Summary
Denne protokol beskriver en metode til at inducere en nøjagtig og reproducerbar hornhinde- og limbalalkaliskade i en musemodel. Protokollen er fordelagtig, da den giver mulighed for en jævnt fordelt skade på den stærkt buede musehornhinde og limbus.
Abstract
Hornhinden er afgørende for synet, og hornhindeheling efter traumer er grundlæggende for at opretholde dens gennemsigtighed og funktion. Gennem studiet af modeller for hornhindeskader sigter forskerne mod at forbedre deres forståelse af, hvordan hornhinden heler og udvikle strategier til forebyggelse og håndtering af uklarheder i hornhinden. Kemisk skade er en af de mest populære skademodeller, der er blevet grundigt undersøgt på mus. De fleste tidligere efterforskere har brugt et fladt papir gennemblødt i natriumhydroxid for at fremkalde hornhindeskade. Imidlertid er det upålideligt at fremkalde hornhinde- og limbalskader ved hjælp af fladt filterpapir, da musehornhinden er meget buet. Her præsenterer vi et nyt instrument, et modificeret biopsislag, der gør det muligt for forskerne at skabe en velafgrænset, lokaliseret og jævnt fordelt alkaliskade på murinhinden og limbussen. Denne punch-trephin-metode gør det muligt for forskere at fremkalde en nøjagtig og reproducerbar kemisk forbrænding til hele murinhinden og limbussen, mens andre strukturer, såsom øjenlågene, forbliver upåvirket af kemikaliet. Desuden introducerer denne undersøgelse en enukleationsteknik, der bevarer den mediale caruncle som et vartegn for at identificere næsesiden af kloden. Bulbar og palpebral conjunctiva og lacrimalkirtel holdes også intakte ved hjælp af denne teknik. Oftalmologiske undersøgelser blev udført via spaltelampebiomikroskop og fluoresceinfarvning på dag 0, 1, 2, 6, 8 og 14 efter skade. Kliniske, histologiske og immunhistokemiske fund bekræftede limbal stamcellemangel og okulær overflade regenereringssvigt hos alle eksperimentelle mus. Den præsenterede alkaliske hornhindeskademodel er ideel til undersøgelse af limbalstamcellemangel, hornhindebetændelse og fibrose. Denne metode er også velegnet til undersøgelse af prækliniske og kliniske virkninger af topiske oftalmologiske lægemidler på murinhindeoverfladen.
Introduction
Hornhinden er kritisk for synet og udviser unikke egenskaber, herunder gennemsigtighed, hvilket er en forudsætning for klart syn. Ud over at tjene en stor beskyttende rolle tegner hornhinden sig for 2/3 af øjets brydningskraft1. På grund af hornhindeskader og uigennemsigtighed spiller en væsentlig rolle i synet og er ansvarlige for den næsthøjeste årsag til blindhed, der kan forebygges, på verdensplan 2,3. Ved hornhindeskader med svær limbaldysfunktion falder limbusens barrierefunktion, hvilket resulterer i migration af konjunktivalceller mod hornhindeoverfladen og hornhindekonjunktivalisering 4,5, hvilket kompromitterer synet dramatisk. Der er derfor behov for effektive forebyggende og terapeutiske strategier for at tackle den globale byrde af hornhindeblindhed og dermed forbundne handicap.
Den nuværende forståelse af den menneskelige hornhindes sårhelingsproces er baseret på tidligere undersøgelser, der har undersøgt hornhindens reaktioner på forskellige skader. Flere teknikker og dyremodeller er blevet anvendt til at fremkalde forskellige kemiske eller mekaniske hornhindeskader 6,7,8,9 og til at undersøge forskellige aspekter af hornhindesårets helingsproces.
Alkaliforbrændingsmodellen er en veletableret skademodel, der udføres ved at påføre natriumhydroxid (NaOH) direkte over hornhindeoverfladen eller ved hjælp af fladt filterpapir10. En alkaliskade resulterer i frigivelse af proinflammatoriske mediatorer og infiltration af polymorfonukleære celler, ikke kun i hornhinden og det forreste kammer i øjet, men også i nethinden. Dette inducerer utilsigtet retinal ganglioncelleapoptose og CD45+ celleaktivering11. Derfor er det afgørende at lokalisere skadestedet præcist for at undgå overdreven utilsigtet skade ved hjælp af en alkalisk skademodel.
Den aksiale længde af murine øjeæblet er ca. 3 mm12. På grund af denne korte afstand mellem hornhinden og nethinden findes der en stejl hornhindekrumning for at give høj brydningskraft til at fokusere lyset på nethinden (figur 1A). Som vi tidligere har rapporteret13, er det vanskeligt at fremkalde kemisk skade på denne stærkt buede overflade ved hjælp af et fladt filterpapir, især ved limbus (figur 1B). Inducerende skade på limbussen kræver hældning af filterpapiret, hvilket har potentiale til at forårsage utilsigtet skade på fornix og tilstødende bindehinde14. En anden tilgang indebærer direkte påføring af det kemiske middel som dråber på hornhindeoverfladen. Denne metode mangler imidlertid kontrol over eksponeringstiden, og der er en potentiel risiko for at fremkalde skade på bindehinden, fornix og øjenlåg på grund af diffusionen af væsken til disse områder.
For at overvinde disse begrænsninger præsenterer denne undersøgelse en ny punch-trephin-metode til at fremkalde skade. Denne teknik har flere fordele, herunder (i) inducering af en effektiv kemisk skade på hele hornhindeoverfladen og limbussen i musemodellen, (ii) inducering af en lokaliseret og velafgrænset skade på hornhinden, (iii) evnen til at anvende enhver væske af interesse i en forudbestemt varighed og (iv) evnen til at fremkalde forskellige størrelser af hornhindeskader ved at vælge passende biopsislag. Denne metode er også mulig for rotte- og kaninskademodeller, som også udviser en buet hornhindeoverflade og er almindelige dyremodeller, der bruges til at studere sårheling på okulær overflade.
Protocol
Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med Stanford laboratoriedyrpleje APLAC nummer 33420, brug af dyr til videnskabelige formål og ARVO-erklæringen til brug af dyr i oftalmisk og visionsforskning. I alt 10 C57BL/6-han- og hunmus i alderen 8-12 uger blev generøst leveret af Irving L. Weissman-laboratoriet. Dyrene blev akklimatiseret til en 12 timers lys-mørk cyklus og forsynet med vand og foder ad libitum. Skader blev induceret til dyrets ene øje.
1. Forberedelse af forsøget
- Forberedelse af materialer
BEMÆRK: Alle reagenser skal holdes ved stuetemperatur.- Forbered punch-trephine: Forbered en biopsistans med en diameter på 3,5 mm og markér stansens aksel 5 mm væk fra dens distale kant. Fastgør stansen fast, og skær den markerede distale del af akslen ved hjælp af et to-trins roterende værktøj. Brug okulær beskyttelse under denne proces. Skær akslen i 3,5 mm dybde, og lad de sidste 1,5 mm være fastgjort. Bøj spidsen 90° som vist i figur 1.
- Der fremstilles 0,5 M NaOH-opløsning ved at opløse 1 g NaOH i 50 ml destilleret vand.
- Forbered 10 ml bedøvelsescocktail ved at kombinere 2 ml 100 mg / ml ketamin og 1 ml 20 mg / ml xylazin. Før injektion fortyndes denne blanding med 7 ml 0,9% NaCl (normalt saltvand).
- Forbered 0,1% fluoresceinnatriumopløsning ved at tilsætte 0,1 ml 10% AK-fluorfluorescerende væske i 9,9 ml sterilt fosfatbufret saltvand (1x PBS).
- Der fremstilles PBS (1x) ved at opløse 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 gNa2HPO4 og 0,23 gNaH2PO4i 900 ml destilleret vand. Opløsningens pH justeres til 7,4. Opløsningen bringes til et endeligt volumen på 1 liter ved tilsætning af destilleret vand.
- Forbered 4% paraformaldehyd (PFA) opløsning til fiksering. Under en kemisk hætte opløses 2 g PFA i 45 ml PBS. Blandingen opvarmes til 65 °C og titreres til 7,4. Når PFA'en er opløst, bringes opløsningen op på et slutvolumen på 50 ml.
2. Tilberedning af dyr
- Vej musen for at bestemme den passende mængde injicerbar anæstetisk cocktail til injektion. Efter korrekt håndtering og fastholdelse af musen som beskrevet i Machholz et al.15 administreres bedøvelsescocktailen intraperitonealt (IP) i en dosis på 0,01 ml/g16,17. Målret mod de ringere abdominale kvadranter til IP-injektion for at forhindre organskader.
- Injicer buprenorphin injicerbar suspension med forlænget frigivelse (3,25 mg/kg) subkutant for yderligere analgesi under og efter operationen, da hornhindealkaliskade er ekstremt smertefuld.
- Vent, indtil et dybt anæstesiplan er opnået. Kontroller for manglende reaktion på tåklemmen som en indikation af et vellykket dybt anæstesiplan. Påfør simpel øjensalve til det kontralaterale øje for at forhindre tørhed, inden operationen påbegyndes.
- Efter anæstesi skal du placere musen på operationsbordet, der er udarbejdet i henhold til standard gnaverkirurgiske principper18. Placer en 5 mm høj pude under gnaverens hoved, placeret i lateral decubitus position. Puden hjælper med at støtte gnaverens hoved under operationen.
- Administrer tetracainhydrochlorid (0,5%) øjendråber til yderligere anæstesi. Tør den okulære overflade korrekt med et kirurgisk øjenspyd og trim øjenvipper.
3. Induktion af alkaliskade
- Før operationen påbegyndes, skal du organisere operationsbordet i henhold til standard gnaverkirurgiske principper18,19 og holde det kirurgiske felt sterilt under operationen. Placer det kirurgiske mikroskop for korrekt at visualisere den bedøvede mus og juster timeren til 30 s. Placer et snoet papirhåndklæde på dyrets næse for at forhindre utilsigtet nasal aspiration under skylleprocessen.
- Bestem limbalområdets omkreds ved hjælp af det kirurgiske mikroskop, samtidig med at musens øjenlåg er vidt åbne ved hjælp af tommelfingeren og pegefingrene. Hold forsigtigt den rene punch-trephin parallelt med øjets akse uden at anvende noget nedadgående tryk. Undgå at dreje instrumentet, og hold stansetrefinens akse parallelt med klodens akse.
- Bed den kirurgiske assistent om at droppe 3 dråber NaOH-opløsning (svarende til 40 μL) i punch-trephinens hul for at fylde værktøjet og dække hornhindeoverfladen korrekt. Væskens overfladespænding forhindrer enhver lækage ud af instrumentet (figur 1).
BEMÆRK: Vi brugte en 1 mm sprøjte med en 27G nål med en flad spids vinklet 50 ° for forsigtigt at tabe NaOH-opløsningen. - Efter 30 s skylles hornhinden og fornix straks med 5 ml PBS (1x). Video 1 demonstrerer proceduren for at fremkalde kemisk skade.
- Brug et universelt pH-indikatorpapir for at sikre en pH-værdi på 7 - 7,5 på hornhindeoverfladen af det skadede øje. Påfør derefter den tredobbelte antibiotiske oftalmiske salve over den kemisk skadede okulære overflade.
BEMÆRK: Halebevægelse under operationen er et tegn på lav bedøvelsesdybde. Påfør yderligere bedøvelsescocktail (ketamin + xylazin) ved at injicere et bedøvelsesmiddel [bolus IP (50% af det oprindelige volumen)]. - Efter operationen skal du bekræfte, at musen er i en stabil tilstand. Administrer anden buprenorphin, hvis dyret har smerter. Der anvendes samme håndteringsteknik som i punkt 2.2. Start den postoperative undersøgelse, mens dyret er under anæstesi.
- Efter proceduren skal du vaske, tørre og desinficere punch-trephin og operationsbordet med 70% ethanol.
4. Klinisk evaluering
- Til undersøgelse bedøves musen som tidligere beskrevet i trin 2.1.
- Undersøg øjnene (skadede og ikke-skadede) under et spaltelampebiomikroskop. Brug et kamera til at tage billeder (i denne undersøgelse blev der brugt et telefonkamera i filmisk tilstand).
- Scor uklarhed af hornhinden i henhold til Yoeruek-klassificeringssystemet20: 0 = normal, klar hornhinde; 1 = mild opacitet; 2 = større opacitet, men iris og elev kan let skelnes; 3 = iris og elev kan næppe skelnes; 4 = hornhinden er fuldstændig uigennemsigtig med en usynlig pupil.
- Påfør 0,1% fluorescein øjendråber. Tør overskydende fluorescerende væske med en bomuldsapplikator og vurder for tilstedeværelsen af hornhindepiteldefekter ved hjælp af koboltblåfilteret. Tag billeder.
- Overvåg dyret, indtil det genvinder tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystliggende. Genintroducer ikke dyret til andre dyr, før det er helt genoprettet.
5. Nukleation
- Aflive mus 2 uger efter kemisk skade induktion ved cervikal dislokation i 3-5 s21.
- Enucleate øjet, mens den mediale caruncle og hele palpebral conjunctiva bevares i følgende rækkefølge, som vist i video 2.
- Under det kirurgiske mikroskop skal du forsigtigt dissekere krydset mellem caruncle og hud. Brug tandtang til at trække caruncle tilbage og før spidsen af kirurgisk saks under palpebral conjunctiva mod dens kryds med tarsalpladen.
- Skær bindehinden langs vedhæftningslinjen mod den laterale canthus. Drej derefter den kirurgiske saks til krydset mellem bindehinden og den ringere tarsalplade ved subkonjunktivalplanet.
- Efter afslutning af konjunktival dissektion trækkes de overlegne og ringere øjenlåg tilbage fra næsesiden med tommelfingeren og pegefingrene. Mens du trækker dig tilbage, skal du lede spidsen af en buet pincet bag den fremspringende lacrimal glad mod synsnerven. Tag godt fat i synsnerven og udtræk kloden (figur 2).
- Skyl globussen med PBS (1x) og overfør den til fikseringsopløsningen.
6. Hæmatoxylin og eosin (H&E) og periodisk syre-Schiff (PAS) farvning
- Fastgør globerne i 10% formalinopløsning natten over ved stuetemperatur.
- Dehydrer vævene ved hjælp af en sekventiel serie af gradueret alkohol med koncentrationer af 70% ethanol, 80% ethanol, 90% ethanol og 100% ethanol, hver i 10-15 minutter. Derefter nedsænkes øjnene i xylen i 10 min. Til sidst indkapsles øjnene i paraffin.
- Paraffinblokkene opdeles i 6 μm tykke skiver, og de monteres på glasmikroskopglas til hæmatoxylin og eosin (H&E) og periodisk syre-Schiff-farvning (PAS) som beskrevet i supplerende fil 1.
7. Immunofluorescens billeddannelse og analyse
- Til immunhistokemiske undersøgelser (IHC) fikseres øjnene i 1 ml PBS (1x) indeholdende 4% PFA ved 4 °C natten over. Prøven vaskes 3x i 1 ml PBS (1x) i 5 minutter hver.
- For at forhindre dannelse af iskrystaller og for at beskytte proteinernes molekylære strukturer udføres seriel saccharosemætning med 10% saccharose, 20% saccharose og 30% saccharosekoncentrationer i PBS. Integrer globerne i optisk kohærenstomografiløsning (OCT; Figur 2), og opbevar dem ved -80 °C.
- Del OCT-blokken i 12 μm tykke skiver og monter på glasmikroskopglas til IHC-farvning.
- Permeabiliser vævssektioner på mikroskopglas i 0,1% Triton X -100 i PBS (1x) i 15 min. Bloker derefter uspecifikke antigener med 5% BSA i PBS (1x) i yderligere 1 time ved stuetemperatur.
- Der inkuberes vævssektioner på mikroskopglas ved 4 °C natten over i cocktailen af de målrettede primære antistoffer fremstillet i PBS (1x) indeholdende 1% BSA. I dette eksperiment var de primære antistoffer 1:100 fortyndede kaninantikeratin 13 (K13) og anti-keratin 12 (K12) antistoffer med koncentration på henholdsvis 2,24 μg / ml og 1,56 μg / ml.
- Efter inkubation vaskes vævssektionerne på mikroskopglas 3x med PBS (1x). Derefter detekteres bundne primære antistoffer med 1:500 fortyndet æselanti-kanin-IgG. Det sekundære antistof inkuberes ved 4 °C i 1 time i mørke. Vask derefter i PBS (1x) 3x i 5 min hver.
- Påfør en dråbe anti-fade fluorescens monteringsmedium indeholdende DAPI på vævssektionerne på mikroskop og dæk med en dæksel. Lad prøverne tørre i mørke og undersøg dem under et fluorescerende mikroskop med samme laserindstilling for normale og skadede øjne.
Representative Results
Effekten af metoden til inducering af limbal stamcellemangel (LSCD) blev vurderet ved at evaluere de kliniske og histologiske tegn på LSCD. Klinisk vurdering blev udført ved spaltelampemikroskopi og anterior segment-optisk kohærenstomografi (AS-OCT) billeddannelse (figur 3 og figur 4).
Re-epithelialisering forekom på en centripetal måde og var hurtigere ved den tidsmæssige del af hornhinden sammenlignet med dens næsedel. Skadede øjne udviklede 2+-3+ hornhindetåge umiddelbart efter kemisk skade (figur 3). Epitelceller migrerede fra bindehinden til hornhindeoverfladen efter limbalskade. Den store hornhindepiteldefekt blev re-epiteliseret fuldstændigt på dag 12-14, hvilket tog længere tid sammenlignet med en hornhindepitelskade af tilsvarende størrelse og intakt kældermembran og stroma, som typisk helede inden for 5 dage efter skade 8,9. På grund af LSCD udviklede 50% af de skadede øjne vedvarende epiteldefekter i slutningen af anden uge (figur 3). Hornhindeødem var mere fremtrædende i løbet af de første par dage (figur 3, figur 4), mens hornhindefibrose var signifikant i den anden uge, der resulterede i 4+ uklarhed af hornhinden i 100% af skadede øjne.
Tidlige tegn på neovaskularisering (NV) blev observeret klinisk og histologisk, 24 timer efter kemisk skadeinduktion, som illustreret i figur 5, i overensstemmelse med tidslinjen for NV identificeret af Kvanta et al. undersøgelse, der viste tegn på limbal NV 24 timer efter skade22. Under helingsprocessen modnes nye fartøjer, og den 14. dag efter skaden krydsede NV limbusen og nåede den centrale hornhinde. Limbussen, som definerer grænsen mellem bindehinden og hornhinden, blev ødelagt.
Histologiske tegn på limbal stamcellemangel og konjunktivalisering blev observeret ved udseendet af PAS + bægerceller og stromale blodkar 23,24,25,26. Bægerceller blev observeret i den nuværende skadesmodel og angivet med pilen i figur 6.
Konjunktival og hornhindeepitelia udtrykker hovedsageligt unikke keratiner, henholdsvis K13 og K1227. Efter limbalskaden dækkede nye epitelceller, der stammer fra bindehinden, den denuderede hornhinde, og K12 blev ikke udtrykt på hornhindeoverfladen hos skadede dyr i 2 uger efter skaden. Dette fund, i overensstemmelse med andre undersøgelser28, indikerede fuldstændig LSCD og fraværet af hornhindeepitelceller på hornhindeoverfladen. I undersøgelsen af Park et al.29 opdagede de imidlertid K12-ekspression 20 og 32 uger efter skade, hvilket tyder på en mulig transdifferentiering af epitelcellerne.
Derfor observerede vi, at kemisk skade ødelagde limbus og limbal stamceller, hvilket resulterede i migration af konjunktivale epitelceller til midten af hornhinden for at dække den denuded hornhindeoverflade. Dette valideres yderligere af konjunktivepitelcellemarkøren, K13, som blev udtrykt i hele bindehinden og hornhindeoverfladerne som vist i figur 7.
Figur 1: Normal mus højre øje og punch-trephin til at fremkalde hornhinde og limbal skade. (A) Sidebillede, der viser museøje med stærkt buet hornhinde (pilespidser angiver limbus). (B) Billedet viser, at selv et stort filterpapir er utilstrækkeligt til at dække limbalområdet tilstrækkeligt. Limbus-til-limbus-diameteren i museøjet er næsten 4 mm, og en stansebiopsi med en udvendig diameter på 4,5 mm og en indvendig diameter på 3,5 mm (panelerne D og H) dækker passende hornhinden og limbaloverfladen som vist i panelerne (C) og (E). (F) Punch-trephin holdes passende over hele kloden omkring limbalområdet. G) For at sikre, at der ikke sker lækage gennem stanse-trefinens kant, fyldes hullet med methylenblåt efter passende placering af punch-trephinen i en parallel akse med globussen. Der påvises ingen lækage af methylenblåt. Vægtstang = 1 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Nukleerede øjne. (A) Øjnene blev enukleeret, mens de bevarede bulbar og palpebral conjunctiva, lacrimalkirtlen (pilespids) og synsnerven (pilen). De normale (B) og skadede (C) øjne blev mættet i 30% saccharose for at beskytte mod kryokrystaldannelse. Den nasale del af kloden kan genkendes gennem næsekarunklen (mærket N). Vægtstang = 1 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Sårheling af venstre øje. Sårhelingsprocessen i venstre museøje gennem 2 uger efter hornhinde- og limbalalkaliskade i en musemodel er vist her (A-F). Spaltelampeundersøgelsen af øjet. Hornhindeødem er mere fremtrædende på dag 0 og 2 (A, B), mens fibrose er mere tydelig i den anden uge efter skade (E-F). A.f-F.f viser re-epithelialiseringsprocessen for det samme øje. Total hornhinde og limbal epiteldefekt umiddelbart efter skadeinduktion observeres i A.f. Epiteldefekten helet ved konjunktival epitelcellemigration i et centripetalt mønster med 12-14 dage (A.f-F.f). Imidlertid udviklede 50% af de skadede øjne vedvarende epiteldefekt i slutningen af anden uge som vist med pil i F- og F.f-billeder. Skalabjælke = 1 mm (panel C). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Det forreste OCT-segment af museøjet. (A) AS-OLT illustrerer normal hornhindekrumning og forreste kammer. Irisstrukturen er veldefineret og genkendelig. Ingen iridocorneal adhæsion kan påvises i midten af iris. (B) Umiddelbart efter skaden øges hornhindetykkelsen på grund af ødemdannelse, og iridocorneal adhæsion udvikler sig i midten af irisens periferi. (C) To uger efter skaden er hornhindekrumningen ændret, og total iridocorneal adhæsion med ødelæggelse af det forreste kammer er synlig. Vægtstang = 1 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Hornhindeneovaskularisering. Kliniske og histologiske tegn på neovaskularisering af hornhinden kan observeres under sårhelingsprocessen efter natriumhydroxid (NaOH) skade. (A) De første tegn på neovaskularisering kan påvises den første dag efter skaden, karakteriseret ved en rødlig misfarvning af hornhinden (angivet med en hvid pil). Denne misfarvning skyldes aggregering af røde blodlegemer i stroma, som illustreret i det tilsvarende histologiske billede (D) (angivet med gule pilespidser). B) I løbet af den første uge af regenereringen øges antallet af nye fartøjer gradvis og spredes over hele hornhinden. (C) Ved udgangen af 2 uger er limbalområdet ødelagt, og de nye fartøjer fortsætter med at udvikle sig. (E) Den histologiske del af hornhinden illustrerer yderligere tilstedeværelsen af dyb stromal neovaskularisering (vist med pilespidser). Slids lampe Billedskalabjælke = 1 mm, histologibilledskalabjælken = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Periodisk syre-Schiff og immunohistokemisk (IHC) farvning af hornhinden. Periodisk syre-Schiff og immunohistokemisk farvning af den normale og skadede hornhinde blev udført 2 uger efter skade. Normalt musehornhindepitel sammensat af 4-5 lag celler (A). Alkaliskader på hornhinden og limbus førte til konjunktivalisering af hornhinden med udseende af bægerceller på hornhindeoverfladen som vist med sorte pile i (D). Normale hornhindepitelceller udtrykker K12 (B), som ikke udtrykkes af konjunktivcellerne, der dækker den skadede hornhinde (E). K13, en karakteristisk markør for konjunktivale epitelceller, udtrykkes ikke på de normale hornhindepitelceller (C). Det er imidlertid til stede på natriumhydroxid (NaOH) skadet hornhindeoverflade, der er et tegn på hornhindekonjunktivalisering (F). Histologi billedskalabjælke = 50 μm, IHC farvet billedskalabjælke = 20 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Hæmatoxylin og eosin og immunohistokemisk farvning. Hæmatoxylin og eosin (H&E) og immunhistokemisk farvning af det normale og skadede limbusvæv blev udført. (A) Den normale limbus markerer overgangsområdet mellem slutningen af sclera og begyndelsen af hornhinden. Denne region er typisk dækket af et eller to lag konjunktivale epitelceller (angivet med pilene). I et sundt øje begynder udtrykket af en specifik hornhindepitelmarkør kaldet K12 ved limbus og strækker sig til hornhindens overflade (vist på billede B). På den anden side er udtrykket af en konjunktival markør kendt som K13 begrænset til limbus og strækker sig ikke ud over den (angivet med den hvide pil i billede C). I øjne, der er skadet af natriumhydroxid (NaOH), forstyrres grænserne for limbus. Dette fører til migration af konjunktivalceller mod den skadede hornhinde. (D) Billederne af den NaOH-skadede limbus viser tilstedeværelsen af neovaskularisering både under epitellaget og i stromalvævet. Efter skaden mangler den skadede hornhindeoverflade tilstedeværelsen af K12 (E), mens K13 udtrykkes rigeligt på hornhindeoverfladen (F). Histologi billedskalabjælke = 50 μm, IHC farvet billedskalabjælke = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende fil 1: Farvningsprotokol. Klik her for at downloade denne fil.
Video 1: NaOH hornhinde og limbal skade i en musemodel med en punch-trephine. Videoen demonstrerer proceduren for at fremkalde NaOH hornhinde og limbal skade i en musemodel med en punch-trephin. Det er afgørende at holde punch-trephin i en parallel akse med kloden og anvende minimalt tryk på limbussen. Denne korrekte teknik er afgørende for at forhindre lækage og opnå optimale resultater. Klik her for at downloade denne video.
Video 2: Illustration af enukleationsteknikken, samtidig med at bulbar conjunctiva. For at differentiere næsesiden af kloden fra den tidsmæssige side bevares næsekaruncle sammen med kloden. Hele bindehinden dissekeres fra dens kryds til tarsalpladen. Med minimalt tryk stikker orbitalindholdet udad. Ved at lede tangen mod bagsiden af kloden gribes synsnerven, og vævet ekstraheres. Det enukleerede væv omfatter kloden, orbitalfedt og orbital lacrimalkirtel. Klik her for at downloade denne video.
Discussion
Denne undersøgelse foreslår en innovativ enhed, punch-trephine, som kan bruges til med succes at fremkalde en effektiv og reproducerbar hornhinde- og limbalskade i en musemodel. Denne limbal stamcellemangelmodel er ideel til at undersøge dynamikken i hornhindesårheling og konjunktivalisering efter skade.
Beviser tyder på, at både limbal niche og centrale del af murin hornhinden indeholder stamceller30. Derfor kræves en effektiv hornhinde- og limbalskade for at producere en stamcellemangelmodel, og skademodellen, der præsenteres her, muliggør eksponering af den buede hornhindelimbus for et kemisk middel i en bestemt periode. For at bestemme den bedste koncentration og varighed af NaOH-skade blev skader påført forskellige NaOH-koncentrationer og varigheder. Højere NaOH-koncentrationer eller længere eksponeringsvarighed resulterede i øget vævsskade og fibrose. Derfor kan forskere justere disse parametre baseret på de specifikke mål for deres undersøgelse og den ønskede sværhedsgrad af skaden.
For at kunne reproducere denne hornhinde- og limbalskademodel bør flere vigtige overvejelser overvejes. For det første er det bydende nødvendigt at måle det målrettede øjes limbal-til-limbale diameter for at bestemme den passende størrelse af stansen. Det anbefales at vælge en biopsistans med en udvendig diameter, der er 0,5 - 1 mm større end denne diameter.
Overfladespændingen af den anvendte væske er en vigtig faktor for at forhindre lækage ved grænsefladen mellem den okulære overflade og kanten af stansetrefinen som vist i figur 1G. Derfor er der ikke behov for at lægge pres på spidsen af stansebiopsi.
For at undgå at forårsage mekanisk skade på vævet er det vigtigt at holde stansetrepfinen i en parallel akse med øjet og afstå fra at lægge pres på limbussen. Forkert justering af stansetrephinaksen kan øge risikoen for lækage og resultere i et degraderet skadested og unøjagtige resultater.
Nogle potentielle begrænsninger ved denne teknik inkluderer behovet for at vælge den passende stansestørrelse, erhverve færdigheder i at holde stansetrephinen og den potentielle risiko for at forårsage mekanisk skade. Disse begrænsninger kan dog overvindes gennem praksis og ved at følge instruktionerne i denne protokol. Musens stamme og aldersgruppe er andre faktorer, der påvirker re-epithelialiseringsprocessen og skal overvejes i undersøgelsen.
Desuden er den foreslåede protokol fordelagtig, da den beskriver en enukleationsmetode, der bevarer bulbar og palpebral conjunctiva og muliggør bestemmelse af den nasale del af kloden uden anvendelse af kirurgiske suturer som markør. Tidligere forskning har vist, at næseområdet i øjet har den laveste neurale innervering sammenlignet med andre områder af hornhinden, hvilket gør det mere sårbart over for neovaskularisering og reduceret regenerativ effekt31,32.
Sammenfattende bekræfter de kliniske tegn på LSCD, såsom hornhindeopacitet (CO), vedvarende epiteldefekter og hornhindeneovaskularisering (NV) sammen med de observerede histologiske ændringer, herunder bægercellemetaplasi, ekspression af K13 på hornhindeoverfladen og fravær af K12 på hornhindeoverfladen, tilstedeværelsen af LSCD i denne model. Disse resultater giver bevis for, at denne nye teknik er effektiv til at inducere LSCD. Denne kemiske skademodel kan anvendes i prækliniske undersøgelser til at undersøge nye lægemidler og farmaceutiske behandlinger inden for hornhindeskade og regenerering.
Disclosures
Ingen af forfatterne har nogen økonomisk interesse i nogen af de virksomheder eller produkter, der er beskrevet i denne undersøgelse. Forfatterne erklærer ingen andre interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi anerkender, at NEI P30-EY026877 understøtter denne forskning. Vi anerkender i høj grad Charlene Wang og Dr. Irv Weissman Lab ved Stanford University's Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine for al deres venlige hjælp til at levere forsøgsdyr. Vi sætter pris på Hirad Rezaeipoors hjælp med forberedelsen og redigeringen af billederne.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-K12 antibody | ABCAM | ab185627 | |
| Anti-K13 antibody | ABCAM | ab92551 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | ThermoFisher Scientific | B14 | |
| C57BL/6 mice | Dr Weissman Lab, Stanford University | ||
| Curved forceps | Storz | E1885 | |
| Disposable 90 degree bent needle | |||
| Disposable biopsy punch | Med blades | ||
| Donkey anti-rabbit IgG H&L | ABCAM | ab150073 | |
| Ethanol | ThermoFisher Scientific | T038181000CS | |
| Ethiqa XR (Buprenorphine extended-release injectable suspension) | Fidelis Animal Health | ||
| Heating pad for mouse | |||
| Ketamine hydrochloride | Ambler | ANADA 200-055 | |
| OCT | Tissue-Tek 4583 | ||
| Ophthalmic surgical scissors | |||
| pH Indicator Sticks | Whatman | ||
| Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | AM9624 | |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| Slit-lamp microscope | NIDEK | SL-450 | |
| Sodium fluorescein AK-fluor 10% | Dailymed | NDC17478-253-10 | |
| Sterile irrigation solution (BSS) | Alcon | 9017036-0119 | |
| Sterile syringe, 1 and 5 ml | |||
| Straight forceps | Katena K5 | 4550- Storz E1684 | |
| Surgical eye spears | American White 17240 Cross | ||
| Surgical microscope | Zeiss S5 microscope | ||
| Tetracaine ophthalmic drop | Alcon | NDC0065-0741-14 | |
| Timer | |||
| Triple antibiotic ophthalmic ointment | Bausch and Lomb | ||
| TritonX -100 | Fisher Scientific | 50-295-34 | |
| Two-speed rotary tool | 200-1/15 Two Speed Rotary Toolkit | ||
| Xylazine | AnaSed | NADA#139-236 |
References
- Sridhar, M. S. Anatomy of cornea and ocular surface. Indian Journal of Ophthalmology. 66 (2), 190-194 (2018).
- Robaei, D., Watson, S. Corneal blindness: a global problem. Clinical & experimental Ophthalmology. 42 (3), 213-214 (2014).
- Lamm, V., Hara, H., Mammen, A., Dhaliwal, D., Cooper, D. K. C.
- Danjo, S., Friend, J., Thoft, R. A. Conjunctival epithelium in healing of corneal epithelial wounds. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 28 (9), 1445-1449 (1987).
- Shapiro, M. S., Friend, J., Thoft, R. A.
- Shah, D., Aakalu, V. K. Murine Corneal Epithelial Wound Modeling. Wound Regeneration: Methods and Protocols. Das, H. , Springer US. 175-181 (2021).
- Rittié, L., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D.
- Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
- Akowuah, P. K., De La Cruz, A., Smith, C. W., Rumbaut, R. E., Burns, A. R. An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing. Journal of Visualized Experiments. (178), 63112 (2021).
- Bai, J. Q., Qin, H. F., Zhao, S. H. Research on mouse model of grade II corneal alkali burn. International journal of Ophthalmology. 9 (4), 487-490 (2016).
- Paschalis, E. I., et al. The Role of Microglia and Peripheral Monocytes in Retinal Damage after Corneal Chemical Injury. The American Journal of Pathology. 188 (7), 1580-1596 (2018).
- Jiang, M., et al. Single-Shot Dimension Measurements of the Mouse Eye Using SD-OCT. Ophthalmic Surgery, Lasers and Imaging Retina. 43 (3), 252-256 (2012).
- Shadmani, A., Razmkhah, M., Jalalpoor, M. H., Lari, S. Y., Eghtedari, M. Autologous Activated Omental versus Allogeneic Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells in Corneal Alkaline Injury: An Experimental Study. Journal of Current Ophthalmology. 33 (2), 136-142 (2021).
- Swarup, A., et al. PNP Hydrogel Prevents Formation of Symblephara in Mice After Ocular Alkali Injury. Translational Vision Science & Technology. 11 (2), 31-31 (2022).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), 2771 (2012).
- Jaber, S. M., et al. Dose Regimens, Variability, and Complications Associated with Using Repeat-Bolus Dosing to Extend a Surgical Plane of Anesthesia in Laboratory Mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (6), 684-691 (2014).
- Navarro, K. L., et al. Mouse Anesthesia: The Art and Science. ILAR Journal. 62 (1-2), 238-273 (2021).
- Hoogstraten-Miller, S. L., Brown, P. A.
- ACLAM Medical Records Committee. Medical Records for Animals Used in Research, Teaching, and Testing: Public Statement from the American College of Laboratory Animal Medicine. ILAR Journal. 48 (1), 37-41 (2007).
- Yoeruek, E., et al. Safety, penetration and efficacy of topically applied bevacizumab: evaluation of eyedrops in corneal neovascularization after chemical burn. Acta Ophthalmologica. 86 (3), 322-328 (2008).
- Shomer, N. H., et al.
- Kvanta, A., Sarman, S., Fagerholm, P., Seregard, S., Steen, B. Expression of Matrix Metalloproteinase-2 (MMP-2) and Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) in Inflammation-associated Corneal Neovascularization. Experimental Eye Research. 70 (4), 419-428 (2000).
- Tseng, S. C., Hirst, L. W., Farazdaghi, M., Green, W. R. Goblet cell density and vascularization during conjunctival transdifferentiation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (10), 1168-1176 (1984).
- Huang, A. J., Tseng, S. C. Corneal epithelial wound healing in the absence of limbal epithelium. Investigative ophthalmology & visual science. 32 (1), 96-105 (1991).
- Rama, P., et al. Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration. New England Journal of Medicine. 363 (2), 147-155 (2010).
- Deng, S. X., et al. Global consensus on the definition, classification, diagnosis and staging of limbal stem cell deficiency. Cornea. 38 (3), 364-375 (2019).
- Wei, Z. G., Wu, R. L., Lavker, R. M., Sun, T. T. In vitro growth and differentiation of rabbit bulbar, fornix, and palpebral conjunctival epithelia: Implications on conjunctival epithelial transdifferentiation and stem cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 34 (5), 1814-1828 (1993).
- Kao, W. W. Y. Keratin expression by corneal and limbal stem cells during development. Experimental Eye Research. 200, 108206 (2020).
- Park, M., et al. Plasticity of ocular surface epithelia: Using a murine model of limbal stem cell deficiency to delineate metaplasia and transdifferentiation. Stem Cell Reports. 17 (11), 2451-2466 (2022).
- Li, J., et al. Identification for Differential Localization of Putative Corneal Epithelial Stem Cells in Mouse and Human. Scientific Reports. 7 (1), 5169 (2017).
- McKenna, C. C., Lwigale, P. Y. Innervation of the Mouse Cornea during Development. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (1), 30-35 (2011).
- He, J., Bazan, H. E. P. Neuroanatomy and Neurochemistry of Mouse Cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (2), 664-674 (2016).
