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Chemistry

ライン走査型振動和周波数発生顕微鏡を用いたマルチモーダル非線形ハイパースペクトルケミカルイメージング

Published: December 1, 2023 doi: 10.3791/65388
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1,3,4
1Department of Chemistry and Biochemistry, UC San Diego, 2State Key Laboratory of Molecular Reaction Dynamics, Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, 3Materials Science and Engineering Program, UC San Diego, 4Department of Electrical and Computer Engineering, UC San Diego

Summary

広帯域振動和周波数発生(VSFG)画像と明視野第2高調波発生(SHG)イメージングモダリティを取得するために、マルチモーダルで高速ハイパースペクトルイメージングフレームワークが開発されました。赤外線周波数は分子振動と共鳴するため、対称性が許容されるサンプルの微視的構造およびメゾスコピックな形態学の知識が明らかになります。

Abstract

2次の非線形光信号である振動和周波数発生(VSFG)は、~100μmの空間分解能を持つ分光法として、界面の分子を研究するために伝統的に使用されてきました。ただし、分光法はサンプルの不均一性に敏感ではありません。メゾスコピック的に不均一なサンプルを研究するために、私たちは他の研究者とともに、VSFG分光法の分解能の限界を~1μmレベルまで下げ、VSFG顕微鏡を構築しました。このイメージング技術は、イメージングによってサンプルの形態を分解できるだけでなく、画像のすべてのピクセルで広帯域のVSFGスペクトルを記録することもできます。2次非線形光学技術であるため、その選択規則により、生物学、材料科学、生物工学などで一般的に見られる非中心対称またはキラルな自己組織化構造を可視化できます。本稿では、固定されていないサンプルのイメージングを可能にする倒立透過設計について説明します。また、この研究は、VSFG顕微鏡をニューラルネットワーク関数ソルバーと組み合わせることで、個々の自己組織化シートの化学的特異的な幾何学的情報を解像できることも示しています。最後に、さまざまなサンプルの明視野、SHG、およびVSFG構成で得られた画像は、VSFGイメージングによって明らかにされる固有の情報について簡単に説明します。

Introduction

2次非線形光学技術1,2である振動和周波数発生(VSFG)は、対称性で許容されるサンプル3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13を化学的にプロファイリングするための分光ツールとして広く使用されています。14、15、16、17、18、19、20、21、22。従来、VSFGは界面系8,9,10,11(気液、液液、気体-固体、固液)に適用されてきましたが、VSFG活性の要件である反転対称性を欠いています。VSFGのこの応用により、埋もれた界面12,13、界面14,15,16,17,18の水分子の配置、界面19,20,21,22の化学種の豊富な分子詳細が得られました。

VSFGは、界面の分子種や配置を決定するのに強力ですが、反転中心を欠く物質の分子構造を測定する可能性はまだ十分に発揮されていませんでした。これは、材料が化学的環境、組成、および幾何学的配置において不均一である可能性があり、従来のVSFG分光計は100μm2程度の広い照明面積を有することによるものです。したがって、従来のVSFG分光法は、典型的な100μm2の照明領域におけるサンプルのアンサンブル平均情報を報告します。このアンサンブル平均化は、反対の配向を持つ整然としたドメイン間のシグナルキャンセルと、局所的な不均一性の誤った特徴付けにつながる可能性があります15,20,23,24。

色収差がほとんどない高開口数(NA)、反射型顕微鏡対物レンズ(シュワルツシルトおよびカセグレン形状)の進歩により、VSFG実験における2つのビームの焦点サイズを100μm2から1〜2μm2に、場合によってはサブミクロン25に縮小することができます。この技術的進歩を含め、私たちのグループなどはVSFGを顕微鏡プラットフォームに開発しました20,23,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36。最近、我々は、マルチモーダル画像(VSFG、第2高調波発生(SHG)、および明視野光学)のシームレスな収集を可能にする反転光学レイアウトおよび広帯域検出スキーム37を実装した。マルチモダリティイメージングにより、光学イメージング、さまざまなタイプの画像を相関させ、サンプル画像上の信号位置を特定することで、サンプルの迅速な検査が可能になります。アクロマティック照明光学系とパルスレーザー照明光源の選択により、この光学プラットフォームは、蛍光顕微鏡38やラマン顕微鏡などの追加技術を将来シームレスに統合することができます。

この新しい配置では、階層組織や分子自己組織化(MSA)のクラスなどのサンプルが研究されています。これらの材料には、コラーゲンとバイオミメティクスが含まれ、化学組成と幾何学的構造の両方が材料の最終的な機能にとって重要です。VSFGは2次の非線形光信号であるため、分子間距離やねじれ角などの分子間配列39,40に特に敏感であり、化学組成と分子配列の両方を明らかにするための理想的なツールとなる。この作業は、光パラメトリック増幅器(OPA)をポンピングするイッテルビウムドープ共振器固体レーザー、自作のマルチモーダル倒立顕微鏡および2次元荷電結合素子(CCD)検出器27に結合されたモノクロメーター周波数分析器からなるコア機器のVSFG、SHG、および明視野モダリティについて説明する。ステップバイステップの構造と位置合わせ手順、およびセットアップの完全な部品リストが提供されます。基本的な分子サブユニットが、一般的な界面活性剤である1分子のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)と、2分子のβ-シクロデキストリン(β-CD)(本明細書ではSDS@2 β-CD)で構成されるMSAの詳細な分析も、VSFGが組織化物質の分子固有の幾何学的詳細を明らかにする方法を示す例として提供されています。また、MSAの化学的特異的な幾何学的詳細は、ニューラルネットワーク関数ソルバーアプローチで決定できることも実証されています。

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Protocol

1. ハイパースペクトルライン走査型VSFG顕微鏡

  1. レーザーシステム
    1. 1025nm±5nmを中心とするパルスレーザーシステム( 材料表を参照)を使用します。レーザーは40W、200kHz(200μJ/パルス)、パルス幅は~290fsに設定されています。
      注:正確な繰り返し率は異なる場合があり、このVSFG顕微鏡では一般的に高繰り返し率のレーザーの方がうまく機能します。
    2. シードレーザーの出力を市販の光パラメトリック増幅器(OPA)に誘導して、中赤外(MIR)ビームを生成します( 材料表を参照)。MIRを対象周波数に調整します(図1A)。
      注:本研究では、MIRは3450 nm±85 nm(~2900 ± 72 cm-1)を中心とし、パルス幅は~290 fs、パルスエネルギーは~6 μJで、-CHx 官能基領域の一部を包含しています。
  2. アップコンバージョンビーム
    1. OPAからの残留1025 nmビームをファブリ・ペローエタロン( 材料表を参照)に通し、半値幅が~4.75 cm-1のスペクトル的に狭くなったアップコンバージョンビームを生成します。
    2. 狭くなった1025 nmのビームを8 μmのサファイアピンホールで空間的にフィルタリングします。
      注:1025nmビームは、NIRカードを使用して視覚化できます。
    3. 1025 nmパルスの偏光をλ/2波長板で制御します( 材料表を参照)。
  3. MIRビーム
    1. MIRビームを遅延ステージに誘導し、時間的なオーバーラップを細かく制御します。
    2. MIRの偏光をλ/2波長板で制御します。
  4. VSFG顕微鏡
    1. MIRを透過し、近赤外を反射するカスタマイズされたダイクロイックミラー(DM、図1B)で、アップコンバージョンビームとMIRビームの両方を空間的に重ね合わせます( 材料表を参照)。2つの虹彩を使用して、DMの直後と遠端の2つの虹彩を使用します。虹彩の後にパワーメーターを使用してMIRが中央に配置されているかどうかを判断し、NIRカードを使用してNIR位置を特定します。
      注:オーバーラップ後、NIRビームを使用して両方のビームをガイドできます。
    2. 重なり合ったビームを、内蔵の325 Hz単軸共鳴ビームスキャナー(統合2ポジションスキャナー(I2PS)に取り付けられた倒立顕微鏡、 図1B)に導きます( 資料表を参照)。
      注:レゾナントスキャナーは、重なり合った2つのビームの線をコンデンサー対物レンズの背面開口部に投影します。スライダーに取り付けられており、VSFG/SHGと明視野モダリティ間のシームレスな再構成が可能です。
    3. 空間的に重なり合った2つのビームを、純粋に反射するシュワルツシルト対物レンズ(SO、 図1B、D)でサンプルに集束します( 材料表を参照)。
    4. 無限遠補正屈折対物レンズ(RO、 図1B、D)でサンプルによって生成されたVSFG信号を収集します( 材料表を参照)。
    5. コリメートされた出力VSFG信号を直線偏光子に通し、次に2枚のf = 60 mm焦点レンズ(TL1およびTL2、 図1B、C)で構成されるテレセントリックチューブレンズシステムに通します( 材料表を参照)。
      注:チューブレンズからの拡大画像は、モノクロメーターの入射スリットに形成され(MC、図1B、C)、空間/周波数分解データは2次元CCD検出器(CCD、図1B)で検出されます。
  5. SHGモード
    1. SHGイメージングに切り替えるには、IRビームを遮断し、分光器の回折格子を501.5 nmに回転させてSHG信号をイメージングします。
  6. 明視野モード
    1. 明視野光学イメージングに切り替えるには、白色光源をオンにします( 材料表を参照)。内蔵スライダ(I2PS、 図1B)を動かして、結像対物レンズ(RO)を集光器、集光器対物レンズ(SO)を結像対物レンズとして、対向伝搬方向の明視野画像を収集します。
    2. 市販のチューブレンズシステムを使用して、RGB明視野カメラのセンサー面での屈折対物レンズのコリメート出力の画像を形成します( 材料表を参照)。

Figure 1
図1:マルチモーダルハイパースペクトルVSFG顕微鏡。 (ア) コア・セットアップの上面図 1025nmの励起レーザーをOPAに送り、調整可能な中赤外パルスを生成しました。残留1025 nmは、エタロン(E)によって頻繁に狭められ、空間フィルター(SFG)によって空間的にフィルタリングされてガウシアンビームになりました。中赤外および1025nmのビームは、カスタマイズされたダイクロイックミラー(DM)で空間的に重なり合い、倒立顕微鏡( Aのボックス領域)に導かれます。(B)2つのビームは、統合された2ポジションスライダー(I2PS)に取り付けられた325Hzの共鳴ビームスキャナーに送られ、明視野と非線形光学モダリティのシームレスな切り替えを可能にします。顕微鏡プラットフォームには、コンデンサーとして機能する反射ベースの無限遠補正シュワルツシルト対物レンズ(SO)と、垂直ナノポジショニング(VNP)z軸ステージに取り付けられた屈折ベースの無限遠補正イメージング対物レンズ(RO)が装備されています。SOは、共振ビームスキャナーがサンプルに反射する入射ビームのラインを集束し、ROは信号のVSFGラインセクションを収集します。ROのz軸位置を1μmの精度で微調整し、サンプルを高品質のイメージングに最適な焦点条件にすることが重要です。次に、VSFG信号のコリメートされた線は、2つのタブレンズ(TL1およびTL2)で構成されるチューブレンズシステムに向けられ、モノクロメーター(MC)の入射スリットで拡大画像を形成します。次に、周波数分解されたスペクトル線が電荷結合素子(CCD)上でハイパースペクトル画像化されます。各ハイパースペクトル線を収集した後、NPを使用して、共鳴ビームスキャナーのスキャン軸に垂直な軸でサンプルをスキャンします。サンプルの明視野画像を収集するために、I2PSを明視野位置に移動し、白色光源(WLS)を遮断するミラーを取り付けます。その後、光はROによって集束され、SOによって結像されます。次に、倒立顕微鏡の上部にある明視野カメラ(BC)のセンサー面に画像が形成されます。(C)チューブレンズ領域からMCおよびCCDへの光路の詳細図。(D)SOとROの間のサンプル領域の詳細図。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

2.ハイパースペクトル顕微鏡のアライメントと垂直CCD軸の空間校正

  1. 15 mm x 15 mm x 0.170 mm ± 0.005 mmのカバーガラスでコーティングされたZnO(厚さ1 μm)パターンスパッタリングの標準サンプルを使用してサンプル平面(ナノポジショナーz軸)の位置を大まかに最適化し、明視野イメージングモダリティを使用して明視野焦点に焦点を合わせます。
    注:ROのZ位置と白色光のアライメントは、必要に応じて調整する必要がある場合があります。アライメントキャリブレーションに用いたガラスパターン上のZnOの代表的な画像を 図2に示します。
  2. I2PSを非線形照明アームに戻し、CCDカメラで観察されたZnO領域によって生成される最大の非共振VSFG強度が得られるようにサンプルの高さを最適化します。
    注意: ROのZ位置は、最大強度になるように調整する必要があります。サンプルの最適な高さに達する前に、ステップ2.1と2.2を数回繰り返す必要があり、ROに達する必要があります。
  3. 共鳴ビームスキャナーをオンにして、画像の線を収集します。
  4. 試料をビームスキャナーの方向に垂直に走査することにより、非共振強度の画像を収集します。画像データの垂直スライスを取得し、ピクセルとミクロンの比率を確立します。( 図 3 とその凡例を参照)。
    注:これらのラインセクションの微分は、将来の画像に使用される垂直CCD軸のピクセル:ミクロン比を生成するために分析されます。

Figure 2
図2:ZnOパターンの明視野イメージングモダリティのラフアライメントの代表的な画質。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:垂直軸キャリブレーションのワークフロー。 この図は、CCD画素をμm単位で垂直空間寸法に変換する方法を示しています。 (A)ZnOパターンカバーガラスの画像を収集し、再構成する。次に、パターンの一方のエッジから他方のエッジまでのピクセル距離( Aの小さな垂直バー)。ZnOパターンクロスは25μm幅に設計されているため、ここでは物理幅とピクセル幅の比を使用して、物理/ピクセル寸法比を計算できます。代表的な縦軸キャリブレーション画像を(B)に示す。 (C) 最後に、赤い線で示されているように垂直スライスが取られます。(D)垂直スライスの微分を取り、空間分解能を求めます。垂直スライスの微分は、空間分解能を取得するために使用されます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

3. ハイパースペクトルデータ収集

  1. VSFG信号の垂直線のスペクトルをCCD上に収集し、そのスペクトルを横軸に沿って分散させ、空間位置をCCDの縦軸に記録します。
    注: この結果、1 行セクションの 2 次元データ セットが作成されます。
  2. サンプルのラインセクションをハイパースペクトル画像化した後、3次元ナノポジショナーを使用して、ラインスキャン軸に垂直な軸でサンプルをスキャンします( NP、図1)。
    注:3Dナノポジショナーは、サンプル領域(x-y平面)の位置特定とサンプルの焦点合わせ(z軸)において、高精度と再現性のために重要です。
  3. ステップ 3.1 とステップ 3.2 を繰り返して、VSFG ハイパースペクトル イメージを収集します。

4. ハイパースペクトルデータ解析

  1. MatLab イメージング ツールボックスのハイパースペクトル イメージング ライブラリ ワークフロー41 を使用して、データをスペクトル的にアンミックスします。
    注:スペクトルアンミキシングは、空間的な位置を一意のスペクトルに関連付けます。ハイパースペクトル データ解析用の Matlab コードは、 補足ファイル 1 で提供されています。
    1. Matlab 画像処理ツールボックスのハイパースペクトル画像ライブラリ41 の関数 hypercube を使用して、4 次元の超立方体 (x = 空間、y = 空間、z = 周波数依存強度、ω = 周波数) を作成します。
    2. 誤警報の確率 (PFA) 値が 10 から 7 の関数 countEndmembersHFC を使用して、一意のスペクトルの数を特定します。
    3. 関数 nfindr スペクトル アンミキシングを使用して一意のスペクトルを同定します。
    4. 最後に、 関数 sid を使用して、各ピクセルを前の手順で特定した一意のスペクトルの 1 つに関連付けます。
      注: 追加のスペクトルアンミキシングおよびマッチング方法は、MatLab Hyperspectral Imaging Library41 で提供される代替関数/アルゴリズムを使用して実行できます。
  2. 各孤立シートの合計データをフォイト関数42(補足ファイル1)に当てはめます。
    注:ローレンツ関数は純粋な同次線形状の限界を表しますが、ガウス関数は不均一な極限に由来します。実際には、系は均質な限界と不均質な限界の組み合わせになる可能性があり、これにはVSFGを含む凝縮相分光法の一般的な方法であるVoigt関数が必要です。

5. 試料の幾何学的解析

  1. ステップ5.2-5.3で説明した手順に従って、サンプルの形状を決定します。本研究では、SDS@2 β-CDを例に挙げる。χ(2) の対称性許容テンソル要素は、SDS@2 β-CD メソシート試料の分子サブユニットの C7 対称性に基づいて導出されます。
    注: χ(2) で許容される対称性は対称性に依存します。対称性の許容非線形感受率を計算するには、参考文献43を参照してください。
  2. オイラー回転27 を適用して、ラボ フレームの測定値を分子フレームに関連付けます。
    注:SDS@2 β-CDの場合、そのC7対称性は、8つの出力(ラボフレームχ(2))と8つの入力(6つの独立した過分極性β(2))と2つの角度(Θ、すべてのシートのサンプル面に対する傾斜角、およびφ、シートの面内回転(図4)))に関連する8つの独立した方程式につながります。2枚のシートを使用して、2枚のシートに共通する分子配列を抽出します。明視野画像から、φ1とφ2の関係(2枚のシートの面内回転角度)を抽出することができます。現在の例では、φ2 = φ1 + 60°です。すべての分子単位が同じ角度でタイル状になっていると仮定すると、Θ1=Θ2になります。この結果、16の既知物質(1枚あたり8つのラボフレーム偏光、2枚のシート)に対して、11個の未知物質(6個の独立した過分極性β(2))、Θ1およびφ1、シートN間の相対被覆率、および2つの従属角度(φ2、Θ2)を含む9個の独立した未知数)が得られた。
  3. 偏光分解ラボフレーム χ(2) と分子フレーム過分極性 β(2) をニューラル ネットワーク関数ソルバーに関連付けます。
    注: このアプローチの詳細な概要については、参考文献27 を参照してください。
    1. Python44で、200-100-50 のノード構造と双曲線正接活性化関数で構成される Keras を使用して、階層化されたニューラル ネットワーク モデルを作成します。
    2. β(2)、Θ 1、Θ2、φ1、φ 2、N の値からランダムに生成された 100000 x 11 行列を作成します。 オイラー回転によって 5.2 で決定された式を使用して、対応するラボ フレーム 16 χ(2) を計算します。
    3. 計算されたχ(2)値(合計100,000×16の値)を入力として使用し、16個のχ(2)値が与えられたときに11個の値(β(2)、Θ 1、Θ 2、φ1、φ2、N)を予測する方法を学習します。
    4. トレーニングが完了したら、入力と出力の両方を含む別の 1000 エントリのセットを使用して、トレーニング済みモデルをテストします。予測出力と実際の出力は、傾きが 1 の線形関係を示す必要があります。
    5. 最後に、実験的に測定された χ(2) を 2 枚のシートから供給し (各シートには 8 個の χ(2) が測定されています)、トレーニング済みのモデルを使用して、傾斜角 Θ を他のプロパティと共に予測します。

Figure 4
図4:オイラー変換の図。 (A)実験室座標(XYZ)の2次感受率χ(2)と分子座標(XYZ)の超分極率βijkの間のオイラー変換の図。z-y'-z'' オイラー回転は分子座標に対して行われ、φ を面内回転角、θ を傾斜角、ψ をねじれ角とします。ψは、分子軸周りの任意のねじれ角度に対して積分されています。φは、すべての分子がラボフレームに対して特定の角度に回転して自己組織化シートを形成するため、集積されません。N は 2 枚のシートの相対的なサーフェス カバレッジです。(B)ニューラルネットワークの結果によって決定されるシートを形成する傾斜したサブユニットの視覚化。この図は Wagner et al.27 から修正されたものである。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

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Representative Results

Figure 5
図5:SDS@β-CDの分子構造、形態、ポテンシャル配向 。 (A)SDS@β-CDの上面図と(B)側面図の化学構造。(C)試料面上のメソスケールシートの代表的な不均質な試料分布。分子サブユニットは、基質上で異なる配向とアライメントを持つ可能性がありますが、これは不明です。この図は Wagner et al.27 から修正されたものである。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

一意に組織化された分子構造と等方性バルクを区別する顕微鏡の能力は、SDS@2 β-CDサンプル23,34で実証されています(図5)。この研究では、2 つの溶質が 10% m/m 濃度に達するまで、脱イオン水(DI)水に β-CD と SDS を 2:1 の比率で添加してサンプルを調製しました。その後、懸濁液を加熱して透明化し、一晩室温まで冷却しました。CuCl 2を1:10 CuCl2:SDSの濃度で添加して静電相互作用を調整し、混合物を3〜5日間放置して、SDS@2 β-CDメソシートが完全に形成されました。最後に、15 mm x 15 mm x 0.170 mm ± 0.005 mm のカバーガラスに 5 μL のシート懸濁液をドロップキャストし、10,000 rpm で動作するスピンコーターに貼り付けて単離メソシートを作製しました。

メソスケールシートは、特定のC7対称性を持つ自己組織化から形成されました。しかし、この自己組織化における単一分子単位の分子配向については、物質の機能に影響を与える可能性のある基礎的な知識が不明です。(図5C)。カバーガラス上に分散した自己組織化シートのVSFG画像を撮影しました(図6A)。Matlabハイパースペクトルイメージング機能を用いたスペクトル同定(ステップ4ハイパースペクトルデータ解析)により、すべてのシートをVSFG強度の高いシート(図6Bの青色のスペクトル、図6Aの青色のラベルのシート)と強度の低いシートの2種類に分類できることがわかりました。光学画像(図6C、D)を検査して比較すると、画像中央の大きなシートは二重のシートが積み重なっているように見え、2つの異なるオリエンテーションシート間の破壊的な干渉により、VSFG強度が小さいことが分かりました。1枚のシートに焦点を合わせて、1分子単位配向(図6Aの青いもの)を抽出しました。2枚のシート(図6Aの赤と青の四角で強調表示)は、さまざまなVSFG偏光によって測定され、Voigt関数を使用してスペクトルが適合しました。VSFG偏波は、信号、アップコンバージョン、MIRの順で記述されていることに注意してください。たとえば、SSPは、IRのP偏波、アップコンバージョンのS偏波、および信号のS偏波を意味します。

Figure 6
図6:明視野モダリティによる偏光分解VSFG画像オーバーレイ 。 (A)SDS@2 β-CDの偏光分解(SSS)ハイパースペクトルVSFG画像。紫色とピンク色は異なるスペクトルが存在する領域を表し、対応するスペクトルを(B)にプロットし、青とマゼンタのスペクトルのS/N比がそれぞれ~56と~26の単一ピクセルの代表スペクトルです。赤と青のボックス内のシートは、超分子の傾斜角を抽出するために、以下で明示的に分析されています。(C)(A)と同じ面積の明視野画像。(D)同一領域の光学画像と重ね合わせたVSFGハイパースペクトル画像。(E)左から右へ:(A)の赤と青の枠で囲まれた2枚の単一シート内の180ピクセルと480ピクセル以上のPPS、PPP、SSP、およびSSS偏光分解スペクトル。すべてのスペクトルは、約 2910 cm-1 を中心とする支配的な特徴を持ち、S/N 比は 1000 程度でした。スペクトルには複数のフォイト関数が取り付けられ、影付きの領域で表され、さらなる方位分析に使用されました。この図は Wagner et al.27 から修正されたものである。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

次いで、分子配向を抽出するために、対称性許容過分極性を、最初に決定し、 Equation 1 対称性選択規則によって許容される、以前に公表された手順43を用いた。そして、ラボ系と分子系の関係は、オイラー回転27から導かれる。次に、上記のニューラルネットワーク手法を使用して傾斜角θを抽出し、傾斜角度が~23°であることがわかりました(図6)。

最後に、このプラットホーム37におけるマルチモーダルイメージングの能力が示されている(図7)。ここでは、SDS@2 β-CD、コラーゲン、L-フェニルアラニル-L-フェニルアラニン(FF)の3つの異なるサンプルを、明視野、SHG、およびVSFGイメージングモダリティを備えた顕微鏡で研究します。まず第一に、すべてのサンプルは、異なるイメージングモダリティで同様の形態を示しました。SHGとVSFGはどちらも、光学画像にはない空間的な強度変動を示しました。SHGとVSFGはどちらも規則的な非中心対称構造を必要とするため、シグナル強度の変動は、局所的な分子秩序または分子配向の変動に起因する可能性があります。SHGとは異なり、VSFGのMIRビームは、さまざまな振動モードと共振するように調整できます。ここで示したケースでは、CHx 振動モードを 3.5 μm で、Amid-I モードを 6 μm で検討しました。FFでは、強く均一な信号を持つVSFG画像が得られ、すべての振動群に対して規則正しい自己組織化構造が示唆され、その結晶性と一致しました。対照的に、コラーゲンサンプルは、アミド領域よりもCHx 領域でより強いVSFGシグナルを示し、サンプルが柔軟であり、それらの振動グループが異なる程度の秩序を持っていることを示しています。

Figure 7
図7:3つの異なるサンプルのマルチモーダル画像。(あ i-A iii)SDS@2 β−CD明視野、SHG(PP偏光)および、VSFG(PPP偏光)の3.5μm領域の画像。非線形画像は明視野画像と重ね合わされます。SDSと2β-CDの化学構造をiの挿入図に示します。(B i-B iv)凍結乾燥したコラーゲン明視野、SHG(PP偏光)、VSFG(PPP偏光)は、それぞれ3.5μmおよび6μm領域です。グリシン、プロリン、ヒドロキシプロリンからなるコラーゲンの一次タンパク質三量体残基の化学構造を、BIの挿入図に示している。(C i-Civ)FF明視野、SHG(PP偏光)、VSFG(PPP偏光)はそれぞれ3.5μmと6μmの領域です。FF分子サブユニットの化学構造は、ciの挿入図に示されている。すべての 6 μm 画像は、周囲の空気水分から減衰を除去するために、パージされた窒素装置環境で撮影されています。SDS@2 β-CDは、Amid基を持たないため、6μmのVSFG像がありません。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

補足ファイル1:ハイパースペクトルデータ解析用のMATLABコード このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

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Discussion

最も重要なステップは 1.42 から 1.44 です。光学空間分解能を得るためには、対物レンズの位置を合わせることが重要です。また、出射された信号を集めて中継し、入射スリットに走査ビームを線状に投影することも重要です。適切なアライメントにより、最高の分解能とS/N比が保証されます。SDS@2 β-CD 100 μm x 100 μm シートのような一般的なサンプルでは、高い S/N 比で高解像度の画像(~1 μm 分解能)を得るには 20 分かかります。これは、以前のバージョンの機器24,26よりもすでに高速です。より高い繰り返し率のレーザーにより、データ取得速度のさらなる向上を実現できます。

現在の限界は空間分解能であり、さらに高いNA対物レンズ光学系と潜在的な非線形光学系ベースの超解像技術によってさらに改善される可能性がある45。ヘテロダイン検出は、VSFG分光法でその相を分離し、分子配向5,46,47,48を抽出するために適用されています。これは、私たちの実験では技術的に実行可能です。しかし、VSFGイメージングは、当然のことながらサンプルからのシグナル散乱に依存しており、サンプルの位相がスクラブリングされるため、分子配向とVSFGシグナルの位相の関係が複雑になります。

多くのイメージング技術では分子感度が不足しているため、化学的特異性を持つ材料の形態をイメージングすることは困難です。高速ハイパースペクトルVSFG顕微鏡は、分子振動の痕跡を調べ、材料科学、化学、生物学において重要なメソスケールの組織化物質の分子アライメントを明らかにすることで、この空白を埋めます。将来的には、照明光学系の反射特性により、他の技術をコア機器に統合し、その機能をさらに向上させ、化学的、生物学的、および材料サンプルのマルチモーダル画像を可能にすることができます。

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Disclosures

著者は何も開示していません。

Acknowledgments

装置の開発は、Grant NSF CHE-1828666によってサポートされています。ZW、JCW、WXは、米国国立衛生研究所、国立総合医学研究所、助成金1R35GM138092-01の支援を受けています。BYは、中国科学院青年イノベーション促進協会(CAS、2021183)の支援を受けています。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x Camera Por Thorlabs WFA4100 connect a camera to a microscope or optical system
25.0 mm Right-Angle Prism Mirror, Protected Gold Thorlabs MRA25-M01 reflect light and produce retroreflection, redirecting light back along its original path
3” Universal Post Holder-5 Pack Thorlabs UPH3-P5 hold and support posts of various sizes and configurations
30 mm to 60 mm Cage Plate, 4 mm Thick Thorlabs LCP4S convert between a 30 mm cage system and a 60 mm cage system
500 mm Tall Cerna Body with Epi Arm Thorlabs CEA1500 provide the function of enabling top illumination techniques in microscopy
60 mm Cage Mounted Ø50.0 mm Iris Thorlabs LCP50S control the amount of light passing through an optical system
60 mm Cage Mounting Bracket Thorlabs LCP01B mount and position a 60 mm cage system in optical setups
Air spaced Etalon SLS Optics Ltd. Customized generate narrow-band 1030 nm light 
Cage Plate Mounting Bracket Thorlabs KCB2 hold and adjust mirrors at a precise angle
CCD Andor Technologies Newton  2D CCD for frequency and spatial resolution
Collinear Optical Parametric Amplifier Light Conversion Orpheus-One-HP Tunable MID light generator
Copper Chloride Thermo Fischer Scientific A16064.30 Self-assembly component
Customized Dichroic Mirror Newport Customized selectively reflects or transmits light based on its wavelength or polarization
Ext to M32 Int Adapter Thorlabs SM1A34 provide compatibility and facilitating the connection between components with different thread types
Infinity Corrected Refractive Objective Zeiss 420150-9900-000 Refractive Objective
Infinity Corrected Schwarzschild Objective Pike Technologies Inc. 891-0007 Reflective objective
Laser Carbide, Light-Conversion C18212 Laser source
M32x0.75 External to Internal RMS Thorlabs M32RMSS adapt or convert the threading size or type of microscope objectives 
M32x0.75 External to M27x0.75 Internal Engraving Thorlabs M32M27S adapt or convert the threading size or type of microscope objectives 
Manual Mid-Height Condenser Focus Module Thorlabs ZFM1030 adjust the focus of an optical element
Monochromator Andor Technologies Shamrock 500i Provides frequency resolution for each line scan
Motorized module with 1" Travel for Edge-Mounted Arms Thorlabs ZFM2020 control the vertical positon of the imaging objective
Nanopositioner Mad City Labs Inc. MMP3 3D sample stage
Resonant Scanner EOPC SC-25 325Hz resonant beam scanner
RGB Color CCD Camera Thorlabs DCU224C Brightfield camera, discontinued but other cameras will work just as well
RGB tube lens Thorlabs ITL200 white light collection
Right Angle Kinematic Breadboard Thorlabs OPX2400 incorporate a sliding mechanism with two fixed positions
Right Angle Kinematic Mirror Mount, 30 mm Thorlabs KCB1 hold and adjust mirrors at a precise angle
Right Angle Kinematic Mirror Mount, 60 mm Thorlabs KCB2 hold and adjust mirrors at a precise angle
SM2, 60 mm Cage Arm for Cerna Focusing Stage Thorlabs CSA2100 securely mount and position condensers
Snap on Cage Cover for 60 mm Cage, 24 in Long, Thorlabs C60L24 enclose and protect the components inside the cage
Sodium dodecyl sulfate Thermo Fischer Scientific J63394.AK Self-assembly component
Three-Chnnale Controller and Knob Box for 1" Cerna Travel Stages Thorlabs MCM3001 control ZFM2020
Tube lens Thorlabs LA1380-AB - N-BK7 SFG signal collection
Visible LED Set Thorlabs WFA1010 provide illumination in imaging setup
Whitelight Source Thorlabs WFA1010 Whitelight illumination source for brightfield imaging
WPH05M-1030 - Ø1/2" Zero-Order Half-Wave Plate, Ø1" Mount, 1030 nm  Thorlabs WPH05M-1030 alter the polarization state of light passing through it
WPLQ05M-3500 - Ø1/2" Mounted Low-Order Quarter-Wave Plate, 3.5 µm  Thorlabs WPLQ05M-3500 alter the polarization state of light passing through it
X axis Long Travel Steel Extended Contact Slide Stages Optosigma TSD-65122CUU positioning stages that offer extended travel in the horizontal (X) direction
XT95 4in Rail Carrier Thorlabs XT95RC4 mount and position optical components
X-Y Axis Translation Stage w/ 360 deg. Rotation Thorlabs XYR1 precise movement and positioning of objects in two dimensions, along with the ability to rotate the platform
XY(1/2") Linear Translator with Central SM1 Thru Hole Thorlabs XYT1 provide precise movement and positioning in two dimensions
Yb doped Solid State Laser Light Conversion CB3-40W Seed laser
β-Cyclodextrin Thermo Fischer Scientific J63161.22 Self-assembly component

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References

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化学、202号、赤外イメージング、非線形光学、構造特性、自己組織化、振動和周波数発生、和周波数発生顕微鏡、ハイパースペクトルイメージング、材料特性評価、階層構造
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Wagner, J. C., Yang, B., Wu, Z.,… More

Wagner, J. C., Yang, B., Wu, Z., Xiong, W. Multimodal Nonlinear Hyperspectral Chemical Imaging Using Line-Scanning Vibrational Sum-Frequency Generation Microscopy. J. Vis. Exp. (202), e65388, doi:10.3791/65388 (2023).

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