeutics via affinity depletions, LC-MS/MS, and multivariate analysis. MAbs. 7 (6), 1128-1137 (2015).
  24. Nie, S. Simple and sensitive method for deep profiling of host cell proteins in therapeutic antibodies by combining ultra-low trypsin concentration digestion, long chromatographic gradients, and boxcar mass spectrometry acquisition. Analytical Chemistry. 93 (10), 4383-4390 (2021).
  25. Yang, F. Versatile LC-MS-Based workflow with robust 0.1 ppm sensitivity for identifying residual HCPs in biotherapeutic products. Analytical Chemistry. 94 (2), 723-731 (2022).
  26. Zhang, Q. Comprehensive tracking of host cell proteins during monoclonal antibody purifications using mass spectrometry. MAbs. 6 (3), 659-670 (2014).
  27. Zhang, S., et al. Putative phospholipase B-Like 2 is not responsible for polysorbate degradation in monoclonal antibody drug products. Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (9), 2710-2718 (2020).
  28. Zhang, J., He, J., Smith, K. J. Fatty acids can induce the formation of proteinaceous particles in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 111 (3), 655-662 (2022).
  29. Uniprot1. , https://www.uniprot.org/uniprotkb?query=mus%2Bmusculus (2023).
  30. Uniprot2. , https://www.uniprot.org/uniprotkb (2023).

Tags

Deze maand in JoVE Gastheerceleiwit LC-MS ProteoMiner-technologie beperkte spijsvertering
Gastheerceleiwitanalyse met behulp van verrijkingsparels in combinatie met beperkte spijsvertering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, S., Xiao, H., Li, N. Host… More

Zhang, S., Xiao, H., Li, N. Host Cell Protein Analysis using Enrichment Beads Coupled with Limited Digestion. J. Vis. Exp. (203), e65544, doi:10.3791/65544 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter