Summary
Denne protokollen beskriver en metode for å indusere en nøyaktig og reproduserbar hornhinne- og limbal alkaliskade i en musemodell. Protokollen er fordelaktig da den muliggjør en jevnt fordelt skade på den høyt buede musehornhinnen og limbus.
Abstract
Hornhinnen er kritisk for syn, og hornhindeheling etter traumer er grunnleggende for å opprettholde sin gjennomsiktighet og funksjon. Gjennom studiet av hornhindeskademodeller tar forskerne sikte på å forbedre forståelsen av hvordan hornhinnen helbreder og utvikle strategier for å forebygge og håndtere hornhindeopasiteter. Kjemisk skade er en av de mest populære skademodellene som har blitt grundig studert på mus. De fleste tidligere etterforskere har brukt et flatt papir dynket i natriumhydroksid for å indusere hornhinneskade. Imidlertid er indusering av hornhinne- og limbalskade ved bruk av flatt filterpapir upålitelig, siden musehornhinnen er svært buet. Her presenterer vi et nytt instrument, en modifisert biopsistans, som gjør det mulig for forskerne å skape en godt begrenset, lokalisert og jevnt fordelt alkaliskade på murine hornhinnen og limbus. Denne punch-trephine-metoden gjør det mulig for forskere å indusere en nøyaktig og reproduserbar kjemisk brenning til hele murine hornhinnen og limbus, mens de forlater andre strukturer, som øyelokkene, upåvirket av kjemikaliet. Videre introduserer denne studien en enukleasjonsteknikk som bevarer den mediale karunkelen som et landemerke for å identifisere nesesiden av kloden. Bulbar og palpebral conjunctiva og lacrimal kjertel holdes også intakt ved hjelp av denne teknikken. Oftalmologiske undersøkelser ble utført med spaltelampebiomikroskop og fluoresceinfarging dag 0, 1, 2, 6, 8 og 14 etter skaden. Kliniske, histologiske, og immunhistokjemiske funn bekreftet limbal stamcellemangel og okulær overflateregenereringssvikt hos alle eksperimentelle mus. Den presenterte alkaliske hornhinneskademodellen er ideell for å studere limbal stamcellemangel, hornhinnebetennelse og fibrose. Denne metoden er også egnet for å undersøke prekliniske og kliniske effekter av aktuelle oftalmologiske medisiner på murine hornhinnen.
Introduction
Hornhinnen er kritisk for syn og viser unike egenskaper, inkludert gjennomsiktighet, som er en forutsetning for klar visjon. I tillegg til å tjene en viktig beskyttende rolle, står hornhinnen for 2/3 av brytningskraften i øyet1. På grunn av sin betydelige rolle i synet, forårsaker hornhinneskader og opasitet betydelig visuell nedgang og er ansvarlig for den nest høyeste årsaken til forebyggbar blindhet over hele verden 2,3. Ved hornhinneskader med alvorlig limbal dysfunksjon reduseres barrierefunksjonen til limbus, noe som resulterer i migrasjon av konjunktivceller mot hornhinnens overflate og hornhindekonjunktivalisering 4,5, noe som kompromitterer visjonen dramatisk. Effektive forebyggende og terapeutiske strategier er derfor nødvendig for å takle den globale byrden av hornhindeblindhet og relatert funksjonshemming.
Den nåværende forståelsen av den menneskelige hornhinnen sårhelingsprosessen er basert på tidligere studier som har undersøkt hornhinnerespons på ulike skader. Flere teknikker og dyremodeller har blitt brukt for å indusere ulike kjemiske eller mekaniske hornhinneskader 6,7,8,9 og for å undersøke ulike aspekter av hornhinnen sårhelingsprosessen.
Alkalibrenningsmodellen er en veletablert skademodell som utføres ved å påføre natriumhydroksid (NaOH) direkte over hornhinnens overflate eller ved å bruke flatt filterpapir10. En alkaliskade resulterer i frigjøring av proinflammatoriske mediatorer og infiltrering av polymorfonukleære celler, ikke bare i hornhinnen og øyets fremre kammer, men også i netthinnen. Dette induserer utilsiktet retinal ganglioncelleapoptose og CD45+ celleaktivering11. Derfor er det viktig å lokalisere skadestedet nøyaktig for å unngå overdreven utilsiktet skade ved hjelp av en alkaliskademodell.
Den aksiale lengden på murine øyebollet er ca. 3 mm12. På grunn av denne korte avstanden mellom hornhinnen og netthinnen, eksisterer en bratt hornhinnekurvatur for å gi høy brytningskraft for å fokusere lyset på netthinnen (figur 1A). Som vi tidligere har rapportert13, er det vanskelig å indusere kjemisk skade på denne svært buede overflaten ved hjelp av et flatt filterpapir, spesielt ved limbus (figur 1B). Å indusere skade på limbus krever å vippe filterpapiret, som har potensial til å forårsake utilsiktet skade på fornix og tilstøtende bindehinne14. En annen tilnærming innebærer direkte påføring av kjemisk middel som dråper på hornhinnen. Denne metoden mangler imidlertid kontroll over eksponeringstiden, og det er en potensiell risiko for å forårsake skade på bindehinden, fornix og øyelokkene på grunn av diffusjon av væsken til disse områdene.
For å overvinne disse begrensningene, presenterer denne studien en ny punch-trephine metode for å indusere skade. Denne teknikken har flere fordeler, inkludert (i) å indusere en effektiv kjemisk skade på hele hornhinnens overflate og limbus i musemodell, (ii) indusere en lokalisert og godt omskrevet skade på hornhinnen, (iii) evnen til å påføre væske av interesse for en forhåndsbestemt varighet, og (iv) evnen til å indusere forskjellige størrelser av hornhinneskader ved å velge passende biopsistanser. Denne metoden er også mulig for rotte- og kaninskademodeller, som også viser en buet hornhinneoverflate og er vanlige dyremodeller som brukes til å studere sårheling av okulær overflate.
Protocol
Alle prosedyrer ble utført i samsvar med Stanford laboratoriedyrpleie APLAC nummer 33420, bruk av dyr til vitenskapelige formål, og ARVO-erklæringen for bruk av dyr i oftalmisk og synsforskning. Totalt 10 mannlige og kvinnelige C57BL/6 mus i alderen 8-12 uker ble sjenerøst levert av Irving L. Weissman-laboratoriet. Dyrene ble akklimatisert til en 12 timers lys-mørk syklus og forsynt med vann og fôr ad libitum. Skader ble indusert på det ene øyet av dyret.
1. Forberedelse til forsøket
- Forberedelse av materialer
MERK: Alle reagenser skal oppbevares ved romtemperatur.- Forbered punch-trephine: Forbered en biopsi-stans med en diameter på 3,5 mm og merk skaftet på stansen 5 mm vekk fra den distale kanten. Fest stansen godt og kutt den markerte distale delen av akselen ved hjelp av et to-trinns roterende verktøy. Bruk øyebeskyttelse under denne prosessen. Klipp akselen på 3,5 mm dybde og la de siste 1,5 mm være festet. Bøy spissen 90°, som vist i figur 1.
- Forbered 0,5 M NaOH-oppløsning ved å oppløse 1 g NaOH i 50 ml destillert vann.
- Forbered 10 ml bedøvelsescocktail ved å kombinere 2 ml 100 mg / ml ketamin og 1 ml 20 mg / ml xylazin. Før injeksjon fortynnes denne blandingen med 7 ml 0,9 % NaCl (vanlig saltvann).
- Forbered 0,1% fluoresceinnatriumoppløsning ved å tilsette 0,1 ml 10% AK-fluorfluorescerende væske til 9,9 ml steril fosfatbufret saltoppløsning (1x PBS).
- Klargjør PBS (1x) ved å oppløse 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44g Na2HPO4 og 0,23 g NaH2PO4i 900 ml destillert vann. Juster oppløsningens pH til 7,4. Bring løsningen til et endelig volum på 1 L ved å tilsette destillert vann.
- Forbered 4% paraformaldehyd (PFA) løsning for fiksering. Løs opp 2 g PFA i 45 ml PBS under en kjemisk hette. Varm blandingen til 65 °C og titrer pH til 7,4. Når PFA er oppløst, bring løsningen til et endelig volum på 50 ml.
2. Dyr forberedelse
- Vei musen for å bestemme riktig volum av injiserbar bedøvelsescocktail for injeksjon. Etter riktig håndtering og fastholding av musen som beskrevet i Machholz et al.15, administrer bedøvelsesmiddelcocktailen intraperitonealt (IP) i en dose på 0,01 ml / g16,17. Mål de nedre abdominale kvadranter for IP-injeksjon for å forhindre organskade.
- Injiser buprenorfin injiserbar suspensjon med forlenget frisetting (3,25 mg/kg) subkutant for ytterligere analgesi under og etter operasjonen, da hornhinnealkaliskade er ekstremt smertefull.
- Vent til et dypt anestesiplan er oppnådd. Sjekk for manglende respons på tåklemme som en indikasjon på et vellykket dypt anestesiplan. Påfør enkel øyesalve for det kontralaterale øyet for å forhindre tørrhet før du starter operasjonen.
- Etter anestesi, legg musen på operasjonsbordet utarbeidet i henhold til standard gnagerkirurgiske prinsipper18. Legg en 5 mm høy pute under gnagerens hode, plassert i lateral decubitusposisjon. Puten hjelper til med å støtte gnagerens hode under operasjonen.
- Administrer tetrakainhydroklorid (0,5%) øyedråper for videre anestesi. Tørk den okulære overflaten riktig med et kirurgisk øyespyd og trim øyevippene.
3. Induksjon av alkaliskade
- Før du starter operasjonen, organiser operasjonsbordet i henhold til standard gnageroperasjonsprinsipper18,19 og hold det kirurgiske feltet sterilt under operasjonen. Plasser det kirurgiske mikroskopet for å visualisere den bedøvede musen riktig og juster timeren til 30 s. Legg et vridd papirhåndkle på dyrets neseparti for å forhindre utilsiktet nasal aspirasjon under skylleprosessen.
- Bestem den limbale omkretsen ved hjelp av det kirurgiske mikroskopet, samtidig som du sørger for at øyelokkene på musen er vidåpne ved hjelp av tommelen og pekefingrene. Hold forsiktig den rene stanse-trefinen parallelt med øyets akse, uten å trykke nedover. Unngå å snurre instrumentet og hold aksen til stanse-trefinen parallell med klodens akse.
- Be kirurgisk assistent om å slippe 3 dråper NaOH-løsning (lik 40 μL) i hullet til stanse-trefinen for å fylle verktøyet og dekke hornhinnen på riktig måte. Væskens overflatespenning forhindrer lekkasje ut av instrumentet (figur 1).
MERK: Vi brukte en 1 mm sprøyte med en 27G kanyle med en flat spiss vinklet ved 50 ° for å forsiktig slippe NaOH oppløsningen. - Etter 30 s, skyll straks hornhinnen og fornix med 5 ml PBS (1x). Video 1 viser prosedyren for å indusere kjemisk skade.
- Bruk et universelt pH-indikatorpapir for å sikre en pH på 7 - 7,5 på hornhinnen overflaten av det skadede øyet. Påfør deretter den trippel-antibiotiske oftalmiske salven over den kjemisk skadede okulære overflaten.
MERK: Halebevegelse under operasjonen er et tegn på lav bedøvelsesdybde. Påfør ekstra bedøvelsescocktail (ketamin + xylazin) ved å injisere et bedøvelsesmiddel [bolus IP (50% av startvolumet)]. - Etter operasjonen, bekreft at musen er i stabil tilstand. Administrer andre buprenorfin hvis dyret har smerter. Bruk samme håndteringsteknikk som i 2.2. Start den postoperative undersøkelsen mens dyret er under anestesi.
- Etter prosedyren, vask, tørk og desinfiser punch-trephine og operasjonsbordet med 70% etanol.
4. Klinisk evaluering
- For undersøkelse, bedøv musen som tidligere beskrevet i trinn 2.1.
- Undersøk øynene (skadet og ikke-skadet) under et slit-lampe biomikroskop. Bruk et kamera til å ta bilder (i denne studien ble et telefonkamera i kinomodus brukt).
- Score hornhindeopasitet i henhold til Yoeruek-graderingssystemet20: 0 = normal, klar hornhinne; 1 = mild opasitet; 2 = større opasitet, men iris og elev er lett å skille mellom; 3 = iris og elev er knapt å skille; 4 = hornhinnen er helt ugjennomsiktig med en usynlig pupill.
- Påfør 0,1% fluorescein øyedråper. Tørk overflødig fluorescerende væske med en bomullsapplikator og vurder for tilstedeværelse av hornhinneepiteldefekter ved bruk av koboltblåfilteret. Ta bilder.
- Overvåk dyret til det gjenvinner tilstrekkelig bevissthet til å opprettholde sternal hvile. Ikke gjeninnfør dyret til andre dyr før det har fullstendig gjenopprettet.
5. Enukleasjon
- Avlive mus 2 uker etter kjemisk skadeinduksjon ved cervikal dislokasjon i 3-5 s21.
- Enucleate øyet mens du bevarer mediale caruncle og hele palpebral conjunctiva i følgende rekkefølge, som vist i Video 2.
- Under kirurgisk mikroskop, dissekere forsiktig krysset mellom karunkel og hud. Bruk tanntang, trekk inn karunkelen og før spissen av kirurgisk saks under palpebrale conjunctiva mot krysset med tarsalplaten.
- Skjær konjunktivene langs adhesjonslinjen mot sidekanten. Vri deretter kirurgisk saks til krysset mellom konjunktivene og den dårligere tarsalplaten ved subkonjunktivplanet.
- Etter å ha fullført konjunktival disseksjon, trekk de øvre og nedre øyelokkene fra nesesiden med tommelen og pekefingrene. Mens du trekker tilbake, før spissen av en buet pinsett bak den utstikkende lakrimalen glad mot synsnerven. Ta et godt tak i synsnerven og trekk ut kloden (figur 2).
- Skyll globen med PBS (1x) og overfør den til fikseringsløsningen.
6. Hematoksylin og eosin (H&E) og periodisk syre-Schiff (PAS) farging
- Fest klodene i 10% formalinløsning over natten ved romtemperatur.
- Dehydrer vevet ved hjelp av en sekvensiell serie gradert alkohol med konsentrasjoner på 70% etanol, 80% etanol, 90% etanol og 100% etanol, hver i 10-15 minutter. Deretter senker du øynene i xylen i 10 minutter. Til slutt omslutter du øynene i parafin.
- Seksjoner parafinblokkene i 6 μm tykke skiver og monter dem på glassmikroskopglass for hematoksylin og eosin (H&E) og periodisk syre-Schiff (PAS) farging, som beskrevet i tilleggsfil 1.
7. Immunofluorescens avbildning og analyse
- For immunhistokjemistudier (IHC), fikser øynene i 1 ml PBS (1x) som inneholder 4% PFA ved 4 °C over natten. Vask prøven 3x i 1 ml PBS (1x) i 5 minutter hver.
- For å forhindre iskrystalldannelse og for å beskytte molekylære strukturer av proteinene, utfør seriell sukrosemetning med 10% sukrose, 20% sukrose og 30% sukrosekonsentrasjoner i PBS. Bygg inn globusene i optisk koherens tomografi løsning (OCT; Figur 2), og oppbevares ved -80 °C.
- Seksjon OCT-blokken i 12 μm tykke skiver og monter på glassmikroskopglass for IHC-farging.
- Permeabiliser vevssnitt på mikroskopglass i 0,1% Triton X -100 i PBS (1x) i 15 minutter. Deretter blokkerer du uspesifikke antigener med 5% BSA i PBS (1x) i ytterligere 1 time ved romtemperatur.
- Inkuber vevssnitt på mikroskopglass ved 4 °C over natten i cocktailen av de målrettede primære antistoffene fremstilt i PBS (1x) inneholdende 1 % BSA. I dette forsøket var de primære antistoffene 1:100 fortynnet kaninantikeratin 13 (K13) og antikeratin 12 (K12) antistoffer med konsentrasjon på henholdsvis 2,24 μg / ml og 1,56 μg / ml.
- Etter inkubering, vask vevsseksjonene på mikroskoplysbilder 3x med PBS (1x). Deretter detekteres bundne primære antistoffer med 1:500 fortynnet esel-antikanin-IgG. Inkuber med sekundært antistoff ved 4 °C i 1 time i mørket. Vask deretter i PBS (1x) 3x i 5 min hver.
- Påfør en dråpe anti-fade fluorescensmonteringsmedium som inneholder DAPI på vevsseksjonene på mikroskop og deksel med et deksel. La prøvene tørke i mørket og undersøk dem under et fluorescerende mikroskop med samme laserinnstilling for normale og skadede øyne.
Representative Results
Effekten av metoden for å indusere limbal stamcellemangel (LSCD) ble vurdert ved å evaluere kliniske og histologiske tegn på LSCD. Klinisk vurdering ble gjort med spaltelampemikroskopi og fremre segmentoptisk koherenstomografi (AS-OCT) (figur 3 og figur 4).
Reepitelialisering skjedde på sentripetal måte og var raskere ved den temporale delen av hornhinnen sammenlignet med nesedelen. Skadde øyne utviklet 2+-3+ hornhinnedis umiddelbart etter kjemisk skade (figur 3). Epitelceller migrerte fra bindehinnen til hornhinnen etter limbal skade. Den store hornhinneepiteldefekten ble fullstendig reepitelialisert på dag 12-14, noe som tok lengre tid sammenlignet med en hornhinneepitelskade av tilsvarende størrelse og intakt kjellermembran og stroma som typisk tilhelet innen 5 dager etter skade 8,9. På grunn av LSCD utviklet 50 % av de skadde øynene vedvarende epiteldefekter i slutten av andre uke (figur 3). Hornhinneødem var mer fremtredende i løpet av de første dagene (figur 3, figur 4), mens hornhinnefibrose var signifikant i den andre uken som resulterte i 4+ hornhinnefortetning i 100% av skadede øyne.
Tidlige tegn på neovaskularisering (NV) ble observert klinisk og histologisk, 24 timer etter kjemisk skadeinduksjon, som illustrert i figur 5, i samsvar med tidslinjen for NV identifisert av Kvanta et al. studie som viste tegn på limbal NV 24 timer etter skade22. Under helbredelsesprosessen modnet nye fartøy og ved den 14. dagen etter skade krysset NV limbus og nådde den sentrale hornhinnen. Limbus, som definerer grensen mellom bindehinden og hornhinnen, ble ødelagt.
Histologiske tegn på limbal stamcellemangel og konjunktivalisering ble observert ved forekomst av PAS+ begerceller og stromale blodkar 23,24,25,26. Begerceller ble observert i den foreliggende skademodellen og angitt med pilen i figur 6.
Konjunktival og hornhinneepitel uttrykker hovedsakelig unike keratiner, henholdsvis K13 og K12,27. Etter limbalskaden dekket nye epitelceller med utspring fra bindehinnen denudert hornhinne, og K12 ble ikke uttrykt på hornhinnens overflate hos noen skadde dyr i 2 uker etter skade. Dette funnet, i samsvar med andre studier28, indikerte fullstendig LSCD og fravær av hornhinneepitelceller på hornhinnen. I studien til Park et al.29 oppdaget de imidlertid K12-uttrykk 20 og 32 uker etter skade, noe som tyder på en mulig transdifferensiering av epitelcellene.
Følgelig observerte vi at kjemisk skade ødela limbus og limbale stamceller som resulterte i migrasjon av konjunktivale epitelceller til sentrum av hornhinnen for å dekke den denuderte hornhinnen. Dette bekreftes videre av konjunktival epitelcellemarkør, K13, som ble uttrykt i hele bindehinne- og hornhinneflaten som vist i figur 7.
Figur 1 Normalt høyre øye med mus og stanse-trefin for indusering av hornhinne- og limbalskade. (A) Lateralt bilde som viser museøye med sterkt buet hornhinne (pilspisser indikerer limbus). (B) Bildet viser at selv et stort filterpapir ikke er tilstrekkelig til å dekke det limbale området tilstrekkelig. Limbus-til-limbus-diameteren på museøyet er nesten 4 mm og en stansebiopsi med en ytre diameter på 4,5 mm og en indre diameter på 3,5 mm (panelene D og H), dekker hornhinnen og limbaloverflaten på riktig måte som vist i panelene (C) og (E). (F) Punch-trephine holdes passende over kloden rundt limbalområdet. (G) For å sikre at det ikke er lekkasje gjennom kanten av stanse-trefinen, etter riktig plassering av stanse-trefinet i en parallell akse med kloden, er hullet fylt med metylenblått. Ingen lekkasje av metylenblå oppdages. Skala bar = 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Enucleated øyne. (A) Øynene ble enukleert mens bulbar og palpebral conjunctiva ble bevart, lacrimal kjertelen (pilspiss) og synsnerven (pil). De normale (B) og skadede (C) øynene ble mettet i 30% sukrose for å beskytte mot kryokrystalldannelse. Den nasale delen av kloden er gjenkjennelig gjennom nesekarunkelen (merket N). Skala bar = 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 Sårtilheling på venstre øye. Sårhelingsprosessen på venstre museøye gjennom 2 uker etter hornhinne- og limbal alkaliskade i en musemodell er vist her (A-F). Spaltelampeundersøkelsen av øyet. Hornhinneødem er mer fremtredende på dag 0 og 2 (A, B), mens fibrose er tydeligere i løpet av den andre uken etter skade (E-F). A.f-F.f viser re-epitelialiseringsprosessen av samme øye. Total hornhinne- og limbal epiteldefekt umiddelbart etter skadeinduksjon observeres hos A.f. Epiteldefekten helbredes ved konjunktival epitelcellemigrasjon i et sentripetalmønster med 12-14 dager (A.f-F.f). Imidlertid utviklet 50% av de skadde øynene vedvarende epiteldefekt i slutten av andre uke som vist med pil i F- og F.f-bilder. Skalastang = 1 mm (panel C). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Fremre segment OCT av museøyet. (A) AS-OCT illustrerer normal hornhinnekurvatur og fremre kammer. Irisstrukturen er veldefinert og gjenkjennelig. Ingen iridocorneal adhesjon kan påvises i midten av periferien av iris. (B) Umiddelbart etter skade øker hornhinnenes tykkelse på grunn av ødemdannelse og iridocorneal adhesjon utvikler seg i midten av periferien av iris. (C) To uker etter skaden har hornhinnekurvaturen endret seg og total iridocorneal adhesjon med fremre kammerdestruksjon er synlig. Skala bar = 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Hornhinne-neovaskularisering. Kliniske og histologiske tegn på hornhinneneovaskularisering kan observeres under sårhelingsprosessen etter natriumhydroksidskade (NaOH). (A) De første tegnene på neovaskularisering kan påvises den første dagen etter skade, preget av en rødlig misfarging av hornhinnen (indikert med en hvit pil). Denne misfargingen skyldes aggregering av røde blodlegemer i stroma, som illustrert i tilsvarende histologisk bilde (D) (indikert med gule pilspisser). (B) I løpet av den første uken av regenerering øker og sprer nye kar seg gradvis gjennom hornhinnen. (C) Ved slutten av 2 uker er limbalområdet ødelagt, og de nye fartøyene fortsetter å utvikle seg. (E) Den histologiske delen av hornhinnen illustrerer ytterligere tilstedeværelsen av dyp stromal neovaskularisering (vist med pilspisser). Spaltelampe Bildeskala bar = 1 mm, histologi bildeskala bar = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Periodisk syre-Schiff og immunhistokjemisk (IHC) farging av hornhinne. Periodisk syre-Schiff og immunhistokjemisk farging av normal og skadet hornhinne ble gjort 2 uker etter skaden. Normalt hornhinneepitel fra mus sammensatt av 4-5 lag med celler (A). Alkaliskade på hornhinnen og limbus førte til konjunktivalisering av hornhinnen med utseende av begerceller på hornhinnens overflate som vist ved svarte piler i (D). Normale hornhinneepitelceller uttrykker K12 (B), som ikke uttrykkes av konjunktivcellene som dekker den skadede hornhinnen (E). K13, en karakteristisk markør for konjunktivale epitelceller, uttrykkes ikke på de normale hornhinneepitelcellene (C). Imidlertid er det tilstede på natriumhydroksid (NaOH) skadet hornhinneoverflate som er et tegn på hornhindekonjunktivalisering (F). Histologi bildeskala bar = 50 μm, IHC farget bildeskala bar = 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7 Hematoksylin og eosin og immunhistokjemisk farging. Hematoksylin og eosin (H&E) og immunhistokjemisk farging av normalt og skadet limbusvev ble gjort. (A) Den normale limbus markerer overgangsområdet mellom enden av sclera og begynnelsen av hornhinnen. Denne regionen er vanligvis dekket av ett eller to lag med konjunktivale epitelceller (indikert med pilene). I et sunt øye begynner uttrykket av en spesifikk hornhinneepitelmarkør kalt K12 ved limbus og strekker seg til overflaten av hornhinnen (vist på bilde B). På den annen side er uttrykket av en konjunktivmarkør kjent som K13 begrenset til limbus og strekker seg ikke utover den (indikert med den hvite pilen i bilde C). I øyne skadet av natriumhydroksid (NaOH), blir grensene til limbus forstyrret. Dette fører til migrasjon av konjunktivceller mot den skadede hornhinnen. (D) Bildene av den NaOH-skadde limbus viser tilstedeværelse av neovaskularisering både under epitellaget og i stromalvevet. Etter skaden mangler den skadede hornhinneoverflaten tilstedeværelse av K12 (E), mens K13 uttrykkes rikelig på hornhinnens overflate (F). Histologi bildeskala bar = 50 μm, IHC farget bildeskala bar = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfil 1: Fargeprotokoll. Klikk her for å laste ned denne filen.
Video 1: NaOH hornhinne og limbal skade i en musemodell med en punch-trefin. Videoen demonstrerer prosedyren for å indusere NaOH hornhinne- og limbalskade i en musemodell med en slag-trefin. Det er avgjørende å holde stanse-trefinen i en parallell akse med kloden og legge minimalt trykk på limbusen. Denne riktige teknikken er viktig for å forhindre lekkasje og oppnå optimale resultater. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Video 2: Illustrasjon av enukleasjonsteknikken mens du bevarer bulbar conjunctiva. For å skille nesesiden av kloden fra den tidlige siden, er nesekarunkelen bevart sammen med kloden. Hele konjunktivene dissekeres fra krysset til tarsalplaten. Med minimalt trykk stikker orbitalinnholdet utover. Ved å lede tangen mot baksiden av kloden, gripes synsnerven, og vevet ekstraheres. Det enucleated vevet inkluderer kloden, orbitalfett og orbital lacrimal kjertel. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Discussion
Denne studien foreslår en innovativ enhet, punch-trephine, som kan brukes til å indusere en effektiv og reproduserbar hornhinne- og limbal skade i en musemodell. Denne limbale stamcellemangelmodellen er ideell for å undersøke dynamikken i hornhinnen sårheling og konjunktivalisering etter skade.
Bevis tyder på at både limbal nisje og sentral del av murine hornhinnen inneholder stamceller30. Derfor er det nødvendig med en effektiv hornhinne- og limbalskade for å produsere en stamcellemangelmodell, og skademodellen som presenteres her muliggjør eksponering av den buede hornhinnelimbus til et kjemisk middel i en bestemt periode. For å bestemme den beste konsentrasjonen og varigheten av NaOH-skaden, ble det påført skader med ulike NaOH-konsentrasjoner og varigheter. Høyere NaOH-konsentrasjoner eller lengre eksponeringsvarighet resulterte i økt vevsskade og fibrose. Derfor kan forskere justere disse parametrene basert på de spesifikke målene for studien og ønsket alvorlighetsgrad av skade.
For å lykkes med å reprodusere denne hornhinne- og limbalskademodellen, bør flere viktige hensyn vurderes. For det første er det viktig å måle limbal-til-limbal diameter av det målrettede øyet for å bestemme riktig størrelse på stansen. Det anbefales å velge en biopsistans med en ytre diameter som er 0,5 - 1 mm større enn denne diameteren.
Overflatespenningen til væsken som brukes er en viktig faktor for å forhindre lekkasje i grenseflaten mellom den okulære overflaten og kanten av stansetrefinet som vist i figur 1G. Derfor er det ikke nødvendig å legge press på spissen av stansebiopsien.
For å unngå å forårsake mekanisk skade på vevet, er det viktig å holde stansen trefin i en parallell akse med øyet og avstå fra å legge press på limbus. Feil justering av hulltrefilaksen kan øke risikoen for lekkasje og resultere i et ødelagt skadested og unøyaktige resultater.
Noen potensielle begrensninger av denne teknikken inkluderer behovet for å velge riktig stansestørrelse, skaffe seg ferdigheter i å holde punch trefin, og den potensielle risikoen for å forårsake mekanisk skade. Disse begrensningene kan imidlertid overvinnes gjennom praksis og ved å følge instruksjonene som er beskrevet i denne protokollen. Stammen og aldersgruppen til musene er andre faktorer som påvirker reepitelialiseringsprosessen og må vurderes i studien.
Videre er den foreslåtte protokollen fordelaktig da den beskriver en enukleasjonsmetode som bevarer bulbar og palpebral conjunctiva og muliggjør bestemmelse av nesedelen av kloden uten anvendelse av kirurgiske suturer som markør. Tidligere forskning har indikert at neseområdet i øyet har den laveste nevrale innerveringen sammenlignet med andre områder av hornhinnen, noe som gjør den mer utsatt for neovaskularisering og redusert regenerativ effekt31,32.
Oppsummert bekrefter de kliniske tegnene på LSCD, som hornhindefortetning (CO), vedvarende epiteldefekter og hornhinde-neovaskularisering (NV), sammen med de observerte histologiske endringene, inkludert begercellemetaplasi, ekspresjon av K13 på hornhinnen, og fravær av K12 på hornhinnen, tilstedeværelsen av LSCD i denne modellen. Disse funnene gir bevis på at denne nye teknikken er effektiv i å indusere LSCD. Denne kjemiske skademodellen kan brukes i prekliniske studier for å undersøke nye medisiner og farmasøytiske behandlinger innen hornhinneskade og regenerering.
Disclosures
Ingen av forfatterne har økonomiske interesser i noen av selskapene eller produktene som er beskrevet i denne studien. Forfatterne oppgir ingen andre interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi anerkjenner at NEI P30-EY026877 støtter denne forskningen. Vi anerkjenner Charlene Wang og Dr. Irv Weissman Lab ved Stanford University's Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine for all deres vennlige hjelp til å gi eksperimentelle dyr. Vi setter pris på Hirad Rezaeipoors hjelp til utarbeidelse og redigering av bildene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-K12 antibody | ABCAM | ab185627 | |
| Anti-K13 antibody | ABCAM | ab92551 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | ThermoFisher Scientific | B14 | |
| C57BL/6 mice | Dr Weissman Lab, Stanford University | ||
| Curved forceps | Storz | E1885 | |
| Disposable 90 degree bent needle | |||
| Disposable biopsy punch | Med blades | ||
| Donkey anti-rabbit IgG H&L | ABCAM | ab150073 | |
| Ethanol | ThermoFisher Scientific | T038181000CS | |
| Ethiqa XR (Buprenorphine extended-release injectable suspension) | Fidelis Animal Health | ||
| Heating pad for mouse | |||
| Ketamine hydrochloride | Ambler | ANADA 200-055 | |
| OCT | Tissue-Tek 4583 | ||
| Ophthalmic surgical scissors | |||
| pH Indicator Sticks | Whatman | ||
| Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | AM9624 | |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| Slit-lamp microscope | NIDEK | SL-450 | |
| Sodium fluorescein AK-fluor 10% | Dailymed | NDC17478-253-10 | |
| Sterile irrigation solution (BSS) | Alcon | 9017036-0119 | |
| Sterile syringe, 1 and 5 ml | |||
| Straight forceps | Katena K5 | 4550- Storz E1684 | |
| Surgical eye spears | American White 17240 Cross | ||
| Surgical microscope | Zeiss S5 microscope | ||
| Tetracaine ophthalmic drop | Alcon | NDC0065-0741-14 | |
| Timer | |||
| Triple antibiotic ophthalmic ointment | Bausch and Lomb | ||
| TritonX -100 | Fisher Scientific | 50-295-34 | |
| Two-speed rotary tool | 200-1/15 Two Speed Rotary Toolkit | ||
| Xylazine | AnaSed | NADA#139-236 |
References
- Sridhar, M. S. Anatomy of cornea and ocular surface. Indian Journal of Ophthalmology. 66 (2), 190-194 (2018).
- Robaei, D., Watson, S. Corneal blindness: a global problem. Clinical & experimental Ophthalmology. 42 (3), 213-214 (2014).
- Lamm, V., Hara, H., Mammen, A., Dhaliwal, D., Cooper, D. K. C.
- Danjo, S., Friend, J., Thoft, R. A. Conjunctival epithelium in healing of corneal epithelial wounds. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 28 (9), 1445-1449 (1987).
- Shapiro, M. S., Friend, J., Thoft, R. A.
- Shah, D., Aakalu, V. K. Murine Corneal Epithelial Wound Modeling. Wound Regeneration: Methods and Protocols. Das, H. , Springer US. 175-181 (2021).
- Rittié, L., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D.
- Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
- Akowuah, P. K., De La Cruz, A., Smith, C. W., Rumbaut, R. E., Burns, A. R. An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing. Journal of Visualized Experiments. (178), 63112 (2021).
- Bai, J. Q., Qin, H. F., Zhao, S. H. Research on mouse model of grade II corneal alkali burn. International journal of Ophthalmology. 9 (4), 487-490 (2016).
- Paschalis, E. I., et al. The Role of Microglia and Peripheral Monocytes in Retinal Damage after Corneal Chemical Injury. The American Journal of Pathology. 188 (7), 1580-1596 (2018).
- Jiang, M., et al. Single-Shot Dimension Measurements of the Mouse Eye Using SD-OCT. Ophthalmic Surgery, Lasers and Imaging Retina. 43 (3), 252-256 (2012).
- Shadmani, A., Razmkhah, M., Jalalpoor, M. H., Lari, S. Y., Eghtedari, M. Autologous Activated Omental versus Allogeneic Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells in Corneal Alkaline Injury: An Experimental Study. Journal of Current Ophthalmology. 33 (2), 136-142 (2021).
- Swarup, A., et al. PNP Hydrogel Prevents Formation of Symblephara in Mice After Ocular Alkali Injury. Translational Vision Science & Technology. 11 (2), 31-31 (2022).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), 2771 (2012).
- Jaber, S. M., et al. Dose Regimens, Variability, and Complications Associated with Using Repeat-Bolus Dosing to Extend a Surgical Plane of Anesthesia in Laboratory Mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (6), 684-691 (2014).
- Navarro, K. L., et al. Mouse Anesthesia: The Art and Science. ILAR Journal. 62 (1-2), 238-273 (2021).
- Hoogstraten-Miller, S. L., Brown, P. A.
- ACLAM Medical Records Committee. Medical Records for Animals Used in Research, Teaching, and Testing: Public Statement from the American College of Laboratory Animal Medicine. ILAR Journal. 48 (1), 37-41 (2007).
- Yoeruek, E., et al. Safety, penetration and efficacy of topically applied bevacizumab: evaluation of eyedrops in corneal neovascularization after chemical burn. Acta Ophthalmologica. 86 (3), 322-328 (2008).
- Shomer, N. H., et al.
- Kvanta, A., Sarman, S., Fagerholm, P., Seregard, S., Steen, B. Expression of Matrix Metalloproteinase-2 (MMP-2) and Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) in Inflammation-associated Corneal Neovascularization. Experimental Eye Research. 70 (4), 419-428 (2000).
- Tseng, S. C., Hirst, L. W., Farazdaghi, M., Green, W. R. Goblet cell density and vascularization during conjunctival transdifferentiation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (10), 1168-1176 (1984).
- Huang, A. J., Tseng, S. C. Corneal epithelial wound healing in the absence of limbal epithelium. Investigative ophthalmology & visual science. 32 (1), 96-105 (1991).
- Rama, P., et al. Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration. New England Journal of Medicine. 363 (2), 147-155 (2010).
- Deng, S. X., et al. Global consensus on the definition, classification, diagnosis and staging of limbal stem cell deficiency. Cornea. 38 (3), 364-375 (2019).
- Wei, Z. G., Wu, R. L., Lavker, R. M., Sun, T. T. In vitro growth and differentiation of rabbit bulbar, fornix, and palpebral conjunctival epithelia: Implications on conjunctival epithelial transdifferentiation and stem cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 34 (5), 1814-1828 (1993).
- Kao, W. W. Y. Keratin expression by corneal and limbal stem cells during development. Experimental Eye Research. 200, 108206 (2020).
- Park, M., et al. Plasticity of ocular surface epithelia: Using a murine model of limbal stem cell deficiency to delineate metaplasia and transdifferentiation. Stem Cell Reports. 17 (11), 2451-2466 (2022).
- Li, J., et al. Identification for Differential Localization of Putative Corneal Epithelial Stem Cells in Mouse and Human. Scientific Reports. 7 (1), 5169 (2017).
- McKenna, C. C., Lwigale, P. Y. Innervation of the Mouse Cornea during Development. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (1), 30-35 (2011).
- He, J., Bazan, H. E. P. Neuroanatomy and Neurochemistry of Mouse Cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (2), 664-674 (2016).
