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Chemistry

सीमित पाचन के साथ युग्मित संवर्धन मोती का उपयोग करके मेजबान सेल प्रोटीन विश्लेषण

Published: January 19, 2024 doi: 10.3791/65544
Automatic Translation
1, 1, 1
1Analytical Chemistry, Regeneron Pharmaceuticals Inc.

Summary

दवा उत्पादों (डीपी) से मेजबान सेल प्रोटीन (एचसीपी) को समृद्ध करने और प्रोटिओम संवर्धन मोतियों का उपयोग करके पेप्टाइड्स का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया जाता है। विधि को इन-हाउस निर्मित मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबी) दवा पदार्थ (डीएस) का उपयोग करके प्रदर्शित किया जाता है, जो प्रदर्शन के संदर्भ में विभिन्न तरीकों के मूल्यांकन और तुलना के लिए एक अच्छी तरह से विशेषता संदर्भ सामग्री है।

Abstract

मेजबान सेल प्रोटीन (एचसीपी) अशुद्धियां हैं जो चिकित्सीय प्रोटीन पर प्रतिकूल प्रभाव डाल सकती हैं, यहां तक कि कम मात्रा में भी। दवा उत्पादों से जुड़े संभावित जोखिमों का मूल्यांकन करने के लिए, कम बहुतायत वाले एचसीपी की पहचान करने के लिए तरीके विकसित किए गए हैं। एक संवेदनशील एचसीपी डिटेक्शन विधि विकसित करने के लिए एक महत्वपूर्ण दृष्टिकोण में एचसीपी को समृद्ध करना शामिल है, साथ ही विश्लेषण से पहले मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबीएस) को हटाना, तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस) का उपयोग करना।

इस प्रोटोकॉल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रोटिओम संवर्धन मोती का उपयोग मेजबान सेल प्रोटीन को समृद्ध करने के लिए विस्तृत निर्देश प्रदान करता है. इन मोतियों में विभिन्न प्रोटीनों के लिए विशिष्ट समानता के साथ हेक्सापेप्टाइड लिगैंड की एक विविध लाइब्रेरी होती है। प्रोटोकॉल में नैनो एलसी-एमएस / एमएस का उपयोग करके सीमित पाचन और बाद में पेप्टाइड का पता लगाना भी शामिल है। इन तकनीकों को नियोजित करके, कम बहुतायत वाले एचसीपी को 7000 गुना से अधिक समृद्ध किया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप 0.002 पीपीएम जितनी कम प्रभावशाली पहचान सीमा होती है। गौरतलब है कि यह प्रोटोकॉल एनआईएसटी एमएबी का उपयोग करके उच्च स्तर के आत्मविश्वास के साथ 850 एचसीपी का पता लगाने में सक्षम बनाता है। इसके अलावा, इसे उपयोगकर्ता के अनुकूल बनाया गया है और इसके कार्यान्वयन में सहायता के लिए एक वीडियो प्रदर्शन शामिल है। इन चरणों का पालन करके, शोधकर्ता एचसीपी को प्रभावी ढंग से समृद्ध और पहचान सकते हैं, जिससे दवा उत्पादों के लिए जोखिम मूल्यांकन की संवेदनशीलता और सटीकता बढ़ जाती है।

Introduction

मेजबान सेल प्रोटीन (एचसीपी) अशुद्धियां हैं जो मेजबान जीव की सेल संस्कृति से जारी होती हैं और मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबी)1,2,3,4के साथ सह-शुद्ध होती हैं। एचसीपी का ट्रेस स्तर दवा उत्पाद 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 की गुणवत्ता को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकता है, और इसलिए, उप-पीपीएम से पीपीएम स्तरों में एचसीपी का पता लगाने के लिए एक संवेदनशील एचसीपी विश्लेषण विधि वांछित है।

कम बहुतायत में एचसीपी का पता लगाने के लिए ऑर्थोगोनल विधियों को लागू किया जा सकता है। एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा) आम तौर पर समग्र एचसीपी मात्रा निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है, और यह भी इसी एंटीबॉडी16 उपलब्ध हैं, तो यह भी पता लगाने और व्यक्तिगत एचसीपी मात्रा निर्धारित कर सकते हैं. हालांकि, एचसीपी-विशिष्ट एंटीबॉडी का उत्पादन समय लेने वाली और श्रम-गहन है। इसके विपरीत, मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस) के साथ मिलकर तरल क्रोमैटोग्राफी एमएबी दवा उत्पादों में व्यक्तिगत एचसीपी के बारे में व्यापक जानकारी प्रदान कर सकती है और एचसीपी पहचान के लिए व्यापक रूप से लागू होती है 4,7,9,10,12,13,14,15,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,27.

एमएस के साथ एचसीपी का पता लगाने के लिए कई तरीके विकसित किए गए हैं, जिनमें सीमित पाचन20, निस्पंदन17, प्रोटीन ए विलोपन21, इम्यूनोप्रिपिटेशन (आईपी), और प्रोटीन माइनर संवर्धन (पीएम)18शामिल हैं। अधिकांश विधियों का उद्देश्य एमएबी की मात्रा को कम करना और एलसी-एमएस / एमएस विश्लेषण से पहले एचसीपी को समृद्ध करना है, जिससे एमएबी पेप्टाइड्स और एचसीपी पेप्टाइड्स के बीच गतिशील रेंज कम हो जाती है। यह प्रोटोकॉल एक प्रोटिओमिक नमूना संवर्धन विधि प्रस्तुत करता है जो प्रोटिओमाइनर प्रौद्योगिकी और सीमित पाचन (पीएमएलडी)28को जोड़ती है। ProteoMiner संवर्धन सिद्धांत में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रोटिओम संवर्धन मोतियों का उपयोग करना शामिल है जिसमें कॉम्बिनेटरियल पेप्टाइड लिगैंड की एक विविध लाइब्रेरी होती है। ये लिगैंड विशेष रूप से एंटीबॉडी-ड्रग उत्पादों पर प्रोटीन से बंधते हैं, जिससे अतिरिक्त अणुओं को हटाने की अनुमति मिलती है, जबकि उनके संबंधित आत्मीयता लिगैंड पर कम-बहुतायत वाले मेजबान सेल प्रोटीन (एचसीपी) को केंद्रित किया जाता है। दूसरी ओर, सीमित पाचन के सिद्धांत में ट्रिप्सिन की कम सांद्रता का उपयोग करना शामिल है। यह एकाग्रता कम मात्रा वाले एचसीपी को पचाने के लिए पर्याप्त है लेकिन सभी एंटीबॉडी दवा उत्पादों को पचाने के लिए पर्याप्त नहीं है। यह दृष्टिकोण समाधान से पचाने वाले एचसीपी पेप्टाइड्स की वसूली और संवर्धन को सक्षम बनाता है।

निस्पंदन विधियों की तुलना में, पीएमएलडी तकनीक का पता लगाया एचसीपी17 के आकार से सीमित नहीं है. प्रोटीन एक विलोपन विधियां एंटीबॉडी21 से जुड़े एचसीपी का पता लगाने के लिए विशिष्ट हैं, जबकि इम्यूनोप्रिपिटेशन एक विशेष सेल लाइन (जैसे चीनी हम्सटर अंडाशय (सीएचओ) सेल लाइन) से पूर्वनिर्धारित एचसीपी तक सीमित है, जहां एक एंटी-एचसीपी एंटीबॉडीउत्पन्न हुई थी 4. इसके विपरीत, पीएमएलडी को किसी भी दवा मॉड्यूल से एचसीपी का पता लगाने के लिए लागू किया जा सकता है और विभिन्न सेल लाइनों से दवा उत्पादों के साथ सह-शुद्ध सेल प्रोटीन होस्ट किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, पीएमएलडी उल्लिखित विधियों 17,18,20,21,24 की तुलना में बेहतर संवेदनशीलता प्रदर्शित करता है।

यह दृष्टिकोण एचसीपी एकाग्रता को 7000 गुना तक समृद्ध कर सकता है और पता लगाने की सीमा को 0.002 पीपीएम28 तक कम कर सकता है। प्रयोगात्मक सेटअप चित्रा 1 में सचित्र है.

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Protocol

प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले संक्षिप्ताक्षर पूरक तालिका 1 में सूचीबद्ध हैं।

1. समाधान और बफ़र्स की तैयारी

नोट: सभी अभिकर्मकों के वाणिज्यिक विवरण सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध हैं।

  1. एक गिलास शीशी में विआयनीकृत पानी के 9 एमएल में 1 एम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 8.0 के 1 एमएल जोड़कर 0.1 एम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 8.0 समाधान तैयार करें, और भंवर द्वारा अच्छी तरह मिलाएं। अप करने के लिए 3 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.
  2. 0.1 एम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 8.0 के 1 एमएल में 10 मिलीग्राम एसडीसी को भंग करके 24 मिमी सोडियम डीऑक्सीकोलेट (एसडीसी) तैयार करें।
  3. 0.1 एम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 8.0 के 1 एमएल में 7 मिलीग्राम एसएलएस को भंग करके 24 एमएम सोडियम लॉरॉयल सार्कोसिनेट (एसएलएस) तैयार करें।
  4. एक 1:1 (वी / वी) अनुपात में 24 मिमी एसडीसी और 24 मिमी एसएलएस मिश्रण करके क्षालन बफर तैयार करें.
  5. 20 माइक्रोन ट्रिप्सिन में 400 माइक्रोन विआयनीकृत पानी जोड़कर ट्रिप्सिन समाधान के 50 एनजी /
  6. डीटीटी के 7.7 मिलीग्राम में 0.1 एम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 8.0 के 308 माइक्रोन जोड़कर 25 मिलीग्राम / एमएल डाइथियोथ्रेइटोल (डीटीटी) तैयार करें।
  7. आईएएम के 56 मिलीग्राम में 0.1 एम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 8.0 के 1.2 एमएल जोड़कर 0.25 एम आयोडोसेटामाइड (आईएएम) तैयार करें।
  8. विआयनीकृत पानी के 9 एमएल में ट्राइफ्लोरोएसेटिक एसिड (टीएफए) के 1 एमएल जोड़कर 10% टीएफए तैयार करें। 4 एस के लिए भंवर और नीचे स्पिन. अप करने के लिए 3 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.
  9. विआयनीकृत पानी के 99 एमएल में 10% टीएफए के 1 एमएल जोड़कर बफर ए तैयार करें।
  10. 10% टीएफए के 1 एमएल, और एसीटोनिट्राइल (एसीएन) के 50 एमएल में विआयनीकृत पानी के 49 एमएल जोड़कर बफर बी तैयार करें।
  11. 50 एमएल पानी में 37 मिलीग्राम एल-हिस्टिडाइन और 54.8 मिलीग्राम एल-हिस्टिडाइन मोनोहाइड्रोक्लोराइड मोनोहाइड्रेट जोड़कर 10 मिमी हिस्टिडाइन बफर तैयार करें।

2. मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबी) समाधान की तैयारी

  1. एमएल से ऊपर सांद्रता वाले दवा उत्पादों के लिए, 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में विआयनीकृत पानी के साथ मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबी) ( सामग्री की तालिका देखें) के 15 मिलीग्राम को पतला करें, जिसके परिणामस्वरूप कुल मात्रा 300 माइक्रोन और अंतिम पीएच ~ 6 है। यदि आवश्यक हो, एसिटिक एसिड या Tris-HCl का उपयोग कर पीएच समायोजित.
  2. एमएल से नीचे सांद्रता वाले दवा उत्पादों के लिए, 2.2.1 से 2.2.5 चरणों का पालन करते हुए बफर एक्सचेंज करें।
    1. प्रत्येक नमूने के 20 मिलीग्राम को 10k केन्द्रापसारक फिल्टर डिवाइस ( सामग्री की तालिकादेखें) में स्थानांतरित करें और 25 मिनट (कमरे के तापमान, आरटी पर) के लिए 14,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र जब तक लगभग 100 माइक्रोन वॉल्यूम न रह जाए।
    2. आरटी पर 25 मिनट के लिए फिल्टर, भंवर, और अपकेंद्रित्र में 10 एमएम हिस्टिडाइन (सामग्री की तालिकादेखें), पीएच 6.0 बफर के 350 माइक्रोन जोड़ें
    3. फिल्टर पलटना और नमूना संग्रह ट्यूब में जगह है, तो आरटी पर 5 मिनट के लिए 1000 x ग्राम पर नमूने अपकेंद्रित्र संग्रह ट्यूब में पूरी मात्रा को पुनः प्राप्त करने के लिए. फिल्टर को 200 μLof 10 एमएम हिस्टिडीन बफर के साथ धोएं और किसी भी शेष प्रोटीन के नमूनों को पुनर्प्राप्त करने के लिए ऊपर और नीचे पाइप करें। पूरे समाधान को एक ही संग्रह ट्यूब, भंवर में स्थानांतरित करें, और नीचे स्पिन करें।
    4. नैनोड्रॉप द्वारा नमूना एकाग्रता को मापें। संवर्धन मोतियों के साथ इनक्यूबेशन से पहले हिस्टिडीन बफर जोड़कर प्रत्येक प्रोटीन नमूने की एकाग्रता को 50 मिलीग्राम /
    5. नमूने के 300 माइक्रोन को 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।

3. प्रोटीन संवर्धन मोतियों की तैयारी

  1. वाणिज्यिक प्रोटीन संवर्धन किट से प्राप्त प्रत्येक स्पिन स्तंभ से ऊपर और नीचे टोपी निकालें ( सामग्री की तालिकादेखें). कैप को न फेंके, क्योंकि उनका उपयोग बाद में किया जाएगा।
  2. स्पिन कॉलम लें और इसे कैप के बिना 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में रखें। भंडारण समाधान को खत्म करने के लिए आरटी पर 30-60 एस के लिए कमरे के तापमान और 1,000 x ग्राम पर सेटअप अपकेंद्रित्र। इस चरण के दौरान एकत्र की गई सामग्री का निपटान करें।
  3. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध संवर्धन मोतियों ( सामग्री की तालिकादेखें) में 200 माइक्रोन वॉश बफर जोड़ें और कई बार ऊपर और नीचे पाइप करें। बफर को हटाने के लिए आरटी पर 30-60 एस के लिए 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब और अपकेंद्रित्र में स्पिन कॉलम रखें। एकत्रित सामग्री को त्यागें।
    नोट: वॉश बफर वाणिज्यिक प्रोटीन संवर्धन किट में शामिल है।
  4. चरण 3.3 को दो बार दोहराएं।
  5. नीचे की टोपी को बदलें और 200 माइक्रोन पानी जोड़ें, फिर शीर्ष टोपी को बदलें।

4. प्रोटीन संवर्धन

  1. पाइप ऊपर और नीचे घोल (चरण 3.5 से) और चरण 2 में तैयार नमूने के लिए घोल के 40 माइक्रोन हस्तांतरण. ट्यूब को इनक्यूबेट और 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर घुमाएं।
  2. उपयुक्त फ्रिट आकार प्राप्त करने के लिए 16 जी सुई का उपयोग करके फ्रिट ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ एक टिप बनाएं, फिर इसे 200 माइक्रोन टिप के टिप एंड में डालें।
  3. चरण 4.2 में तैयार टिप करने के लिए मोती के साथ नमूना स्थानांतरण. समाधान को हटाने के लिए आरटी पर 3 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब के साथ टिप अपकेंद्रित्र।
  4. टिप को 200 माइक्रोन वॉश बफर जोड़कर मोतियों को धोएं और धोने के समाधान को हटाने के लिए आरटी पर 2 मिन के लिए 200 x ग्राम पर 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब के साथ टिप को अपकेंद्रित्र करें। चरण को दो बार दोहराएं।
  5. टिप करने के लिए 200 माइक्रोन पानी जोड़कर मोती धो लें और पानी को हटाने के लिए आरटी पर 2 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब के साथ टिप अपकेंद्रित्र करें।
  6. टिप में क्षालन बफर (चरण 1.4) के 10 माइक्रोन जोड़कर मोतियों से प्रोटीन को एल्यूट करें, और मोतियों को क्षालन बफर के साथ भिगोए जाने के लिए सुनिश्चित करने के लिए टिप में घोल को दस बार पाइप करें।
  7. एलुएंट इकट्ठा करने के लिए आरटी पर 30 एस के लिए 200 x ग्राम पर एक नई 0.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब के साथ टिप को अपकेंद्रित्र करें। दो बार 4.6-4.7 कदम दोहराएँ और एक 0.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में सभी क्षालन गठबंधन.
  8. 28 डिग्री सेल्सियस पर रात भर पाचन के लिए एलुएंट में ट्रिप्सिन समाधान (चरण 1.5) के 1.5 माइक्रोन जोड़ें। एमएल डीटीटी (चरण 1.6) के 1.5 माइक्रोन जोड़ें, और 20 मिनट के लिए 90 डिग्री सेल्सियस पर नमूना गर्मी।
  9. 0.25 एम आईएएम (चरण 1.7) के 1.5 माइक्रोन जोड़ें और 20 मिनट के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर सेते हैं। 3.5 माइक्रोन 10% टीएफए (चरण 1.8), 2 मिनट के लिए भंवर जोड़ें, और सुनिश्चित करें कि पीएच ~ 2-3 पर है।
  10. एसडीसी और एसएलएस अवक्षेपित करने के लिए आरटी पर 10 मिनट के लिए 14,400 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र। desalting के लिए सतह पर तैरनेवाला ले लीजिए.
  11. नीचे दिए गए चरणों का पालन करके डिसाल्टिंग करें।
    1. जीसी-डिसाल्टिंग टिप में बफर बी (चरण 1.10) के 50 माइक्रोन जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें)। आरटी पर 3 मिनट के लिए 1000 x ग्राम पर एक धारक के साथ टिप अपकेंद्रित्र. एकत्रित सामग्री त्यागें.
    2. टिप करने के लिए बफर एक (1.9 कदम) के 50 माइक्रोन जोड़ें. आरटी पर 3 मिनट के लिए 1000 x ग्राम पर एक धारक के साथ टिप अपकेंद्रित्र. एकत्रित सामग्री त्यागें.
    3. अम्लीय नमूना टिप करने के लिए जोड़ें. आरटी पर 6 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर एक धारक के साथ टिप अपकेंद्रित्र. एकत्रित सामग्री त्यागें.
    4. टिप करने के लिए बफर ए के 50 माइक्रोन जोड़कर टिप धो लें। आरटी पर 3 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर धारक के साथ टिप अपकेंद्रित्र. एकत्रित सामग्री त्यागें. एक बार दोहराएं।
    5. जीसी-डिसाल्टिंग टिप में बफर बी के 50 माइक्रोन जोड़कर टिप से पेप्टाइड को एल्यूट करें। आरटी पर 3 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर एक नई ट्यूब के साथ टिप अपकेंद्रित्र. सामग्री ले लीजिए. चरण को एक बार दोहराएं और एलुएंट को मिलाएं।
    6. एक वैक्यूम सांद्रक के साथ एलुएंट को सुखाएं ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  12. सूखे एलुएंट को 0.1% फॉर्मिक एसिड (एफए) समाधान के 30 माइक्रोन में फिर से निलंबित करें।
  13. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर द्वारा 214 एनएम पर पेप्टाइड मिश्रण के यूवी को मापें ( सामग्री की तालिकादेखें)। पेप्टाइड मिश्रण की एकाग्रता 0.1 और 0.5 मिलीग्राम / एमएल के बीच होनी चाहिए।
  14. प्रत्येक पचाने वाले नमूने के 10 माइक्रोन को एलसी नमूना शीशी में स्थानांतरित करें, फिर नैनो एलसी-एमएस / एमएस पर प्रत्येक पचाने वाले नमूने के 1 माइक्रोग्राम इंजेक्ट करें ( सामग्री की तालिकादेखें)। चरण 5 के बाद विश्लेषण करें। पचा नमूनों के बाकी एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर करें.

5. नैनो एलसी-एमएस/एमएस विश्लेषण

  1. पेप्टाइड मिश्रण को एक नैनो-एलसी प्रणाली में इंजेक्ट करें जो एक मास स्पेक्ट्रोमीटर से जुड़ा हुआ है। पेप्टाइड मिश्रण (~ 1 माइक्रोग्राम) को सी18 ट्रैप कॉलम पर डिसाल्टिंग के लिए तालिका 1 ए में प्रदान किए गए ढाल के साथ लोड करें और फिर पृथक्करण के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर सी 18 विश्लेषणात्मक कॉलम पर।
    नोट: मोबाइल चरण ए बफर में अल्ट्रा-शुद्ध पानी में 0.1% एफए शामिल था, और मोबाइल चरण बी में 80% एसीएन में 0.1% एफए शामिल था।
  2. पेप्टाइड्स को अलग करें और 250 एनएल/मिनट की प्रवाह दर के साथ तालिका 1 बी में प्रदान किए गए ढाल के साथ एल्यूट करें।
    नोट: मास स्पेक्ट्रोमीटर 3 एस के चक्र समय के साथ डेटा-निर्भर मोड (डीडीए) में संचालित किया गया था। आयनों ने प्रत्येक पूर्ण एमएस स्कैन के लिए 30% की सामान्यीकृत टक्कर ऊर्जा के साथ उच्च-ऊर्जा टक्कर पृथक्करण (एचसीडी) के माध्यम से विखंडन किया। स्कैन 60,000 के रिज़ॉल्यूशन पर किए गए थे, जिसमें 3e6 का स्वचालित लाभ नियंत्रण (AGC) लक्ष्य, 20 ms का अधिकतम इंजेक्शन समय और 380-1600 की m/z रेंज थी। MS/MS इवेंट 15,000 के रिज़ॉल्यूशन पर आयोजित किए गए थे, जिसमें AGC लक्ष्य 1e5, अधिकतम इंजेक्शन समय 60 ms और m/z रेंज 200-2000 था। बहिष्करण अवधि 45 s पर सेट की गई थी। आयन स्रोत गुण तालिका 1 सी में प्रदान किए जाते हैं, और विशिष्ट द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री पैरामीटर तालिका 2 ए-एफ में पाए जा सकते हैं।

6. डेटा विश्लेषण

  1. UniProt mus+musculus डेटाबेस29 के विरुद्ध NISTmAb मास स्पेक्ट्रोमेट्री कच्ची फ़ाइलों की खोज करें। इसके अतिरिक्त, UniProt Cricetulus Griseus डेटाबेस30 के खिलाफ पुनः संयोजक प्रोटीन नुकीले-इन mAb DS मास स्पेक्ट्रोमेट्री कच्ची फ़ाइलों की खोज करें।
    नोट: ये खोज Sequest HT और शुभंकर खोज इंजन का उपयोग करके Proteome Discoverer सॉफ़्टवेयर ( सामग्री की तालिका देखें) में आयोजित की गई थीं। उपयोग किए गए डेटाबेस अनावश्यक प्रविष्टियों से मुक्त थे।
  2. मास स्पेक्ट्रोमेट्री खोजों के लिए, 10 पीपीएम की द्रव्यमान सहिष्णुता लागू करें, और टुकड़ा द्रव्यमान सहिष्णुता को 0.02 दा पर सेट करें।
    नोट: खोज मानदंड में सिस्टीन अवशेषों (+57.0214 डीए) के स्थिर कार्बामिडोमेथिलेशन और मेथियोनीन अवशेषों पर ऑक्सीकरण (+15.9949 डीए) का चर संशोधन शामिल है। इसके अतिरिक्त, डीमिनेशन (+0.984 डीए) का एक चर संशोधन लागू किया गया था।
  3. ट्रिप्सिन पाचन का उपयोग करके डेटाबेस खोज करें, जिससे अधिकतम दो छूटे हुए दरार की अनुमति मिलती है। 0.01 पर प्रोटीन और पेप्टाइड्स दोनों के लिए झूठी खोज दर निर्धारित करें।
    नोट: मेजबान सेल प्रोटीन (एचसीपी) की सकारात्मक पहचान करने के लिए, कम से कम दो अद्वितीय पेप्टाइड्स की न्यूनतम आवश्यकता लागू की गई थी। तालिका 3 Proteome खोजकर्ता सॉफ्टवेयर द्वारा विश्लेषण NIST mAb के साथ जुड़े पहचान एचसीपी के प्रतिनिधि सारांश प्रदान करता है.

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल एक नमूना तैयारी कार्यप्रवाह प्रस्तुत किया, सीमित पाचन के साथ युग्मित प्रोटीन संवर्धन कहा जाता है (PMLD), एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबी) नमूने में मेजबान सेल प्रोटीन (एचसीपी) के विश्लेषण के लिए. चित्र 1 पीएमएलडी की चरण-दर-चरण प्रक्रिया को दर्शाता है। शोधकर्ताओं ने प्रत्यक्ष पाचन (चित्रा 2 के शीर्ष पैनल में दिखाया गया है) और पीएमएलडी ( चित्रा 2 के निचले पैनल में दिखाया गया है) का उपयोग करके एचसीपी विश्लेषण के परिणामों की तुलना की। कुल आयन क्रोमैटोग्राम (टीआईसी) प्रोफाइल ने संकेत दिया कि पीएमएलडी ने एमएबी पेप्टाइड्स की तुलना में कुछ एचसीपी पेप्टाइड्स के अवलोकन की अनुमति देते हुए प्रमुख एमएबी पेप्टाइड्स को काफी कम या समाप्त कर दिया। नैनो एलसी (तालिका 1) और एमएस / एमएस (तालिका 2) विश्लेषण के लिए विस्तृत पैरामीटर प्रदान किए जाते हैं। इसके अतिरिक्त, तालिका 3 एनआईएसटी एमएबी से जुड़े पहचाने गए एचसीपी का सारांश प्रदर्शित करती है, जिसमें परिग्रहण संख्या, एचसीपी नाम, प्रजातियां, कवरेज प्रतिशत, पीएसएम, अद्वितीय पेप्टाइड्स, आणविक भार, अपेक्षित आइसोइलेक्ट्रिक पॉइंट (पीआई), शुभंकर स्कोर, सीक्वेस्ट एचटी स्कोर, और शुभंकर और सीक्वेस्ट एचटी द्वारा पहचाने गए पेप्टाइड्स की संख्या जैसी जानकारी शामिल है।

Figure 1
चित्रा 1: सीमित पाचन (पीएमएलडी) के साथ युग्मित प्रोटीन संवर्धन के नमूना तैयारी कार्यप्रवाह। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: एनआईएसटी एमएबी के एचसीपी विश्लेषण के लिए कुल आयन क्रोमैटोग्राम (टीआईसी) प्रोफाइल। शीर्ष पैनल: प्रत्यक्ष पाचन का उपयोग करके एनआईएसटी एमएबी के एचसीपी विश्लेषण के लिए टीआईसी प्रोफाइल। निचला पैनल: PMLD का उपयोग करके NIST mAb के HCP विश्लेषण के लिए TIC प्रोफ़ाइल। टीआईसी प्रोफाइल से यह स्पष्ट है कि प्रत्यक्ष पाचन की तुलना में, पीएमएलडी के बाद अधिकांश प्रमुख एमएबी पेप्टाइड्स को कम या समाप्त कर दिया गया है, जबकि एचसीपी से संबंधित कुछ पेप्टाइड्स देखे जा सकते हैं और एमएबी पेप्टाइड्स के बराबर हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: नैनो एलसी के लिए पैरामीटर। (ए) लोडिंग पंप ढाल। (बी) एनसी पंप ढाल। (सी) आयन स्रोत गुण। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 2: एमएस/एमएस के लिए पैरामीटर। (ए) पूर्ण स्कैन गुण। (B) MIPS गुण. (सी) तीव्रता गुण। (डी) चार्ज राज्य गुण। (ई) गतिशील बहिष्करण। (F) डेटा-निर्भर MS2 स्कैन गुण। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 3: प्रोटिओम डिस्कवरर सॉफ्टवेयर द्वारा विश्लेषण किए गए एनआईएसटी एमएबी से जुड़े पहचाने गए एचसीपी की प्रतिनिधि सारांश तालिका। तालिका में परिग्रहण संख्या, एचसीपी नाम, प्रजातियां, कवरेज का प्रतिशत, पेप्टाइड स्पेक्ट्रम मैचों की संख्या (पीएसएम), अद्वितीय पेप्टाइड्स की संख्या, आणविक भार, अपेक्षित आइसोइलेक्ट्रिक पॉइंट (पीआई), शुभंकर स्कोर, सीक्वेस्ट एचटी स्कोर, और शुभंकर और सीक्वेस्ट एचटी द्वारा पहचाने गए पेप्टाइड्स की संख्या जैसी जानकारी शामिल है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुपूरक तालिका 1: प्रयुक्त संक्षिप्ताक्षरों की सूची। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रोटीन संवर्धन मोतियों के दो संस्करण हैं: एक छोटी क्षमता के साथ और दूसरा बड़ी क्षमता के साथ ( सामग्री की तालिकादेखें)। संवर्धन मोतियों के दोनों संस्करणों में पैकेज में दस प्रीप्स होते हैं। निर्माता के निर्देश बताते हैं कि छोटी क्षमता किट से प्रत्येक तैयारी का उपयोग कुल प्रोटीन के 10 मिलीग्राम को समृद्ध करने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, डीएस से मेजबान सेल प्रोटीन (एचसीपी) संवर्धन के इष्टतम प्रदर्शन के लिए, प्रत्येक तैयारी पांच डीएस नमूनों के लिए अच्छा है। इसलिए, प्रत्येक किट का उपयोग पचास नमूनों से एचसीपी को समृद्ध करने के लिए किया जा सकता है। बड़ी क्षमता किट से प्रत्येक तैयारी के लिए, यह पच्चीस डीएस नमूनों से एचसीपी के संवर्धन के लिए अच्छा है, जिससे कुल दो सौ पचास नमूनों से एचसीपी का पता लगाया जा सकता है।

चरण 3.1 ऊपर या नीचे कैप को त्यागने के खिलाफ सलाह देता है, क्योंकि उन्हें पूरे प्रोटोकॉल में पुन: उपयोग किया जाएगा। यदि मोती शीर्ष टोपी में बस जाते हैं, तो कॉलम पर शीर्ष टोपी रखते हुए नीचे प्लग और अपकेंद्रित्र को हटाने के बाद उन्हें बदलें। नीचे की टोपी को प्लग के रूप में उपयोग करने के लिए, इसे उल्टा करें और इसे स्पिन कॉलम के नीचे सुरक्षित रूप से रखें।

प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम 4.1 कदम है, जहां मनका घोल ट्यूब के तल पर बसता है। इसलिए, घोल को मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबी) नमूनों में स्थानांतरित करते समय निरंतर पाइपिंग को ऊपर और नीचे बनाए रखना महत्वपूर्ण है। एक और महत्वपूर्ण कदम 4.6 कदम है, जहां यह टिप के भीतर दस बार घोल विंदुक करने के लिए आवश्यक है, जबकि मोती क्षालन बफर के साथ संतृप्त कर रहे हैं. चरण 4.3-4.5, 4.7, और 4.10 में सेंट्रीफ्यूजेशन की अवधि संचित मेजबान सेल प्रोटीन (एचसीपी) की मात्रा के आधार पर भिन्न हो सकती है। इसलिए, यह जांचना और सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि अगले चरण पर आगे बढ़ने से पहले टिप में तरल पदार्थ ठीक से काता गया है। फिर, जब एंटीबॉडी-ड्रग उत्पाद के 15 मिलीग्राम की प्रारंभिक मात्रा के साथ शुरू होता है, तो लगभग 30 माइक्रोग्राम एंटीबॉडी और समृद्ध मेजबान सेल प्रोटीन (एचसीपी) को निकाला जा सकता है। सीमित पाचन के लिए 400: 1 के प्रोटीन-टू-एंजाइम अनुपात को प्राप्त करने के लिए, ट्रिप्सिन के 75 एनजी को जोड़ा गया था। जब इनपुट सामग्री की कम मात्रा का उपयोग किया जाता है, तो एल्यूटेड प्रोटीन नमूने की एकाग्रता को मापना आवश्यक है। यह माप ट्रिप्सिन की मात्रा को समायोजित करने में मदद करता है जिसे तदनुसार जोड़ा जाना चाहिए। चरण 4.9 10% TFA जोड़ने के बाद एक सफेद अवक्षेप दिखाता है। एमएस सिग्नल के साथ सर्फेक्टेंट से किसी भी हस्तक्षेप को रोकने के लिए, सतह पर तैरनेवाला से डिटर्जेंट को पूरी तरह से हटाने के लिए ट्राइफ्लोरोएसेटिक एसिड (टीएफए) जोड़ने के बाद पीएच की जांच करना महत्वपूर्ण है।

पानी में एलुएंट के सुखाने और पुन: निलंबन के बाद, पेप्टाइड मिश्रण का यूवी माप करना आवश्यक है। यह माप महत्वपूर्ण है क्योंकि कॉलम पर लोड किए गए पेप्टाइड्स की मात्रा एमएस का उपयोग करके पता लगाने को प्रभावित कर सकती है। मूल्यांकन के बाद, यह पाया गया कि पेप्टाइड मिश्रण के लगभग 1 माइक्रोग्राम ने एमएस में सर्वश्रेष्ठ प्रदर्शन का प्रदर्शन किया। नतीजतन, इस इष्टतम राशि को आगे के विश्लेषण के लिए नैनो एलसी-एमएस / एमएस में इंजेक्ट करने की आवश्यकता है।

पीएमएलडी दृष्टिकोण नमूना तैयार करने में कई फायदे प्रदान करता है, जिसमें पर्याप्त मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबी) डीएस कमी शामिल है, जबकि कम-बहुतायत वाले मेजबान सेल प्रोटीन (एचसीपी) के बहुमत को संरक्षित किया जाता है। इम्यूनोप्रिपिटेशन (आईपी) के विपरीत, यह तकनीक एंटी-एचसीपी एंटीबॉडी पर भरोसा नहीं करती है, इस प्रकार पूर्वनिर्धारित एंटीबॉडी से जुड़े पूर्वाग्रह को समाप्त करती है और एंटी-एचसीपी एंटीबॉडी के उत्पादन के लिए आवश्यक श्रम और समय को कम करती है। इसके अलावा, आणविक भार कट-ऑफ17 के आधार पर निस्पंदन विधियों के विपरीत, पीएमएलडी एचसीपी को उनके आकार की परवाह किए बिना समृद्ध करता है। यह इस तरह के एंटीबॉडी, संलयन प्रोटीन, ScFv, और अधिक के रूप में विभिन्न दवा मॉड्यूल, से एचसीपी को समृद्ध करने के लिए लागू किया जा सकता है, यह प्रोटीन एक हटाने के तरीकों21 की तुलना में एक बहुमुखी दृष्टिकोण बनाने.

इन फायदों के अलावा, पीएमएलडी एक कम पहचान सीमा प्रदर्शित करता है और अन्य तरीकों की तुलना में एनआईएसटीएमएबी से अधिक संख्या में एचसीपी का पता लगाने में सक्षम बनाता है, जो व्यापक रूप से विशेषता संदर्भ मानक है। हालांकि, यह ध्यान देने योग्य है कि पीएमएलडी को घर के बने उपकरणों की आवश्यकता होती है, जो स्वचालन के लिए इसके आवेदन को सीमित करता है। इसकी उपयोगिता का विस्तार करने के लिए, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध विकल्पों के साथ कुछ उपकरणों, जैसे कि टिप को फ्रिट के साथ बदलना संभव है। इसके अतिरिक्त, 96-अच्छी प्लेटों पर डिसाल्टिंग करने से इस दृष्टिकोण का उपयोग करके उच्च थ्रूपुट सक्षम हो सकता है। भविष्य के प्रयोगों में स्वचालन या अर्ध-स्वचालन की खोज पीएमएलडी के व्यापक अनुप्रयोग का विस्तार करने के लिए एक तार्किक अगला कदम हो सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं है।

Acknowledgments

कोई नहीं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16 G, Metal Hub Needle, 2 in, point style 3 Hamilton 91016
Acclaim PepMap 100 C18 trap column (20 cm × 0.075 mm) Thermo Fisher 164535
Acetonitrile Fisher-Scientific A955
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade  Fisher-Scientific LS120-4
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit Millipore Sigma UFC5010
C18 analytical column (0.075 mm × 1.7 μm × 30 cm, 100 Å) CoAnn Technologies HEB07503001718I
Centrifuge 5424 Eppendorf 5405000646
Dithiothreitol (DTT)  Thermo Fisher A39255
Frit for SPE cartridges, 9.5 mm, 3 mL, 100/pk Agilent 12131020
GL-Tip GC GL Sciences Inc   7820-11201
in-house mAb Regeneron concentration 200 mg/mL
Iodoacetamide (30 x 9.3 mg) Thermo Fisher A39271
Isopropanol Fisher-Scientific 149320025
L-Histidine Sigma Aldrich H6034
L-Histidine monohydrochloride monohydrate Sigma Aldrich 53370
Methanol Fisher-Scientific A456-4 
Milli-Q Millpore 30035
NanoDrop 2000 Thermo Scientific ND-2000
Orbitrap Exploris 480 Thermo Fisher BRE725539
Protein LoBind Tube 0.5 mL Eppendorf (VWR) 22431064
Protein LoBind Tube 2.0 mL Eppendorf (VWR) 22431102
Proteome Discoverer software 2.4 Thermo Scientific
ProteoMiner Protein Enrichment Large-Capacity Kit Bio-Rad 1633007
ProteoMiner Protein Enrichment Small-Capacity Kit Bio-Rad 1633006
Sodium deoxycholate (SDC) Sigma Aldrich D6750
Sodium lauroyl sarcosinate (SLS)  Sigma Aldrich L5777
SpeedVac Labconco 7970010
Thermomixer R Eppendorf 22670107
Trifluoracetic acid (TFA) Fisher-Scientific 28904
Trypsin (Sequencing Grade Modified)  (5 x 20 ug) Promega V5111
Tube Revolver Rotator Thermo Fisher 88881001
UltiMate 3000 RSLC nano system Thermo Fisher ULTIM3000RSLCNANO
UltraPure 1 M Tris-HCl pH 8.0 Thermo Fisher 15568-025
Vortex Genie 2 VWR 102091-234
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade  Fisher-Scientific LS118-4 

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References

  1. Aboulaich, N. A novel approach to monitor clearance of host cell proteins associated with monoclonal antibodies. Biotechnology Progress. 30 (5), 1114-1124 (2014).
  2. Goey, C. H., Alhuthali, S., Kontoravdi, C. Host cell protein removal from biopharmaceutical preparations: Towards the implementation of quality by design. Biotechnology Advances. 36 (4), 1223-1237 (2018).
  3. Levy, N. E., Valente, K. N., Choe, L. H., Lee, K. H., Lenhoff, A. M. Identification and characterization of host cell protein product-associated impurities in monoclonal antibody bioprocessing. Biotechnology and Bioengineering. 111 (5), 904-912 (2014).
  4. Molden, R. Host cell protein profiling of commercial therapeutic protein drugs as a benchmark for monoclonal antibody-based therapeutic protein development. MAbs. 13 (1), 1955811 (2021).
  5. Bee, J. S. Trace levels of the CHO host cell protease cathepsin D caused particle formation in a monoclonal antibody product. Biotechnology Progress. 31 (5), 1360-1369 (2015).
  6. Bracewell, D. G., Francis, R., Smales, C. M. The future of host cell protein (HCP) identification during process development and manufacturing linked to a risk-based management for their control. Biotechnology and Bioengineering. 112 (9), 1727-1737 (2015).
  7. Chiu, J., et al. Knockout of a difficult-to-remove CHO host cell protein, lipoprotein lipase, for improved polysorbate stability in monoclonal antibody formulations. Biotechnology and Bioengineering. 114 (5), 1006-1015 (2017).
  8. Gilgunn, S., et al. Identification and tracking of problematic host cell proteins removed by a synthetic, highly functionalized nonwoven media in downstream bioprocessing of monoclonal antibodies. Journal of Chromatography A. 1595, 28-38 (2019).
  9. Graf, T. Identification and characterization of polysorbate-degrading enzymes in a monoclonal antibody formulation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (11), 3558-3567 (2021).
  10. Hall, T., Sandefur, S. L., Frye, C. C., Tuley, T. L., Huang, L. Polysorbates 20 and 80 degradation by group XV lysosomal phospholipase A2 isomer X1 in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 105 (5), 1633-1642 (2016).
  11. Jones, M. 34;High-risk" host cell proteins (HCPs): A multi-company collaborative view. Biotechnology and Bioengineering. 118 (8), 2870-2885 (2021).
  12. Li, X., et al. Identification and characterization of a residual host cell protein hexosaminidase B associated with N-glycan degradation during the stability study of a therapeutic recombinant monoclonal antibody product. Biotechnology Progress. 37 (3), e3128 (2021).
  13. Zhang, S. Identification of the specific causes of polysorbate 20 degradation in monoclonal antibody formulations containing multiple lipases. Pharmaceutical Research. 39 (1), 75-87 (2022).
  14. Zhang, S., Xiao, H., Li, N. Degradation of polysorbate 20 by Sialate O-Acetylesterase in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (12), 3866-3873 (2021).
  15. Zhang, S., Xiao, H., Molden, R., Qiu, H., Li, N. Rapid polysorbate 80 degradation by liver carboxylesterase in a monoclonal antibody formulated drug substance at early stage development. Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (11), 3300-3307 (2020).
  16. Gunawan, F. Comparison of platform host cell protein ELISA to process-specific host cell protein ELISA. Biotechnology and Bioengineering. 115 (2), 382-389 (2018).
  17. Chen, I. H., Xiao, H., Daly, T., Li, N. Improved host cell protein analysis in monoclonal antibody products through molecular weight cutoff enrichment. Analytical Chemistry. 92 (5), 3751-3757 (2020).
  18. Chen, I. H., Xiao, H., Li, N. Improved host cell protein analysis in monoclonal antibody products through ProteoMiner. Analytical Biochemistry. 610, 113972 (2020).
  19. Doneanu, C. E., et al. Enhanced detection of low-abundance host cell protein impurities in high-purity monoclonal antibodies down to 1 ppm using ion mobility mass spectrometry coupled with multidimensional liquid chromatography. Analytical Chemistry. 87 (20), 10283-10291 (2015).
  20. Huang, L., et al. A Novel sample preparation for shotgun proteomics characterization of HCPs in antibodies. Analytical Chemistry. 89 (10), 5436-5444 (2017).
  21. Johnson, R. O., Greer, T., Cejkov, M., Zheng, X., Li, N. Combination of FAIMS, Protein A depletion, and native digest conditions enables deep proteomic profiling of host cell proteins in monoclonal antibodies. Analytical Chemistry. 92 (15), 10478-10484 (2020).
  22. Kreimer, S. Host cell protein profiling by targeted and untargeted analysis of data independent acquisition mass spectrometry data with parallel reaction monitoring verification. Analytical Chemistry. 89 (10), 5294-5302 (2017).
  23. Madsen, J. A., et al. Toward the complete characterization of host cell proteins in biotherapeutics via affinity depletions, LC-MS/MS, and multivariate analysis. MAbs. 7 (6), 1128-1137 (2015).
  24. Nie, S. Simple and sensitive method for deep profiling of host cell proteins in therapeutic antibodies by combining ultra-low trypsin concentration digestion, long chromatographic gradients, and boxcar mass spectrometry acquisition. Analytical Chemistry. 93 (10), 4383-4390 (2021).
  25. Yang, F. Versatile LC-MS-Based workflow with robust 0.1 ppm sensitivity for identifying residual HCPs in biotherapeutic products. Analytical Chemistry. 94 (2), 723-731 (2022).
  26. Zhang, Q. Comprehensive tracking of host cell proteins during monoclonal antibody purifications using mass spectrometry. MAbs. 6 (3), 659-670 (2014).
  27. Zhang, S., et al. Putative phospholipase B-Like 2 is not responsible for polysorbate degradation in monoclonal antibody drug products. Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (9), 2710-2718 (2020).
  28. Zhang, J., He, J., Smith, K. J. Fatty acids can induce the formation of proteinaceous particles in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 111 (3), 655-662 (2022).
  29. Uniprot1. , https://www.uniprot.org/uniprotkb?query=mus%2Bmusculus (2023).
  30. Uniprot2. , https://www.uniprot.org/uniprotkb (2023).

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