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Chemistry

Analisi delle proteine delle cellule ospiti utilizzando perle di arricchimento accoppiate a digestione limitata

Published: January 19, 2024 doi: 10.3791/65544
Automatic Translation
1, 1, 1
1Analytical Chemistry, Regeneron Pharmaceuticals Inc.

Summary

Viene presentato un protocollo per l'arricchimento delle proteine della cellula ospite (HCP) da prodotti farmaceutici (DP) e la rilevazione di peptidi utilizzando perle di arricchimento del proteoma. Il metodo è dimostrato utilizzando una sostanza farmaceutica (DS) a base di anticorpi monoclonali (mAb) prodotta internamente, che è un materiale di riferimento ben caratterizzato per la valutazione e il confronto di diversi metodi in termini di prestazioni.

Abstract

Le proteine della cellula ospite (HCP) sono impurità che possono influire negativamente sulle proteine terapeutiche, anche in piccole quantità. Per valutare i potenziali rischi associati ai prodotti farmaceutici, sono stati sviluppati metodi per identificare gli operatori sanitari a bassa abbondanza. Un approccio cruciale per lo sviluppo di un metodo di rilevamento sensibile degli HCP prevede l'arricchimento degli HCP e la contemporanea rimozione degli anticorpi monoclonali (mAb) prima dell'analisi, utilizzando la cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS).

Questo protocollo offre istruzioni dettagliate per l'arricchimento delle proteine della cellula ospite utilizzando perle di arricchimento del proteoma disponibili in commercio. Queste perle contengono una libreria diversificata di ligandi esapeptidici con affinità specifiche per diverse proteine. Il protocollo incorpora anche una digestione limitata e il successivo rilevamento dei peptidi utilizzando nano LC-MS/MS. Impiegando queste tecniche, gli HCP con bassa abbondanza possono essere arricchiti di oltre 7000 volte, con un limite di rilevamento impressionante fino a 0,002 ppm. Significativamente, questo protocollo consente il rilevamento di 850 HCP con un alto livello di confidenza utilizzando un anticorpo monoclonale NIST. Inoltre, è progettato per essere facile da usare e include una dimostrazione video per assisterne l'implementazione. Seguendo questi passaggi, i ricercatori possono arricchire e rilevare efficacemente gli operatori sanitari, migliorando la sensibilità e l'accuratezza della valutazione del rischio per i prodotti farmaceutici.

Introduction

Le proteine della cellula ospite (HCP) sono impurità che vengono rilasciate dalla coltura cellulare dell'organismo ospite e co-purificate con l'anticorpo monoclonale (mAb)1,2,3,4. I livelli di tracce di HCP possono avere un impatto negativo sulla qualità del prodotto farmaceutico 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 e, pertanto, è necessario un metodo di analisi HCP sensibile per rilevare gli HCP a livelli da sub-ppm a ppm.

I metodi ortogonali possono essere applicati per rilevare gli HCP in bassa abbondanza. Il test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) è generalmente utilizzato per quantificare gli HCP complessivi e può anche rilevare e quantificare i singoli HCP se sono disponibili gli anticorpi corrispondenti16. Tuttavia, la produzione di anticorpi specifici per l'HCP richiede molto tempo e lavoro. Al contrario, la cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa (LC-MS) può fornire informazioni complete sui singoli HCP nei prodotti farmaceutici mAb ed è ampiamente applicata per l'identificazione degli HCP 4,7,9,10,12,13,14,15,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,27.

Sono stati sviluppati diversi metodi per rilevare gli HCP con LC-MS/MS, tra cui la digestione limitata20, la filtrazione 17, la delezione della proteina A21, l'immunoprecipitazione (IP) e l'arricchimento di ProteoMiner (PM)18. La maggior parte dei metodi mira a ridurre la quantità di anticorpi monoclonali e ad arricchire gli HCP prima dell'analisi LC-MS/MS, diminuendo così l'intervallo dinamico tra i peptidi degli anticorpi monoclonali e i peptidi HCP. Questo protocollo presenta un metodo di arricchimento del campione proteomico che combina la tecnologia ProteoMiner e la digestione limitata (PMLD)28. Il principio di arricchimento di ProteoMiner prevede l'utilizzo di perle di arricchimento del proteoma disponibili in commercio contenenti una libreria diversificata di ligandi peptidici combinatori. Questi ligandi si legano specificamente alle proteine sui prodotti anticorpali-farmacologici, consentendo la rimozione delle molecole in eccesso e concentrando le proteine delle cellule ospiti (HCP) a bassa abbondanza sui rispettivi ligandi di affinità. D'altra parte, il principio della digestione limitata prevede l'utilizzo di una bassa concentrazione di tripsina. Questa concentrazione è sufficiente per digerire gli HCP a bassa abbondanza, ma non sufficiente per digerire tutti i farmaci anticorpali. Questo approccio consente il recupero e l'arricchimento dei peptidi HCP digeriti dalla soluzione.

Rispetto ai metodi di filtrazione, la tecnica PMLD non è limitata dalle dimensioni degli HCP rilevati17. I metodi di delezione della proteina A sono specifici per rilevare gli HCP associati agli anticorpi21, mentre l'immunoprecipitazione è limitata agli HCP predefiniti di una particolare linea cellulare (come la linea cellulare dell'ovaio di criceto cinese (CHO)), in cui è stato generato un anticorpo anti-HCP4. Al contrario, la PMLD può essere applicata per rilevare gli HCP da qualsiasi modulo farmacologico e proteine della cellula ospite co-purificate con prodotti farmaceutici di varie linee cellulari. Inoltre, PMLD mostra una migliore sensibilità rispetto ai metodi menzionati 17,18,20,21,24.

Questo approccio può arricchire la concentrazione di HCP di 7000 volte e abbassare il limite di rilevamento a 0,002 ppm28. La configurazione sperimentale è illustrata nella Figura 1.

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Protocol

Le abbreviazioni utilizzate nel protocollo sono elencate nella tabella supplementare 1.

1. Preparazione di soluzioni e tamponi

NOTA: I dettagli commerciali di tutti i reagenti sono elencati nella Tabella dei materiali.

  1. Preparare una soluzione 0,1 M di Tris-HCl, pH 8,0 aggiungendo 1 mL di 1 M Tris-HCl, pH 8,0 in 9 mL di acqua deionizzata in un flaconcino di vetro e mescolare bene mediante vortex. Conservare a 4 °C per un massimo di 3 mesi.
  2. Preparare 24 mM di desossicolato di sodio (SDC) sciogliendo 10 mg di SDC in 1 mL di Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0.
  3. Preparare 24 mM di sodio lauroil sarcosinato (SLS) sciogliendo 7 mg di SLS in 1 mL di Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0.
  4. Preparare il tampone di eluizione mescolando 24 mM di SDC e 24 mM di SLS con un rapporto di 1:1 (v/v).
  5. Preparare 50 ng/μL di soluzione di tripsina aggiungendo 400 μL di acqua deionizzata a 20 μg di tripsina.
  6. Preparare 25 mg/mL di ditiotreitolo (DTT) aggiungendo 308 μL di Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0, a 7,7 mg di DTT.
  7. Preparare iodoacetammide 0,25 M (IAM) aggiungendo 1,2 mL di Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0, a 56 mg di IAM.
  8. Preparare il 10% di TFA aggiungendo 1 mL di acido trifluoroacetico (TFA) in 9 mL di acqua deionizzata. Vortice per 4 s e rotazione verso il basso. Conservare a 4 °C per un massimo di 3 mesi.
  9. Preparare il tampone A aggiungendo 1 mL di TFA al 10% in 99 mL di acqua deionizzata.
  10. Preparare il tampone B aggiungendo 1 mL di TFA al 10% e 49 mL di acqua deionizzata in 50 mL di acetonitrile (ACN).
  11. Preparare 10 mM di tampone di istidina aggiungendo 37 mg di L-istidina e 54,8 mg di L-istidina monocloridrato monoidrato in 50 ml di acqua.

2. Preparazione di soluzioni di anticorpi monoclonali (mAb)

  1. Per i prodotti farmaceutici con concentrazioni superiori a 50 mg/mL, diluire 15 mg dell'anticorpo monoclonale (mAb) (vedere la tabella dei materiali) con acqua deionizzata in una provetta da microcentrifuga da 2 mL, ottenendo un volume totale di 300 μL e un pH finale di ~6. Se necessario, regolare il pH utilizzando acido acetico o Tris-HCl.
  2. Per i prodotti farmaceutici con concentrazioni inferiori a 50 mg/mL, eseguire lo scambio di tamponi seguendo i passaggi da 2.2.1 a 2.2.5.
    1. Trasferire 20 mg di ciascun campione in un dispositivo di filtraggio centrifugo da 10k (vedere la tabella dei materiali) e centrifugare a 14.000 x g per 25 minuti (a temperatura ambiente, RT) fino a quando rimane un volume di circa 100 μL.
    2. Aggiungere 350 μL di istidina 10 mM (vedere la tabella dei materiali), tampone pH 6,0 nel filtro, nel vortice e centrifugare a 14.000 x g per 25 minuti a RT. Ripetere una volta.
    3. Capovolgere il filtro e posizionarlo nella provetta di raccolta del campione, quindi centrifugare i campioni a 1000 x g per 5 minuti a RT per recuperare l'intero volume nella provetta di raccolta. Lavare il filtro con 200 μL di tampone istidinico da 10 mM e pipettare su e giù per recuperare eventuali campioni proteici rimanenti. Trasferire l'intera soluzione nella stessa provetta di raccolta, vortice e centrifugazione.
    4. Misurare la concentrazione del campione con NanoDrop. Regolare la concentrazione di ciascun campione proteico a 50 mg/mL aggiungendo il tampone istidina prima dell'incubazione con microsfere di arricchimento.
    5. Trasferire 300 μL del campione in una provetta per microcentrifuga da 2 mL.

3. Preparazione di perle di arricchimento del proteoma

  1. Rimuovere il tappo superiore e inferiore da ciascuna colonna di centrifuga ottenuta dal kit di arricchimento proteico commerciale (vedere Tabella dei materiali). Non gettare i tappi, poiché verranno utilizzati in seguito.
  2. Prendere la colonna di centrifuga e posizionarla in una provetta per microcentrifuga da 2 mL senza tappo. Centrifugare l'impianto a temperatura ambiente e 1.000 x g per 30-60 s a RT per eliminare la soluzione di conservazione. Smaltire il materiale raccolto durante questa fase.
  3. Aggiungere 200 μL di tampone di lavaggio alle microsfere di arricchimento disponibili in commercio (vedere la tabella dei materiali) e pipettare più volte su e giù. Posizionare la colonna rotante in una provetta per microcentrifuga da 2 mL e centrifugare a 1.000 x g per 30-60 s a RT per rimuovere il tampone. Scartare il materiale raccolto.
    NOTA: Il tampone di lavaggio è incluso nel kit di arricchimento proteico commerciale.
  4. Ripetere due volte i passaggi 3.3.
  5. Riposizionare il tappo inferiore e aggiungere 200 μL di acqua, quindi riposizionare il tappo superiore.

4. Arricchimento proteico

  1. Pipettare su e giù per il liquame (dal punto 3.5) e trasferire 40 μL di liquame sul campione preparato nel passaggio 2. Incubare e ruotare la provetta a temperatura ambiente per 2 ore.
  2. Realizzare una punta con la fritta (vedere la tabella dei materiali) utilizzando l'ago da 16 G per ottenere la dimensione appropriata della fritta, quindi inserirla nell'estremità della punta della punta da 200 μL.
  3. Trasferire il campione con le perline sulla punta preparata al punto 4.2. Centrifugare la punta con una provetta per microcentrifuga da 2 mL a 200 x g per 3 minuti a RT per rimuovere la soluzione.
  4. Lavare le perle aggiungendo 200 μL di tampone di lavaggio al puntale e centrifugare il puntale con una provetta per microcentrifuga da 2 mL a 200 x g per 2 minuti a RT per rimuovere la soluzione di lavaggio. Ripeti il passaggio due volte.
  5. Lavare le perle aggiungendo 200 μL di acqua al puntale e centrifugare il puntale con una provetta da microcentrifuga da 2 mL a 200 x g per 2 minuti a RT per rimuovere l'acqua.
  6. Eluire le proteine dalle microsfere aggiungendo 10 μL di tampone di eluizione (passaggio 1.4) nel puntale e pipettare il liquame dieci volte nel puntale per assicurarsi che le microsfere siano imbevute di tampone di eluizione.
  7. Centrifugare il puntale con una nuova provetta per microcentrifuga da 0,5 mL a 200 x g per 30 s a RT per raccogliere l'eluente. Ripetere due volte i passaggi 4.6-4.7 e combinare tutta l'eluizione in una provetta per microcentrifuga da 0,5 mL.
  8. Aggiungere 1,5 μL di soluzione di tripsina (fase 1.5) nell'eluente per la digestione notturna a 28 °C. Aggiungere 1,5 μL di DTT da 25 mg/mL (fase 1.6) e riscaldare il campione a 90 °C per 20 minuti.
  9. Aggiungere 1,5 μL di IAM 0,25 M (passaggio 1,7) e incubare a temperatura ambiente al buio per 20 minuti. Aggiungere 3,5 μL di TFA al 10% (passaggio 1,8), vortice per 2 minuti e assicurarsi che il pH sia a ~2-3.
  10. Centrifugare a 14.400 × g per 10 minuti a RT per precipitare SDC e SLS. Raccogliere il surnatante per la dissalazione.
  11. Eseguire la dissalazione seguendo i passaggi seguenti.
    1. Aggiungere 50 μL di tampone B (passaggio 1.10) alla punta di desalinizzazione GC (vedere la tabella dei materiali). Centrifugare il puntale con un supporto a 1000 x g per 3 minuti a RT. Scartare il materiale raccolto.
    2. Aggiungere 50 μL di tampone A (passaggio 1.9) alla punta. Centrifugare il puntale con un supporto a 1000 x g per 3 minuti a RT. Scartare il materiale raccolto.
    3. Aggiungere il campione acidificato alla punta. Centrifugare il puntale con un supporto a 500 x g per 6 minuti a RT. Scartare il materiale raccolto.
    4. Lavare la punta aggiungendo 50 μL di tampone A alla punta. Centrifugare il puntale con il supporto a 500 x g per 3 minuti a RT. Scartare il materiale raccolto. Ripeti una volta.
    5. Eluire il peptide dalla punta aggiungendo 50 μL di tampone B alla punta di desalinizzazione GC. Centrifugare la punta con una nuova provetta a 500 x g per 3 minuti a RT. Raccogliere il materiale. Ripetere il passaggio una volta e combinare l'eluente.
    6. Asciugare l'eluente con un concentratore sottovuoto (vedi Tabella dei materiali).
  12. Risospendere l'eluente essiccato in 30 μL di soluzione di acido formico (FA) allo 0,1%.
  13. Misurare l'UV di miscele peptidiche a 214 nm con uno spettrofotometro (vedere Tabella dei materiali). La concentrazione delle miscele peptidiche deve essere compresa tra 0,1 e 0,5 mg/mL.
  14. Trasferire 10 μL di ciascun campione digerito in una fiala di campione LC, quindi iniettare 1 μg di ciascun campione digerito su nano LC-MS/MS (vedere la tabella dei materiali). Eseguire l'analisi seguendo il passaggio 5. Conservare il resto dei campioni digeriti in un congelatore a -80 °C.

5. Analisi Nano LC-MS/MS

  1. Iniettare la miscela peptidica in un sistema nano-LC accoppiato a uno spettrometro di massa. Caricare le miscele di peptidi (~1 μg) su una colonna trappola C18 con il gradiente fornito nella Tabella 1A per la desalinizzazione e quindi su una colonna analitica C18 a 40 °C per la separazione.
    NOTA: Il tampone di fase mobile A era costituito dallo 0,1% di FA in acqua ultrapura e la fase mobile B consisteva dallo 0,1% di FA nell'80% di ACN.
  2. Separare i peptidi ed eluire con il gradiente indicato nella Tabella 1B con una portata di 250 nL/min.
    NOTA: Lo spettrometro di massa è stato utilizzato in modalità dipendente dai dati (DDA) con un tempo di ciclo di 3 s. Gli ioni hanno subito una frammentazione attraverso la dissociazione collisionale ad alta energia (HCD) con un'energia di collisione normalizzata del 30% per ogni scansione MS completa. Le scansioni sono state eseguite a una risoluzione di 60.000, con un target di controllo automatico del guadagno (AGC) di 3e6, un tempo di iniezione massimo di 20 ms e un intervallo m/z di 380-1600. Gli eventi MS/MS sono stati condotti con una risoluzione di 15.000, con un target AGC di 1e5, un tempo di iniezione massimo di 60 ms e un intervallo m/z di 200-2000. La durata dell'esclusione è stata impostata su 45 s. Le proprietà della sorgente ionica sono fornite nella Tabella 1C e i parametri specifici della spettrometria di massa sono riportati nella Tabella 2A-F.

6. Analisi dei dati

  1. Eseguire una ricerca dei file grezzi della spettrometria di massa NISTmAb rispetto al database UniProt mus+musculus29. Inoltre, cercare i file grezzi di spettrometria di massa mAb DS con proteina spiked della proteina ricombinante rispetto al database UniProt Cricetulus Griseus30.
    NOTA: Queste ricerche sono state condotte nel software Proteome Discoverer (vedi Tabella dei materiali) utilizzando i motori di ricerca Sequest HT e Mascot. Le banche dati utilizzate erano prive di voci ridondanti.
  2. Per le ricerche di spettrometria di massa, applicare una tolleranza di massa di 10 ppm e impostare la tolleranza di massa del frammento su 0,02 Da.
    NOTA: I criteri di ricerca comprendevano la carbamidometilazione statica dei residui di cisteina (+57.0214 Da) e la modificazione variabile dell'ossidazione (+15.9949 Da) sui residui di metionina. Inoltre, è stata applicata una modifica variabile della deaminazione (+0,984 Da).
  3. Eseguire la ricerca nel database utilizzando la digestione della tripsina, consentendo un massimo di due scissioni mancate. Impostare i tassi di falsa scoperta sia per le proteine che per i peptidi a 0,01.
    NOTA: Per identificare positivamente le proteine della cellula ospite (HCP), è stato applicato un requisito minimo di almeno due peptidi unici. La Tabella 3 fornisce il riepilogo rappresentativo degli HCP identificati associati agli anticorpi monoclonali NIST analizzati dal software Proteome Discoverer.

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Representative Results

Questo protocollo ha presentato un flusso di lavoro per la preparazione del campione, denominato arricchimento proteico accoppiato con digestione limitata (PMLD), per l'analisi delle proteine della cellula ospite (HCP) in un campione di anticorpi monoclonali (mAb). La Figura 1 illustra la procedura passo-passo di PMLD. I ricercatori hanno confrontato i risultati dell'analisi HCP utilizzando la digestione diretta (mostrata nel pannello superiore della Figura 2) e PMLD (mostrata nel pannello inferiore della Figura 2). I profili del cromatogramma ionico totale (TIC) hanno indicato che la PMLD ha ridotto o eliminato significativamente i principali peptidi mAb, consentendo al contempo l'osservazione di alcuni peptidi HCP paragonabili ai peptidi mAb. Vengono forniti parametri dettagliati per le analisi nano LC (Tabella 1) e MS/MS (Tabella 2). Inoltre, la Tabella 3 mostra un riepilogo degli HCP identificati associati all'anticorpo monoclonale NIST, comprese informazioni quali il numero di adesione, il nome dell'HCP, la specie, la percentuale di copertura, i PSM, i peptidi unici, il peso molecolare, il punto isoelettrico previsto (pI), il punteggio Mascot, il punteggio Sequest HT e il numero di peptidi identificati da Mascot e Sequest HT.

Figure 1
Figura 1: Flusso di lavoro per la preparazione dei campioni di arricchimento proteico abbinato a digestione limitata (PMLD). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Profilo del cromatogramma ionico totale (TIC) per l'analisi HCP degli anticorpi monoclonali NIST. Pannello superiore: profilo TIC per l'analisi HCP di anticorpi monoclonali NIST mediante digestione diretta. Pannello inferiore: profilo TIC per l'analisi HCP di anticorpi monoclonali NIST utilizzando PMLD. E' evidente dal profilo TIC che, rispetto alla digestione diretta, la maggior parte dei principali peptidi mAb sono stati ridotti o eliminati dopo PMLD, mentre si possono osservare alcuni peptidi appartenenti agli HCP e paragonabili ai peptidi mAb. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Parametri per nano LC. (A) Pendenza della pompa di carico. (B) Gradiente della pompa NC. (C) Proprietà della sorgente ionica. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Parametri per MS/MS. (A) Proprietà di scansione completa. (B) Proprietà MIPS. (C) Proprietà dell'intensità. (D) Proprietà dello stato di carica. (E) Esclusione dinamica. (F) Proprietà di scansione MS2 dipendenti dai dati. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 3: Tabella riassuntiva rappresentativa degli HCP identificati associati agli anticorpi monoclonali NIST analizzati dal software Proteome Discoverer. La tabella include informazioni quali il numero di adesione, il nome dell'HCP, la specie, la percentuale di copertura, il numero di corrispondenze dello spettro peptidico (PSM), il numero di peptidi unici, il peso molecolare, il punto isoelettrico previsto (pI), il punteggio Mascot, il punteggio Sequest HT e il numero di peptidi identificati da Mascot e Sequest HT. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Tabella supplementare 1: Elenco delle abbreviazioni utilizzate. Clicca qui per scaricare questa tabella.

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Discussion

Esistono due versioni di perle di arricchimento proteico disponibili in commercio: una con una capacità inferiore e l'altra con una capacità maggiore (vedi Tabella dei materiali). Entrambe le versioni delle perle di arricchimento contengono dieci preparazioni nella confezione. Le istruzioni del produttore suggeriscono che ogni preparazione del kit di piccola capacità può essere utilizzata per arricchire 10 mg di proteine totali. Tuttavia, per prestazioni ottimali dell'arricchimento di proteine della cellula ospite (HCP) da DS, ogni preparazione è buona per cinque campioni di DS. Pertanto, ogni kit può essere utilizzato per arricchire gli HCP a partire da cinquanta campioni. Per ogni preparazione del kit di grande capacità, è utile per l'arricchimento di HCP da venticinque campioni DS, consentendo la rilevazione di HCP da un totale di duecentocinquanta campioni.

Il passaggio 3.1 sconsiglia di scartare i tappi superiore o inferiore, poiché verranno riutilizzati durante l'intero protocollo. Se le perle si depositano nel tappo superiore, sostituirle dopo aver rimosso il tappo inferiore e centrifugato mantenendo il tappo superiore sulla colonna. Per utilizzare il tappo inferiore come tappo, capovolgerlo e posizionarlo saldamente nella parte inferiore della colonna di rotazione.

Una fase critica della procedura è la fase 4.1, in cui il liquame di microsfere si deposita sul fondo della provetta. Pertanto, è fondamentale mantenere il pipettaggio continuo su e giù durante il trasferimento del liquame nei campioni di anticorpi monoclonali (mAb). Un'altra fase critica è la fase 4.6, in cui è essenziale pipettare il liquame dieci volte all'interno del puntale mentre le microsfere sono sature di tampone di eluizione. La durata della centrifugazione nelle fasi 4.3-4.5, 4.7 e 4.10 può variare a seconda della quantità di proteine accumulate nella cellula ospite (HCP). Pertanto, è fondamentale controllare e assicurarsi che i liquidi nella punta siano stati correttamente centrifugati prima di procedere alla fase successiva. Anche in questo caso, quando si inizia con una quantità iniziale di 15 mg di prodotto anticorpale-farmaco, è possibile eluire circa 30 μg di anticorpi e proteine arricchite della cellula ospite (HCP). Per ottenere un rapporto proteine-enzimi di 400:1 per una digestione limitata, sono stati aggiunti 75 ng di tripsina. Quando si utilizza una quantità inferiore di materiale in ingresso, è necessario misurare la concentrazione del campione proteico eluito. Questa misurazione aiuta a regolare di conseguenza la quantità di tripsina che deve essere aggiunta. Il passaggio 4.9 mostra un precipitato bianco dopo l'aggiunta del TFA al 10%. Per evitare qualsiasi interferenza dei tensioattivi con il segnale MS, è fondamentale controllare il pH dopo l'aggiunta di acido trifluoroacetico (TFA) per garantire la completa rimozione del detergente dal surnatante.

Dopo l'essiccazione e la risospensione dell'eluente in acqua, è necessario eseguire una misurazione UV della miscela peptidica. Questa misurazione è fondamentale perché la quantità di peptidi caricati sulla colonna può influenzare il rilevamento mediante MS. Dopo la valutazione, è stato riscontrato che circa 1 μg della miscela peptidica ha mostrato le migliori prestazioni nella SM. Di conseguenza, questa quantità ottimale deve essere iniettata in nano LC-MS/MS per ulteriori analisi.

L'approccio PMLD offre diversi vantaggi nella preparazione dei campioni, tra cui una sufficiente riduzione della DS degli anticorpi monoclonali (mAb) preservando la maggior parte delle proteine delle cellule ospiti (HCP) a bassa abbondanza. A differenza dell'immunoprecipitazione (IP), questa tecnica non si basa sugli anticorpi anti-HCP, eliminando così il bias associato agli anticorpi predefiniti e riducendo il lavoro e il tempo necessari per la produzione di anticorpi anti-HCP. Inoltre, a differenza dei metodi di filtrazione basati sul cut-off del peso molecolare17, il PMLD arricchisce gli HCP indipendentemente dalle loro dimensioni. Può essere applicato per arricchire gli HCP da vari moduli farmacologici, come anticorpi, proteine di fusione, ScFv e altro, rendendolo un approccio versatile rispetto ai metodi di delezione della proteina A21.

Oltre a questi vantaggi, il PMLD presenta un limite di rilevamento inferiore e consente il rilevamento di un numero maggiore di HCP da NISTmAb, uno standard di riferimento ampiamente caratterizzato, rispetto ad altri metodi. Tuttavia, vale la pena notare che il PMLD richiede apparecchiature fatte in casa, il che ne limita l'applicazione per l'automazione. Per ampliarne l'usabilità, è possibile sostituire alcune apparecchiature, come la punta con fritta, con alternative disponibili in commercio. Inoltre, l'esecuzione della desalinizzazione su piastre a 96 pozzetti può consentire una maggiore produttività utilizzando questo approccio. Esplorare l'automazione o la semi-automazione in esperimenti futuri può essere un passo logico successivo per espandere l'applicazione più ampia della PMLD.

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Disclosures

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.

Acknowledgments

Nessuno.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16 G, Metal Hub Needle, 2 in, point style 3 Hamilton 91016
Acclaim PepMap 100 C18 trap column (20 cm × 0.075 mm) Thermo Fisher 164535
Acetonitrile Fisher-Scientific A955
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade  Fisher-Scientific LS120-4
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit Millipore Sigma UFC5010
C18 analytical column (0.075 mm × 1.7 μm × 30 cm, 100 Å) CoAnn Technologies HEB07503001718I
Centrifuge 5424 Eppendorf 5405000646
Dithiothreitol (DTT)  Thermo Fisher A39255
Frit for SPE cartridges, 9.5 mm, 3 mL, 100/pk Agilent 12131020
GL-Tip GC GL Sciences Inc   7820-11201
in-house mAb Regeneron concentration 200 mg/mL
Iodoacetamide (30 x 9.3 mg) Thermo Fisher A39271
Isopropanol Fisher-Scientific 149320025
L-Histidine Sigma Aldrich H6034
L-Histidine monohydrochloride monohydrate Sigma Aldrich 53370
Methanol Fisher-Scientific A456-4 
Milli-Q Millpore 30035
NanoDrop 2000 Thermo Scientific ND-2000
Orbitrap Exploris 480 Thermo Fisher BRE725539
Protein LoBind Tube 0.5 mL Eppendorf (VWR) 22431064
Protein LoBind Tube 2.0 mL Eppendorf (VWR) 22431102
Proteome Discoverer software 2.4 Thermo Scientific
ProteoMiner Protein Enrichment Large-Capacity Kit Bio-Rad 1633007
ProteoMiner Protein Enrichment Small-Capacity Kit Bio-Rad 1633006
Sodium deoxycholate (SDC) Sigma Aldrich D6750
Sodium lauroyl sarcosinate (SLS)  Sigma Aldrich L5777
SpeedVac Labconco 7970010
Thermomixer R Eppendorf 22670107
Trifluoracetic acid (TFA) Fisher-Scientific 28904
Trypsin (Sequencing Grade Modified)  (5 x 20 ug) Promega V5111
Tube Revolver Rotator Thermo Fisher 88881001
UltiMate 3000 RSLC nano system Thermo Fisher ULTIM3000RSLCNANO
UltraPure 1 M Tris-HCl pH 8.0 Thermo Fisher 15568-025
Vortex Genie 2 VWR 102091-234
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade  Fisher-Scientific LS118-4 

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References

  1. Aboulaich, N. A novel approach to monitor clearance of host cell proteins associated with monoclonal antibodies. Biotechnology Progress. 30 (5), 1114-1124 (2014).
  2. Goey, C. H., Alhuthali, S., Kontoravdi, C. Host cell protein removal from biopharmaceutical preparations: Towards the implementation of quality by design. Biotechnology Advances. 36 (4), 1223-1237 (2018).
  3. Levy, N. E., Valente, K. N., Choe, L. H., Lee, K. H., Lenhoff, A. M. Identification and characterization of host cell protein product-associated impurities in monoclonal antibody bioprocessing. Biotechnology and Bioengineering. 111 (5), 904-912 (2014).
  4. Molden, R. Host cell protein profiling of commercial therapeutic protein drugs as a benchmark for monoclonal antibody-based therapeutic protein development. MAbs. 13 (1), 1955811 (2021).
  5. Bee, J. S. Trace levels of the CHO host cell protease cathepsin D caused particle formation in a monoclonal antibody product. Biotechnology Progress. 31 (5), 1360-1369 (2015).
  6. Bracewell, D. G., Francis, R., Smales, C. M. The future of host cell protein (HCP) identification during process development and manufacturing linked to a risk-based management for their control. Biotechnology and Bioengineering. 112 (9), 1727-1737 (2015).
  7. Chiu, J., et al. Knockout of a difficult-to-remove CHO host cell protein, lipoprotein lipase, for improved polysorbate stability in monoclonal antibody formulations. Biotechnology and Bioengineering. 114 (5), 1006-1015 (2017).
  8. Gilgunn, S., et al. Identification and tracking of problematic host cell proteins removed by a synthetic, highly functionalized nonwoven media in downstream bioprocessing of monoclonal antibodies. Journal of Chromatography A. 1595, 28-38 (2019).
  9. Graf, T. Identification and characterization of polysorbate-degrading enzymes in a monoclonal antibody formulation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (11), 3558-3567 (2021).
  10. Hall, T., Sandefur, S. L., Frye, C. C., Tuley, T. L., Huang, L. Polysorbates 20 and 80 degradation by group XV lysosomal phospholipase A2 isomer X1 in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 105 (5), 1633-1642 (2016).
  11. Jones, M. 34;High-risk" host cell proteins (HCPs): A multi-company collaborative view. Biotechnology and Bioengineering. 118 (8), 2870-2885 (2021).
  12. Li, X., et al. Identification and characterization of a residual host cell protein hexosaminidase B associated with N-glycan degradation during the stability study of a therapeutic recombinant monoclonal antibody product. Biotechnology Progress. 37 (3), e3128 (2021).
  13. Zhang, S. Identification of the specific causes of polysorbate 20 degradation in monoclonal antibody formulations containing multiple lipases. Pharmaceutical Research. 39 (1), 75-87 (2022).
  14. Zhang, S., Xiao, H., Li, N. Degradation of polysorbate 20 by Sialate O-Acetylesterase in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (12), 3866-3873 (2021).
  15. Zhang, S., Xiao, H., Molden, R., Qiu, H., Li, N. Rapid polysorbate 80 degradation by liver carboxylesterase in a monoclonal antibody formulated drug substance at early stage development. Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (11), 3300-3307 (2020).
  16. Gunawan, F. Comparison of platform host cell protein ELISA to process-specific host cell protein ELISA. Biotechnology and Bioengineering. 115 (2), 382-389 (2018).
  17. Chen, I. H., Xiao, H., Daly, T., Li, N. Improved host cell protein analysis in monoclonal antibody products through molecular weight cutoff enrichment. Analytical Chemistry. 92 (5), 3751-3757 (2020).
  18. Chen, I. H., Xiao, H., Li, N. Improved host cell protein analysis in monoclonal antibody products through ProteoMiner. Analytical Biochemistry. 610, 113972 (2020).
  19. Doneanu, C. E., et al. Enhanced detection of low-abundance host cell protein impurities in high-purity monoclonal antibodies down to 1 ppm using ion mobility mass spectrometry coupled with multidimensional liquid chromatography. Analytical Chemistry. 87 (20), 10283-10291 (2015).
  20. Huang, L., et al. A Novel sample preparation for shotgun proteomics characterization of HCPs in antibodies. Analytical Chemistry. 89 (10), 5436-5444 (2017).
  21. Johnson, R. O., Greer, T., Cejkov, M., Zheng, X., Li, N. Combination of FAIMS, Protein A depletion, and native digest conditions enables deep proteomic profiling of host cell proteins in monoclonal antibodies. Analytical Chemistry. 92 (15), 10478-10484 (2020).
  22. Kreimer, S. Host cell protein profiling by targeted and untargeted analysis of data independent acquisition mass spectrometry data with parallel reaction monitoring verification. Analytical Chemistry. 89 (10), 5294-5302 (2017).
  23. Madsen, J. A., et al. Toward the complete characterization of host cell proteins in biotherapeutics via affinity depletions, LC-MS/MS, and multivariate analysis. MAbs. 7 (6), 1128-1137 (2015).
  24. Nie, S. Simple and sensitive method for deep profiling of host cell proteins in therapeutic antibodies by combining ultra-low trypsin concentration digestion, long chromatographic gradients, and boxcar mass spectrometry acquisition. Analytical Chemistry. 93 (10), 4383-4390 (2021).
  25. Yang, F. Versatile LC-MS-Based workflow with robust 0.1 ppm sensitivity for identifying residual HCPs in biotherapeutic products. Analytical Chemistry. 94 (2), 723-731 (2022).
  26. Zhang, Q. Comprehensive tracking of host cell proteins during monoclonal antibody purifications using mass spectrometry. MAbs. 6 (3), 659-670 (2014).
  27. Zhang, S., et al. Putative phospholipase B-Like 2 is not responsible for polysorbate degradation in monoclonal antibody drug products. Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (9), 2710-2718 (2020).
  28. Zhang, J., He, J., Smith, K. J. Fatty acids can induce the formation of proteinaceous particles in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 111 (3), 655-662 (2022).
  29. Uniprot1. , https://www.uniprot.org/uniprotkb?query=mus%2Bmusculus (2023).
  30. Uniprot2. , https://www.uniprot.org/uniprotkb (2023).

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Zhang, S., Xiao, H., Li, N. Host… More

Zhang, S., Xiao, H., Li, N. Host Cell Protein Analysis using Enrichment Beads Coupled with Limited Digestion. J. Vis. Exp. (203), e65544, doi:10.3791/65544 (2024).

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