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कॉर्नियल और लिम्बल क्षार चोट प्रेरण एक माउस मॉडल में एक पंच-ट्रेफिन तकनीक का उपयोग कर

Published: August 4, 2023 doi: 10.3791/65609
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Department of Ophthalmology, Stanford University School of Medicine, 2McGill University Faculty of Medicine and Health Sciences

Summary

यह प्रोटोकॉल एक माउस मॉडल में एक सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य कॉर्नियल और लिम्बल क्षार चोट को प्रेरित करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है। प्रोटोकॉल फायदेमंद है क्योंकि यह अत्यधिक घुमावदार माउस कॉर्निया और लिम्बस को समान रूप से वितरित चोट के लिए अनुमति देता है।

Abstract

कॉर्निया दृष्टि के लिए महत्वपूर्ण है, और आघात के बाद कॉर्नियल उपचार इसकी पारदर्शिता और कार्य को बनाए रखने में मौलिक है। कॉर्नियल चोट मॉडल के अध्ययन के माध्यम से, शोधकर्ताओं का लक्ष्य है कि कॉर्निया कैसे ठीक होता है और कॉर्नियल अपारदर्शिता को रोकने और प्रबंधित करने के लिए रणनीति विकसित करता है। रासायनिक चोट सबसे लोकप्रिय चोट मॉडल में से एक है जिसका चूहों पर बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है। अधिकांश पिछले जांचकर्ताओं ने कॉर्नियल चोट को प्रेरित करने के लिए सोडियम हाइड्रॉक्साइड में भिगोए गए एक फ्लैट पेपर का उपयोग किया है। हालांकि, फ्लैट फिल्टर पेपर का उपयोग करके कॉर्नियल और लिम्बल चोट को प्रेरित करना अविश्वसनीय है, क्योंकि माउस कॉर्निया अत्यधिक घुमावदार है। यहां, हम एक नया उपकरण, एक संशोधित बायोप्सी पंच प्रस्तुत करते हैं, जो शोधकर्ताओं को म्यूरिन कॉर्निया और लिम्बस को एक अच्छी तरह से परिवृत्त, स्थानीयकृत और समान रूप से वितरित क्षार चोट बनाने में सक्षम बनाता है। यह पंच-ट्रेफिन विधि शोधकर्ताओं को रासायनिक से अप्रभावित अन्य संरचनाओं, जैसे पलकें छोड़ते हुए पूरे म्यूरिन कॉर्निया और लिम्बस को एक सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य रासायनिक जला प्रेरित करने में सक्षम बनाती है। इसके अलावा, यह अध्ययन एक एन्यूक्लिएशन तकनीक का परिचय देता है जो दुनिया के नाक पक्ष की पहचान करने के लिए औसत दर्जे का कारनकल को एक मील का पत्थर के रूप में संरक्षित करता है। इस तकनीक का उपयोग करके बल्ब और तालु कंजाक्तिवा, और लैक्रिमल ग्रंथि को भी बरकरार रखा जाता है। ओप्थाल्मोलॉजिक परीक्षाएं स्लिट लैंप बायोमाइक्रोस्कोप और फ्लोरेसिन धुंधला के माध्यम से 0, 1, 2, 6, 8 और 14 के बाद की चोट के बाद के दिनों में की गईं। नैदानिक, हिस्टोलॉजिकल, और इम्यूनोहिस्टोकेमिकल निष्कर्षों ने सभी प्रयोगात्मक चूहों में लिम्बल स्टेम सेल की कमी और ओकुलर सतह पुनर्जनन विफलता की पुष्टि की। प्रस्तुत क्षार कॉर्नियल चोट मॉडल लिम्बल स्टेम सेल की कमी, कॉर्नियल सूजन और फाइब्रोसिस के अध्ययन के लिए आदर्श है। यह विधि म्यूरिन कॉर्नियल सतह पर सामयिक नेत्र संबंधी दवाओं के पूर्व-नैदानिक और नैदानिक प्रभावकारिता की जांच के लिए भी उपयुक्त है।

Introduction

कॉर्निया दृष्टि के लिए महत्वपूर्ण है और पारदर्शिता सहित अद्वितीय विशेषताओं को प्रदर्शित करता है, जो स्पष्ट दृष्टि के लिए एक शर्त है। एक प्रमुख सुरक्षात्मक भूमिका निभाने के अलावा, कॉर्निया आंख की अपवर्तक शक्ति के 2/3 के लिए जिम्मेदार है1. दृष्टि में अपनी महत्वपूर्ण भूमिका के कारण, कॉर्नियल चोटों और अस्पष्टता महत्वपूर्ण दृश्य गिरावट का कारण बनती है और दुनिया भर में रोकथाम योग्य अंधापन के दूसरे सबसे बड़े कारण के लिए जिम्मेदार हैं 2,3. गंभीर अंग रोग के साथ कॉर्नियल चोटों में, लिंबस का बाधा कार्य कम हो जाता है, जिसके परिणामस्वरूप कॉर्नियल सतह और कॉर्नियल कंजंक्टिवलाइजेशन 4,5 की ओर नेत्रश्लेष्मला कोशिकाओं का प्रवास होता है, जो नाटकीय रूप से दृष्टि से समझौता करता है। इसलिए कॉर्नियल अंधापन और संबंधित विकलांगता के वैश्विक बोझ को संबोधित करने के लिए प्रभावी निवारक और चिकित्सीय रणनीतियों की आवश्यकता होती है।

मानव कॉर्नियल घाव भरने की प्रक्रिया की वर्तमान समझ पिछले अध्ययनों पर आधारित है जिन्होंने विभिन्न चोटों के लिए कॉर्नियल प्रतिक्रियाओं की जांच की है। कई तकनीकों और पशु मॉडल विभिन्न रासायनिक या यांत्रिक कॉर्नियल चोटों 6,7,8,9 प्रेरित करने और कॉर्नियल घाव भरने की प्रक्रिया के विभिन्न पहलुओं की जांच करने के लिए नियोजित किया गया है.

क्षार जला मॉडल एक अच्छी तरह से स्थापित चोट मॉडल है जो सीधे कॉर्नियल सतह पर सोडियम हाइड्रॉक्साइड (NaOH) लागू करके या फ्लैट फिल्टर पेपर10 का उपयोग करके किया जाता है। एक क्षार की चोट के परिणामस्वरूप प्रो-भड़काऊ मध्यस्थों की रिहाई और बहुरूपता कोशिकाओं की घुसपैठ न केवल आंख के कॉर्निया और पूर्वकाल कक्ष में बल्कि रेटिना में भी होती है। यह अनपेक्षित रेटिना नाड़ीग्रन्थि सेल apoptosis और CD45 + सेल सक्रियण11 लाती है. इसलिए, क्षार चोट मॉडल का उपयोग करके अत्यधिक अनपेक्षित चोट से बचने के लिए चोट स्थल को ठीक से स्थानीयकृत करना महत्वपूर्ण है।

मुराइन नेत्रगोलक की अक्षीय लंबाई लगभग 3 मिमी12 है। कॉर्निया और रेटिना के बीच इस छोटी दूरी के कारण, रेटिना (चित्रा 1 ए) पर प्रकाश केंद्रित करने के लिए उच्च अपवर्तक शक्ति प्रदान करने के लिए एक खड़ी कॉर्नियल वक्रता मौजूद है। जैसा कि हमने पहले13 की सूचना दी थी, एक फ्लैट फिल्टर पेपर का उपयोग करके इस अत्यधिक घुमावदार सतह पर रासायनिक चोट को प्रेरित करना मुश्किल है, खासकर लिम्बस (चित्रा 1बी)पर। अंग के लिए चोट उत्प्रेरण फिल्टर कागज, जो fornix और आसन्न कंजाक्तिवा14 के लिए अनपेक्षित चोट का कारण बनने की क्षमता है झुकाव की आवश्यकता है. एक अन्य दृष्टिकोण में रासायनिक एजेंट को सीधे कॉर्नियल सतह पर बूंदों के रूप में लागू करना शामिल है। हालांकि, इस विधि में एक्सपोज़र समय पर नियंत्रण का अभाव है, और इन क्षेत्रों में तरल के प्रसार के कारण कंजाक्तिवा, फोर्निक्स और पलकों को चोट लगने का एक संभावित जोखिम है।

इन सीमाओं को दूर करने के लिए, यह अध्ययन चोट को प्रेरित करने के लिए एक उपन्यास पंच-ट्रेफिन विधि प्रस्तुत करता है। इस तकनीक के कई फायदे हैं (i) माउस मॉडल में पूरे कॉर्नियल सतह और लिम्बस के लिए एक प्रभावी रासायनिक चोट को प्रेरित करना, (ii) कॉर्निया को एक स्थानीय और अच्छी तरह से परिचालित चोट को प्रेरित करना, (iii) पूर्व निर्धारित अवधि के लिए ब्याज के किसी भी तरल को लागू करने की क्षमता, और (iv) उपयुक्त बायोप्सी घूंसे का चयन करके कॉर्नियल चोटों के विभिन्न आकारों को प्रेरित करने की क्षमता। यह विधि चूहे और खरगोश की चोट के मॉडल के लिए भी संभव है, जो एक घुमावदार कॉर्नियल सतह भी प्रदर्शित करते हैं और ओकुलर सतह घाव भरने का अध्ययन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले सामान्य पशु मॉडल हैं।

Protocol

सभी प्रक्रियाओं को स्टैनफोर्ड प्रयोगशाला पशु देखभाल APLAC संख्या 33420, वैज्ञानिक उद्देश्यों के लिए जानवरों के उपयोग और नेत्र और दृष्टि अनुसंधान में जानवरों के उपयोग के लिए ARVO स्टेटमेंट के अनुसार किया गया था। इरविंग एल. वीसमैन प्रयोगशाला द्वारा 10-57 सप्ताह की आयु के कुल 6 नर और मादा C8BL/12 चूहों को उदारतापूर्वक प्रदान किया गया था। जानवरों को 12 घंटे के प्रकाश-अंधेरे चक्र के लिए अनुकूलित किया गया था और पानी और फ़ीड एड लिबिटम के साथ प्रदान किया गया था। जानवर की एक आंख में चोट लगी थी।

1. प्रयोग के लिए तैयारी

  1. सामग्री की तैयारी
    नोट: सभी अभिकर्मकों को कमरे के तापमान पर बनाए रखा जाना है।
    1. पंच-ट्रेफिन तैयार करें: 3.5 मिमी के व्यास के साथ एक बायोप्सी पंच तैयार करें और पंच के शाफ्ट को अपने बाहर के किनारे से 5 मिमी दूर चिह्नित करें। पंच को मजबूती से चिपकाएं और दो-स्पीड रोटरी टूल का उपयोग करके इसके शाफ्ट के चिह्नित बाहर के हिस्से को काट लें। इस प्रक्रिया के दौरान ओकुलर सुरक्षा पहनें। शाफ्ट को 3.5 मिमी गहराई पर काटें और अंतिम 1.5 मिमी संलग्न छोड़ दें। टिप 90 ° मोड़, चित्र 1 में दिखाया गया के रूप में.
    2. आसुत जल के 50 एमएल में 1 ग्राम NaOH भंग करके 0.5 एम NaOH समाधान तैयार करें.
    3. 100 मिलीग्राम/एमएल केटामाइन के 2 एमएल और 20 मिलीग्राम/एमएल xylazine के 1 एमएल के संयोजन से संवेदनाहारी कॉकटेल के 10 एमएल तैयार करें। इंजेक्शन से पहले, 0.9% NaCl (सामान्य खारा) के 7 एमएल के साथ इस मिश्रण पतला.
    4. बाँझ फॉस्फेट-बफर खारा (1x पीबीएस) के 9.9 एमएल में 10% एके-फ्लोर फ्लोरोसेंट तरल के 0.1 एमएल जोड़कर 0.1% फ्लोरेसिन सोडियम समाधान तैयार करें।
    5. आसुत जल के 900 एमएल में 8 ग्राम NaCl, 0.2 ग्राम KCl, 1.44 ग्राम Na2HPO4, और 0.23 ग्राम NaH2PO4को भंग करके पीबीएस (1x) तैयार करें। समाधान के पीएच को 7.4 पर समायोजित करें। आसुत जल जोड़कर समाधान को 1 एल की अंतिम मात्रा में लाएं।
    6. निर्धारण के लिए 4% paraformaldehyde (पीएफए) समाधान तैयार करें. एक रासायनिक हुड के तहत, पीबीएस के 45 एमएल में 2 ग्राम पीएफए भंग. मिश्रण को 65 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें और इसके पीएच को 7.4 तक टाइट्रेट करें। एक बार पीएफए भंग हो जाने के बाद, समाधान को 50 एमएल की अंतिम मात्रा में लाएं।

2. पशु तैयारी

  1. इंजेक्शन के लिए संवेदनाहारी कॉकटेल की उचित मात्रा निर्धारित करने के लिए माउस वजन. Machholz et al.15 में वर्णित माउस को ठीक से संभालने और रोकने के बाद, 0.01 एमएल/जी16,17 की खुराक पर संवेदनाहारी कॉकटेल इंट्रापेरिटोनली (आईपी) का प्रशासन करें। अंग क्षति को रोकने के लिए आईपी इंजेक्शन के लिए अवर पेट quadrants लक्ष्य.
  2. सर्जरी के दौरान और बाद में अतिरिक्त एनाल्जेसिया के लिए चमड़े के नीचे ब्यूप्रेनोर्फिन विस्तारित-रिलीज इंजेक्टेबल सस्पेंशन (3.25 मिलीग्राम / किग्रा) इंजेक्ट करें क्योंकि कॉर्नियल क्षार की चोट बेहद दर्दनाक है।
  3. संज्ञाहरण का एक गहरा विमान प्राप्त होने तक प्रतीक्षा करें। संज्ञाहरण के एक सफल गहरे विमान के संकेत के रूप में पैर की अंगुली चुटकी की प्रतिक्रिया की कमी के लिए जाँच करें। सर्जरी शुरू करने से पहले इसे सूखापन से बचाने के लिए contralateral आंख के लिए सरल आंख मरहम लागू करें।
  4. संज्ञाहरण के बाद, मानक कृंतक सर्जरी सिद्धांतों18 के अनुसार तैयार शल्य चिकित्सा मेज पर माउस जगह है. कृंतक के सिर के नीचे एक 5 मिमी ऊंचा तकिया रखें, पार्श्व डिकुबिटस स्थिति में स्थित हो। तकिया सर्जरी के दौरान कृंतक के सिर का समर्थन करने में मदद करता है।
  5. आगे संज्ञाहरण के लिए टेट्राकाइन हाइड्रोक्लोराइड (0.5%) आंखों की बूंदों का प्रशासन करें। सर्जिकल आई स्पीयर से ओकुलर सतह को ठीक से सुखाएं और पलकों को ट्रिम करें।

3. क्षार की चोट का प्रेरण

  1. सर्जरी शुरू करने से पहले, मानक कृंतक सर्जरी सिद्धांतों18,19 के अनुसार सर्जरी तालिका का आयोजन और सर्जरी के दौरान शल्य चिकित्सा क्षेत्र बाँझ रखने. ठीक से संवेदनाहारी माउस कल्पना और 30 एस करने के लिए टाइमर समायोजित करने के लिए शल्य चिकित्सा खुर्दबीन स्थिति. rinsing प्रक्रिया के दौरान अनपेक्षित नाक आकांक्षा को रोकने के लिए जानवर के थूथन पर एक मुड़ कागज तौलिया रखें.
  2. सर्जिकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके अंग क्षेत्र परिधि का निर्धारण करें, जबकि यह सुनिश्चित करना कि माउस की पलकें अंगूठे और तर्जनी का उपयोग करके खुली हैं। धीरे से आंख की धुरी के समानांतर साफ पंच-ट्रेफिन पकड़ो, बिना किसी नीचे की ओर दबाव लागू किए। साधन को घुमाने से बचें और पंच-ट्रेफिन की धुरी को ग्लोब की धुरी के समानांतर रखें।
  3. सर्जिकल सहायक को उपकरण को भरने और कॉर्नियल सतह को उचित रूप से कवर करने के लिए पंच-ट्रेफिन के छेद में NaOH समाधान (40 μL के बराबर) की 3 बूंदों को छोड़ने के लिए कहें। तरल की सतह तनाव उपकरण (चित्रा 1) से बाहर किसी भी रिसाव को रोकता है।
    नोट: हमने 27G सुई के साथ 1 मिमी सिरिंज का उपयोग किया, जिसमें NaOH समाधान को ध्यान से छोड़ने के लिए 50 ° पर एक चपटा टिप लगाया गया।
  4. 30 एस के बाद, तुरंत पीबीएस (1x) के 5 एमएल के साथ कॉर्निया और फोर्निक्स कुल्ला। वीडियो 1 रासायनिक चोट को प्रेरित करने की प्रक्रिया को प्रदर्शित करता है।
  5. घायल आंख की कॉर्नियल सतह पर 7 - 7.5 का पीएच सुनिश्चित करने के लिए एक सार्वभौमिक पीएच संकेतक पेपर का उपयोग करें। फिर, रासायनिक रूप से घायल ओकुलर सतह पर ट्रिपल-एंटीबायोटिक नेत्र मरहम लागू करें।
    नोट: सर्जरी के दौरान पूंछ आंदोलन कम संवेदनाहारी गहराई का संकेत है। एक संवेदनाहारी [बोलस आईपी (प्रारंभिक मात्रा का 50%) इंजेक्ट करके अतिरिक्त संवेदनाहारी कॉकटेल (केटामाइन + xylazine) लागू करें।
  6. सर्जरी के बाद, पुष्टि करें कि माउस एक स्थिर स्थिति में है. यदि जानवर दर्द में है तो दूसरे ब्यूप्रेनोर्फिन का प्रशासन करें। 2.2 की तरह ही हैंडलिंग तकनीक का उपयोग करें। पश्चात परीक्षा शुरू करते हैं, जबकि पशु संज्ञाहरण के तहत है.
  7. प्रक्रिया के बाद, 70% इथेनॉल के साथ पंच-ट्रेफिन और सर्जिकल टेबल को धोएं, सुखाएं और साफ करें।

4. नैदानिक मूल्यांकन

  1. परीक्षा के लिए, माउस anesthetize के रूप में पहले चरण 2.1 में वर्णित है.
  2. एक भट्ठा-दीपक बायोमाइक्रोस्कोप के तहत आंखों (घायल और गैर-घायल) की जांच करें। फ़ोटो कैप्चर करने के लिए एक कैमरे का उपयोग करें (इस अध्ययन में, सिनेमैटिक मोड में एक फोन कैमरा का उपयोग किया गया था)।
  3. Yoeruek ग्रेडिंग सिस्टम20: 0 = सामान्य, स्पष्ट कॉर्निया के अनुसार कॉर्नियल अस्पष्टता स्कोर करें; 1 = हल्की अस्पष्टता; 2 = अधिक अस्पष्टता, लेकिन परितारिका और पुतली आसानी से अलग हैं; 3 = आईरिस और पुतली मुश्किल से अलग हैं; 4 = कॉर्निया एक अदृश्य पुतली के साथ पूरी तरह से अपारदर्शी है।
  4. 0.1% फ्लोरेसिन आई ड्रॉप लागू करें। एक कपास आवेदक के साथ अतिरिक्त फ्लोरोसेंट तरल सूखी और कोबाल्ट नीले फिल्टर का उपयोग कॉर्नियल उपकला दोष की उपस्थिति के लिए मूल्यांकन. तस्वीरें कैप्चर करें।
  5. जानवर की निगरानी करें जब तक कि यह स्टर्नल पुनरावृत्ति को बनाए रखने के लिए पर्याप्त चेतना प्राप्त न कर ले। जानवर को अन्य जानवरों के लिए फिर से पेश न करें जब तक कि वह पूरी तरह से ठीक न हो जाए।

5. संकेंद्रीकरण

  1. Euthanize चूहों 2 सप्ताह में गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा रासायनिक चोट प्रेरण के बाद 3-5 एस21.
  2. निम्नलिखित क्रम में औसत दर्जे का caruncle और पूरे palpebral कंजाक्तिवा को संरक्षित करते हुए आंख को संयुक्तित करें, जैसा कि वीडियो 2 में दिखाया गया है।
  3. सर्जिकल माइक्रोस्कोप के तहत, कारनकल और त्वचा के जंक्शन को ध्यान से काटना। दांत संदंश का प्रयोग, caruncle वापस लेने और tarsal प्लेट के साथ अपने जंक्शन की ओर palpebral कंजाक्तिवा के तहत शल्य कैंची की नोक गाइड.
  4. पार्श्व कैंथस की ओर आसंजन रेखा के साथ कंजाक्तिवा को काटें। फिर, subconjunctival विमान पर कंजाक्तिवा और अवर tarsal प्लेट के जंक्शन के लिए शल्य कैंची बारी.
  5. नेत्रश्लेष्मला विच्छेदन को पूरा करने के बाद, अंगूठे और तर्जनी के साथ नाक की तरफ से बेहतर और अवर पलकें वापस ले लें। पीछे हटते समय, ऑप्टिक तंत्रिका की ओर उभरे हुए लैक्रिमल के पीछे एक घुमावदार-टिप चिमटी की नोक का मार्गदर्शन करें। दृढ़ता से ऑप्टिक तंत्रिका समझ और ग्लोब (चित्रा 2) निकालने.
  6. पीबीएस (1x) के साथ ग्लोब कुल्ला और यह फिक्सिंग समाधान में हस्तांतरण.

6. हेमेटोक्सिलिन और ईोसिन (एच एंड ई) और आवधिक एसिड-शिफ (पीएएस) धुंधला हो जाना

  1. कमरे के तापमान पर रातोंरात 10% फॉर्मेलिन समाधान में ग्लोब को ठीक करें।
  2. 70% इथेनॉल, 80% इथेनॉल, 90% इथेनॉल, और 100% इथेनॉल की सांद्रता के साथ वर्गीकृत शराब की अनुक्रमिक श्रृंखला का उपयोग करके ऊतकों को निर्जलित करें, प्रत्येक 10-15 मिनट के लिए। इसके बाद, 10 मिनट के लिए xylene में आंखों विसर्जित कर दिया. अंत में, आंखों को पैराफिन में बंद करें।
  3. पैराफिन ब्लॉकों को 6 माइक्रोन मोटी स्लाइस में अनुभाग करें और उन्हें हेमेटोक्सिलिन और ईोसिन (एच एंड ई) और आवधिक एसिड-शिफ (पीएएस) धुंधला के लिए ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड पर माउंट करें, जैसा कि पूरक फ़ाइल 1में वर्णित है।

7. इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग और विश्लेषण

  1. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री अध्ययन (आईएचसी) के लिए, पीबीएस (1x) के 1 एमएल में आंखों को ठीक करें जिसमें रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर 4% पीएफए होता है। प्रत्येक 5 मिनट के लिए पीबीएस (1x) के 1 एमएल में नमूना 3x धो लें।
  2. बर्फ क्रिस्टल गठन को रोकने के लिए और प्रोटीन की आणविक संरचनाओं की रक्षा के लिए, 10% सुक्रोज, 20% सुक्रोज, और पीबीएस में 30% सुक्रोज सांद्रता के साथ धारावाहिक सुक्रोज संतृप्ति प्रदर्शन. ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी समाधान में ग्लोब एम्बेड करें (OCT; चित्रा 2), और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. 12 माइक्रोन मोटी स्लाइस में अक्टूबर ब्लॉक अनुभाग और आईएचसी धुंधला के लिए ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड पर माउंट.
  4. 15 मिनट के लिए पीबीएस (1x) में 0.1% ट्राइटन एक्स -100 में माइक्रोस्कोप स्लाइड पर ऊतक वर्गों पारगम्यता. फिर, कमरे के तापमान पर अतिरिक्त 1 घंटे के लिए पीबीएस (1x) में 5% बीएसए के साथ निरर्थक एंटीजन को ब्लॉक करें।
  5. 1% बीएसए युक्त पीबीएस (1x) में तैयार लक्षित प्राथमिक एंटीबॉडी के कॉकटेल में रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर माइक्रोस्कोप स्लाइड पर ऊतक वर्गों सेते हैं. इस प्रयोग में, प्राथमिक एंटीबॉडी क्रमशः 1:100 पतला खरगोश एंटी-केराटिन 13 (K13) और एंटी-केराटिन 12 (K12) एंटीबॉडी क्रमशः 2.24 μg/mL और 1.56 μg/mL की एकाग्रता के साथ थे।
  6. इनक्यूबेशन बाद, पीबीएस (1x) के साथ माइक्रोस्कोप स्लाइड 3x पर ऊतक वर्गों धो लें. इसके बाद, 1:500 पतला गधा विरोधी खरगोश-आईजीजी के साथ बाध्य प्राथमिक एंटीबॉडी का पता लगाएं। अंधेरे में 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ सेते हैं. फिर पीबीएस (1x) 3x में 5 मिनट प्रत्येक के लिए धो लें।
  7. एंटी-फीका प्रतिदीप्ति बढ़ते माध्यम की एक बूंद लागू करें जिसमें माइक्रोस्कोप पर ऊतक वर्गों पर डीएपीआई होता है और एक कवरस्लिप के साथ कवर होता है। नमूनों को अंधेरे में सूखने दें और सामान्य और घायल आंखों के लिए एक ही लेजर सेटिंग के साथ फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत उनकी जांच करें।

Representative Results

लिम्बल स्टेम सेल की कमी को प्रेरित करने में विधि की प्रभावकारिता (LSCD) LSCD के नैदानिक और ऊतकीय संकेतों का मूल्यांकन करके मूल्यांकन किया गया था। नैदानिक मूल्यांकन भट्ठा-दीपक माइक्रोस्कोपी और पूर्वकाल खंड- ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी (एएस-ओसीटी) इमेजिंग (चित्रा 3 और चित्रा 4) द्वारा किया गया था।

पुन: उपकलाकरण एक केन्द्रापसारक तरीके से हुआ और इसके नाक के हिस्से की तुलना में कॉर्निया के अस्थायी भाग में तेज था। घायल आंखें रासायनिक चोट (चित्रा 3) के तुरंत बाद 2 + -3 + कॉर्नियल धुंध विकसित हुईं। उपकला कोशिकाएं अंग की चोट के बाद कंजाक्तिवा से कॉर्नियल सतह पर चली गईं। बड़े कॉर्नियल उपकला दोष को 12-14 दिनों में पूरी तरह से फिर से उपकला किया गया था, जो समान आकार और बरकरार तहखाने झिल्ली और स्ट्रोमा की कॉर्नियल उपकला चोट की तुलना में अधिक समय लेता था जो आमतौर पर चोट के बाद 5 दिनों के भीतर ठीक हो जाता था 8,9. एलएससीडी के कारण, घायल आंखों के 50% ने दूसरे सप्ताह के अंत में लगातार उपकला दोष विकसित किए (चित्र 3)। कॉर्नियल एडिमा पहले कुछ दिनों (चित्रा 3, चित्रा 4) के दौरान अधिक प्रमुख था, जबकि कॉर्नियल फाइब्रोसिस दूसरे सप्ताह में महत्वपूर्ण था जिसके परिणामस्वरूप 100% घायल आंखों में 4+ कॉर्नियल अस्पष्टता हुई।

नवसंवहनीकरण (एनवी) के शुरुआती लक्षण चिकित्सकीय और हिस्टोलॉजिकल रूप से देखे गए थे, रासायनिक चोट प्रेरण के बाद 24 घंटे, जैसा कि चित्रा 5 में दिखाया गया है, क्वांटा एट अल द्वारा पहचाने गए एनवी की समयरेखा के अनुरूप अध्ययन जो चोट22 के बाद लिम्बल एनवी 24 एच का संकेत दिखाता है। उपचार प्रक्रिया के दौरान, नए जहाजों को परिपक्व किया गया और चोट के 14 वें दिन तक, एनवी ने लिम्बस को पार कर लिया और केंद्रीय कॉर्निया तक पहुंच गया। लिम्बस, जो कंजाक्तिवा और कॉर्निया के बीच की सीमा को परिभाषित करता है, नष्ट हो गया था।

लिम्बल स्टेम सेल की कमी और नेत्रश्लेष्म के ऊतकीय साक्ष्य पीएएस + गॉब्लेट कोशिकाओं और स्ट्रोमल रक्त वाहिकाओं23,24,25,26की उपस्थिति से देखे गए थे। गॉब्लेट कोशिकाओं को वर्तमान चोट मॉडल में देखा गया और चित्रा 6 में तीर द्वारा इंगित किया गया।

कंजंक्टिवल और कॉर्नियल एपिथेलिया मुख्य रूप से क्रमशः अद्वितीय केराटिन, K13 और K12 व्यक्त करतेहैं। लिम्बल की चोट के बाद, कंजाक्तिवा से उत्पन्न नई उपकला कोशिकाओं ने अनाच्छादित कॉर्निया को कवर किया, और K12 को चोट के बाद 2 सप्ताह के दौरान किसी भी घायल जानवर की कॉर्नियल सतह पर व्यक्त नहीं किया गया था। यह खोज, अन्य अध्ययनों28 के अनुरूप, पूर्ण एलएससीडी और कॉर्नियल सतह पर कॉर्नियल उपकला कोशिकाओं की अनुपस्थिति का संकेत दिया. हालांकि, पार्क एट अल.29 द्वारा किए गए अध्ययन में, उन्होंने चोट के 20 और 32 सप्ताह बाद K12 अभिव्यक्ति का पता लगाया, उपकला कोशिकाओं के संभावित ट्रांस-भेदभाव का सुझाव दिया।

नतीजतन, हमने देखा कि रासायनिक चोट ने लिम्बस और लिम्बल स्टेम कोशिकाओं को नष्ट कर दिया, जिसके परिणामस्वरूप नेत्रश्लेष्मला उपकला कोशिकाओं का कॉर्निया के केंद्र में प्रवास हुआ ताकि कॉर्नियल सतह को कवर किया जा सके। यह आगे नेत्रश्लेष्मला उपकला सेल मार्कर, K13, जो पूरे कंजाक्तिवा और कॉर्नियल सतहों में व्यक्त किया गया था के रूप में चित्रा 7 में दिखाया गया द्वारा मान्य है.

Figure 1
चित्रा 1: सामान्य माउस दाहिनी आंख और कॉर्नियल और लिम्बल चोट उत्प्रेरण के लिए पंच-ट्रेफिन । (ए) अत्यधिक घुमावदार कॉर्निया के साथ माउस आंख दिखा पार्श्व दृश्य (तीर के निशान लिम्बस को इंगित करते हैं)। (बी) छवि दर्शाती है कि एक बड़ा फिल्टर पेपर भी लिम्बल क्षेत्र को पर्याप्त रूप से कवर करने के लिए अपर्याप्त है। माउस आंख के लिंबस से limbus व्यास लगभग 4 मिमी और 4.5 मिमी के एक बाहरी व्यास और 3.5 मिमी (पैनल डी और एच) के आंतरिक व्यास के साथ एक पंच बायोप्सी है, उचित रूप से कॉर्निया और अंग सतह को कवर किया गया के रूप में पैनल में दिखाया गया है (सी) और (ई). (एफ) पंच-ट्रेफिन उचित रूप से लिम्बल क्षेत्र के आसपास दुनिया भर में आयोजित किया जाता है। (जी) यह सुनिश्चित करने के लिए कि पंच-ट्रेफिन के किनारे के माध्यम से कोई रिसाव नहीं है, ग्लोब के साथ समानांतर अक्ष में पंच-ट्रेफिन को उचित रूप से स्थिति देने के बाद, छेद मेथिलीन नीले रंग से भर जाता है। मेथिलीन ब्लू का कोई रिसाव नहीं पाया गया है। स्केल बार = 1 मिमी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: एन्यूक्लियेटेड आंखें। (ए) बल्ब और तालु कंजाक्तिवा, लैक्रिमल ग्रंथि (एरोहेड), और ऑप्टिक तंत्रिका (तीर) को संरक्षित करते हुए आंखों को एन्यूक्लियेट किया गया था। क्रायोक्रिस्टल गठन से बचाने के लिए सामान्य (बी) और घायल (सी) आंखों को 30% सुक्रोज में संतृप्त किया गया था। ग्लोब का नाक हिस्सा नाक कारनकल (लेबल एन) के माध्यम से पहचानने योग्य है। स्केल बार = 1 मिमी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: बाईं आंख का घाव भरना। माउस मॉडल में कॉर्नियल और लिम्बल क्षार की चोट के बाद 2 सप्ताह के दौरान बाएं माउस आंख की घाव भरने की प्रक्रिया यहां (ए-एफ) दिखाई गई है। आंख की झिरी लैंप जांच। कॉर्नियल एडिमा 0 और 2 (ए, बी) दिनों में अधिक प्रमुख है, जबकि फाइब्रोसिस दूसरे सप्ताह के बाद की चोट (ई-एफ) के दौरान अधिक स्पष्ट है। A.f-F.f एक ही आंख की पुन: उपकलाकरण प्रक्रिया दिखाते हैं। चोट के तुरंत बाद कुल कॉर्नियल और लिम्बल एपिथेलियल दोष एएफ में पाया गया है। उपकला दोष 12-14 दिनों (एएफ-एफएफ) द्वारा एक केन्द्रापसारक पैटर्न में नेत्रश्लेष्मला उपकला कोशिका प्रवास द्वारा ठीक हो गया। हालांकि, 50% घायल आंखों ने दूसरे सप्ताह के अंत में लगातार उपकला दोष विकसित किया जैसा कि एफ और एफ एफ छवियों में तीर द्वारा दिखाया गया है। स्केल बार = 1 मिमी (पैनल सी)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: माउस आंख के पूर्वकाल खंड ओसीटी। (ए) एएस-ओसीटी सामान्य कॉर्निया वक्रता और पूर्वकाल कक्ष को दिखाता है। आईरिस संरचना अच्छी तरह से परिभाषित और पहचानने योग्य है। आईरिस के मध्य-परिधि पर कोई इरिडोकोर्नियल आसंजन पता लगाने योग्य नहीं है। (बी) चोट के तुरंत बाद एडिमा गठन के कारण कॉर्नियल मोटाई बढ़ जाती है और आईरिस के मध्य परिधि में इरिडोकोर्नियल आसंजन विकसित होता है। (सी) चोट के दो सप्ताह बाद कॉर्नियल वक्रता बदल गई है और पूर्वकाल कक्ष विनाश के साथ कुल इरिडोकोर्नियल आसंजन दिखाई दे रहा है। स्केल बार = 1 मिमी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: कॉर्नियल नवसंवहनीकरण। सोडियम हाइड्रॉक्साइड (NaOH) की चोट के बाद घाव भरने की प्रक्रिया के दौरान कॉर्नियल नवसंवहनीकरण के नैदानिक और ऊतकीय संकेत देखे जा सकते हैं। (ए) नवसंवहनीकरण के प्रारंभिक लक्षण चोट के बाद पहले दिन पता लगाने योग्य हो जाते हैं, जो कॉर्निया के लाल रंग के मलिनकिरण (एक सफेद तीर द्वारा इंगित) की विशेषता है। यह मलिनकिरण स्ट्रोमा में लाल रक्त कोशिकाओं के एकत्रीकरण के परिणामस्वरूप होता है, जैसा कि संबंधित हिस्टोलॉजिकल छवि (डी) (पीले तीर के निशान द्वारा इंगित) में दिखाया गया है। (बी) उत्थान के पहले सप्ताह में, नए जहाजों में उत्तरोत्तर वृद्धि होती है और पूरे कॉर्निया में फैल जाती है। (सी) 2 सप्ताह के अंत तक, लिम्बल क्षेत्र नष्ट हो जाता है, और नए जहाजों का विकास जारी रहता है। (ई) कॉर्निया का हिस्टोलॉजिकल सेक्शन आगे गहरे स्ट्रोमल नवसंवहनीकरण (तीर के सिरों द्वारा दिखाया गया) की उपस्थिति को दर्शाता है। भट्ठा लैंप छवि स्केल बार = 1 मिमी, ऊतक विज्ञान छवि स्केल बार = 50 माइक्रोन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: आवधिक एसिड-शिफ और इम्यूनोहिस्टोकेमिकल (आईएचसी) कॉर्निया का धुंधलापन। सामान्य और घायल कॉर्निया के आवधिक एसिड-शिफ और इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला चोट के 2 सप्ताह बाद किया गया था। सामान्य माउस कॉर्नियल एपिथेलियम कोशिकाओं (ए) की 4-5 परतों से बना होता है। कॉर्निया और लिम्बस के लिए क्षार की चोट ने कॉर्निया की सतह पर गॉब्लेट कोशिकाओं की उपस्थिति के साथ कॉर्निया के संयोजन का नेतृत्व किया जैसा कि (डी) में काले तीरों द्वारा दिखाया गया है। सामान्य कॉर्नियल उपकला कोशिकाएं K12 (B) को व्यक्त करती हैं, जो घायल कॉर्निया (E) को कवर करने वाली नेत्रश्लेष्मला कोशिकाओं द्वारा व्यक्त नहीं की जाती हैं। K13, नेत्रश्लेष्मला उपकला कोशिकाओं का एक विशेषता मार्कर, सामान्य कॉर्नियल उपकला कोशिकाओं (सी) पर व्यक्त नहीं किया जाता है। हालांकि, यह सोडियम हाइड्रॉक्साइड (NaOH) घायल कॉर्नियल सतह पर मौजूद है जो कॉर्नियल कंजंक्टिवलाइजेशन (F) का संकेत है। हिस्टोलॉजी छवि स्केल बार = 50 माइक्रोन, आईएचसी सना हुआ छवि स्केल बार = 20 माइक्रोन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: हेमेटोक्सिलिन और ईोसिन और इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला। हेमेटोक्सिलिन और ईोसिन (एच एंड ई) और सामान्य और घायल लिंबस ऊतक के इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला हो गया था। (ए) सामान्य अंग श्वेतपटल के अंत और कॉर्निया की शुरुआत के बीच संक्रमण क्षेत्र को चिह्नित करता है। यह क्षेत्र आमतौर पर नेत्रश्लेष्मला उपकला कोशिकाओं (तीर द्वारा इंगित) की एक या दो परतों द्वारा कवर किया जाता है। एक स्वस्थ आंख में, K12 नामक एक विशिष्ट कॉर्नियल उपकला मार्कर की अभिव्यक्ति लिम्बस से शुरू होती है और कॉर्निया की सतह तक फैली हुई है (छवि बी में दिखाया गया है)। दूसरी ओर, K13 के रूप में जाना जाने वाला एक नेत्रश्लेष्मला मार्कर की अभिव्यक्ति लिम्बस तक ही सीमित है और इससे आगे नहीं बढ़ती है (छवि C में सफेद तीर द्वारा इंगित)। सोडियम हाइड्रॉक्साइड (NaOH) द्वारा घायल आंखों में, लिम्बस की सीमाएं बाधित होती हैं। इससे घायल कॉर्निया की ओर नेत्रश्लेष्मला कोशिकाओं का प्रवास होता है। (डी) NaOH- घायल लिंबस की छवियां उपकला परत के नीचे और स्ट्रोमल ऊतक के भीतर नवसंवहनीकरण की उपस्थिति को प्रदर्शित करती हैं। चोट के बाद, घायल कॉर्नियल सतह में K12 (E) की उपस्थिति का अभाव होता है, जबकि K13 कॉर्नियल सतह (F) पर बहुतायत से व्यक्त किया जाता है। ऊतक विज्ञान छवि पैमाने पट्टी = 50 माइक्रोन, आईएचसी सना हुआ छवि पैमाने पट्टी = 100 माइक्रोन. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फ़ाइल 1: धुंधला प्रोटोकॉल. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

वीडियो 1: एक पंच-ट्रेफिन के साथ एक माउस मॉडल में NaOH कॉर्नियल और लिम्बल चोट। वीडियो एक पंच-ट्रेफिन के साथ माउस मॉडल में NaOH कॉर्नियल और लिम्बल चोट को प्रेरित करने की प्रक्रिया को प्रदर्शित करता है। ग्लोब के साथ समानांतर अक्ष में पंच-ट्रेफिन को पकड़ना और लिम्बस पर न्यूनतम दबाव लागू करना महत्वपूर्ण है। रिसाव को रोकने और इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए यह उचित तकनीक आवश्यक है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

वीडियो 2: बल्ब कंजाक्तिवा को संरक्षित करते हुए संलयन तकनीक का चित्रण। लौकिक पक्ष से ग्लोब के नाक पक्ष को अलग करने के लिए, नाक कैरुनकल को ग्लोब के साथ संरक्षित किया जाता है। पूरे कंजाक्तिवा को उसके जंक्शन से शुरू होकर टार्सल प्लेट तक विच्छेदित किया जाता है। न्यूनतम दबाव के साथ, कक्षीय सामग्री बाहर की ओर फैलती है। ग्लोब के पीछे की ओर संदंश का मार्गदर्शन करके, ऑप्टिक तंत्रिका को पकड़ लिया जाता है, और ऊतक निकाला जाता है। एन्यूक्लियेटेड ऊतक में ग्लोब, कक्षीय वसा और कक्षीय लैक्रिमल ग्रंथि शामिल हैं। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

यह अध्ययन एक अभिनव उपकरण, पंच-ट्रेफिन का प्रस्ताव करता है, जिसका उपयोग माउस मॉडल में एक प्रभावी और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य कॉर्नियल और लिम्बल चोट को सफलतापूर्वक प्रेरित करने के लिए किया जा सकता है। यह लिम्बल स्टेम सेल की कमी मॉडल चोट के बाद कॉर्नियल घाव भरने और कंजंक्टिवलाइजेशन की गतिशीलता की जांच करने के लिए आदर्श है।

साक्ष्य बताते हैं कि दोनों लिम्बल आला और murine कॉर्निया के मध्य भाग स्टेम सेल30 होते हैं. इसलिए, स्टेम सेल की कमी के मॉडल का उत्पादन करने के लिए एक कुशल कॉर्नियल और लिम्बल चोट की आवश्यकता होती है, और यहां प्रस्तुत चोट मॉडल एक विशिष्ट अवधि के लिए एक रासायनिक एजेंट को घुमावदार कॉर्नियल लिंबस के संपर्क में सक्षम बनाता है। NaOH चोट की सर्वोत्तम एकाग्रता और अवधि निर्धारित करने के लिए, विभिन्न NaOH सांद्रता और अवधि के साथ चोटों को भड़काया गया था। उच्च NaOH सांद्रता या लंबे समय तक जोखिम अवधि के परिणामस्वरूप ऊतक क्षति और फाइब्रोसिस में वृद्धि हुई। इसलिए, शोधकर्ता अपने अध्ययन के विशिष्ट लक्ष्यों और चोट की वांछित गंभीरता के आधार पर इन मापदंडों को समायोजित कर सकते हैं।

इस कॉर्नियल और लिम्बल चोट मॉडल को सफलतापूर्वक पुन: पेश करने के लिए, कई महत्वपूर्ण विचारों पर विचार किया जाना चाहिए। सबसे पहले, पंच के उचित आकार को निर्धारित करने के लिए लक्षित आंख के अंग-से-अंग व्यास को मापना अनिवार्य है। एक बाहरी व्यास के साथ एक बायोप्सी पंच का चयन करना जो इस व्यास से 0.5 - 1 मिमी बड़ा है।

उपयोग किए गए तरल की सतह तनाव ओकुलर सतह और पंच ट्रेफिन के किनारे के बीच इंटरफेस पर रिसाव को रोकने में एक महत्वपूर्ण कारक है जैसा कि चित्र 1 जी में दिखाया गया है। इसलिए, पंच बायोप्सी की नोक पर दबाव लागू करने की कोई आवश्यकता नहीं है।

ऊतक को यांत्रिक क्षति के कारण से बचने के लिए, आंख के साथ समानांतर अक्ष में पंच ट्रेफिन को पकड़ना और लिम्बस पर दबाव डालने से बचना महत्वपूर्ण है। पंच ट्रेफिन अक्ष के अनुचित समायोजन से रिसाव का खतरा बढ़ सकता है और इसके परिणामस्वरूप चोट की एक घटिया साइट और गलत परिणाम हो सकते हैं।

इस तकनीक की कुछ संभावित सीमाओं में उपयुक्त पंच आकार का चयन करने की आवश्यकता, पंच ट्रेफिन को पकड़ने में दक्षता प्राप्त करना और यांत्रिक चोट लगने का संभावित जोखिम शामिल है। हालांकि, इन सीमाओं को अभ्यास के माध्यम से और इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित निर्देशों का पालन करके दूर किया जा सकता है। चूहों की तनाव और आयु सीमा अन्य कारक हैं जो पुन: उपकलाकरण प्रक्रिया को प्रभावित करते हैं और अध्ययन में विचार किया जाना चाहिए।

इसके अलावा, प्रस्तावित प्रोटोकॉल फायदेमंद है क्योंकि यह एक स्पष्टीकरण विधि का विवरण देता है जो बल्ब और तालु कंजाक्तिवा को संरक्षित करता है और मार्कर के रूप में सर्जिकल टांके के आवेदन के बिना ग्लोब के नाक भाग के निर्धारण की अनुमति देता है। पिछले शोध से संकेत मिलता है कि आंख के नाक क्षेत्र में कॉर्निया के अन्य क्षेत्रों की तुलना में सबसे कम तंत्रिका संक्रमण होता है, जो इसे नवसंवहनीकरण के प्रति अधिक संवेदनशील बनाता है और पुनर्योजी प्रभावकारिता 31,32को कम करता है।

सारांश में, एलएससीडी के नैदानिक संकेत, जैसे कॉर्नियल अस्पष्टता (सीओ), लगातार उपकला दोष, और कॉर्नियल नवसंवहनीकरण (एनवी), मनाया गया हिस्टोलॉजिकल परिवर्तनों के साथ, गॉब्लेट सेल मेटाप्लासिया सहित, कॉर्नियल सतह पर K13 की अभिव्यक्ति, और कॉर्नियल सतह पर K12 की अनुपस्थिति, इस मॉडल में LSCD की उपस्थिति की पुष्टि करते हैं। ये निष्कर्ष इस बात का प्रमाण देते हैं कि यह उपन्यास तकनीक एलएससीडी को प्रेरित करने में प्रभावी है। इस रासायनिक चोट मॉडल को कॉर्नियल चोट और पुनर्जनन के क्षेत्र में नई दवाओं और दवा उपचार की जांच के लिए प्रीक्लिनिकल अध्ययन में नियोजित किया जा सकता है।

Disclosures

इस अध्ययन में वर्णित किसी भी कंपनी या उत्पाद में लेखकों में से किसी का भी कोई वित्तीय हित नहीं है। लेखक हितों के अन्य टकराव की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

हम स्वीकार करते हैं कि NEI P30-EY026877 इस शोध का समर्थन करता है। हम प्रयोगात्मक जानवरों को प्रदान करने में अपनी सभी तरह की सहायता के लिए स्टैनफोर्ड यूनिवर्सिटी के इंस्टीट्यूट फॉर स्टेम सेल बायोलॉजी एंड रीजेनरेटिव मेडिसिन में चार्लेन वांग और डॉ इरव वीसमैन लैब को बहुत स्वीकार करते हैं। हम छवियों की तैयारी और संपादन में हिराद रेज़ाईपुर की सहायता की सराहना करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-K12 antibody ABCAM ab185627
Anti-K13 antibody ABCAM ab92551
Bovine serum albumin (BSA) ThermoFisher Scientific B14
C57BL/6 mice Dr Weissman Lab, Stanford University
Curved forceps Storz E1885
Disposable 90 degree bent needle
Disposable biopsy punch Med blades
Donkey anti-rabbit IgG H&L ABCAM ab150073
Ethanol ThermoFisher Scientific T038181000CS
Ethiqa XR (Buprenorphine extended-release injectable suspension) Fidelis Animal Health
Heating pad for mouse 
Ketamine hydrochloride Ambler ANADA 200-055
OCT Tissue-Tek 4583
Ophthalmic surgical scissors
pH Indicator Sticks Whatman
Phosphate buffered saline (PBS) ThermoFisher Scientific AM9624
Prolong gold antifade reagent with DAPI Invitrogen P36935
Slit-lamp microscope NIDEK SL-450
Sodium fluorescein AK-fluor 10% Dailymed NDC17478-253-10
Sterile irrigation solution (BSS) Alcon 9017036-0119
Sterile syringe, 1 and 5 ml
Straight forceps Katena K5 4550- Storz E1684
Surgical eye spears American White 17240 Cross
Surgical microscope Zeiss S5 microscope
Tetracaine ophthalmic drop Alcon    NDC0065-0741-14
Timer
Triple antibiotic ophthalmic ointment Bausch and Lomb
TritonX -100 Fisher Scientific   50-295-34
Two-speed rotary tool 200-1/15 Two Speed Rotary Toolkit
Xylazine AnaSed NADA#139-236

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Shadmani, A., Dhowre, H. S., Ercal,… More

Shadmani, A., Dhowre, H. S., Ercal, O., Meng, X. Q., Wu, A. Y. Corneal and Limbal Alkali Injury Induction Using a Punch-Trephine Technique in a Mouse Model. J. Vis. Exp. (198), e65609, doi:10.3791/65609 (2023).

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