Summary
Этот протокол описывает метод индуцирования точного и воспроизводимого повреждения роговицы и лимбальной щелочи на мышиной модели. Преимущество протокола заключается в том, что он позволяет равномерно распределить повреждение сильно изогнутой роговицы и лимба мыши.
Abstract
Роговица имеет решающее значение для зрения, и заживление роговицы после травмы имеет основополагающее значение для поддержания ее прозрачности и функции. Изучая модели повреждений роговицы, исследователи стремятся улучшить свое понимание того, как заживает роговица, и разработать стратегии для предотвращения и лечения помутнений роговицы. Химическая травма является одной из самых популярных моделей травмы, которая была широко изучена на мышах. Большинство предыдущих исследователей использовали плоскую бумагу, смоченную в гидроксиде натрия, чтобы вызвать повреждение роговицы. Однако индуцирование повреждения роговицы и лимба с помощью плоской фильтровальной бумаги ненадежно, так как роговица мыши сильно изогнута. Здесь мы представляем новый инструмент, модифицированный биопсийный пуансон, который позволяет исследователям создать хорошо очерченное, локализованное и равномерно распределенное щелочное повреждение роговицы и лимба мыши. Этот метод удара трепаном позволяет исследователям вызвать точный и воспроизводимый химический ожог всей роговицы и лимба мыши, оставляя другие структуры, такие как веки, незатронутыми химическим веществом. Кроме того, в этом исследовании представлена техника энуклеации, которая сохраняет медиальный карункул в качестве ориентира для идентификации носовой стороны земного шара. Бульбарная и пальпебральная конъюнктива, слезная железа также сохраняются нетронутыми с помощью этой техники. Офтальмологические исследования проводили с помощью щелевого лампового биомикроскопа и флуоресцеинового окрашивания на 0, 1, 2, 6, 8 и 14 сутки после травмы. Клинические, гистологические и иммуногистохимические данные подтвердили дефицит лимбальных стволовых клеток и недостаточность регенерации глазной поверхности у всех подопытных мышей. Представленная модель щелочного повреждения роговицы идеально подходит для изучения дефицита лимбальных стволовых клеток, воспаления роговицы и фиброза. Этот метод также подходит для исследования доклинической и клинической эффективности местных офтальмологических препаратов на поверхности роговицы мышей.
Introduction
Роговица имеет решающее значение для зрения и обладает уникальными характеристиками, в том числе прозрачностью, которая является необходимым условием для четкого зрения. Помимо того, что роговица выполняет важную защитную роль, на нее приходится 2/3 преломляющейсилы глаза1. Из-за своей значительной роли в зрении травмы роговицы и помутнение кожи вызывают значительное ухудшение зрения и являются второй по значимости причиной предотвратимой слепоты во всем мире 2,3. При повреждениях роговицы с тяжелой лимбальной дисфункцией барьерная функция лимба снижается, что приводит к миграции клеток конъюнктивы к поверхности роговицы и конъюнктивализации роговицы 4,5, что резко ухудшает зрение. В связи с этим для решения проблемы глобального бремени слепоты роговицы и связанной с ней инвалидности необходимы эффективные профилактические и терапевтические стратегии.
Современное понимание процесса заживления ран роговицы человека основано на предыдущих исследованиях, в которых изучалась реакция роговицы на различные травмы. Для индуцирования различных химических или механических повреждений роговицы 6,7,8,9 и для исследования различных аспектов процесса заживления ран роговицы было использовано несколько методов и моделей на животных.
Модель ожога щелочью представляет собой хорошо зарекомендовавшую себя модель травмы, которая выполняется путем нанесения гидроксида натрия (NaOH) непосредственно на поверхность роговицы или с помощью плоской фильтровальной бумаги10. Щелочное повреждение приводит к высвобождению провоспалительных медиаторов и инфильтрации полиморфноядерных клеток не только в роговице и передней камере глаза, но и в сетчатке. Это индуцирует непреднамеренный апоптоз ганглиозных клеток сетчатки и активацию CD45+ клеток11. Поэтому очень важно точно локализовать место повреждения, чтобы избежать чрезмерного непреднамеренного травмирования с помощью модели щелочного повреждения.
Осевая длина глазного яблока мыши составляет примерно 3 мм12. Из-за такого короткого расстояния между роговицей и сетчаткой существует крутая кривизна роговицы, обеспечивающая высокую преломляющую силу для фокусировки света на сетчатке (рис. 1A). Какмы сообщали ранее, вызвать химическое повреждение этой сильно изогнутой поверхности с помощью плоской фильтровальной бумаги сложно, особенно в лимбе (рис. 1B). Чтобы вызвать повреждение лимба, необходимо наклонить фильтровальную бумагу, что может привести к непреднамеренному повреждению свода и прилегающей конъюнктивы14. Другой подход заключается в непосредственном нанесении химического агента в виде капель на поверхность роговицы. Однако этот метод не контролирует время воздействия, и существует потенциальный риск вызвать травму конъюнктивы, свода и век из-за диффузии жидкости в эти области.
Чтобы преодолеть эти ограничения, в данном исследовании представлен новый метод удара-трепана, вызывающий травму. Этот метод имеет ряд преимуществ, в том числе (i) индуцирование эффективного химического повреждения всей поверхности роговицы и лимба в мышиной модели, (ii) индуцирование локализованного и четко очерченного повреждения роговицы, (iii) возможность применения любой интересующей жидкости в течение заранее определенного времени, и (iv) способность вызывать различные размеры повреждений роговицы путем выбора соответствующих биопсийных пуансонов. Этот метод также применим для моделей травм крыс и кроликов, которые также демонстрируют изогнутую поверхность роговицы и являются распространенными животными моделями, используемыми для изучения заживления ран на поверхности глаза.
Protocol
Все процедуры проводились в соответствии со Стэнфордским соглашением по уходу за лабораторными животными APLAC No 33420, использованием животных в научных целях, а также Заявлением ARVO об использовании животных в офтальмологических исследованиях и исследованиях зрения. В общей сложности 10 самцов и самок мышей C57BL/6 в возрасте 8-12 недель были щедро предоставлены лабораторией Ирвинга Л. Вайсмана. Животные были акклиматизированы к 12-часовому циклу «свет-темнота» и обеспечены водой и кормом вволю. Животное получило травму одного глаза.
1. Подготовка к эксперименту
- Подготовка материалов
ПРИМЕЧАНИЕ: Все реагенты должны храниться при комнатной температуре.- Подготовьте пуансон-трепан: Подготовьте биопсийный пуансон диаметром 3,5 мм и отметьте стержень пунша на расстоянии 5 мм от его дистального края. Плотно закрепите пуансон и обрежьте отмеченную дистальную часть его вала с помощью двухскоростного поворотного инструмента. Во время этого процесса надевайте защитные очки. Отрежьте вал на глубину 3,5 мм и оставьте последние 1,5 мм прикрепленными. Согните кончик на 90°, как показано на рисунке 1.
- Приготовьте 0,5 М раствора NaOH, растворив 1 г NaOH в 50 мл дистиллированной воды.
- Приготовьте 10 мл анестетического коктейля, смешав 2 мл кетамина 100 мг/мл и 1 мл ксилазина 20 мг/мл. Перед инъекцией разбавьте эту смесь 7 мл 0,9% NaCl (физиологический раствор).
- Приготовьте 0,1% раствор флуоресцеина натрия, добавив 0,1 мл 10% флуоресцентной жидкости AK-Fluor в 9,9 мл стерильного фосфатно-солевого буфера (1x PBS).
- Приготовьте PBS (1x), растворив 8 г NaCl, 0,2 г KCl, 1,44 гNa2HPO4 и 0,23 г2PO4в 900 мл дистиллированной воды. Доведите рН раствора до 7,4. Доведите раствор до конечного объема в 1 л, добавив дистиллированную воду.
- Приготовьте 4% раствор параформальдегида (ПФА) для фиксации. Под химическим колпаком растворите 2 г PFA в 45 мл PBS. Нагрейте смесь до 65 °C и титруйте ее pH до 7,4. После того, как PFA растворится, доведите раствор до окончательного объема 50 мл.
2. Подготовка животных
- Взвесьте мышь, чтобы определить подходящий объем инъекционного анестетического коктейля для инъекции. После правильного обращения с мышью и ее удержания, как описано в Machholz et al.15, введите анестетик коктейль внутрибрюшинно (ВП) в дозе 0,01 мл/г16,17. Нацеливайтесь на нижние квадранты брюшной полости для инъекции IP, чтобы предотвратить повреждение органа.
- Вводите инъекционную суспензию бупренорфина с пролонгированным высвобождением (3,25 мг/кг) подкожно для дополнительного обезболивания во время и после операции, так как повреждение роговицы щелочью чрезвычайно болезненно.
- Подождите, пока не будет достигнута глубокая плоскость анестезии. Проверьте, нет ли реакции на защемление пальца ноги как признак успешного глубокого обезболивания. Перед началом операции нанесите простую глазную мазь на контралатеральный глаз, чтобы предотвратить его сухость.
- После анестезии поместите мышь на операционный стол, подготовленный в соответствии со стандартными принципами хирургии грызунов18. Подложите под голову грызуна подушку высотой 5 мм, расположив ее в положении бокового пролежня. Подушка помогает поддерживать голову грызуна во время операции.
- Закапывают глазные капли тетракаина гидрохлорида (0,5%) для дальнейшего обезболивания. Хорошенько высушите поверхность глаза хирургическим глазным копьем и подстригите ресницы.
3. Индукция щелочного повреждения
- Перед началом операции организуйте операционный стол в соответствии со стандартными принципами хирургии грызунов18,19 и поддерживайте стерильность операционного поля во время операции. Расположите операционный микроскоп так, чтобы правильно визуализировать мышь под наркозом, и установите таймер на 30 секунд. Положите на морду животного скрученное бумажное полотенце, чтобы предотвратить непреднамеренную аспирацию из носа во время промывки.
- Определите окружность лимбальной области с помощью операционного микроскопа, убедившись, что веки мыши широко открыты с помощью большого и указательного пальцев. Аккуратно держите чистый пуансон-трепан параллельно оси глаза, не надавливая вниз. Избегайте вращения инструмента и держите ось пуансона-трепана параллельной оси земного шара.
- Попросите ассистента хирурга капнуть 3 капли раствора NaOH (равных 40 мкл) в отверстие перфоратора-трепана, чтобы заполнить инструмент и соответствующим образом покрыть поверхность роговицы. Поверхностное натяжение жидкости предотвращает утечку из прибора (Рисунок 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы использовали шприц диаметром 1 мм с иглой 27G с уплощенным кончиком, расположенным под углом 50°, чтобы осторожно капать раствор NaOH. - Через 30 с немедленно промыть роговицу и свод 5 мл PBS (1x). На видео 1 показана процедура индуцирования химической травмы.
- Используйте универсальную бумагу-индикатор рН, чтобы обеспечить рН 7 - 7,5 на поверхности роговицы поврежденного глаза. Затем нанести офтальмологическую мазь с тройным антибиотиком на химически поврежденную поверхность глаза.
ПРИМЕЧАНИЕ: Движение хвоста во время операции является признаком низкой глубины анестезии. Применяют дополнительный анестетик коктейль (кетамин + ксилазин) путем введения анестетика [болюс ИП (50% от первоначального объема)]. - После операции убедитесь, что мышь находится в стабильном состоянии. Введите второй бупренорфин, если животное испытывает боль. Используйте ту же технику обработки, что и в 2.2. Приступайте к послеоперационному осмотру, пока животное находится под наркозом.
- После процедуры вымойте, высушите и продезинфицируйте пунш-трепан и операционный стол 70% этанолом.
4. Клиническая оценка
- Для обследования обезболивайте мышь, как описано ранее в шаге 2.1.
- Осмотрите глаза (поврежденные и неповрежденные) под биомикроскопом с щелевой лампой. Используйте камеру для съемки фотографий (в этом исследовании использовалась камера телефона в режиме «Киноэффект»).
- Оценка помутнения роговицы в соответствии с системой оценок Yoeruek20: 0 = нормальная, прозрачная роговица; 1 = слабая непрозрачность; 2 = большая непрозрачность, но радужная оболочка и зрачок легко различимы; 3 = радужная оболочка и зрачок едва различимы; 4 = роговица полностью непрозрачная, с невидимым зрачком.
- Нанесите 0,1% флуоресцеиновые глазные капли. Высушите излишки флуоресцентной жидкости ватным аппликатором и оцените наличие дефектов эпителия роговицы с помощью фильтра кобальтово-синего цвета. Делайте фотографии.
- Наблюдайте за животным до тех пор, пока оно не придет в сознание настолько, чтобы поддерживать положение грудины. Не вводите животное повторно другим животным до тех пор, пока оно полностью не выздоровеет.
5. Энуклеация
- Усыпляют мышей через 2 недели после индукции химического повреждения вывихом шейки матки через 3-5 с21.
- Энуклейте глаз, сохранив медиальный карункул и всю пальпебральную конъюнктиву в следующем порядке, как показано на видео 2.
- Под операционным микроскопом тщательно рассекают место соединения карункула и кожи. С помощью зубных щипцов втяните карункул и направьте кончик хирургических ножниц под пальпебральную конъюнктиву к ее соединению с тарзальной пластинкой.
- Разрежьте конъюнктиву по линии спайки по направлению к латеральному кантусу. Затем поверните хирургические ножницы к месту соединения конъюнктивы и нижней тарзальной пластинки в субконъюнктивальной плоскости.
- После завершения рассечения конъюнктивы большим и указательным пальцами втянуть верхнее и нижнее веки со стороны носа. При втягивании направьте кончик пинцета с изогнутым концом за выступающую слезную гладь к зрительному нерву. Крепко возьмитесь за зрительный нерв и извлеките глобус (рис. 2).
- Промойте шар PBS (1x) и перенесите его в фиксирующий раствор.
6. Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) и периодическим кислотным окрашиванием по Шиффу (PAS)
- Зафиксируйте шарики в 10% растворе формалина на ночь при комнатной температуре.
- Обезвоживайте ткани с помощью последовательных серий градуированного спирта с концентрациями 70% этанола, 80% этанола, 90% этанола и 100% этанола, каждый в течение 10-15 минут. После этого погрузите глаза в ксилол на 10 мин. Наконец, оберните глаза парафином.
- Разделите парафиновые блоки на ломтики толщиной 6 мкм и установите их на предметные стекла микроскопа для окрашивания гематоксилином и эозином (H&E) и периодическим кислотным окрашиванием по Шиффу (PAS), как описано в Дополнительном файле 1.
7. Иммунофлуоресцентная визуализация и анализ
- Для иммуногистохимических исследований (ИГХ) зафиксируйте глаза в 1 мл PBS (1x), содержащего 4% PFA, при 4 °C на ночь. Промывают образец 3 раза в 1 мл PBS (1x) в течение 5 мин каждый.
- Чтобы предотвратить образование кристаллов льда и защитить молекулярные структуры белков, выполните последовательное насыщение сахарозой концентрацией 10%, 20% сахарозы и 30% сахарозы в PBS. Встраивание глобусов в раствор для оптической когерентной томографии (ОКТ; Рисунок 2) и хранят их при -80 °C.
- Разрезать блок ОКТ на срезы толщиной 12 мкм и закрепить на предметных стеклах микроскопа для окрашивания ИГХ.
- Пермеабилизация срезов тканей на предметных стеклах микроскопа в 0,1% Triton X −100 в PBS (1x) в течение 15 мин. Затем блокируют неспецифические антигены 5% БСА в PBS (1x) еще 1 ч при комнатной температуре.
- Инкубируют срезы тканей на предметных стеклах микроскопа при температуре 4 °C в течение ночи в коктейле из таргетных первичных антител, приготовленных в PBS (1x), содержащем 1% BSA. В этом эксперименте первичными антителами были разбавленные в соотношении 1:100 кролики антикератин 13 (К13) и антикератин 12 (К12) с концентрацией 2,24 мкг/мл и 1,56 мкг/мл соответственно.
- После инкубации промыть срезы тканей на предметных стеклах микроскопа 3 раза PBS (1x). Впоследствии выявляют связанные первичные антитела с помощью разбавленного в 1:500 ослиного анти-IgG. Инкубируют со вторичным антителом при 4 °С в течение 1 ч в темноте. Затем постирайте в PBS (1x) 3 раза по 5 минут каждый.
- Нанесите каплю флуоресцентной монтажной среды, содержащей DAPI, на срезы тканей на микроскопе и накройте покровным стеклом. Дайте образцам высохнуть в темноте и исследуйте их под флуоресцентным микроскопом с той же лазерной настройкой для нормальных и травмированных глаз.
Representative Results
Эффективность метода в индуцировании дефицита лимбальных стволовых клеток (ЛСКД) оценивали путем оценки клинико-гистологических признаков ЛСКД. Клиническую оценку проводили с помощью щелевой микроскопии и оптической когерентной томографии переднего сегмента (АС-ОКТ) (рис. 3 и рис. 4).
Реэпителизация происходила центростремительно и происходила быстрее в височной части роговицы по сравнению с ее носовой частью. У поврежденных глаз сразу после химического поражения развилась мутность роговицы 2+-3+ (рис. 3). Эпителиальные клетки мигрировали из конъюнктивы на поверхность роговицы после травмы лимба. Большой дефект эпителия роговицы был полностью реэпителизирован на 12-14-е сутки, что заняло больше времени по сравнению с повреждением эпителия роговицы аналогичного размера и неповрежденной базальной мембраны и стромы, которое обычно заживало в течение 5 дней после травмы 8,9. Из-за LSCD у 50% поврежденных глаз к концу второй недели развились стойкие дефекты эпителия (рис. 3). Отек роговицы был более выраженным в течение первых нескольких дней (рис. 3, рис. 4), в то время как фиброз роговицы был значительным на второй неделе, что привело к помутнению роговицы 4+ у 100% поврежденных глаз.
Ранние признаки неоваскуляризации (НВ) наблюдались клинически и гистологически через 24 ч после индукции химического повреждения, как показано на рисунке 5, что согласуется с хронологической шкалой НВ, выявленной в исследовании Kvanta et al., которое показало признаки лимбального НВ через 24 ч после травмы22. В процессе заживления созревали новые сосуды и к 14-му дню после травмы НВ пересекал лимб и достигал центральной роговицы. Лимб, определяющий границу между конъюнктивой и роговицей, был разрушен.
Гистологические признаки дефицита лимбальных стволовых клеток и конъюнктивализации наблюдались по появлению бокаловидных клеток PAS+ и стромальных кровеносных сосудов 23,24,25,26. Бокаловидные клетки наблюдались в данной модели травмы и обозначены стрелкой на рисунке 6.
Эпителий конъюнктивы и роговицы в основном экспрессируют уникальные кератины К13 и К12 соответственно27. После лимбальной травмы новые эпителиальные клетки, происходящие из конъюнктивы, покрывали оголенную роговицу, и K12 не экспрессировался на поверхности роговицы ни одного травмированного животного в течение 2 недель после травмы. Этот результат, согласующийся с другими исследованиями28, указывал на полную ЛСКД и отсутствие эпителиальных клеток роговицы на поверхности роговицы. Тем не менее, в исследовании Park et al.29 они обнаружили экспрессию K12 через 20 и 32 недели после травмы, что позволяет предположить возможную трансдифференцировку эпителиальных клеток.
Следовательно, мы наблюдали, что химическое повреждение разрушало лимб и лимбальные стволовые клетки, что приводило к миграции эпителиальных клеток конъюнктивы в центр роговицы, чтобы покрыть оголенную поверхность роговицы. Это подтверждается маркером клеток эпителия конъюнктивы K13, который экспрессировался по всей поверхности конъюнктивы и роговицы, как показано на рисунке 7.
Рисунок 1: Нормальный правый глаз мыши и пунш-трепан для индуцирования повреждения роговицы и лимбов. (A) Вид сбоку, показывающий глаз мыши с сильно изогнутой роговицей (стрелки указывают на лимб). (Б) На рисунке видно, что даже большой фильтровальной бумаги недостаточно для того, чтобы адекватно покрыть лимбальную область. Диаметр глаза мыши от лимба до лимба составляет почти 4 мм, а пункционная биопсия с наружным диаметром 4,5 мм и внутренним диаметром 3,5 мм (панели D и H) соответствующим образом покрывает поверхность роговицы и лимбальной поверхности, как показано на панелях (C) и (E). (F) Пунш-трепан надлежащим образом удерживается над земным шаром вокруг лимбальной области. (G) Чтобы гарантировать отсутствие утечки через край пуансона-трепана, после соответствующего позиционирования пуансона-трепина на параллельной оси с глобусом, отверстие заполняется метиленовым синим. Утечки метиленового синего не обнаружено. Масштабная линейка = 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Энуклеированные глаза. (А) Глаза были энуклеированы с сохранением бульбарной и пальпебральной конъюнктивы, слезной железы (наконечник стрелы) и зрительного нерва (стрелка). Нормальные (В) и поврежденные (С) глаза насыщали 30% сахарозой для защиты от образования криокристаллов. Носовая часть земного шара узнаваема через носовой карункул (обозначен буквой N). Масштабная линейка = 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Заживление раны левого глаза. Процесс заживления раны левого глаза мыши в течение 2 недель после повреждения роговицы и лимбальной щелочи на мышиной модели показан здесь (A-F). Осмотр глаза с помощью щелевой лампы. Отек роговицы более выражен на 0-й и 2-й дни (A, B), тогда как фиброз более заметен на второй неделе после травмы (E-F). A.f-F.f показывают процесс реэпителизации одного и того же глаза. Тотальный дефект эпителия роговицы и лимба непосредственно после индукции травмы наблюдается при А.Ф. Дефект эпителия заживает миграцией клеток эпителия конъюнктивы по центростремительному типу к 12-14 суткам (А.ф-Ф.ф.). Тем не менее, у 50% поврежденных глаз развился стойкий дефект эпителия в конце второй недели, как показано стрелкой на изображениях F и F.f. Масштабная линейка = 1 мм (панель C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: ОКТ переднего сегмента глаза мыши. (A) АС-ОКТ иллюстрирует нормальное искривление роговицы и передней камеры. Структура радужной оболочки хорошо выражена и узнаваема. Иридокорнеальная адгезия не обнаруживается на средней периферии радужной оболочки. (Б) Сразу после травмы толщина роговицы увеличивается из-за образования отека, и на средней периферии радужки развивается иридокорнеальная адгезия. (В) Через две недели после травмы кривизна роговицы изменилась, и видна полная иридокорнеальная адгезия с разрушением передней камеры. Масштабная линейка = 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Неоваскуляризация роговицы. Клинико-гистологические признаки неоваскуляризации роговицы могут наблюдаться в процессе заживления раны после повреждения гидроксидом натрия (NaOH). (А) Начальные признаки неоваскуляризации обнаруживаются в первые сутки после травмы и характеризуются красноватым обесцвечиванием роговицы (обозначено белой стрелкой). Это изменение цвета является результатом скопления эритроцитов в строме, как показано на соответствующем гистологическом изображении (D) (отмечено желтыми стрелками). (Б) В течение первой недели регенерации новые сосуды постепенно увеличиваются и распространяются по всей роговице. (В) К концу 2 недель лимбальная область разрушается, и новые сосуды продолжают развиваться. (E) Гистологический разрез роговицы дополнительно иллюстрирует наличие глубокой стромальной неоваскуляризации (показано наконечниками стрелок). Щелевая лампа Масштабная линейка изображения = 1 мм, масштабная линейка гистологического изображения = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Периодическое кислотно-шиффовское и иммуногистохимическое (ИГХ) окрашивание роговицы. Периодическое кислотно-шиффовское и иммуногистохимическое окрашивание нормальной и поврежденной роговицы проводили через 2 недели после травмы. Нормальный эпителий роговицы мыши, состоящий из 4-5 слоев клеток (А). Щелочное повреждение роговицы и лимба приводило к конъюнктивализации роговицы с появлением бокаловидных клеток на поверхности роговицы, как показано черными стрелками на рисунке (D). Нормальные эпителиальные клетки роговицы экспрессируют K12 (B), который не экспрессируется конъюнктивальными клетками, покрывающими поврежденную роговицу (E). К13, характерный маркер эпителиальных клеток конъюнктивы, не экспрессируется на нормальных эпителиальных клетках роговицы (С). Однако он присутствует на поврежденной поверхности роговицы гидроксидом натрия (NaOH), что является признаком конъюнктивализации роговицы (F). Масштабная линейка гистологического изображения = 50 мкм, масштабная линейка окрашенного ИГХ изображения = 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Гематоксилин и эозин и иммуногистохимическое окрашивание. Проводили гематоксилин и эозин (H&E) и иммуногистохимическое окрашивание нормальной и поврежденной ткани лимба. (А) Нормальный лимб отмечает переходную область между концом склеры и началом роговицы. Эта область обычно покрыта одним или двумя слоями эпителиальных клеток конъюнктивы (обозначены стрелками). В здоровом глазу экспрессия специфического эпителиального маркера роговицы, называемого K12, начинается в лимбе и распространяется на поверхность роговицы (показано на рисунке B). С другой стороны, экспрессия конъюнктивального маркера, известного как K13, ограничена лимбом и не выходит за его пределы (обозначена белой стрелкой на рисунке C). В глазах, поврежденных гидроксидом натрия (NaOH), нарушаются границы лимба. Это приводит к миграции клеток конъюнктивы в сторону поврежденной роговицы. (D) Изображения лимба, поврежденного NaOH, демонстрируют наличие неоваскуляризации как под эпителиальным слоем, так и в стромальной ткани. После травмы на поврежденной поверхности роговицы отсутствует присутствие K12 (E), в то время как K13 обильно экспрессируется на поверхности роговицы (F). Масштабная линейка гистологического изображения = 50 мкм, масштабная линейка окрашенного ИГХ изображения = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный файл 1: Протокол окрашивания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Видео 1: Повреждение роговицы и лимба NaOH на мышиной модели с помощью панч-трепана. На видео демонстрируется процедура индуцирования NaOH повреждения роговицы и лимба на мышиной модели с помощью пунша-трепана. Очень важно держать пунш-трепан параллельно земному шару и оказывать минимальное давление на лимб. Эта правильная техника необходима для предотвращения протечек и достижения оптимальных результатов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.
Видео 2: Иллюстрация техники энуклеации с сохранением бульбарной конъюнктивы. Чтобы отличить носовую сторону земного шара от височной стороны, носовой карункул сохраняют вместе с глобусом. Рассекается вся конъюнктива, начиная от ее соединения с тарзальной пластинкой. При минимальном давлении орбитальное содержимое выпячивается наружу. Направляя щипцы к задней части шара, зрительный нерв захватывается, и ткань извлекается. Энуклеированная ткань включает в себя глобус, орбитальный жир и слезную железу орбиты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.
Discussion
В этом исследовании предлагается инновационное устройство, панч-трепан, которое может быть использовано для успешного индуцирования эффективного и воспроизводимого повреждения роговицы и лимба на мышиной модели. Эта модель дефицита лимбальных стволовых клеток идеально подходит для изучения динамики заживления ран роговицы и конъюнктивализации после травмы.
Фактические данные свидетельствуют о том, что как лимбальная ниша, так и центральная часть роговицы мыши содержат стволовые клетки30. Таким образом, для создания модели дефицита стволовых клеток требуется эффективное повреждение роговицы и лимбальной области, а представленная здесь модель повреждения позволяет подвергать искривленный лимб роговицы воздействию химического агента в течение определенного периода времени. Для определения наилучшей концентрации и продолжительности повреждения NaOH травмы наносили с различными концентрациями и продолжительностью NaOH. Более высокие концентрации NaOH или более длительная продолжительность воздействия приводили к усилению повреждения тканей и фиброзу. Таким образом, исследователи могут корректировать эти параметры в зависимости от конкретных целей своего исследования и желаемой тяжести травмы.
Для успешного воспроизведения этой модели повреждения роговицы и лимба необходимо учитывать несколько ключевых моментов. Во-первых, необходимо измерить лимбальный диаметр целевого глаза, чтобы определить подходящий размер пуансона. Рекомендуется выбрать биопсийный пуансон с наружным диаметром, который на 0,5 - 1 мм больше этого диаметра.
Поверхностное натяжение используемой жидкости является важным фактором предотвращения утечки на границе раздела между поверхностью глаза и краем трепана, как показано на рисунке 1G. Поэтому нет необходимости оказывать давление на кончик пункционной биопсии.
Чтобы избежать нанесения механических повреждений тканям, критически важно держать пуансон трепан параллельно оси с глазом и воздерживаться от давления на лимб. Неправильная регулировка оси трепана пуансона может увеличить риск утечки и привести к децентрированному месту травмы и неточным результатам.
Некоторые потенциальные ограничения этой техники включают в себя необходимость выбора подходящего размера пуансона, приобретение навыков удержания трепана пуансона и потенциальный риск причинения механических травм. Однако эти ограничения можно преодолеть на практике и следуя инструкциям, изложенным в этом протоколе. Штамм и возрастной диапазон мышей являются другими факторами, влияющими на процесс реэпителизации, и должны быть учтены в исследовании.
Кроме того, преимущество предлагаемого протокола заключается в том, что в нем подробно описан метод энуклеации, который сохраняет бульбарную и пальпебральную конъюнктиву и позволяет определить носовую часть земного шара без наложения хирургических швов в качестве маркера. Предыдущие исследования показали, что носовая область глаза обладает самой низкой нервной иннервацией по сравнению с другими областями роговицы, что делает ее более уязвимой к неоваскуляризации и снижению регенеративной эффективности31,32.
Таким образом, клинические признаки LSCD, такие как помутнение роговицы (CO), стойкие дефекты эпителия и неоваскуляризация роговицы (NV), наряду с наблюдаемыми гистологическими изменениями, включая метаплазию бокаловидных клеток, экспрессию K13 на поверхности роговицы и отсутствие K12 на поверхности роговицы, подтверждают наличие LSCD в этой модели. Эти результаты свидетельствуют о том, что этот новый метод эффективен в индуцировании LSCD. Эта модель химического повреждения может быть использована в доклинических исследованиях для изучения новых лекарств и фармацевтических методов лечения в области повреждения и регенерации роговицы.
Disclosures
Ни один из авторов не имеет финансовой заинтересованности ни в одной из компаний или продуктов, описанных в этом исследовании. Авторы не заявляют об отсутствии других конфликтов интересов.
Acknowledgments
Мы признаем, что NEI P30-EY026877 поддерживает это исследование. Мы выражаем глубокую признательность Шарлин Вонг и лаборатории доктора Ирва Вайсмана в Институте биологии стволовых клеток и регенеративной медицины Стэнфордского университета за их любезную помощь в предоставлении экспериментальных животных. Мы благодарим Хирада Резаипура за помощь в подготовке и редактировании изображений.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-K12 antibody | ABCAM | ab185627 | |
| Anti-K13 antibody | ABCAM | ab92551 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | ThermoFisher Scientific | B14 | |
| C57BL/6 mice | Dr Weissman Lab, Stanford University | ||
| Curved forceps | Storz | E1885 | |
| Disposable 90 degree bent needle | |||
| Disposable biopsy punch | Med blades | ||
| Donkey anti-rabbit IgG H&L | ABCAM | ab150073 | |
| Ethanol | ThermoFisher Scientific | T038181000CS | |
| Ethiqa XR (Buprenorphine extended-release injectable suspension) | Fidelis Animal Health | ||
| Heating pad for mouse | |||
| Ketamine hydrochloride | Ambler | ANADA 200-055 | |
| OCT | Tissue-Tek 4583 | ||
| Ophthalmic surgical scissors | |||
| pH Indicator Sticks | Whatman | ||
| Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | AM9624 | |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| Slit-lamp microscope | NIDEK | SL-450 | |
| Sodium fluorescein AK-fluor 10% | Dailymed | NDC17478-253-10 | |
| Sterile irrigation solution (BSS) | Alcon | 9017036-0119 | |
| Sterile syringe, 1 and 5 ml | |||
| Straight forceps | Katena K5 | 4550- Storz E1684 | |
| Surgical eye spears | American White 17240 Cross | ||
| Surgical microscope | Zeiss S5 microscope | ||
| Tetracaine ophthalmic drop | Alcon | NDC0065-0741-14 | |
| Timer | |||
| Triple antibiotic ophthalmic ointment | Bausch and Lomb | ||
| TritonX -100 | Fisher Scientific | 50-295-34 | |
| Two-speed rotary tool | 200-1/15 Two Speed Rotary Toolkit | ||
| Xylazine | AnaSed | NADA#139-236 |
References
- Sridhar, M. S. Anatomy of cornea and ocular surface. Indian Journal of Ophthalmology. 66 (2), 190-194 (2018).
- Robaei, D., Watson, S. Corneal blindness: a global problem. Clinical & experimental Ophthalmology. 42 (3), 213-214 (2014).
- Lamm, V., Hara, H., Mammen, A., Dhaliwal, D., Cooper, D. K. C.
- Danjo, S., Friend, J., Thoft, R. A. Conjunctival epithelium in healing of corneal epithelial wounds. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 28 (9), 1445-1449 (1987).
- Shapiro, M. S., Friend, J., Thoft, R. A.
- Shah, D., Aakalu, V. K. Murine Corneal Epithelial Wound Modeling. Wound Regeneration: Methods and Protocols. Das, H. , Springer US. 175-181 (2021).
- Rittié, L., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D.
- Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
- Akowuah, P. K., De La Cruz, A., Smith, C. W., Rumbaut, R. E., Burns, A. R. An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing. Journal of Visualized Experiments. (178), 63112 (2021).
- Bai, J. Q., Qin, H. F., Zhao, S. H. Research on mouse model of grade II corneal alkali burn. International journal of Ophthalmology. 9 (4), 487-490 (2016).
- Paschalis, E. I., et al. The Role of Microglia and Peripheral Monocytes in Retinal Damage after Corneal Chemical Injury. The American Journal of Pathology. 188 (7), 1580-1596 (2018).
- Jiang, M., et al. Single-Shot Dimension Measurements of the Mouse Eye Using SD-OCT. Ophthalmic Surgery, Lasers and Imaging Retina. 43 (3), 252-256 (2012).
- Shadmani, A., Razmkhah, M., Jalalpoor, M. H., Lari, S. Y., Eghtedari, M. Autologous Activated Omental versus Allogeneic Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells in Corneal Alkaline Injury: An Experimental Study. Journal of Current Ophthalmology. 33 (2), 136-142 (2021).
- Swarup, A., et al. PNP Hydrogel Prevents Formation of Symblephara in Mice After Ocular Alkali Injury. Translational Vision Science & Technology. 11 (2), 31-31 (2022).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), 2771 (2012).
- Jaber, S. M., et al. Dose Regimens, Variability, and Complications Associated with Using Repeat-Bolus Dosing to Extend a Surgical Plane of Anesthesia in Laboratory Mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (6), 684-691 (2014).
- Navarro, K. L., et al. Mouse Anesthesia: The Art and Science. ILAR Journal. 62 (1-2), 238-273 (2021).
- Hoogstraten-Miller, S. L., Brown, P. A.
- ACLAM Medical Records Committee. Medical Records for Animals Used in Research, Teaching, and Testing: Public Statement from the American College of Laboratory Animal Medicine. ILAR Journal. 48 (1), 37-41 (2007).
- Yoeruek, E., et al. Safety, penetration and efficacy of topically applied bevacizumab: evaluation of eyedrops in corneal neovascularization after chemical burn. Acta Ophthalmologica. 86 (3), 322-328 (2008).
- Shomer, N. H., et al.
- Kvanta, A., Sarman, S., Fagerholm, P., Seregard, S., Steen, B. Expression of Matrix Metalloproteinase-2 (MMP-2) and Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) in Inflammation-associated Corneal Neovascularization. Experimental Eye Research. 70 (4), 419-428 (2000).
- Tseng, S. C., Hirst, L. W., Farazdaghi, M., Green, W. R. Goblet cell density and vascularization during conjunctival transdifferentiation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (10), 1168-1176 (1984).
- Huang, A. J., Tseng, S. C. Corneal epithelial wound healing in the absence of limbal epithelium. Investigative ophthalmology & visual science. 32 (1), 96-105 (1991).
- Rama, P., et al. Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration. New England Journal of Medicine. 363 (2), 147-155 (2010).
- Deng, S. X., et al. Global consensus on the definition, classification, diagnosis and staging of limbal stem cell deficiency. Cornea. 38 (3), 364-375 (2019).
- Wei, Z. G., Wu, R. L., Lavker, R. M., Sun, T. T. In vitro growth and differentiation of rabbit bulbar, fornix, and palpebral conjunctival epithelia: Implications on conjunctival epithelial transdifferentiation and stem cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 34 (5), 1814-1828 (1993).
- Kao, W. W. Y. Keratin expression by corneal and limbal stem cells during development. Experimental Eye Research. 200, 108206 (2020).
- Park, M., et al. Plasticity of ocular surface epithelia: Using a murine model of limbal stem cell deficiency to delineate metaplasia and transdifferentiation. Stem Cell Reports. 17 (11), 2451-2466 (2022).
- Li, J., et al. Identification for Differential Localization of Putative Corneal Epithelial Stem Cells in Mouse and Human. Scientific Reports. 7 (1), 5169 (2017).
- McKenna, C. C., Lwigale, P. Y. Innervation of the Mouse Cornea during Development. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (1), 30-35 (2011).
- He, J., Bazan, H. E. P. Neuroanatomy and Neurochemistry of Mouse Cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (2), 664-674 (2016).
