Summary
Detta protokoll beskriver en metod för att inducera en exakt och reproducerbar hornhinne- och limbalkaliskada i en musmodell. Protokollet är fördelaktigt eftersom det möjliggör en jämnt fördelad skada på den mycket krökta musens hornhinna och limbus.
Abstract
Hornhinnan är avgörande för synen, och hornhinnans läkning efter trauma är grundläggande för att upprätthålla dess transparens och funktion. Genom att studera modeller för hornhinneskador vill forskarna öka sin förståelse för hur hornhinnan läker och utveckla strategier för att förebygga och hantera hornhinnegrumlingar. Kemisk skada är en av de mest populära skademodellerna som har studerats utförligt på möss. De flesta tidigare forskare har använt ett platt papper indränkt i natriumhydroxid för att framkalla hornhinneskada. Att inducera hornhinne- och limbalskador med platt filterpapper är dock otillförlitligt, eftersom musens hornhinna är mycket krökt. Här presenterar vi ett nytt instrument, en modifierad biopsistans, som gör det möjligt för forskarna att skapa en väl avgränsad, lokaliserad och jämnt fördelad alkaliskada på hornhinnan och limbus. Denna punch-trephine-metod gör det möjligt för forskare att inducera en exakt och reproducerbar kemisk brännskada på hela hornhinnan och limbus samtidigt som andra strukturer, såsom ögonlocken, lämnas opåverkade av kemikalien. Dessutom introducerar denna studie en enukleationsteknik som bevarar den mediala karunkeln som ett landmärke för att identifiera den nasala sidan av jordklotet. Den bulbära och palpebrala bindhinnan och tårkörteln hålls också intakta med denna teknik. Oftalmologiska undersökningar utfördes med spaltlampans biomikroskop och fluoresceinfärgning dag 0, 1, 2, 6, 8 och 14 efter skadan. Kliniska, histologiska och immunhistokemiska fynd bekräftade brist på limbala stamceller och misslyckad regenerering av okulär yta hos alla experimentella möss. Den presenterade alkaliska hornhinneskademodellen är idealisk för att studera limbal stamcellsbrist, hornhinneinflammation och fibros. Denna metod är också lämplig för att undersöka prekliniska och kliniska effekter av topikala oftalmologiska läkemedel på hornhinnans yta.
Introduction
Hornhinnan är avgörande för synen och uppvisar unika egenskaper, inklusive transparens, vilket är en förutsättning för klar syn. Förutom att ha en viktig skyddande roll står hornhinnan för 2/3 av ögats brytningskraft1. På grund av dess betydande roll för synen orsakar hornhinneskador och opacitet betydande synförsämring och är ansvariga för den näst största orsaken till blindhet som kan förebyggasi världen 2,3. Vid hornhinneskador med allvarlig limbal dysfunktion minskar limbus barriärfunktion, vilket resulterar i att konjunktivala celler migrerar mot hornhinnans yta och hornhinnans konjunktivalisering 4,5, vilket äventyrar synen dramatiskt. Det krävs därför effektiva förebyggande och terapeutiska strategier för att ta itu med den globala bördan av hornhinneblindhet och relaterad funktionsnedsättning.
Den nuvarande förståelsen av hornhinnans sårläkningsprocess bygger på tidigare studier som har undersökt hornhinnans svar på olika skador. Flera tekniker och djurmodeller har använts för att inducera olika kemiska eller mekaniska hornhinneskador 6,7,8,9 och för att undersöka olika aspekter av hornhinnans sårläkningsprocess.
Modellen för alkalibrännskador är en väletablerad skademodell som utförs genom att applicera natriumhydroxid (NaOH) direkt över hornhinnans yta eller genom att använda platt filterpapper10. En alkaliskada resulterar i frisättning av proinflammatoriska mediatorer och infiltration av polymorfonukleära celler inte bara i hornhinnan och ögats främre kammare utan även i näthinnan. Detta inducerar oavsiktlig retinal gangliecellsapoptos och CD45+ -cellaktivering11. Därför är det viktigt att lokalisera skadeplatsen exakt för att undvika överdriven oavsiktlig skada med hjälp av en alkaliskademodell.
Den axiella längden på den murina ögongloben är cirka 3 mm12. På grund av detta korta avstånd mellan hornhinnan och näthinnan finns en brant hornhinnekrökning som ger hög brytningskraft för att fokusera ljuset på näthinnan (Figur 1A). Som vi tidigare rapporterat13 är det svårt att inducera kemisk skada på denna mycket krökta yta med hjälp av ett platt filterpapper, särskilt vid limbus (Figur 1B). För att inducera skada på limbus krävs lutning av filterpapperet, vilket kan orsaka oavsiktlig skada på fornix och intilliggande bindhinna14. Ett annat tillvägagångssätt innebär att man direkt applicerar det kemiska medlet som droppar på hornhinnans yta. Denna metod saknar dock kontroll över exponeringstiden, och det finns en potentiell risk för att inducera skada på bindhinnan, fornix och ögonlocken på grund av vätskans diffusion till dessa områden.
För att övervinna dessa begränsningar presenterar denna studie en ny punch-trephine-metod för att inducera skada. Denna teknik har flera fördelar, inklusive (i) att inducera en effektiv kemisk skada på hela hornhinnans yta och limbus i musmodell, (ii) att inducera en lokaliserad och väl avgränsad skada på hornhinnan, (iii) förmågan att applicera vilken vätska som helst av intresse under en förutbestämd tid, och (iv) förmågan att inducera olika storlekar av hornhinneskador genom att välja lämpliga biopsistansar. Denna metod är också möjlig för skademodeller på råttor och kaniner, som också uppvisar en krökt hornhinneyta och är vanliga djurmodeller som används för att studera sårläkning på okulär yta.
Protocol
Alla procedurer utfördes i enlighet med Stanfords laboratoriedjurvård APLAC-nummer 33420, användning av djur för vetenskapliga ändamål och ARVO-uttalandet för användning av djur i oftalmisk och synforskning. Totalt 10 han- och honmöss av typen C57BL/6 i åldrarna 8-12 veckor tillhandahölls generöst av Irving L. Weissmans laboratorium. Djuren acklimatiserades till en 12 timmars ljus-mörkercykel och försågs med vatten och foder ad libitum. Skada orsakades på djurets ena öga.
1. Förberedelse för försöket
- Förberedelse av material
OBS: Alla reagenser ska förvaras i rumstemperatur.- Förbered stans-trefine: Förbered en biopsistans med en diameter på 3.5 mm och markera stansens skaft 5 mm från dess distala kant. Fäst stansen ordentligt och skär den markerade distala delen av dess axel med ett tvåväxlat roterande verktyg. Använd ögonskydd under denna process. Kapa skaftet på 3.5 mm djup och låt de sista 1.5 mm sitta kvar. Böj spetsen 90°, som visas i figur 1.
- Bered 0,5 M NaOH-lösning genom att lösa 1 g NaOH i 50 ml destillerat vatten.
- Bered 10 ml bedövningscocktail genom att kombinera 2 ml 100 mg/ml ketamin och 1 ml 20 mg/ml xylazin. Före injektion späds denna blandning med 7 ml 0,9 % NaCl (normal koksaltlösning).
- Bered 0,1 % fluoresceinnatriumlösning genom att tillsätta 0,1 ml 10 % fluorescerande AK-Fluor-vätska till 9,9 ml steril fosfatbuffrad koksaltlösning (1x PBS).
- Bered PBS (1x) genom att lösa upp 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4 och 0,23 g NaH2PO4i 900 ml destillerat vatten. Justera lösningens pH till 7,4. Värm lösningen till en slutlig volym på 1 L genom att tillsätta destillerat vatten.
- Bered 4% paraformaldehydlösning (PFA) för fixering. Lös upp 2 g PFA i 45 ml PBS under en kemisk huv. Värm blandningen till 65 °C och titrera pH-värdet till 7,4. När PFA har lösts upp, bringa lösningen till en slutlig volym på 50 ml.
2. Beredning av djur
- Väg musen för att bestämma lämplig volym injicerbar anestesicocktail för injektion. Efter korrekt hantering och fixering av musen enligt beskrivningen i Machholz et al.15, administrera anestesicocktailen intraperitonealt (IP) i en dos på 0,01 ml/g16,17. Rikta in dig på de nedre bukkvadranterna för IP-injektion för att förhindra organskador.
- Injicera buprenorfin injicerbar suspension med förlängd frisättning (3,25 mg/kg) subkutant för ytterligare smärtlindring under och efter operationen eftersom alkaliskada på hornhinnan är extremt smärtsam.
- Vänta tills ett djupt anestesiplan har uppnåtts. Kontrollera om det finns ett uteblivet svar på tånypning som en indikation på ett lyckat djupplan av anestesi. Applicera enkel ögonsalva för det kontralaterala ögat för att förhindra att det blir torrt innan operationen påbörjas.
- Efter bedövning placeras musen på operationsbordet som förberetts enligt standardprinciperna för gnagarkirurgi18. Placera en 5 mm hög kudde under gnagarens huvud, placerad i sidoläge. Kudden hjälper till att stödja gnagarens huvud under operationen.
- Administrera tetrakainhydroklorid (0,5 %) ögondroppar för ytterligare anestesi. Torka ögonytan ordentligt med ett kirurgiskt ögonspjut och trimma ögonfransarna.
3. Induktion av alkaliskada
- Innan du påbörjar operationen, organisera operationsbordet enligt standardprinciperna för gnagarkirurgi18,19 och håll operationsområdet sterilt under operationen. Placera det kirurgiska mikroskopet för att korrekt visualisera den sövda musen och justera timern till 30 s. Placera en tvinnad pappershandduk på djurets nos för att förhindra oavsiktlig näsaspiration under sköljprocessen.
- Bestäm det limbala områdets omkrets med hjälp av det kirurgiska mikroskopet samtidigt som du ser till att musens ögonlock är vidöppna med tummen och pekfingret. Håll försiktigt den rena stanstrefinen parallellt med ögats axel, utan att trycka nedåt. Undvik att snurra instrumentet och håll stanstrefinets axel parallell med globens axel.
- Be den kirurgiska assistenten att droppa 3 droppar NaOH-lösning (motsvarande 40 μL) i hålet för stanstrefin för att fylla verktyget och täcka hornhinnans yta på lämpligt sätt. Vätskans ytspänning förhindrar läckage ut ur instrumentet (Figur 1).
OBS: Vi använde en 1 mm spruta med en 27G nål med en tillplattad spets vinklad i 50° för att försiktigt släppa NaOH-lösningen. - Efter 30 s sköljs hornhinnan och fornix omedelbart med 5 ml PBS (1x). Video 1 visar proceduren för att inducera kemisk skada.
- Använd ett universellt pH-indikatorpapper för att säkerställa ett pH-värde på 7-7,5 på hornhinnans yta av det skadade ögat. Applicera sedan den trippelantibiotiska oftalmiska salvan över den kemiskt skadade ögonytan.
OBS: Svansrörelser under operationen är ett tecken på lågt anestesidjup. Applicera ytterligare bedövningscocktail (ketamin + xylazin) genom att injicera ett bedövningsmedel [bolus IP (50 % av den initiala volymen)]. - Efter operationen, bekräfta att musen är i ett stabilt tillstånd. Administrera ett andra buprenorfin om djuret har ont. Använd samma hanteringsteknik som i 2.2. Starta den postoperativa undersökningen medan djuret är nedsövt.
- Efter ingreppet tvättas, torkas och desinficeras punch-trefinet och operationsbordet med 70 % etanol.
4. Klinisk utvärdering
- För undersökning, bedöva musen enligt beskrivningen i steg 2.1.
- Undersök ögonen (skadade och icke-skadade) under ett spaltlampsbiomikroskop. Använd en kamera för att ta bilder (i den här studien användes en telefonkamera i cinematiskt läge).
- Poäng hornhinnans opacitet enligt Yoerueks graderingssystem20: 0 = normal, klar hornhinna; 1 = lätt opacitet; 2 = större opacitet, men iris och pupill är lätta att urskilja; 3 = iris och pupill är knappt urskiljbara; 4 = hornhinnan är helt ogenomskinlig med en osynlig pupill.
- Applicera 0,1 % fluoresceina ögondroppar. Torka överflödig fluorescerande vätska med en bomullsapplikator och utvärdera förekomsten av hornhinneepiteldefekter med hjälp av det koboltblå filtret. Ta bilder.
- Övervaka djuret tills det återfår tillräckligt med medvetande för att bibehålla sternal liggande. Återintroducera inte djuret för andra djur förrän det har återhämtat sig helt.
5. Kärnbildning
- Avliva möss 2 veckor efter kemisk skadeinduktion genom cervikal luxation i 3-5 s21.
- Enukleär ögat samtidigt som den mediala karunkeln och hela den palpebrala bindhinnan bevaras i följande ordning, som visas i video 2.
- Dissekera försiktigt korsningen mellan karunkeln och huden under det kirurgiska mikroskopet. Använd en tandpincett, dra tillbaka karunkeln och styr spetsen på den kirurgiska saxen under den palpebrala bindhinnan mot dess korsning med tarsalplattan.
- Skär bindhinnan längs vidhäftningslinjen mot den laterala kantusen. Vrid sedan den kirurgiska saxen till korsningen mellan bindhinnan och den nedre tarsalplattan vid det subkonjunktivala planet.
- Efter avslutad konjunktival dissektion, dra tillbaka de övre och nedre ögonlocken från nässidan med tummen och pekfingret. Medan du drar in, styr spetsen på en böjd pincett bakom den utskjutande tårkanalen glad mot synnerven. Ta ett stadigt tag i synnerven och dra ut globen (Figur 2).
- Skölj jordgloben med PBS (1x) och överför den till fixeringslösningen.
6. Hematoxylin och eosin (H&E) och periodisk syra-Schiff (PAS) färgning
- Fixera globerna i 10 % formalinlösning över natten i rumstemperatur.
- Torka vävnaderna med en sekventiell serie graderad alkohol med koncentrationer av 70 % etanol, 80 % etanol, 90 % etanol och 100 % etanol, vardera i 10-15 minuter. Sänk sedan ner ögonen i xylen i 10 minuter. Avsluta med att omsluta ögonen med paraffin.
- Dela paraffinblocken i 6 μm tjocka skivor och montera dem på glasmikroskopglas för hematoxylin och eosin (H&E) och periodisk syra-Schiff (PAS) färgning, enligt beskrivningen i tilläggsfil 1.
7. Immunofluorescensavbildning och analys
- För immunhistokemiska studier (IHC), fixera ögonen i 1 ml PBS (1x) innehållande 4 % PFA vid 4 °C över natten. Tvätta sample 3x i 1 ml PBS (1x) i 5 minuter vardera.
- För att förhindra iskristallbildning och för att skydda proteinernas molekylära strukturer, utför seriell sackarosmättnad med 10 % sackaros, 20 % sackaros och 30 % sackaroskoncentrationer i PBS. Bädda in globerna i optisk koherenstomografilösning (OCT; figur 2) och förvara dem vid -80 °C.
- Dela OCT-blocket i 12 μm tjocka skivor och montera på glasmikroskopglas för IHC-färgning.
- Permeabilisera vävnadssnitt på objektglas i 0,1 % Triton X −100 i PBS (1x) i 15 min. Blockera sedan ospecifika antigener med 5 % BSA i PBS (1x) i ytterligare 1 timme vid rumstemperatur.
- Inkubera vävnadssnitt på objektglas vid 4 °C över natten i en cocktail av de primära antikroppar som framställts i PBS (1x) innehållande 1 % BSA. I detta experiment var de primära antikropparna 1:100 utspädda kaninantikeratin 13 (K13) och anti-keratin 12 (K12) antikroppar med en koncentration på 2,24 μg/ml respektive 1,56 μg/ml.
- Efter inkubationen, tvätta vävnadssnitten på objektglas 3x med PBS (1x). Detektera därefter bundna primära antikroppar med 1:500 utspädd åsna anti-kanin-IgG. Inkubera med sekundärantikroppen vid 4 °C i 1 timme i mörker. Tvätta sedan i PBS (1x) 3x i 5 min vardera.
- Applicera en droppe anti-blekningsfluorescensmonteringsmedium som innehåller DAPI på vävnadssnitten i mikroskopet och täck med ett täckglas. Låt proverna torka i mörker och undersök dem i fluorescerande mikroskop med samma laserinställning för normala och skadade ögon.
Representative Results
Metodens effekt när det gäller att inducera limbal stamcellsbrist (LSCD) utvärderades genom att utvärdera de kliniska och histologiska tecknen på LSCD. Klinisk bedömning gjordes med spaltlampsmikroskopi och anterior segment-optisk koherenstomografi (AS-OCT) avbildning (Figur 3 och Figur 4).
Återepitelisering skedde på ett centripetalt sätt och var snabbare vid den temporala delen av hornhinnan jämfört med dess nasala del. Skadade ögon utvecklade 2+-3+ hornhinnedis omedelbart efter kemisk skada (Figur 3). Epitelceller migrerade från bindhinnan till hornhinnans yta efter limbal skada. Den stora hornhinneepiteldefekten återepiteliserades helt på dag 12-14, vilket tog längre tid jämfört med en hornhinneepitelskada av liknande storlek och intakt basalmembran och stroma som vanligtvis läkte inom 5 dagar efter skada 8,9. På grund av LSCD utvecklade 50 % av de skadade ögonen kvarstående epiteldefekter i slutet av den andra veckan (Figur 3). Hornhinneödem var mer framträdande under de första dagarna (Figur 3, Figur 4), medan hornhinnefibros var signifikant under den andra veckan som resulterade i 4+ hornhinnegrumling i 100 % av de skadade ögonen.
Tidiga tecken på neovaskularisering (NV) observerades kliniskt och histologiskt, 24 timmar efter kemisk skadeinduktion, vilket illustreras i figur 5, vilket överensstämmer med tidslinjen för NV identifierad av Kvanta et al.-studien som visade tecken på limbal NV 24 timmar efter skada22. Under läkningsprocessen mognade nya kärl och på den 14:e dagen efter skadan korsade NV limbus och nådde den centrala hornhinnan. Limbus, som definierar gränsen mellan bindhinnan och hornhinnan, förstördes.
Histologiska tecken på limbal stamcellsbrist och konjunktivalisering observerades genom uppkomsten av PAS+-bägarceller och stromala blodkärl 23,24,25,26. Bägarceller observerades i den aktuella skademodellen och indikerades med pilen i figur 6.
Konjunktival och hornhinneepitel uttrycker huvudsakligen unika keratiner, K13 respektive K1227. Efter den limbala skadan täckte nya epitelceller som härrörde från bindhinnan den blottade hornhinnan, och K12 uttrycktes inte på hornhinnans yta hos något skadat djur under 2 veckor efter skadan. Detta fynd, som överensstämde med andra studier28, indikerade fullständig LSCD och frånvaro av hornhinneepitelceller på hornhinnans yta. Men i studien av Park et al.29 upptäckte de K12-uttryck 20 och 32 veckor efter skadan, vilket tyder på en möjlig transdifferentiering av epitelcellerna.
Följaktligen observerade vi att kemisk skada förstörde limbus och limbala stamceller, vilket resulterade i att konjunktivalepitelceller migrerade till mitten av hornhinnan för att täcka den blottade hornhinnans yta. Detta bekräftas ytterligare av den konjunktivala epitelcellsmarkören, K13, som uttrycktes i hela bindhinnan och hornhinnans ytor som visas i figur 7.
Figur 1: Normalt musöga och punch-trefin för att inducera hornhinne- och limbal skada. (A) Sidovy som visar musöga med kraftigt böjd hornhinna (pilspetsar indikerar limbus). (B) Bilden visar att även ett stort filterpapper är otillräckligt för att täcka limbalområdet på ett tillfredsställande sätt. Limbus-till-limbus-diametern i musögat är nästan 4 mm och en stansbiopsi med en ytterdiameter på 4,5 mm och en innerdiameter på 3,5 mm (panelerna D och H) täcker på lämpligt sätt hornhinnan och limbalytan som visas i panelerna (C) och (E). (F) Stanstrefinet hålls på lämpligt sätt över jordklotet runt det limbala området. (G) För att säkerställa att det inte finns något läckage genom kanten på stanstrefinet, efter att stanstrefinet har placerats på lämpligt sätt i en parallell axel med globen, fylls hålet med metylenblått. Inget läckage av metylenblått har upptäckts. Skalstreck = 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Enukleerade ögon. (A) Ögonen enukleerades samtidigt som bulbär och palpebral bindhinna, tårkörteln (pilspetsen) och synnerven (pilen) bibehölls. De normala (B) och skadade (C) ögonen mättades med 30 % sackaros för att skydda mot kryokristallbildning. Den nasala delen av jordklotet känns igen genom näskarunkeln (märkt N). Skalstreck = 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Sårläkning av vänster öga. Sårläkningsprocessen i vänster musöga under 2 veckor efter hornhinne- och limbalkaliskada i en musmodell visas här (A-F). Spaltlampans undersökning av ögat. Hornhinneödem är mer framträdande på dag 0 och 2 (A,B), medan fibros är mer påtagligt under den andra veckan efter skadan (E-F). A.f-F.f visar återepiteliseringsprocessen i samma öga. Total hornhinne- och limbalepiteldefekt omedelbart efter induktion av skada observeras hos A.f. Epiteldefekten läkt genom konjunktival epitelcellsmigration i ett centripetalmönster med 12-14 dagar (AF-FF). 50 % av de skadade ögonen utvecklade dock ihållande epiteldefekt i slutet av den andra veckan, vilket framgår av pilen i F- och F.f-bilder. Skalstreck = 1 mm (panel C). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Främre segment OCT av musögat. (A) AS-OCT illustrerar hornhinnans normala krökning och främre kammare. Irisstrukturen är väldefinierad och igenkännbar. Ingen vidhäftning av iridocorneal kan detekteras i mitten av iris. (B) Omedelbart efter skadan ökar hornhinnans tjocklek på grund av ödembildning och iridohornhinnevidhäftning utvecklas i mitten av iris. (C) Två veckor efter skadan har hornhinnans krökning förändrats och total vidhäftning av iridocorneal med förstörelse av främre kammaren är synlig. Skalstreck = 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Kärlnybildning av hornhinnan. Kliniska och histologiska tecken på kärlnybildning i hornhinnan kan observeras under sårläkningsprocessen efter skada på natriumhydroxid (NaOH). (A) De första tecknen på neovaskularisering blir detekterbara den första dagen efter skadan, kännetecknad av en rödaktig missfärgning av hornhinnan (indikerad av en vit pil). Denna missfärgning beror på aggregering av röda blodkroppar i stromat, vilket illustreras i motsvarande histologiska bild (D) (indikerad med gula pilspetsar). (B) Under den första veckan av regenereringen ökar nya kärl gradvis och sprider sig över hela hornhinnan. (C) I slutet av 2 veckor är limbalområdet förstört och de nya kärlen fortsätter att utvecklas. (E) Den histologiska delen av hornhinnan illustrerar ytterligare förekomsten av djup stromal neovaskularisering (visas med pilspetsar). Spaltlampa Bildskalan = 1 mm, histologibildens skalstapel = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Periodisk syra-Schiff och immunhistokemisk (IHC) färgning av hornhinnan. Periodisk syra-Schiff och immunhistokemisk färgning av den normala och skadade hornhinnan gjordes 2 veckor efter skadan. Normalt hornhinneepitel hos möss bestående av 4-5 lager av celler (A). Alkaliskador på hornhinnan och limbus ledde till konjunktivalisering av hornhinnan med utseende av bägarceller på hornhinnans yta som visas av svarta pilar i (D). Normala hornhinneepitelceller uttrycker K12 (B), som inte uttrycks av de konjunktivalceller som täcker den skadade hornhinnan (E). K13, en karakteristisk markör för konjunktivalepitelceller, uttrycks inte på de normala hornhinneepitelcellerna (C). Det är dock närvarande på den natriumhydroxidskadade (NaOH) hornhinnans yta som är ett tecken på hornhinnans konjunktivalisering (F). Histologibildskalan = 50 μm, IHC-färgad bildskalan = 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Hematoxylin och eosin och immunhistokemisk färgning. Hematoxylin och eosin (H&E) och immunohistokemisk färgning av normal och skadad limbusvävnad gjordes. (A) Den normala limbus markerar övergångsområdet mellan slutet av sclera och början av hornhinnan. Denna region är vanligtvis täckt av ett eller två lager av konjunktivalepitelceller (indikeras av pilarna). I ett friskt öga börjar uttrycket av en specifik hornhinneepitelmarkör som kallas K12 vid limbus och sträcker sig till hornhinnans yta (visas i bild B). Å andra sidan är uttrycket av en konjunktival markör som kallas K13 begränsad till limbus och sträcker sig inte utanför den (indikeras av den vita pilen i bild C). I ögon som skadats av natriumhydroxid (NaOH) är gränserna för limbus störda. Detta leder till att bindhinnecellerna vandrar mot den skadade hornhinnan. (D) Bilderna av den NaOH-skadade limbus visar närvaron av neovaskularisering både under epitelskiktet och i stromavävnaden. Efter skadan saknar den skadade hornhinnans yta närvaron av K12 (E), medan K13 uttrycks rikligt på hornhinnans yta (F). Histologi bildskalstreck = 50 μm, IHC-färgat bildskalstreck = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tilläggsfil 1: Färgningsprotokoll. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Video 1: NaOH hornhinne- och limbalskada i en musmodell med en punch-trephine. Videon visar proceduren för att inducera NaOH hornhinne- och limbal skada i en musmodell med en punch-trephine. Det är viktigt att hålla stanstrefinet i en parallell axel med globen och applicera minimalt tryck på limbus. Denna korrekta teknik är avgörande för att förhindra läckage och uppnå optimala resultat. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Video 2: Illustration av enukleationstekniken samtidigt som den bulbala bindhinnan bevaras. För att skilja den nasala sidan av jordklotet från den temporala sidan bevaras näskarunkeln tillsammans med globen. Hela bindhinnan dissekeras med början från dess korsning till tarsalplattan. Med minimalt tryck sticker orbitalinnehållet utåt. Genom att styra pincetten mot baksidan av klotet grips synnerven och vävnaden extraheras. Den enukleerade vävnaden inkluderar klotet, orbitalfettet och orbitaltårkörteln. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Discussion
Denna studie föreslår en innovativ anordning, punch-trefine, som kan användas för att framgångsrikt inducera en effektiv och reproducerbar hornhinne- och limbal skada i en musmodell. Denna limbala stamcellsbristmodell är idealisk för att undersöka dynamiken i hornhinnans sårläkning och konjunktivalisering efter skada.
Bevis tyder på att både den limbala nischen och den centrala delen av hornhinnan innehåller stamceller30. Därför krävs en effektiv hornhinne- och limbal skada för att producera en stamcellsbristmodell, och den skademodell som presenteras här möjliggör exponering av den krökta hornhinnelimbus för ett kemiskt medel under en viss period. För att bestämma den bästa koncentrationen och varaktigheten av NaOH-skada tillfogades skador med olika NaOH-koncentrationer och varaktigheter. Högre NaOH-koncentrationer eller längre exponeringstider resulterade i ökad vävnadsskada och fibros. Därför kan forskare justera dessa parametrar baserat på de specifika målen för deras studie och den önskade svårighetsgraden av skadan.
För att framgångsrikt reproducera denna modell för hornhinne- och limbal skada bör flera viktiga överväganden beaktas. För det första är det absolut nödvändigt att mäta den limbala diametern på det riktade ögat för att bestämma lämplig storlek på stansen. Vi rekommenderar att du väljer en biopsistans med en ytterdiameter som är 0,5 - 1 mm större än denna diameter.
Ytspänningen hos den använda vätskan är en viktig faktor för att förhindra läckage vid gränssnittet mellan okulärytan och kanten på stanstrefinet som visas i figur 1G. Därför finns det inget behov av att applicera tryck på spetsen av stansbiopsin.
För att undvika att orsaka mekanisk skada på vävnaden är det viktigt att hålla stanstrefinet i en parallell axel med ögat och avstå från att utöva tryck på limbus. Felaktig justering av stanstrefinaxeln kan öka risken för läckage och resultera i en decentraliserad skadeplats och felaktiga resultat.
Några potentiella begränsningar med denna teknik inkluderar behovet av att välja lämplig stansstorlek, förvärva skicklighet i att hålla stanstrefinet och den potentiella risken för att orsaka mekanisk skada. Dessa begränsningar kan dock övervinnas genom övning och genom att följa instruktionerna i detta protokoll. Mössens stam och åldersintervall är andra faktorer som påverkar återepiteliseringsprocessen och måste beaktas i studien.
Dessutom är det föreslagna protokollet fördelaktigt eftersom det beskriver en enukleationsmetod som bevarar bulbär och palpebral konjunktiva och möjliggör bestämning av den nasala delen av jordklotet utan applicering av kirurgiska suturer som markör. Tidigare forskning har indikerat att ögats näsregion har den lägsta neurala innervationen jämfört med andra delar av hornhinnan, vilket gör den mer sårbar för neovaskularisering och minskad regenerativ effekt31,32.
Sammanfattningsvis bekräftar de kliniska tecknen på LSCD, såsom hornhinnegrumling (CO), ihållande epiteldefekter och hornhinneneovaskularisering (NV), tillsammans med de observerade histologiska förändringarna, inklusive bägarcellsmetaplasi, uttryck av K13 på hornhinnans yta och frånvaro av K12 på hornhinnans yta, närvaron av LSCD i denna modell. Dessa fynd ger bevis för att denna nya teknik är effektiv för att inducera LSCD. Denna kemiska skademodell kan användas i prekliniska studier för att undersöka nya mediciner och läkemedelsbehandlingar inom området hornhinneskada och regenerering.
Disclosures
Ingen av författarna har något ekonomiskt intresse i något av de företag eller produkter som beskrivs i denna studie. Författarna redovisar inga andra intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi är medvetna om att NEI P30-EY026877 stöder denna forskning. Vi vill rikta ett stort tack till Charlene Wang och Dr. Irv Weissman Lab vid Stanford University's Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine för all deras vänliga hjälp med att tillhandahålla försöksdjur. Vi uppskattar Hirad Rezaeipoors hjälp med förberedelse och redigering av bilderna.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-K12 antibody | ABCAM | ab185627 | |
| Anti-K13 antibody | ABCAM | ab92551 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | ThermoFisher Scientific | B14 | |
| C57BL/6 mice | Dr Weissman Lab, Stanford University | ||
| Curved forceps | Storz | E1885 | |
| Disposable 90 degree bent needle | |||
| Disposable biopsy punch | Med blades | ||
| Donkey anti-rabbit IgG H&L | ABCAM | ab150073 | |
| Ethanol | ThermoFisher Scientific | T038181000CS | |
| Ethiqa XR (Buprenorphine extended-release injectable suspension) | Fidelis Animal Health | ||
| Heating pad for mouse | |||
| Ketamine hydrochloride | Ambler | ANADA 200-055 | |
| OCT | Tissue-Tek 4583 | ||
| Ophthalmic surgical scissors | |||
| pH Indicator Sticks | Whatman | ||
| Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | AM9624 | |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| Slit-lamp microscope | NIDEK | SL-450 | |
| Sodium fluorescein AK-fluor 10% | Dailymed | NDC17478-253-10 | |
| Sterile irrigation solution (BSS) | Alcon | 9017036-0119 | |
| Sterile syringe, 1 and 5 ml | |||
| Straight forceps | Katena K5 | 4550- Storz E1684 | |
| Surgical eye spears | American White 17240 Cross | ||
| Surgical microscope | Zeiss S5 microscope | ||
| Tetracaine ophthalmic drop | Alcon | NDC0065-0741-14 | |
| Timer | |||
| Triple antibiotic ophthalmic ointment | Bausch and Lomb | ||
| TritonX -100 | Fisher Scientific | 50-295-34 | |
| Two-speed rotary tool | 200-1/15 Two Speed Rotary Toolkit | ||
| Xylazine | AnaSed | NADA#139-236 |
References
- Sridhar, M. S. Anatomy of cornea and ocular surface. Indian Journal of Ophthalmology. 66 (2), 190-194 (2018).
- Robaei, D., Watson, S. Corneal blindness: a global problem. Clinical & experimental Ophthalmology. 42 (3), 213-214 (2014).
- Lamm, V., Hara, H., Mammen, A., Dhaliwal, D., Cooper, D. K. C.
- Danjo, S., Friend, J., Thoft, R. A. Conjunctival epithelium in healing of corneal epithelial wounds. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 28 (9), 1445-1449 (1987).
- Shapiro, M. S., Friend, J., Thoft, R. A.
- Shah, D., Aakalu, V. K. Murine Corneal Epithelial Wound Modeling. Wound Regeneration: Methods and Protocols. Das, H. , Springer US. 175-181 (2021).
- Rittié, L., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D.
- Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
- Akowuah, P. K., De La Cruz, A., Smith, C. W., Rumbaut, R. E., Burns, A. R. An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing. Journal of Visualized Experiments. (178), 63112 (2021).
- Bai, J. Q., Qin, H. F., Zhao, S. H. Research on mouse model of grade II corneal alkali burn. International journal of Ophthalmology. 9 (4), 487-490 (2016).
- Paschalis, E. I., et al. The Role of Microglia and Peripheral Monocytes in Retinal Damage after Corneal Chemical Injury. The American Journal of Pathology. 188 (7), 1580-1596 (2018).
- Jiang, M., et al. Single-Shot Dimension Measurements of the Mouse Eye Using SD-OCT. Ophthalmic Surgery, Lasers and Imaging Retina. 43 (3), 252-256 (2012).
- Shadmani, A., Razmkhah, M., Jalalpoor, M. H., Lari, S. Y., Eghtedari, M. Autologous Activated Omental versus Allogeneic Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells in Corneal Alkaline Injury: An Experimental Study. Journal of Current Ophthalmology. 33 (2), 136-142 (2021).
- Swarup, A., et al. PNP Hydrogel Prevents Formation of Symblephara in Mice After Ocular Alkali Injury. Translational Vision Science & Technology. 11 (2), 31-31 (2022).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), 2771 (2012).
- Jaber, S. M., et al. Dose Regimens, Variability, and Complications Associated with Using Repeat-Bolus Dosing to Extend a Surgical Plane of Anesthesia in Laboratory Mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (6), 684-691 (2014).
- Navarro, K. L., et al. Mouse Anesthesia: The Art and Science. ILAR Journal. 62 (1-2), 238-273 (2021).
- Hoogstraten-Miller, S. L., Brown, P. A.
- ACLAM Medical Records Committee. Medical Records for Animals Used in Research, Teaching, and Testing: Public Statement from the American College of Laboratory Animal Medicine. ILAR Journal. 48 (1), 37-41 (2007).
- Yoeruek, E., et al. Safety, penetration and efficacy of topically applied bevacizumab: evaluation of eyedrops in corneal neovascularization after chemical burn. Acta Ophthalmologica. 86 (3), 322-328 (2008).
- Shomer, N. H., et al.
- Kvanta, A., Sarman, S., Fagerholm, P., Seregard, S., Steen, B. Expression of Matrix Metalloproteinase-2 (MMP-2) and Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) in Inflammation-associated Corneal Neovascularization. Experimental Eye Research. 70 (4), 419-428 (2000).
- Tseng, S. C., Hirst, L. W., Farazdaghi, M., Green, W. R. Goblet cell density and vascularization during conjunctival transdifferentiation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (10), 1168-1176 (1984).
- Huang, A. J., Tseng, S. C. Corneal epithelial wound healing in the absence of limbal epithelium. Investigative ophthalmology & visual science. 32 (1), 96-105 (1991).
- Rama, P., et al. Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration. New England Journal of Medicine. 363 (2), 147-155 (2010).
- Deng, S. X., et al. Global consensus on the definition, classification, diagnosis and staging of limbal stem cell deficiency. Cornea. 38 (3), 364-375 (2019).
- Wei, Z. G., Wu, R. L., Lavker, R. M., Sun, T. T. In vitro growth and differentiation of rabbit bulbar, fornix, and palpebral conjunctival epithelia: Implications on conjunctival epithelial transdifferentiation and stem cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 34 (5), 1814-1828 (1993).
- Kao, W. W. Y. Keratin expression by corneal and limbal stem cells during development. Experimental Eye Research. 200, 108206 (2020).
- Park, M., et al. Plasticity of ocular surface epithelia: Using a murine model of limbal stem cell deficiency to delineate metaplasia and transdifferentiation. Stem Cell Reports. 17 (11), 2451-2466 (2022).
- Li, J., et al. Identification for Differential Localization of Putative Corneal Epithelial Stem Cells in Mouse and Human. Scientific Reports. 7 (1), 5169 (2017).
- McKenna, C. C., Lwigale, P. Y. Innervation of the Mouse Cornea during Development. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (1), 30-35 (2011).
- He, J., Bazan, H. E. P. Neuroanatomy and Neurochemistry of Mouse Cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (2), 664-674 (2016).
