Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Análise de Proteína de Células Hospedeiras usando Contas de Enriquecimento Acopladas a Digestão Limitada

Published: January 19, 2024 doi: 10.3791/65544
Automatic Translation
1, 1, 1
1Analytical Chemistry, Regeneron Pharmaceuticals Inc.

Summary

Um protocolo é apresentado para o enriquecimento de proteínas da célula hospedeira (HCPs) a partir de produtos farmacêuticos (PD) e detecção de peptídeos usando esferas de enriquecimento de proteoma. O método é demonstrado usando uma substância medicamentosa (MD) de anticorpos monoclonais (mAb) fabricada internamente, que é um material de referência bem caracterizado para avaliar e comparar diferentes métodos em termos de desempenho.

Abstract

As proteínas da célula hospedeira (HCPs) são impurezas que podem afetar adversamente as proteínas terapêuticas, mesmo em pequenas quantidades. Para avaliar os riscos potenciais associados aos medicamentos, métodos têm sido desenvolvidos para identificar PCH de baixa abundância. Uma abordagem crucial para o desenvolvimento de um método sensível de detecção de HCP envolve o enriquecimento de HCPs e, simultaneamente, a remoção de anticorpos monoclonais (mAbs) antes da análise, utilizando cromatografia líquida-espectrometria de massas (LC-MS).

Este protocolo oferece instruções detalhadas para o enriquecimento de proteínas da célula hospedeira usando esferas de enriquecimento de proteoma comercialmente disponíveis. Essas esferas contêm uma biblioteca diversificada de ligantes hexapeptídicos com afinidades específicas para diferentes proteínas. O protocolo também incorpora digestão limitada e subsequente detecção de peptídeos usando nano LC-MS/MS. Ao empregar essas técnicas, HCPs com baixa abundância podem ser enriquecidos mais de 7000 vezes, resultando em um limite de detecção impressionante tão baixo quanto 0,002 ppm. Significativamente, este protocolo permite a detecção de 850 HCPs com um alto nível de confiança usando um mAb do NIST. Além disso, ele foi projetado para ser fácil de usar e inclui uma demonstração em vídeo para ajudar na sua implementação. Ao seguir essas etapas, os pesquisadores podem efetivamente enriquecer e detectar PCHs, aumentando a sensibilidade e a precisão da avaliação de risco para produtos farmacêuticos.

Introduction

As proteínas da célula hospedeira (PCH) são impurezas liberadas da cultura celular do organismo hospedeiro e copurificadas com anticorpo monoclonal (mAb)1,2,3,4. Níveis traço de PID podem afetar negativamente a qualidade do medicamento 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 e, portanto, um método de análise sensível de PID é desejado para detectar PID em níveis sub-ppm a ppm.

Métodos ortogonais podem ser aplicados para detectar PCH em baixa abundância. O ensaio imunoenzimático (ELISA) é geralmente usado para quantificar HCPs globais, e também pode detectar e quantificar HCPs individuais se os anticorpos correspondentes estiverem disponíveis16. No entanto, a produção de anticorpos específicos para o HCP é demorada e trabalhosa. Em contraste, a cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS) pode fornecer informações abrangentes sobre PCH individuais em medicamentos mAb e é amplamente aplicada para identificação de PCH 4,7,9,10,12,13,14,15,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,27.

Vários métodos têm sido desenvolvidos para detectar PCH com LC-MS/MS, incluindo digestão limitada20, filtração17, deleção da proteína A21, imunoprecipitação (IP) e enriquecimento com ProteoMiner (PM)18. A maioria dos métodos visa reduzir a quantidade de mAb e enriquecer HCPs antes da análise de LC-MS/MS, diminuindo assim a faixa dinâmica entre peptídeos mAb e peptídeos HCP. Este protocolo apresenta um método de enriquecimento proteômico de amostras que combina a tecnologia ProteoMiner e digestão limitada (PMLD)28. O princípio de enriquecimento do ProteoMiner envolve o uso de esferas de enriquecimento de proteoma comercialmente disponíveis contendo uma biblioteca diversificada de ligantes peptídicos combinatórios. Esses ligantes ligam-se especificamente a proteínas em produtos anticorpos-fármacos, permitindo a remoção de moléculas em excesso enquanto concentram proteínas de baixa abundância de células hospedeiras (HCPs) em seus respectivos ligantes de afinidade. Por outro lado, o princípio da digestão limitada envolve o uso de uma baixa concentração de tripsina. Esta concentração é suficiente para digerir HCPs de baixa abundância, mas não suficiente para digerir todos os produtos de drogas de anticorpos. Esta abordagem permite a recuperação e o enriquecimento de peptídeos HCP digeridos da solução.

Comparada aos métodos de filtração, a técnica de DLPM não é limitada pelo tamanho dos PID detectados17. Os métodos de deleção da proteína A são específicos para detectar HCPs associados a anticorpos21, enquanto a imunoprecipitação é restrita a HCPs predefinidos de uma linhagem celular particular (como a linhagem celular Chinese Hamster Ovary (CHO)), onde um anticorpo anti-HCP foi gerado4. Em contraste, PMLD pode ser aplicado para detectar HCPs de qualquer módulo de drogas e proteínas da célula hospedeira co-purificadas com produtos de drogas de várias linhagens celulares. Além disso, a DLPM apresenta melhor sensibilidade em relação aos métodos citados 17,18,20,21,24.

Essa abordagem pode enriquecer a concentração de HCP em 7000 vezes e reduzir o limite de detecção para 0,002 ppm28. O arranjo experimental está ilustrado na Figura 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

As abreviaturas utilizadas no protocolo estão listadas na Tabela Suplementar 1.

1. Preparação de soluções e tampões

NOTA: Os detalhes comerciais de todos os reagentes estão listados na Tabela de Materiais.

  1. Preparar 0,1 M Tris-HCl, solução de pH 8,0 adicionando 1 mL de 1 M Tris-HCl, pH 8,0 em 9 mL de água deionizada em um frasco para injetáveis de vidro e misturar bem por vórtice. Conservar a 4 °C até 3 meses.
  2. Preparar 24 mM de desoxicolato de sódio (SDC) dissolvendo 10 mg de SDC em 1 mL de Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0.
  3. Preparar 24 mM de lauroyl sarcosinato de sódio (SLS) dissolvendo 7 mg de SLS em 1 mL de Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0.
  4. Prepare o buffer de eluição misturando 24 mM SDC e 24 mM SLS em uma proporção de 1:1 (v/v).
  5. Preparar 50 ng/μL de solução de tripsina adicionando 400 μL de água deionizada em 20 μg de tripsina.
  6. Preparar 25 mg/ml de ditiotreitol (TDT) adicionando 308 μL de Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0, em 7,7 mg de TDT.
  7. Preparar iodoacetamida (IAM) 0,25 M adicionando 1,2 ml de Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0, em 56 mg de IAM.
  8. Preparar 10% de TFA adicionando 1 mL de ácido trifluoroacético (TFA) em 9 mL de água deionizada. Vórtice por 4 s e gire para baixo. Conservar a 4 °C até 3 meses.
  9. Preparar o tampão A adicionando 1 mL de TFA a 10% em 99 mL de água deionizada.
  10. Preparar o tampão B adicionando 1 mL de TFA a 10% e 49 mL de água deionizada em 50 mL de acetonitrila (ACN).
  11. Preparar tampão de histidina 10 mM adicionando 37 mg de L-histidina e 54,8 mg de monocloridrato de L-histidina monohidratado em 50 ml de água.

2. Preparação de soluções de anticorpos monoclonais (mAb)

  1. Para medicamentos com concentrações acima de 50 mg/mL, diluir 15 mg do anticorpo monoclonal (mAb) (ver Tabela de Materiais) com água deionizada em um tubo de microcentrífuga de 2 mL, resultando em um volume total de 300 μL e pH final de ~6. Se necessário, ajuste o pH usando ácido acético ou Tris-HCl.
  2. Para medicamentos com concentrações inferiores a 50 mg/ml, efectuar a troca de tampão seguindo os passos 2.2.1 a 2.2.5.
    1. Transferir 20 mg de cada amostra para um dispositivo de filtro centrífugo de 10k (ver Tabela de Materiais) e centrifugar a 14.000 x g durante 25 minutos (à temperatura ambiente, RT) até restar aproximadamente 100 μL de volume.
    2. Adicionar 350 μL de histidina 10 mM (ver Tabela de Materiais), tampão pH 6,0 no filtro, vórtice e centrífuga a 14.000 x g por 25 minutos no RT. Repita uma vez.
    3. Inverter o filtro e colocá-lo no tubo de coleta de amostras e, em seguida, centrifugar as amostras a 1000 x g por 5 min no RT para recuperar todo o volume no tubo de coleta. Lavar o filtro com 200 μLof 10 mM tampão de histidina e pipetar para cima e para baixo para recuperar quaisquer amostras de proteína restantes. Transfira toda a solução para o mesmo tubo de coleta, vórtice e gire para baixo.
    4. Meça a concentração da amostra por NanoDrop. Ajustar a concentração de cada amostra de proteína para 50 mg/mL adicionando o tampão Histidina antes da incubação com esferas de enriquecimento.
    5. Transferir 300 μL da amostra para um tubo de microcentrífuga de 2 mL.

3. Preparação de esferas de enriquecimento de proteoma

  1. Remova a tampa superior e inferior de cada coluna de rotação obtida do kit comercial de enriquecimento de proteínas (ver Tabela de Materiais). Não descarte as tampas, pois elas serão usadas posteriormente.
  2. Pegue a coluna de spin e posicione-a em um tubo de microcentrífuga de 2 mL sem tampa. Centrifugar o setup à temperatura ambiente e 1.000 x g por 30-60 s em RT para eliminar a solução de armazenamento. Descarte o material coletado durante essa etapa.
  3. Adicione 200 μL de tampão de lavagem às esferas de enriquecimento disponíveis comercialmente (ver Tabela de Materiais) e pipete para cima e para baixo várias vezes. Coloque a coluna de spin em um tubo de microcentrífuga de 2 mL e centrífuga a 1.000 x g por 30-60 s em TR para remover o tampão. Descarte o material coletado.
    NOTA: O tampão de lavagem está incluído no kit comercial de enriquecimento de proteínas.
  4. Repita as etapas 3.3 duas vezes.
  5. Substitua a tampa inferior e adicione 200 μL de água e, em seguida, substitua a tampa superior.

4. Enriquecimento de proteínas

  1. Pipetar para cima e para baixo o chorume (a partir do passo 3.5) e transferir 40 μL de chorume para a amostra preparada no passo 2. Incubar e girar o tubo à temperatura ambiente durante 2 horas.
  2. Faça uma ponta com frita (ver Tabela de Materiais) usando a agulha de 16 G para obter o tamanho adequado da frita e, em seguida, insira-a na extremidade da ponta da ponta de 200 μL.
  3. Transfira a amostra com contas para a ponta preparada no passo 4.2. Centrifugar a ponta com 2 mL de tubo de microcentrífuga a 200 x g por 3 min na RT para remover a solução.
  4. Lave as contas adicionando 200 μL de tampão de lavagem à ponta e centrifugue a ponta com um tubo de microcentrífuga de 2 mL a 200 x g por 2 min em RT para remover a solução de lavagem. Repita a etapa duas vezes.
  5. Lave as contas adicionando 200 μL de água à ponta e centrifugar a ponta com um tubo de microcentrífuga de 2 mL a 200 x g por 2 min em RT para remover a água.
  6. Eluir proteínas de contas adicionando 10 μL de tampão de eluição (passo 1.4) na ponta e pipetar a pasta dez vezes na ponta para garantir que as contas estejam embebidas com tampão de eluição .
  7. Centrifugar a ponta com um novo tubo de microcentrífuga de 0,5 mL a 200 x g por 30 s no TR para coletar o eluente. Repita os passos 4.6-4.7 duas vezes e combine toda a eluição em um tubo de microcentrífuga de 0,5 mL.
  8. Adicionar 1,5 μL de solução de tripsina (passo 1.5) no eluente para digestão durante a noite a 28 °C. Adicionar 1,5 μL de 25 mg/ml de TDT (passo 1.6) e aquecer a amostra a 90 °C durante 20 minutos.
  9. Adicionar 1,5 μL de IAM 0,25 M (passo 1.7) e incubar à temperatura ambiente no escuro durante 20 min. Adicionar 3,5 μL de TFA a 10% (passo 1,8), vórtice durante 2 minutos e assegurar que o pH esteja em ~2-3.
  10. Centrifugar a 14.400 × g por 10 min em RT para precipitar SDC e SLS. Recolher o sobrenadante para dessalinização.
  11. Execute o dessalinização seguindo as etapas abaixo.
    1. Adicionar 50 μL de tampão B (passo 1.10) à ponta de dessalinização GC (ver Tabela de Materiais). Centrifugar a ponta com um suporte a 1000 x g por 3 min no RT. Descarte o material coletado.
    2. Adicionar 50 μL de tampão A (passo 1.9) à ponta. Centrifugar a ponta com um suporte a 1000 x g por 3 min no RT. Descarte o material coletado.
    3. Adicione a amostra acificada à ponta. Centrifugar a ponta com um suporte a 500 x g por 6 min no RT. Descarte o material coletado.
    4. Lave a ponta adicionando 50 μL de tampão A à ponta. Centrifugar a ponta com o suporte a 500 x g por 3 min no RT. Descarte o material coletado. Repita uma vez.
    5. Eluir o peptídeo da ponta adicionando 50 μL de tampão B à ponta de dessalinização GC. Centrifugar a ponta com um tubo novo a 500 x g por 3 min no RT. Recolher o material. Repita o passo uma vez e combine o eluente.
    6. Secar o eluente com um concentrador a vácuo (ver Tabela de Materiais).
  12. Ressuspender o eluente seco em 30 μL de solução de ácido fórmico (AG) a 0,1%.
  13. Medir o UV de misturas de peptídeos a 214 nm por um espectrofotômetro (ver Tabela de Materiais). A concentração das misturas peptídicas deve variar entre 0,1 e 0,5 mg/mL.
  14. Transfira 10 μL de cada amostra digerida para um frasco para injetáveis de amostra LC e, em seguida, injete 1 μg de cada amostra digerida em nano LC-MS/MS (ver Tabela de Materiais). Execute a análise seguindo a etapa 5. Conservar o resto das amostras digeridas num congelador a -80 °C.

5. Análise Nano LC-MS/MS

  1. Injetar a mistura peptídica em um sistema nano-LC acoplado a um espectrômetro de massa. Carregar as misturas de péptidos (~1 μg) numa coluna de armadilha C18 com o gradiente fornecido no quadro 1A para dessalinização e, em seguida, numa coluna analítica C18 a 40 °C para separação.
    NOTA: O tampão da fase A móvel consistiu de 0,1% de AG em água ultrapura, e a fase móvel B consistiu de 0,1% de AG em 80% de ACN.
  2. Separe os peptídeos e elua com o gradiente fornecido na Tabela 1B com fluxo de 250 nL/min.
    NOTA: O espectrômetro de massas foi operado em modo dependente de dados (DDA) com um tempo de ciclo de 3 s. Os íons sofreram fragmentação através da dissociação colisional de maior energia (HCD) com uma energia de colisão normalizada de 30% para cada exame completo de EM. Os exames foram realizados com resolução de 60.000, com meta de controle automático de ganho (AGC) de 3e6, tempo máximo de injeção de 20 ms e faixa m/z de 380-1600. Os eventos MS/MS foram conduzidos com resolução de 15.000, com meta de AGC de 1e5, tempo máximo de injeção de 60 ms e intervalo m/z de 200-2000. A duração da exclusão foi fixada em 45 s. As propriedades da fonte iônica são fornecidas na Tabela 1C, e os parâmetros específicos de espectrometria de massa podem ser encontrados na Tabela 2A-F.

6. Análise dos dados

  1. Realizar uma pesquisa dos arquivos brutos de espectrometria de massa NISTmAb no banco de dados UniProt mus+musculus29. Além disso, pesquise os arquivos brutos de espectrometria de massa mAb DS spiked-in da proteína recombinante no banco de dados UniProt Cricetulus Griseus30.
    NOTA: Essas buscas foram realizadas no software Proteome Discoverer (ver Tabela de Materiais) usando os mecanismos de busca Sequest HT e Mascot. As bases de dados utilizadas estavam livres de entradas redundantes.
  2. Para as pesquisas por espectrometria de massa, aplique uma tolerância de massa de 10 ppm e defina a tolerância de massa do fragmento para 0,02 Da.
    NOTA: Os critérios de busca abrangeram carbamidometilação estática de resíduos de cisteína (+57,0214 Da) e modificação variável da oxidação (+15,9949 Da) sobre resíduos de metionina. Adicionalmente, uma modificação da variável desaminação (+0,984 Da) foi aplicada.
  3. Realizar a busca no banco de dados usando digestão de tripsina, permitindo um máximo de duas clivagens perdidas. Defina as taxas de descoberta falsa para proteínas e peptídeos em 0,01.
    NOTA: Para identificar positivamente as proteínas da célula hospedeira (HCPs), um requisito mínimo de pelo menos dois peptídeos únicos foi aplicado. A Tabela 3 fornece o resumo representativo dos PIDs identificados associados ao MAB do NIST analisados pelo software Proteome Discoverer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Este protocolo apresentou um fluxo de trabalho de preparação de amostras, denominado enriquecimento proteico acoplado à digestão limitada (PMLD), para a análise de proteínas da célula hospedeira (HCPs) em uma amostra de anticorpo monoclonal (mAb). A Figura 1 ilustra o passo a passo do PMLD. Os pesquisadores compararam os resultados da análise de HCP usando digestão direta (mostrada no painel superior da Figura 2) e PMLD (mostrada no painel inferior da Figura 2). Os perfis de Cromatograma de Íons Totais (TIC) indicaram que o PMLD reduziu ou eliminou significativamente os principais peptídeos mAb, permitindo a observação de alguns peptídeos HCP comparáveis aos peptídeos mAb. Parâmetros detalhados para análises de nano LC (Tabela 1) e MS/MS (Tabela 2) são fornecidos. Além disso, a Tabela 3 exibe um resumo dos PCH identificados associados ao mAb do NIST, incluindo informações como número de acesso, nome do PCH, espécie, porcentagem de cobertura, PSMs, peptídeos únicos, peso molecular, ponto isoelétrico esperado (pI), escore do mascote, escore Sequest HT e o número de peptídeos identificados pelo Mascote e Sequest HT.

Figure 1
Figura 1: Fluxo de trabalho de preparação da amostra de enriquecimento de proteínas acoplado à digestão limitada (PMLD). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Perfil do Cromatograma de Íons Totais (TIC) para análise do HCP do mAb do NIST. Painel superior: Perfil de TIC para análise de HCP de mAb NIST usando digestão direta. Painel inferior: Perfil de TIC para análise de HCP de mAb NIST usando PMLD. É evidente pelo perfil de TIC que, em comparação com a digestão direta, a maioria dos principais peptídeos mAb foi reduzida ou eliminada após PMLD, enquanto alguns peptídeos pertencentes a HCPs podem ser observados e são comparáveis aos peptídeos mAb. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Parâmetros para nano LC. (A) Gradiente da bomba de carga. (B) Gradiente da bomba NC. (C) Propriedades da fonte de íons. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 2: Parâmetros para MS/MS. (A) Propriedades de varredura completa. (B) Propriedades MIPS. (C) Propriedades de intensidade. (D) Cobrar propriedades do Estado. (E) Exclusão dinâmica. (F) Propriedades de verificação MS2 dependentes de dados. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 3: Tabela resumo representativa dos PID identificados associados ao NIST mAb analisados pelo software Proteome Discoverer. A tabela inclui informações como o número de acesso, nome do HCP, espécie, porcentagem de cobertura, número de correspondências do espectro peptídico (PSMs), número de peptídeos únicos, peso molecular, ponto isoelétrico esperado (pI), escore do mascote, escore Sequest HT e o número de peptídeos identificados pelo Mascote e Sequest HT. Clique aqui para baixar esta Tabela.

Quadro suplementar 1: Lista das abreviaturas utilizadas. Clique aqui para baixar esta tabela.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Existem duas versões de esferas de enriquecimento de proteínas disponíveis comercialmente: uma com menor capacidade e outra com maior capacidade (ver Tabela de Materiais). Ambas as versões das contas de enriquecimento contêm dez preparações no pacote. As instruções do fabricante sugerem que cada preparação do kit de pequena capacidade pode ser usada para enriquecer 10 mg de proteína total. No entanto, para um ótimo desempenho do enriquecimento da proteína da célula hospedeira (HCP) a partir da SD, cada preparação é boa para cinco amostras de DS. Portanto, cada kit pode ser usado para enriquecer HCPs a partir de cinquenta amostras. Para cada preparação do kit de grande capacidade, é bom para o enriquecimento de HCPs de vinte e cinco amostras de DS, permitindo a detecção de HCPs de um total de duzentas e cinquenta amostras.

O passo 3.1 desaconselha descartar as tampas superior ou inferior, pois elas serão reutilizadas durante todo o protocolo. Se as contas se acomodarem na tampa superior, substitua-as depois de remover o plugue inferior e centrifugar, mantendo a tampa superior na coluna. Para utilizar a tampa inferior como plugue, inverta-a e posicione-a com segurança na parte inferior da coluna de rotação.

Uma etapa crítica no procedimento é a etapa 4.1, onde a lama do talão se instala no fundo do tubo. Portanto, é crucial manter a pipetagem contínua para cima e para baixo durante a transferência da lama para as amostras de anticorpos monoclonais (mAb). Outra etapa crítica é a etapa 4.6, onde é essencial pipetar a lama dez vezes dentro da ponta enquanto as contas estão saturadas com tampão de eluição. A duração da centrifugação nas etapas 4.3-4.5, 4.7 e 4.10 pode variar dependendo da quantidade de proteínas acumuladas da célula hospedeira (HCPs). Portanto, é crucial verificar e garantir que os líquidos na ponta foram devidamente girados antes de prosseguir para a próxima etapa. Novamente, quando se inicia com uma quantidade inicial de 15 mg de anticorpo-fármaco, podem ser eluídos aproximadamente 30 μg de anticorpos e proteínas enriquecidas da célula hospedeira (PCHs). Para atingir uma relação proteína/enzima de 400:1 para digestão limitada, 75 ng de tripsina foram adicionados. Quando é utilizada uma quantidade menor de material de entrada, é necessário medir a concentração da amostra de proteína eluída. Esta medida ajuda a ajustar a quantidade de tripsina que deve ser adicionada de acordo. O passo 4.9 mostra um precipitado branco após a adição do TFA a 10%. Para evitar qualquer interferência dos surfactantes com o sinal MS, é crucial verificar o pH após a adição de ácido trifluoroacético (TFA) para garantir a remoção completa do detergente do sobrenadante.

Após a secagem e ressuspensão do eluente em água, é necessário realizar uma medição UV da mistura peptídica. Essa medida é crucial porque a quantidade de peptídeos carregados na coluna pode influenciar a detecção usando EM. Após avaliação, verificou-se que aproximadamente 1 μg da mistura peptídica apresentou o melhor desempenho na EM. Consequentemente, essa quantidade ideal precisa ser injetada em nano LC-MS/MS para análise posterior.

A abordagem PMLD oferece várias vantagens na preparação de amostras, incluindo redução suficiente de DS de anticorpos monoclonais (mAb), preservando a maioria das proteínas de células hospedeiras (HCPs) de baixa abundância. Ao contrário da imunoprecipitação (IP), essa técnica não depende de anticorpos anti-HCP, eliminando o viés associado aos anticorpos pré-definidos e reduzindo o trabalho de parto e o tempo necessários para a produção de anticorpos anti-HCP. Além disso, ao contrário dos métodos de filtração baseados no ponto de corte de peso molecular17, o PMLD enriquece os HCPs independentemente de seu tamanho. Pode ser aplicado para enriquecer HCPs de vários módulos de fármacos, como anticorpos, proteínas de fusão, ScFv e outros, tornando-se uma abordagem versátil em comparação com os métodos de deleção da proteína A21.

Além dessas vantagens, o PMLD apresenta um limite de detecção menor e permite a detecção de um maior número de PIH do NISTmAb, um padrão de referência amplamente caracterizado, em comparação com outros métodos. No entanto, vale ressaltar que o PMLD necessita de equipamentos caseiros, o que limita sua aplicação para automação. Para ampliar sua usabilidade, é possível substituir determinados equipamentos, como a ponta por frita, por alternativas disponíveis comercialmente. Além disso, a realização de dessalinização em placas de 96 poços pode permitir maior rendimento usando essa abordagem. Explorar a automação ou semi-automação em experimentos futuros pode ser um próximo passo lógico para expandir a aplicação mais ampla do PMLD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Nenhum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16 G, Metal Hub Needle, 2 in, point style 3 Hamilton 91016
Acclaim PepMap 100 C18 trap column (20 cm × 0.075 mm) Thermo Fisher 164535
Acetonitrile Fisher-Scientific A955
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade  Fisher-Scientific LS120-4
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit Millipore Sigma UFC5010
C18 analytical column (0.075 mm × 1.7 μm × 30 cm, 100 Å) CoAnn Technologies HEB07503001718I
Centrifuge 5424 Eppendorf 5405000646
Dithiothreitol (DTT)  Thermo Fisher A39255
Frit for SPE cartridges, 9.5 mm, 3 mL, 100/pk Agilent 12131020
GL-Tip GC GL Sciences Inc   7820-11201
in-house mAb Regeneron concentration 200 mg/mL
Iodoacetamide (30 x 9.3 mg) Thermo Fisher A39271
Isopropanol Fisher-Scientific 149320025
L-Histidine Sigma Aldrich H6034
L-Histidine monohydrochloride monohydrate Sigma Aldrich 53370
Methanol Fisher-Scientific A456-4 
Milli-Q Millpore 30035
NanoDrop 2000 Thermo Scientific ND-2000
Orbitrap Exploris 480 Thermo Fisher BRE725539
Protein LoBind Tube 0.5 mL Eppendorf (VWR) 22431064
Protein LoBind Tube 2.0 mL Eppendorf (VWR) 22431102
Proteome Discoverer software 2.4 Thermo Scientific
ProteoMiner Protein Enrichment Large-Capacity Kit Bio-Rad 1633007
ProteoMiner Protein Enrichment Small-Capacity Kit Bio-Rad 1633006
Sodium deoxycholate (SDC) Sigma Aldrich D6750
Sodium lauroyl sarcosinate (SLS)  Sigma Aldrich L5777
SpeedVac Labconco 7970010
Thermomixer R Eppendorf 22670107
Trifluoracetic acid (TFA) Fisher-Scientific 28904
Trypsin (Sequencing Grade Modified)  (5 x 20 ug) Promega V5111
Tube Revolver Rotator Thermo Fisher 88881001
UltiMate 3000 RSLC nano system Thermo Fisher ULTIM3000RSLCNANO
UltraPure 1 M Tris-HCl pH 8.0 Thermo Fisher 15568-025
Vortex Genie 2 VWR 102091-234
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade  Fisher-Scientific LS118-4 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aboulaich, N. A novel approach to monitor clearance of host cell proteins associated with monoclonal antibodies. Biotechnology Progress. 30 (5), 1114-1124 (2014).
  2. Goey, C. H., Alhuthali, S., Kontoravdi, C. Host cell protein removal from biopharmaceutical preparations: Towards the implementation of quality by design. Biotechnology Advances. 36 (4), 1223-1237 (2018).
  3. Levy, N. E., Valente, K. N., Choe, L. H., Lee, K. H., Lenhoff, A. M. Identification and characterization of host cell protein product-associated impurities in monoclonal antibody bioprocessing. Biotechnology and Bioengineering. 111 (5), 904-912 (2014).
  4. Molden, R. Host cell protein profiling of commercial therapeutic protein drugs as a benchmark for monoclonal antibody-based therapeutic protein development. MAbs. 13 (1), 1955811 (2021).
  5. Bee, J. S. Trace levels of the CHO host cell protease cathepsin D caused particle formation in a monoclonal antibody product. Biotechnology Progress. 31 (5), 1360-1369 (2015).
  6. Bracewell, D. G., Francis, R., Smales, C. M. The future of host cell protein (HCP) identification during process development and manufacturing linked to a risk-based management for their control. Biotechnology and Bioengineering. 112 (9), 1727-1737 (2015).
  7. Chiu, J., et al. Knockout of a difficult-to-remove CHO host cell protein, lipoprotein lipase, for improved polysorbate stability in monoclonal antibody formulations. Biotechnology and Bioengineering. 114 (5), 1006-1015 (2017).
  8. Gilgunn, S., et al. Identification and tracking of problematic host cell proteins removed by a synthetic, highly functionalized nonwoven media in downstream bioprocessing of monoclonal antibodies. Journal of Chromatography A. 1595, 28-38 (2019).
  9. Graf, T. Identification and characterization of polysorbate-degrading enzymes in a monoclonal antibody formulation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (11), 3558-3567 (2021).
  10. Hall, T., Sandefur, S. L., Frye, C. C., Tuley, T. L., Huang, L. Polysorbates 20 and 80 degradation by group XV lysosomal phospholipase A2 isomer X1 in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 105 (5), 1633-1642 (2016).
  11. Jones, M. 34;High-risk" host cell proteins (HCPs): A multi-company collaborative view. Biotechnology and Bioengineering. 118 (8), 2870-2885 (2021).
  12. Li, X., et al. Identification and characterization of a residual host cell protein hexosaminidase B associated with N-glycan degradation during the stability study of a therapeutic recombinant monoclonal antibody product. Biotechnology Progress. 37 (3), e3128 (2021).
  13. Zhang, S. Identification of the specific causes of polysorbate 20 degradation in monoclonal antibody formulations containing multiple lipases. Pharmaceutical Research. 39 (1), 75-87 (2022).
  14. Zhang, S., Xiao, H., Li, N. Degradation of polysorbate 20 by Sialate O-Acetylesterase in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (12), 3866-3873 (2021).
  15. Zhang, S., Xiao, H., Molden, R., Qiu, H., Li, N. Rapid polysorbate 80 degradation by liver carboxylesterase in a monoclonal antibody formulated drug substance at early stage development. Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (11), 3300-3307 (2020).
  16. Gunawan, F. Comparison of platform host cell protein ELISA to process-specific host cell protein ELISA. Biotechnology and Bioengineering. 115 (2), 382-389 (2018).
  17. Chen, I. H., Xiao, H., Daly, T., Li, N. Improved host cell protein analysis in monoclonal antibody products through molecular weight cutoff enrichment. Analytical Chemistry. 92 (5), 3751-3757 (2020).
  18. Chen, I. H., Xiao, H., Li, N. Improved host cell protein analysis in monoclonal antibody products through ProteoMiner. Analytical Biochemistry. 610, 113972 (2020).
  19. Doneanu, C. E., et al. Enhanced detection of low-abundance host cell protein impurities in high-purity monoclonal antibodies down to 1 ppm using ion mobility mass spectrometry coupled with multidimensional liquid chromatography. Analytical Chemistry. 87 (20), 10283-10291 (2015).
  20. Huang, L., et al. A Novel sample preparation for shotgun proteomics characterization of HCPs in antibodies. Analytical Chemistry. 89 (10), 5436-5444 (2017).
  21. Johnson, R. O., Greer, T., Cejkov, M., Zheng, X., Li, N. Combination of FAIMS, Protein A depletion, and native digest conditions enables deep proteomic profiling of host cell proteins in monoclonal antibodies. Analytical Chemistry. 92 (15), 10478-10484 (2020).
  22. Kreimer, S. Host cell protein profiling by targeted and untargeted analysis of data independent acquisition mass spectrometry data with parallel reaction monitoring verification. Analytical Chemistry. 89 (10), 5294-5302 (2017).
  23. Madsen, J. A., et al. Toward the complete characterization of host cell proteins in biotherapeutics via affinity depletions, LC-MS/MS, and multivariate analysis. MAbs. 7 (6), 1128-1137 (2015).
  24. Nie, S. Simple and sensitive method for deep profiling of host cell proteins in therapeutic antibodies by combining ultra-low trypsin concentration digestion, long chromatographic gradients, and boxcar mass spectrometry acquisition. Analytical Chemistry. 93 (10), 4383-4390 (2021).
  25. Yang, F. Versatile LC-MS-Based workflow with robust 0.1 ppm sensitivity for identifying residual HCPs in biotherapeutic products. Analytical Chemistry. 94 (2), 723-731 (2022).
  26. Zhang, Q. Comprehensive tracking of host cell proteins during monoclonal antibody purifications using mass spectrometry. MAbs. 6 (3), 659-670 (2014).
  27. Zhang, S., et al. Putative phospholipase B-Like 2 is not responsible for polysorbate degradation in monoclonal antibody drug products. Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (9), 2710-2718 (2020).
  28. Zhang, J., He, J., Smith, K. J. Fatty acids can induce the formation of proteinaceous particles in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 111 (3), 655-662 (2022).
  29. Uniprot1. , https://www.uniprot.org/uniprotkb?query=mus%2Bmusculus (2023).
  30. Uniprot2. , https://www.uniprot.org/uniprotkb (2023).

Tags

Este mês em JoVE Edição 203 Proteína da célula hospedeira LC-MS tecnologia ProteoMiner digestão limitada
Análise de Proteína de Células Hospedeiras usando Contas de Enriquecimento Acopladas a Digestão Limitada
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, S., Xiao, H., Li, N. Host… More

Zhang, S., Xiao, H., Li, N. Host Cell Protein Analysis using Enrichment Beads Coupled with Limited Digestion. J. Vis. Exp. (203), e65544, doi:10.3791/65544 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter