Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

تحريض إصابة القرنية والقلوية الداكنة حول القزحية باستخدام تقنية الثقب في نموذج الفأر

Published: August 4, 2023 doi: 10.3791/65609
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Department of Ophthalmology, Stanford University School of Medicine, 2McGill University Faculty of Medicine and Health Sciences

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة للحث على إصابة القرنية والقلويات الداكنة حول سطح دقيقة وقابلة للتكرار في نموذج الفأر. البروتوكول مفيد لأنه يسمح بإصابة موزعة بالتساوي لقرنية الفأر المنحنية للغاية والليمبوس.

Abstract

القرنية أمر بالغ الأهمية للرؤية ، وشفاء القرنية بعد الصدمة أمر أساسي في الحفاظ على شفافيتها ووظيفتها. من خلال دراسة نماذج إصابة القرنية ، يهدف الباحثون إلى تعزيز فهمهم لكيفية شفاء القرنية وتطوير استراتيجيات لمنع عتامة القرنية وإدارتها. الإصابة الكيميائية هي واحدة من نماذج الإصابة الأكثر شعبية التي تمت دراستها على نطاق واسع على الفئران. استخدم معظم الباحثين السابقين ورقة مسطحة مبللة بهيدروكسيد الصوديوم للحث على إصابة القرنية. ومع ذلك ، فإن إحداث إصابة القرنية والداكنة حول الأطراف باستخدام ورق الترشيح المسطح لا يمكن الاعتماد عليه ، لأن قرنية الفأر منحنية للغاية. هنا ، نقدم أداة جديدة ، لكمة خزعة معدلة ، تمكن الباحثين من إنشاء إصابة قلوية محددة جيدا وموضعية وموزعة بالتساوي لقرنية الفئران والليمبوس. تمكن طريقة التثقيب والتريفين هذه الباحثين من إحداث حرق كيميائي دقيق وقابل للتكرار لقرنية الفئران بأكملها مع ترك الهياكل الأخرى ، مثل الجفون ، غير متأثرة بالمادة الكيميائية. علاوة على ذلك ، تقدم هذه الدراسة تقنية الاستئصال التي تحافظ على الغضروف الإنسي كمعلم لتحديد الجانب الأنفي من الكرة الأرضية. كما يتم الحفاظ على الملتحمة البصلية والجفنية والغدة الدمعية سليمة باستخدام هذه التقنية. تم إجراء فحوصات طب العيون عبر المجهر الحيوي للمصباح الشقي وتلطيخ الفلوريسئين في الأيام 0 و 1 و 2 و 6 و 8 و 14 بعد الإصابة. أكدت النتائج السريرية والنسيجية والكيميائية المناعية نقص الخلايا الجذعية الطرفية وفشل تجديد سطح العين في جميع فئران التجارب. يعد نموذج إصابة القرنية القلوية المقدم مثاليا لدراسة نقص الخلايا الجذعية الحوفي والتهاب القرنية والتليف. هذه الطريقة مناسبة أيضا للتحقيق في الكفاءة قبل السريرية والسريرية لأدوية العيون الموضعية على سطح القرنية الفئران.

Introduction

القرنية ضرورية للرؤية وتظهر خصائص فريدة ، بما في ذلك الشفافية ، وهي شرط أساسي للرؤية الواضحة. بالإضافة إلى القيام بدور وقائي رئيسي ، تمثل القرنية 2/3 من القوة الانكسارية للعين1. نظرا لدورها الهام في الرؤية ، تتسبب إصابات القرنية والعتامة في تدهور بصري كبير وهي مسؤولة عن ثاني أكبر سبب للعمى الذي يمكن الوقاية منه في جميع أنحاء العالم 2,3. في إصابات القرنية مع خلل وظيفي حاد في الأطراف ، تنخفض وظيفة الحاجز الواقي للطرف ، مما يؤدي إلى هجرة خلايا الملتحمة نحو سطح القرنية والملتحمةالقرنية 4,5 ، مما يضر بالرؤية بشكل كبير. لذلك يلزم وضع استراتيجيات وقائية وعلاجية فعالة لمعالجة العبء العالمي لعمى القرنية وما يتصل به من إعاقة.

يعتمد الفهم الحالي لعملية التئام جروح القرنية البشرية على الدراسات السابقة التي بحثت في استجابات القرنية للإصابات المختلفة. تم استخدام العديد من التقنيات والنماذج الحيوانية للحث على إصابات القرنية الكيميائية أو الميكانيكيةالمختلفة 6،7،8،9 والتحقيق في الجوانب المختلفة لعملية التئام جروح القرنية.

نموذج الحرق القلوي هو نموذج إصابة راسخ يتم إجراؤه عن طريق تطبيق هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) على سطح القرنية مباشرة أو باستخدام ورق ترشيح مسطح10. تؤدي الإصابة القلوية إلى إطلاق وسطاء مؤيدين للالتهابات وتسلل الخلايا متعددة الأشكال النووية ليس فقط في القرنية والغرفة الأمامية للعين ولكن أيضا في شبكية العين. هذا يحفز موت الخلايا المبرمج غير المقصود لخلايا العقدة الشبكية وتنشيط خلية CD45 + 11. لذلك ، من الأهمية بمكان تحديد موقع الإصابة بدقة لتجنب الإصابة المفرطة غير المقصودة باستخدام نموذج الإصابة القلوية.

يبلغ الطول المحوري لمقلة عين الفئران حوالي 3 مم12. بسبب هذه المسافة القصيرة بين القرنية والشبكية ، يوجد انحناء حاد في القرنية لتوفير قوة انكسارية عالية لتركيز الضوء على الشبكية (الشكل 1 أ). كما ذكرناسابقا 13 ، فإن إحداث إصابة كيميائية لهذا السطح شديد الانحناء باستخدام ورق ترشيح مسطح أمر صعب ، لا سيما في النسيان (الشكل 1 ب). يتطلب إحداث إصابة في الحافة إمالة ورق الترشيح ، والذي من المحتمل أن يتسبب في إصابة غير مقصودة للقبو والملتحمةالمجاورة 14. هناك طريقة أخرى تتضمن تطبيق العامل الكيميائي مباشرة كقطرات على سطح القرنية. ومع ذلك ، تفتقر هذه الطريقة إلى التحكم في وقت التعرض ، وهناك خطر محتمل لإحداث إصابة في الملتحمة والقبو والجفون بسبب انتشار السائل إلى هذه المناطق.

للتغلب على هذه القيود ، تقدم هذه الدراسة طريقة جديدة لكمة تريفين للحث على الإصابة. تتميز هذه التقنية بالعديد من المزايا بما في ذلك (i) إحداث إصابة كيميائية فعالة لسطح القرنية بالكامل و limbus في نموذج الفأر ، (ii) إحداث إصابة موضعية ومحددة جيدا للقرنية ، (iii) القدرة على تطبيق أي سائل مهم لمدة محددة مسبقا ، و (iv) القدرة على إحداث أحجام مختلفة من إصابات القرنية عن طريق اختيار لكمات الخزعة المناسبة. هذه الطريقة ممكنة أيضا لنماذج إصابة الفئران والأرانب ، والتي تظهر أيضا سطحا منحنيا للقرنية وهي نماذج حيوانية شائعة تستخدم لدراسة التئام الجروح على سطح العين.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا لرقم APLAC لرعاية في مختبر ستانفورد 33420 ، واستخدام للأغراض العلمية ، وبيان ARVO لاستخدام في أبحاث العيون والرؤية. تم توفير ما مجموعه 10 ذكور وإناث من الفئران C57BL / 6 الذين تتراوح أعمارهم بين 8-12 أسبوعا بسخاء من قبل مختبر Irving L. Weissman. تم تأقلم مع دورة 12 ساعة من الضوء والظلام وتم تزويدها بالماء والأعلاف الإعلانية. تم إحداث إصابة في عين واحدة من.

1. التحضير للتجربة

  1. تحضير المواد
    ملاحظة: يجب الحفاظ على جميع الكواشف في درجة حرارة الغرفة.
    1. تحضير لكمة تريفين: قم بإعداد لكمة خزعة بقطر 3.5 مم وحدد عمود الثقب على بعد 5 مم من حافته البعيدة. ألصق الثقب بإحكام وقطع الجزء البعيد الملحوظ من عموده باستخدام أداة دوارة ذات سرعتين. ارتداء حماية العين خلال هذه العملية. اقطع العمود على عمق 3.5 مم واترك 1.5 مم النهائي متصلا. ثني الطرف 90 درجة ، كما هو موضح في الشكل 1.
    2. تحضير محلول هيدروكسيد الصوديوم 0.5 M عن طريق إذابة 1 g NaOH في 50 مل من الماء المقطر.
    3. قم بإعداد 10 مل من كوكتيل مخدر عن طريق الجمع بين 2 مل من 100 ملغ / مل من الكيتامين و 1 مل من 20 ملغ / مل زيلازين. قبل الحقن ، تمييع هذا الخليط مع 7 مل من 0.9 ٪ كلوريد الصوديوم (المياه المالحة العادية).
    4. تحضير محلول الصوديوم فلوريسئين 0.1٪ بإضافة 0.1 مل من سائل الفلورسنت AK-Fluor 10٪ إلى 9.9 مل من محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (1x PBS).
    5. تحضير PBS (1x) عن طريق إذابة 8 جم كلوريد الصوديوم ، 0.2 جم KCl ، 1.44 جم Na2HPO4 ، و 0.23 جم NaH2PO4في 900 مل من الماء المقطر. اضبط الرقم الهيدروجيني للمحلول على 7.4. أحضر المحلول إلى حجم نهائي قدره 1 لتر بإضافة الماء المقطر.
    6. تحضير محلول بارافورمالدهايد (PFA) بنسبة 4٪ للتثبيت. تحت غطاء كيميائي ، قم بإذابة 2 جم من PFA في 45 مل من PBS. سخني الخليط إلى 65 درجة مئوية ومعاير درجة الحموضة إلى 7.4. بمجرد حل PFA ، أحضر المحلول إلى الحجم النهائي 50 مل.

2. إعداد

  1. وزن الماوس لتحديد الحجم المناسب من كوكتيل مخدر عن طريق الحقن للحقن. بعد التعامل مع الفأر وتقييده بشكل صحيح كما هو موضح في Machholz et al.15 ، قم بإدارة كوكتيل التخدير داخل الصفاق (IP) بجرعة 0.01 مل / جم16,17. استهدف أرباع البطن السفلية لحقن IP لمنع تلف الأعضاء.
  2. حقن معلق البوبرينورفين ممتد المفعول عن طريق الحقن (3.25 ملغم / كغم) تحت الجلد للحصول على تسكين إضافي أثناء الجراحة وبعدها لأن إصابة القرنية القلوية مؤلمة للغاية.
  3. انتظر حتى يتم تحقيق مستوى عميق من التخدير. تحقق من عدم الاستجابة لقرصة إصبع القدم كمؤشر على نجاح مستوى التخدير العميق. ضع مرهما بسيطا للعين المقابلة لمنعها من الجفاف قبل بدء الجراحة.
  4. بعد التخدير ، ضع الماوس على طاولة الجراحة المعدة وفقا لمبادئ جراحة القوارض القياسية18. ضع وسادة بارتفاع 5 مم تحت رأس القوارض ، موضوعة في وضع الاستلقاء الجانبي. تساعد الوسادة على دعم رأس القوارض أثناء الجراحة.
  5. يتم تطبيق قطرات تتراكائين هيدروكلوريد (0.5٪) للعين لمزيد من التخدير. جفف سطح العين بشكل صحيح باستخدام رمح العين الجراحي وقم بقص الرموش.

3. تحريض الإصابة القلوية

  1. قبل البدء في الجراحة ، قم بتنظيم طاولة الجراحة وفقا لمبادئ جراحة القوارض القياسية18,19 والحفاظ على المجال الجراحي معقما أثناء الجراحة. ضع المجهر الجراحي لتصور الماوس المخدر بشكل صحيح واضبط المؤقت على 30 ثانية. ضع منشفة ورقية ملتوية على كمامة لمنع شفط الأنف غير المقصود أثناء عملية الشطف.
  2. تحديد محيط المنطقة القاحفية باستخدام المجهر الجراحي مع التأكد من أن جفون الفأر مفتوحة على مصراعيها باستخدام إصبعي الإبهام والسبابة. أمسك برفق التثقيب النظيف الموازي لمحور العين ، دون الضغط على أي ضغط. تجنب تدوير الأداة وحافظ على محور التثقيب موازيا لمحور الكرة الأرضية.
  3. اطلب من المساعد الجراحي إسقاط 3 قطرات من محلول هيدروكسيد الصوديوم (يساوي 40 ميكرولتر) في فتحة التريفين المثقوب لملء الأداة وتغطية سطح القرنية بشكل مناسب. يمنع التوتر السطحي للسائل أي تسرب خارج الجهاز (الشكل 1).
    ملاحظة: استخدمنا حقنة 1 مم مع إبرة 27G تتميز بطرف مسطح بزاوية 50 درجة لإسقاط محلول NaOH بعناية.
  4. بعد 30 ثانية ، شطف القرنية و fornix على الفور مع 5 مل من PBS (1x). يوضح الفيديو 1 الإجراء الخاص بإحداث إصابة كيميائية.
  5. استخدم ورقة مؤشر الأس الهيدروجيني العالمي لضمان درجة حموضة 7 - 7.5 على سطح القرنية للعين المصابة. ثم ، ضع مرهم العيون الثلاثي المضادات الحيوية على سطح العين المصاب كيميائيا.
    ملاحظة: حركة الذيل أثناء الجراحة هي علامة على انخفاض عمق التخدير. ضع كوكتيلا مخدرا إضافيا (كيتامين + زيلازين) عن طريق حقن مخدر [بلعة IP (50٪ من الحجم الأولي)].
  6. بعد الجراحة ، تأكد من أن الماوس في حالة مستقرة. تطبيق البوبرينورفين الثاني إذا كان يعاني من الألم. استخدم نفس تقنية المناولة كما في 2.2. ابدأ الفحص بعد العملية الجراحية بينما يكون تحت التخدير.
  7. بعد العملية ، اغسل وجفف وتعقيم ثقب التريفين والطاولة الجراحية بنسبة 70٪ من الإيثانول.

4. التقييم السريري

  1. للفحص ، قم بتخدير الماوس كما هو موضح سابقا في الخطوة 2.1.
  2. افحص العينين (المصابة وغير المصابة) تحت المجهر الحيوي ذو المصباح الشقي. استخدم كاميرا لالتقاط الصور (في هذه الدراسة ، تم استخدام كاميرا هاتف في الوضع السينمائي).
  3. سجل عتامة القرنية وفقا لنظام تصنيف Yoeruek20: 0 = قرنية طبيعية وواضحة ؛ 1 = عتامة خفيفة ؛ 2 = عتامة أكبر ، ولكن يمكن تمييز القزحية والتلميذ بسهولة ؛ 3 = القزحية والتلميذ بالكاد يمكن تمييزهما ؛ 4 = القرنية معتمة تماما مع تلميذ غير مرئي.
  4. تطبيق 0.1 ٪ قطرات العين الفلوريسين. جفف السائل الفلوري الزائد باستخدام قضيب قطني وقم بتقييم وجود عيوب ظهارية في القرنية باستخدام مرشح الكوبالت الأزرق. التقاط الصور.
  5. راقب حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على راقد القص. لا تعيد إدخال إلى أخرى حتى يتعافى تماما.

5. الاستئصال

  1. القتل الرحيم الفئران 2 أسابيع بعد تحريض الإصابة الكيميائية عن طريق خلع عنق الرحم في 3-5 ثانية21.
  2. استئصال العين مع الحفاظ على الغضروف الإنسي والملتحمة الجفنية الكاملة بالترتيب التالي، كما هو موضح في الفيديو 2.
  3. تحت المجهر الجراحي ، تشريح بعناية تقاطع الجمرة والجلد. باستخدام ملقط الأسنان ، اسحب الجمرة وقم بتوجيه طرف المقص الجراحي تحت الملتحمة الجفنية نحو تقاطعه مع الصفيحة الرصغية.
  4. قطع الملتحمة على طول خط الالتصاق نحو canthus الجانبي. ثم أدر المقص الجراحي إلى تقاطع الملتحمة والصفيحة الرصغية السفلية عند المستوى تحت الملتحمة.
  5. بعد الانتهاء من تشريح الملتحمة ، اسحب الجفون العلوية والسفلية من جانب الأنف بإصبعي الإبهام والسبابة. أثناء التراجع ، قم بتوجيه طرف ملقط ذو طرف منحني خلف السعيد الدمعي البارز نحو العصب البصري. أمسك العصب البصري بقوة واستخرج الكرة الأرضية (الشكل 2).
  6. شطف الكرة الأرضية مع PBS (1x) ونقلها إلى محلول التثبيت.

6. الهيماتوكسيلين ويوزين (H&E) وتلطيخ حمض شيف الدوري (PAS)

  1. ثبت الكرات الأرضية في محلول فورمالين بنسبة 10٪ طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.
  2. قم بتجفيف الأنسجة باستخدام سلسلة متسلسلة من الكحول المتدرج بتركيزات 70٪ إيثانول و 80٪ إيثانول و 90٪ إيثانول و 100٪ إيثانول ، كل منها لمدة 10-15 دقيقة. بعد ذلك ، اغمر العينين في الزيلين لمدة 10 دقائق. أخيرا ، قم بتغليف العينين بالبارافين.
  3. قسم كتل البارافين إلى شرائح بسمك 6 ميكرومتر وقم بتركيبها على شرائح مجهرية زجاجية للهيماتوكسيلين والإيوزين (H&E) وتلطيخ حمض شيف الدوري (PAS) ، كما هو موضح في الملف التكميلي 1.

7. التصوير والتحليل المناعي

  1. بالنسبة لدراسات الكيمياء الهيستولوجية المناعية (IHC) ، ثبت العينين في 1 مل من PBS (1x) تحتوي على 4٪ PFA عند 4 درجات مئوية طوال الليل. اغسل العينة 3x في 1 مل من PBS (1x) لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  2. لمنع تكوين بلورات الجليد وحماية الهياكل الجزيئية للبروتينات ، قم بإجراء تشبع السكروز التسلسلي بتركيزات 10٪ سكروز و 20٪ سكروز و 30٪ سكروز في برنامج تلفزيوني. تضمين الكرات الأرضية في محلول التصوير المقطعي للتماسك البصري (OCT; الشكل 2) ، وتخزينها في -80 درجة مئوية.
  3. قسم كتلة OCT إلى شرائح بسمك 12 ميكرومتر وقم بتركيبها على شرائح مجهرية زجاجية لتلطيخ IHC.
  4. تتخلل أقسام الأنسجة على شرائح المجهر في 0.1٪ Triton X −100 في PBS (1x) لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، قم بحظر المستضدات غير المحددة التي تحتوي على 5٪ BSA في PBS (1x) لمدة 1 ساعة إضافية في درجة حرارة الغرفة.
  5. احتضان أقسام الأنسجة على شرائح المجهر عند 4 درجات مئوية طوال الليل في كوكتيل الأجسام المضادة الأولية المستهدفة المحضرة في PBS (1x) التي تحتوي على 1٪ BSA. في هذه التجربة ، كانت الأجسام المضادة الأولية هي 1: 100 من الأجسام المضادة للأرانب المخففة المضادة للكيراتين 13 (K13) والأجسام المضادة للكيراتين 12 (K12) بتركيز 2.24 ميكروغرام / مل و 1.56 ميكروغرام / مل ، على التوالي.
  6. بعد الحضانة ، اغسل أقسام الأنسجة على شرائح المجهر 3x باستخدام PBS (1x). بعد ذلك ، اكتشف الأجسام المضادة الأولية المرتبطة ب 1: 500 حمار مخفف مضاد للأرانب IgG. احتضان مع الجسم المضاد الثانوي في 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في الظلام. ثم اغسل في برنامج تلفزيوني (1x) 3x لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  7. ضع قطرة من وسط تركيب مضان مضاد للتلاشي يحتوي على DAPI على أقسام الأنسجة على المجهر وقم بتغطيتها بغطاء غطاء. اترك العينات تجف في الظلام وافحصها تحت مجهر الفلورسنت بنفس إعداد الليزر للعيون العادية والمصابة.

Representative Results

تم تقييم فعالية الطريقة في إحداث نقص الخلايا الجذعية الحوفي (LSCD) من خلال تقييم العلامات السريرية والنسيجية ل LSCD. تم إجراء التقييم السريري عن طريق الفحص المجهري للمصباح الشقي والتصوير المقطعي للتماسك البصري (AS-OCT) (الشكل 3 والشكل 4).

حدثت إعادة الظهارة بطريقة جاذبة وكانت أسرع في الجزء الصدغي من القرنية مقارنة بالجزء الأنفي. أصيبت العيون المصابة بضباب القرنية 2 + -3 + مباشرة بعد الإصابة الكيميائية (الشكل 3). هاجرت الخلايا الظهارية من الملتحمة إلى سطح القرنية بعد إصابة القزحية. تم إعادة اندمال العيب الظهاري الكبير في القرنية تماما في الأيام 12-14 ، والتي استغرقت وقتا أطول مقارنة بإصابة ظهارية القرنية ذات الحجم المماثل والغشاء القاعدي السليم والسدى الذي يلتئم عادة في غضون 5 أيام بعد الإصابة 8,9. بسبب LSCD ، أصيب 50٪ من العيون المصابة بعيوب ظهارية مستمرة في نهاية الأسبوع الثاني (الشكل 3). كانت وذمة القرنية أكثر وضوحا خلال الأيام القليلة الأولى (الشكل 3 ، الشكل 4) ، في حين كان تليف القرنية كبيرا في الأسبوع الثاني مما أدى إلى عتامة القرنية 4+ في 100٪ من العيون المصابة.

لوحظت العلامات المبكرة للأوعية الدموية الجديدة (NV) سريريا ونسيجيا ، بعد 24 ساعة من تحريض الإصابة الكيميائية ، كما هو موضح في الشكل 5 ، بما يتفق مع الجدول الزمني ل NV الذي حدده Kvanta et al. الدراسة التي أظهرت علامة على NV بعد 24 ساعة من الإصابة22. أثناء عملية الشفاء ، نضجت أوعية جديدة وبحلول اليوم 14 بعد الإصابة ، عبرت NV النسيان ووصلت إلى القرنية المركزية. تم تدمير الحافة ، التي تحدد الحدود بين الملتحمة والقرنية.

لوحظت أدلة نسيجية على نقص الخلايا الجذعية الحوفي والملتحمة من خلال ظهور الخلايا الكأسية PAS + والأوعية الدموية اللحمية23،24،25،26. لوحظت الخلايا الكأسية في نموذج الإصابة الحالي ويشار إليها بالسهم في الشكل 6.

تعبر ظهارة الملتحمة والقرنية بشكل أساسي عن الكيراتين الفريد ، K13 و K12 ، على التوالي27. بعد الإصابة في القزحية ، غطت الخلايا الظهارية الجديدة التي نشأت من الملتحمة القرنية المجردة ، ولم يتم التعبير عن K12 على سطح القرنية لأي مصابة خلال أسبوعين بعد الإصابة. أشارت هذه النتيجة ، بما يتفق مع دراسات أخرى28 ، إلى اكتمال LSCD وغياب الخلايا الظهارية القرنية على سطح القرنية. ومع ذلك ، في الدراسة التي أجراها Park et al.29 ، اكتشفوا تعبير K12 بعد 20 و 32 أسبوعا من الإصابة ، مما يشير إلى احتمال التمايز العابر للخلايا الظهارية.

وبالتالي ، لاحظنا أن الإصابة الكيميائية دمرت الخلايا الجذعية الطرفية والطرفية مما أدى إلى هجرة الخلايا الظهارية الملتحمة إلى مركز القرنية لتغطية سطح القرنية المكشوف. يتم التحقق من صحة ذلك أيضا من خلال علامة الخلايا الظهارية الملتحمة ، K13 ، والتي تم التعبير عنها في كامل أسطح الملتحمة والقرنية كما هو موضح في الشكل 7.

Figure 1
الشكل 1: العين اليمنى للفأر الطبيعي والتريفين المثقوب لإحداث إصابة القرنية والقزحية. (أ) منظر جانبي يظهر عين الفأر مع قرنية منحنية للغاية (تشير رؤوس الأسهم إلى الطرف). (ب) توضح الصورة أنه حتى ورق الترشيح الكبير لا يكفي لتغطية المنطقة الداكنة حول القزحية بشكل كاف. يبلغ قطر عين الفأر من الحافة إلى الحافة حوالي 4 مم وخزعة مثقوبة بقطر خارجي 4.5 مم وقطر داخلي 3.5 مم (الألواح D و H) ، تغطي بشكل مناسب القرنية وسطح القزحية كما هو موضح في اللوحتين (C) و (E). (F) يتم تثبيت التريفين المثقوب بشكل مناسب فوق الكرة الأرضية حول المنطقة الطرفية. (ز) لضمان عدم وجود تسرب عبر حافة التريفين المثقوب ، بعد وضع التريفين المثقوب بشكل مناسب في محور مواز مع الكرة الأرضية ، يتم ملء الثقب باللون الأزرق الميثيلين. لم يتم الكشف عن تسرب لأزرق الميثيلين. شريط المقياس = 1 مم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: العيون المنزوعة. (أ) تم استئصال العينين مع الحفاظ على الملتحمة البصلية والجفنية، والغدة الدمعية (رأس السهم)، والعصب البصري (السهم). تم تشبع العيون الطبيعية (B) والمصابة (C) في 30٪ من السكروز للحماية من تكوين الكريستال البارد. يمكن التعرف على الجزء الأنفي من الكرة الأرضية من خلال غضروف الأنف (المسمى N). شريط المقياس = 1 مم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: التئام جروح العين اليسرى. تظهر هنا عملية التئام الجروح في عين الفأر الأيسر طوال 2 أسابيع بعد إصابة القرنية والقلويات الداكنة في نموذج الماوس (A-F). فحص المصباح الشقي للعين. تكون وذمة القرنية أكثر وضوحا في اليومين 0 و 2 (A ، B) ، في حين أن التليف يكون أكثر وضوحا خلال الأسبوع الثاني بعد الإصابة (E-F). A.f-F.f تظهر عملية إعادة الاندمال لنفس العين. لوحظ وجود عيب ظهاري كامل في القرنية والقولوزية مباشرة بعد تحريض الإصابة في A.F. التئام العيب الظهاري عن طريق هجرة الخلايا الظهارية الملتحمة في نمط الجاذبية المركزية لمدة 12-14 يوما (A.F-F.F). ومع ذلك ، فإن 50٪ من العيون المصابة أصيبت بعيب ظهاري مستمر في نهاية الأسبوع الثاني كما هو موضح بالسهم في صور F و F.F. شريط المقياس = 1 مم (اللوحة C). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: الجزء الأمامي OCT من عين الفأر. (أ) يوضح AS-OCT انحناء القرنية الطبيعي والحجرة الأمامية. هيكل القزحية محدد جيدا ويمكن التعرف عليه. لا يمكن اكتشاف التصاق قزحية القرنية في منتصف محيط القزحية. (ب) بعد الإصابة مباشرة يزداد سمك القرنية بسبب تكوين الوذمة ويتطور التصاق قزحية القرنية في منتصف محيط القزحية. (ج) بعد أسبوعين من الإصابة، تغير انحناء القرنية وأصبح الالتصاق القزحي القرني الكلي مع تدمير الغرفة الأمامية مرئيا. شريط المقياس = 1 مم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 5
الشكل 5: الأوعية الدموية الجديدة للقرنية. يمكن ملاحظة العلامات السريرية والنسيجية للأوعية الدموية الجديدة في القرنية أثناء عملية التئام الجروح بعد إصابة هيدروكسيد الصوديوم (NaOH). (أ) تصبح العلامات الأولية للأوعية الدموية الجديدة قابلة للاكتشاف في اليوم الأول بعد الإصابة ، وتتميز بتغير لون القرنية المحمر (يشار إليه بسهم أبيض). ينتج هذا اللون عن تجمع خلايا الدم الحمراء في السدى ، كما هو موضح في الصورة النسيجية المقابلة (D) (المشار إليها برؤوس الأسهم الصفراء). (ب) خلال الأسبوع الأول من التجديد، تزداد الأوعية الجديدة تدريجيا وتنتشر في جميع أنحاء القرنية. (ج) بحلول نهاية 2 أسابيع ، يتم تدمير المنطقة القزحية ، وتستمر السفن الجديدة في التطور. (ه) يوضح الجزء النسيجي من القرنية أيضا وجود الأوعية الدموية الحديثة اللحمية العميقة (كما هو موضح برؤوس الأسهم). مصباح الشق شريط مقياس الصورة = 1 مم ، شريط مقياس صورة الأنسجة = 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 6
الشكل 6: تلطيخ القرنية الدوري بالحمض والكيمياء المناعية (IHC). تم إجراء تلطيخ دوري للحمض والكيمياء المناعية للقرنية الطبيعية والمصابة بعد 2 أسابيع من الإصابة. ظهارة القرنية الفأر الطبيعية تتكون من 4-5 طبقات من الخلايا (A). أدت الإصابة القلوية للقرنية والليمبوس إلى تلتحمة القرنية مع ظهور خلايا كأسية على سطح القرنية كما هو موضح بالأسهم السوداء في (د). تعبر الخلايا الظهارية القرنية الطبيعية عن K12 (B) ، والتي لا تعبر عنها خلايا الملتحمة التي تغطي القرنية المصابة (E). لا يتم التعبير عن K13 ، وهي علامة مميزة للخلايا الظهارية الملتحمة ، على الخلايا الظهارية القرنية الطبيعية (C). ومع ذلك ، فهو موجود على سطح القرنية المصاب بهيدروكسيد الصوديوم (NaOH) وهو علامة على ملتحمة القرنية (F). شريط مقياس صورة الأنسجة = 50 ميكرومتر ، شريط مقياس الصورة الملون IHC = 20 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 7
الشكل 7: الهيماتوكسيلين والإيوزين والتلوين الكيميائي المناعي. تم إجراء الهيماتوكسيلين ويوزين (H&E & E) والتلوين المناعي الكيميائي لأنسجة الأطراف الطبيعية والمصابة. (أ) يشير الحافة الطبيعية إلى المنطقة الانتقالية بين نهاية الصلبة وبداية القرنية. عادة ما يتم تغطية هذه المنطقة بطبقة أو طبقتين من الخلايا الظهارية الملتحمة (يشار إليها بالأسهم). في العين السليمة ، يبدأ التعبير عن علامة ظهارية قرنية محددة تسمى K12 عند الحافة ويمتد إلى سطح القرنية (كما هو موضح في الصورة ب). من ناحية أخرى ، يقتصر التعبير عن علامة الملتحمة المعروفة باسم K13 على الحافة ولا يمتد إلى ما وراءها (يشار إليها بالسهم الأبيض في الصورة C). في العيون المصابة بهيدروكسيد الصوديوم (NaOH) ، تتعطل حدود الطرف. هذا يؤدي إلى هجرة خلايا الملتحمة نحو القرنية المصابة. (د) توضح صور الحافة المصابة بهيدروكسيد الصوديوم وجود الأوعية الدموية الجديدة تحت الطبقة الطلائية وداخل النسيج اللحمي. بعد الإصابة ، يفتقر سطح القرنية المصاب إلى وجود K12 (E) ، بينما يتم التعبير عن K13 بكثرة على سطح القرنية (F). شريط مقياس صورة الأنسجة = 50 ميكرومتر ، شريط مقياس الصورة الملون IHC = 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الملف التكميلي 1: بروتوكول التلطيخ. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

فيديو 1: إصابة القرنية والطرفية NaOH في نموذج فأر مع ثقب تريفين. يوضح الفيديو إجراء إحداث إصابة القرنية والداكنة حول سطح الرحم NaOH في نموذج فأر باستخدام ثقب تريفين. من الأهمية بمكان تثبيت التريفين المثقوب في محور مواز مع الكرة الأرضية وتطبيق الحد الأدنى من الضغط على الطرف. هذه التقنية المناسبة ضرورية لمنع التسرب وتحقيق أفضل النتائج. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيديو.

فيديو 2: توضيح لتقنية الاستئصال مع الحفاظ على الملتحمة البصلية. للتمييز بين الجانب الأنفي من الكرة الأرضية والجانب الصدغي ، يتم الحفاظ على جثة الأنف مع الكرة الأرضية. يتم تشريح الملتحمة بأكملها بدءا من تقاطعها إلى الصفيحة الرصغية. مع الحد الأدنى من الضغط ، تبرز المحتويات المدارية للخارج. من خلال توجيه الملقط نحو الجزء الخلفي من الكرة الأرضية ، يتم إمساك العصب البصري ، ويتم استخراج الأنسجة. يشمل النسيج المنزوع الكرة الأرضية والدهون المدارية والغدة الدمعية المدارية. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيديو.

Discussion

تقترح هذه الدراسة جهازا مبتكرا ، وهو punch-trephine ، والذي يمكن استخدامه للحث بنجاح على إصابة القرنية والطرفية الفعالة والقابلة للتكرار في نموذج الفأر. يعد نموذج نقص الخلايا الجذعية الحوفي هذا مثاليا للتحقيق في ديناميكيات التئام جروح القرنية والملتحمة بعد الإصابة.

تشير الدلائل إلى أن كلا من مكان القزحية والجزء المركزي من قرنية الفئران يحتويان على الخلايا الجذعية30. لذلك ، يلزم وجود إصابة فعالة في القرنية والأطراف لإنتاج نموذج نقص الخلايا الجذعية ، ويتيح نموذج الإصابة المقدم هنا تعرض طرف القرنية المنحني لعامل كيميائي لفترة محددة. لتحديد أفضل تركيز ومدة إصابة هيدروكسيد الصوديوم ، تم إلحاق إصابات بتركيزات ومدد مختلفة من هيدروكسيد الصوديوم. أدت تركيزات NaOH الأعلى أو فترات التعرض الأطول إلى زيادة تلف الأنسجة والتليف. لذلك ، يمكن للباحثين ضبط هذه المعلمات بناء على الأهداف المحددة لدراستهم وشدة الإصابة المطلوبة.

لإعادة إنتاج نموذج إصابة القرنية والداكنة حول القزحية بنجاح ، يجب مراعاة العديد من الاعتبارات الرئيسية. أولا ، من الضروري قياس قطر العين المستهدفة من القزحية إلى القزحية لتحديد الحجم المناسب للثقب. يوصى باختيار لكمة خزعة بقطر خارجي أكبر من هذا القطر بمقدار 0.5 - 1 مم.

يعد التوتر السطحي للسائل المستخدم عاملا مهما في منع التسرب عند السطح البيني بين سطح العين وحافة التريفين المثقوب كما هو موضح في الشكل 1G. لذلك ، ليست هناك حاجة للضغط على طرف الخزعة لكمة.

لتجنب التسبب في أضرار ميكانيكية للأنسجة ، من الأهمية بمكان تثبيت التريفين المثقوب في محور مواز مع العين والامتناع عن الضغط على الطرف. يمكن أن يؤدي الضبط غير الصحيح لمحور التثقيب إلى زيادة خطر التسرب ويؤدي إلى موقع إصابة غير دقيق ونتائج غير دقيقة.

تتضمن بعض القيود المحتملة لهذه التقنية الحاجة إلى تحديد حجم الثقب المناسب ، واكتساب الكفاءة في حمل التريفين المثقوب ، والمخاطر المحتملة للتسبب في إصابة ميكانيكية. ومع ذلك ، يمكن التغلب على هذه القيود من خلال الممارسة وباتباع التعليمات الموضحة في هذا البروتوكول. تعتبر سلالة الفئران والفئة العمرية من العوامل الأخرى التي تؤثر على عملية إعادة الظهارة ويجب أخذها في الاعتبار في الدراسة.

علاوة على ذلك ، فإن البروتوكول المقترح مفيد لأنه يفصل طريقة الاستئصال التي تحافظ على الملتحمة البصلية والجفنية وتسمح بتحديد الجزء الأنفي من الكرة الأرضية دون تطبيق الغرز الجراحية كعلامة. أشارت الأبحاث السابقة إلى أن منطقة الأنف في العين تمتلك أدنى تعصيب عصبي مقارنة بمناطق القرنية الأخرى ، مما يجعلها أكثر عرضة للأوعية الدموية الجديدة وتقليل فعالية التجدد31,32.

باختصار ، فإن العلامات السريرية ل LSCD ، مثل عتامة القرنية (CO) ، والعيوب الظهارية المستمرة ، والأوعية الدموية الجديدة للقرنية (NV) ، جنبا إلى جنب مع التغيرات النسيجية الملحوظة ، بما في ذلك حؤول الخلايا الكأسية ، والتعبير عن K13 على سطح القرنية ، وغياب K12 على سطح القرنية ، تؤكد وجود LSCD في هذا النموذج. تقدم هذه النتائج دليلا على أن هذه التقنية الجديدة فعالة في تحفيز LSCD. يمكن استخدام نموذج الإصابة الكيميائية هذا في الدراسات قبل السريرية للتحقيق في الأدوية الجديدة والعلاجات الصيدلانية في مجال إصابة القرنية وتجديدها.

Disclosures

ليس لدى أي من المؤلفين أي مصلحة مالية في أي من الشركات أو المنتجات الموصوفة في هذه الدراسة. لا يعلن المؤلفون عن أي تضارب آخر في المصالح.

Acknowledgments

نحن نقر بأن NEI P30-EY026877 يدعم هذا البحث. نحن نقدر كثيرا شارلين وانغ ومختبر الدكتور إيرف وايزمان في معهد جامعة ستانفورد لبيولوجيا الخلايا الجذعية والطب التجديدي على كل ما قدموه من مساعدة كريمة في توفير التجارب. نحن نقدر مساعدة هيراد رضائيبور في إعداد وتحرير الصور.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-K12 antibody ABCAM ab185627
Anti-K13 antibody ABCAM ab92551
Bovine serum albumin (BSA) ThermoFisher Scientific B14
C57BL/6 mice Dr Weissman Lab, Stanford University
Curved forceps Storz E1885
Disposable 90 degree bent needle
Disposable biopsy punch Med blades
Donkey anti-rabbit IgG H&L ABCAM ab150073
Ethanol ThermoFisher Scientific T038181000CS
Ethiqa XR (Buprenorphine extended-release injectable suspension) Fidelis Animal Health
Heating pad for mouse 
Ketamine hydrochloride Ambler ANADA 200-055
OCT Tissue-Tek 4583
Ophthalmic surgical scissors
pH Indicator Sticks Whatman
Phosphate buffered saline (PBS) ThermoFisher Scientific AM9624
Prolong gold antifade reagent with DAPI Invitrogen P36935
Slit-lamp microscope NIDEK SL-450
Sodium fluorescein AK-fluor 10% Dailymed NDC17478-253-10
Sterile irrigation solution (BSS) Alcon 9017036-0119
Sterile syringe, 1 and 5 ml
Straight forceps Katena K5 4550- Storz E1684
Surgical eye spears American White 17240 Cross
Surgical microscope Zeiss S5 microscope
Tetracaine ophthalmic drop Alcon    NDC0065-0741-14
Timer
Triple antibiotic ophthalmic ointment Bausch and Lomb
TritonX -100 Fisher Scientific   50-295-34
Two-speed rotary tool 200-1/15 Two Speed Rotary Toolkit
Xylazine AnaSed NADA#139-236

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sridhar, M. S. Anatomy of cornea and ocular surface. Indian Journal of Ophthalmology. 66 (2), 190-194 (2018).
  2. Robaei, D., Watson, S. Corneal blindness: a global problem. Clinical & experimental Ophthalmology. 42 (3), 213-214 (2014).
  3. Lamm, V., Hara, H., Mammen, A., Dhaliwal, D., Cooper, D. K. C. Corneal blindness and xenotransplantation. Xenotransplantation. 21 (2), 99-114 (2014).
  4. Danjo, S., Friend, J., Thoft, R. A. Conjunctival epithelium in healing of corneal epithelial wounds. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 28 (9), 1445-1449 (1987).
  5. Shapiro, M. S., Friend, J., Thoft, R. A. Corneal re-epithelialization from the conjunctiva. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 21 (1 Pt 1), 135-142 (1981).
  6. Shah, D., Aakalu, V. K. Murine Corneal Epithelial Wound Modeling. Wound Regeneration: Methods and Protocols. Das, H. , Springer US. 175-181 (2021).
  7. Rittié, L., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Mouse models of corneal scarring. Fibrosis: Methods and Protocols. 1627, 117-122 (2017).
  8. Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
  9. Akowuah, P. K., De La Cruz, A., Smith, C. W., Rumbaut, R. E., Burns, A. R. An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing. Journal of Visualized Experiments. (178), 63112 (2021).
  10. Bai, J. Q., Qin, H. F., Zhao, S. H. Research on mouse model of grade II corneal alkali burn. International journal of Ophthalmology. 9 (4), 487-490 (2016).
  11. Paschalis, E. I., et al. The Role of Microglia and Peripheral Monocytes in Retinal Damage after Corneal Chemical Injury. The American Journal of Pathology. 188 (7), 1580-1596 (2018).
  12. Jiang, M., et al. Single-Shot Dimension Measurements of the Mouse Eye Using SD-OCT. Ophthalmic Surgery, Lasers and Imaging Retina. 43 (3), 252-256 (2012).
  13. Shadmani, A., Razmkhah, M., Jalalpoor, M. H., Lari, S. Y., Eghtedari, M. Autologous Activated Omental versus Allogeneic Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells in Corneal Alkaline Injury: An Experimental Study. Journal of Current Ophthalmology. 33 (2), 136-142 (2021).
  14. Swarup, A., et al. PNP Hydrogel Prevents Formation of Symblephara in Mice After Ocular Alkali Injury. Translational Vision Science & Technology. 11 (2), 31-31 (2022).
  15. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), 2771 (2012).
  16. Jaber, S. M., et al. Dose Regimens, Variability, and Complications Associated with Using Repeat-Bolus Dosing to Extend a Surgical Plane of Anesthesia in Laboratory Mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (6), 684-691 (2014).
  17. Navarro, K. L., et al. Mouse Anesthesia: The Art and Science. ILAR Journal. 62 (1-2), 238-273 (2021).
  18. Hoogstraten-Miller, S. L., Brown, P. A. Techniques in Aseptic Rodent Surgery. Current Protocols in Immunology. 1, 1.12.1-1.12.14 (2008).
  19. ACLAM Medical Records Committee. Medical Records for Animals Used in Research, Teaching, and Testing: Public Statement from the American College of Laboratory Animal Medicine. ILAR Journal. 48 (1), 37-41 (2007).
  20. Yoeruek, E., et al. Safety, penetration and efficacy of topically applied bevacizumab: evaluation of eyedrops in corneal neovascularization after chemical burn. Acta Ophthalmologica. 86 (3), 322-328 (2008).
  21. Shomer, N. H., et al. Review of rodent euthanasia methods. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 59 (3), 242-253 (2020).
  22. Kvanta, A., Sarman, S., Fagerholm, P., Seregard, S., Steen, B. Expression of Matrix Metalloproteinase-2 (MMP-2) and Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) in Inflammation-associated Corneal Neovascularization. Experimental Eye Research. 70 (4), 419-428 (2000).
  23. Tseng, S. C., Hirst, L. W., Farazdaghi, M., Green, W. R. Goblet cell density and vascularization during conjunctival transdifferentiation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (10), 1168-1176 (1984).
  24. Huang, A. J., Tseng, S. C. Corneal epithelial wound healing in the absence of limbal epithelium. Investigative ophthalmology & visual science. 32 (1), 96-105 (1991).
  25. Rama, P., et al. Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration. New England Journal of Medicine. 363 (2), 147-155 (2010).
  26. Deng, S. X., et al. Global consensus on the definition, classification, diagnosis and staging of limbal stem cell deficiency. Cornea. 38 (3), 364-375 (2019).
  27. Wei, Z. G., Wu, R. L., Lavker, R. M., Sun, T. T. In vitro growth and differentiation of rabbit bulbar, fornix, and palpebral conjunctival epithelia: Implications on conjunctival epithelial transdifferentiation and stem cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 34 (5), 1814-1828 (1993).
  28. Kao, W. W. Y. Keratin expression by corneal and limbal stem cells during development. Experimental Eye Research. 200, 108206 (2020).
  29. Park, M., et al. Plasticity of ocular surface epithelia: Using a murine model of limbal stem cell deficiency to delineate metaplasia and transdifferentiation. Stem Cell Reports. 17 (11), 2451-2466 (2022).
  30. Li, J., et al. Identification for Differential Localization of Putative Corneal Epithelial Stem Cells in Mouse and Human. Scientific Reports. 7 (1), 5169 (2017).
  31. McKenna, C. C., Lwigale, P. Y. Innervation of the Mouse Cornea during Development. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (1), 30-35 (2011).
  32. He, J., Bazan, H. E. P. Neuroanatomy and Neurochemistry of Mouse Cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (2), 664-674 (2016).

Tags

إصابة القرنية ، إصابة قلوية ، تقنية لكمة تريفين ، نموذج الفأر ، شفاء القرنية ، عتامة القرنية ، إصابة كيميائية ، هيدروكسيد الصوديوم ، خزعة لكمة ، قرنية الفئران ، ليمبوس ، حرق كيميائي ، تقنية الاستئصال ، جرف الإنسي ، المجهر الحيوي للمصباح الشقي ، تلطيخ الفلوريسئين
تحريض إصابة القرنية والقلوية الداكنة حول القزحية باستخدام تقنية الثقب في نموذج الفأر
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shadmani, A., Dhowre, H. S., Ercal,… More

Shadmani, A., Dhowre, H. S., Ercal, O., Meng, X. Q., Wu, A. Y. Corneal and Limbal Alkali Injury Induction Using a Punch-Trephine Technique in a Mouse Model. J. Vis. Exp. (198), e65609, doi:10.3791/65609 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter