Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Multimodal ikke-lineær hyperspektral kemisk billeddannelse ved hjælp af linjescanning vibrationssumfrekvensgenereringsmikroskopi

Published: December 1, 2023 doi: 10.3791/65388
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1,3,4
1Department of Chemistry and Biochemistry, UC San Diego, 2State Key Laboratory of Molecular Reaction Dynamics, Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, 3Materials Science and Engineering Program, UC San Diego, 4Department of Electrical and Computer Engineering, UC San Diego

Summary

En multimodal, hurtig hyperspektral billeddannelsesramme blev udviklet for at opnå bredbåndsvibrationssumfrekvensgenerering (VSFG) billeder sammen med brightfield, anden harmonisk generation (SHG) billedbehandlingsmetoder. På grund af at den infrarøde frekvens resonans med molekylære vibrationer afsløres mikroskopisk strukturel og mesoskopisk morfologividen om symmetri-tilladte prøver.

Abstract

Vibrational sum-frequency generation (VSFG), et andenordens ikke-lineært optisk signal, er traditionelt blevet brugt til at studere molekyler ved grænseflader som en spektroskopiteknik med en rumlig opløsning på ~ 100 μm. Spektroskopien er imidlertid ikke følsom over for heterogeniteten af en prøve. For at studere mesoskopisk heterogene prøver skubbede vi sammen med andre opløsningsgrænsen for VSFG-spektroskopi ned til ~ 1 μm niveau og konstruerede VSFG-mikroskopet. Denne billeddannelsesteknik kan ikke kun løse prøvemorfologier gennem billeddannelse, men også optage et bredbånds VSFG-spektrum ved hver pixel i billederne. Da den er en andenordens ikke-lineær optisk teknik, muliggør dens udvælgelsesregel visualisering af ikke-centrosymmetriske eller chirale selvmonterede strukturer, der almindeligvis findes inden for blandt andet biologi, materialevidenskab og bioteknologi. I denne artikel vil publikum blive guidet gennem et omvendt transmissionsdesign, der giver mulighed for billeddannelse af ikke-fikserede prøver. Dette arbejde viser også, at VSFG-mikroskopi kan løse kemisk specifik geometrisk information om individuelle selvmonterede ark ved at kombinere den med en neurale netværksfunktionsløser. Endelig diskuterer billederne opnået under brightfield-, SHG- og VSFG-konfigurationer af forskellige prøver kort de unikke oplysninger, der afsløres af VSFG-billeddannelse.

Introduction

Vibrational sum-frequency generation (VSFG), en andenordens ikke-lineær optisk teknik1,2, er blevet anvendt i vid udstrækning som et spektroskopiværktøj til kemisk profilering af symmetri-tilladte prøver 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13, 14,15,16,17,18,19,20,21,22. Traditionelt er VSFG blevet anvendt på grænsefladesystemer 8,9,10,11 (dvs. gas-væske, væske-væske, gas-fast, fast-væske), som mangler inversionssymmetri - et krav til VSFG-aktivitet. Denne anvendelse af VSFG har givet et væld af molekylære detaljer om nedgravede grænseflader 12,13, konfigurationer af vandmolekyler ved grænseflader 14,15,16,17,18 og kemiske arter ved grænseflader 19,20,21,22.

Selvom VSFG har været stærk til at bestemme molekylære arter og konfigurationer ved grænseflader, er dets potentiale til måling af molekylære strukturer af materialer, der mangler inversionscentre, ikke blevet opfyldt. Dette skyldes dels, at materialerne kunne være heterogene i deres kemiske miljø, sammensætninger og geometriske arrangement, og et traditionelt VSFG-spektrometer har et stort belysningsområde i størrelsesordenen 100 μm2. Således rapporterer traditionel VSFG-spektroskopi om ensemble-gennemsnitlig information af prøven over et typisk 100 μm2 belysningsområde. Dette ensemblegennemsnit kan føre til signalannulleringer mellem velordnede domæner med modsatte orienteringer og fejlkarakterisering af lokale heterogeniteter 15,20,23,24.

Med fremskridt inden for høj numerisk blænde (NA), reflekterende mikroskopmål (Schwarzschild og Cassegrain geometrier), som er næsten fri for kromatiske aberrationer, kan fokusstørrelsen af de to stråler i VSFG-eksperimenter reduceres fra 100 μm 2 til 1-2 μm2 og i nogle tilfælde submikron25. Inklusive dette teknologiske fremskridt har vores gruppe og andre udviklet VSFG til en mikroskopiplatform 20,23,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36. For nylig har vi implementeret et inverteret optisk layout og bredbåndsdetekteringsskema37, som muliggør en problemfri samling af multimodale billeder (VSFG, anden harmonisk generation (SHG) og brightfield optisk). Multimodalitetsbilleddannelsen muliggør hurtig inspektion af prøver ved hjælp af optisk billeddannelse, korrelering af forskellige typer billeder sammen og lokalisering af signalpositioner på prøvebillederne. Med den akromatiske belysningsoptik og valg af pulserende laserbelysningskilde giver denne optiske platform mulighed for fremtidig problemfri integration af yderligere teknikker såsom fluorescensmikroskopi38 og Ramanmikroskopi, blandt andre.

I dette nye arrangement er prøver som hierarkiske organisationer og en klasse af molekylære selvsamlinger (MSA'er) blevet undersøgt. Disse materialer omfatter kollagen og biomimetik, hvor både den kemiske sammensætning og geometriske organisation er vigtige for materialets ultimative funktion. Fordi VSFG er et andenordens ikke-lineært optisk signal, er det specifikt følsomt over for intermolekylære arrangementer39,40, såsom intermolekylær afstand eller vridningsvinkler, hvilket gør det til et ideelt værktøj til at afsløre både kemiske sammensætninger og molekylære arrangementer. Dette arbejde beskriver VSFG-, SHG- og brightfield-modaliteterne for kerneinstrumentet, der består af en ytterbiumdoteret hulrums-faststoflaser, der pumper en optisk parametrisk forstærker (OPA), et hjemmebygget multimodalt inverteret mikroskop og monokromatorfrekvensanalysator koblet til en todimensionel ladet koblet enhed (CCD) detektor27. En trinvis konstruktions- og justeringsprocedure og en komplet delliste over opsætningen leveres. En dybdegående analyse af en MSA, hvis grundlæggende molekylære underenhed består af et molekyle natrium-dodecylsulfat (SDS), et fælles overfladeaktivt middel og to molekyler β-cyclodextrin (β-CD), kendt som SDS@2 β-CD heri, gives også som et eksempel for at vise, hvordan VSFG kan afsløre molekylespecifikke geometriske detaljer om organiseret stof. Det er også blevet påvist, at kemikaliespecifikke geometriske detaljer i MSA kan bestemmes med en neurale netværksfunktionsløsertilgang.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Hyperspektral linjescanning VSFG-mikroskop

  1. Laseranlæg
    1. Brug et pulserende lasersystem (se materialetabellen) centreret ved 1025 nm ± 5 nm. Laseren er indstillet til 40 W, 200 kHz (200 μJ/puls) med en pulsbredde på ~290 fs.
      BEMÆRK: Den nøjagtige gentagelseshastighed kan variere, og en laser med høj gentagelseshastighed fungerer generelt bedre til dette VSFG-mikroskop.
    2. Før frølaserens output ind i en kommerciel optisk parametrisk forstærker (OPA) for at generere en mid-infrarød (MIR) stråle (se materialetabel). Indstil MIR til frekvensen af interesser (figur 1A).
      BEMÆRK: I denne undersøgelse er MIR centreret ved 3450 nm ± 85 nm (~ 2900 ± 72 cm-1) med en pulsvarighed på ~ 290 fs og pulsenergi på ~ 6 μJ, som omfatter en del af -CHx funktionel grupperegion.
  2. Op-konvertering bjælke
    1. Den resterende 1025 nm stråle fra OPA sendes gennem en Fabry-Perot etalon (se materialetabel) for at frembringe en spektralt indsnævret opkonverteringsstråle med en FWHM på ~4,75 cm-1.
    2. Filtrer rumligt den indsnævrede 1025 nm stråle med et 8 μm safirhul.
      BEMÆRK: 1025 nm strålen kan visualiseres ved hjælp af et NIR-kort.
    3. Kontroller polariseringen af 1025 nm pulsen med en λ/2 bølgeplade (se Materialetabel).
  3. MIR stråle
    1. Før MIR-strålen gennem et forsinkelsestrin for fin kontrol af den tidsmæssige overlapning.
    2. Kontroller polariseringen af MIR med en λ/2 bølgeplade.
  4. VSFG mikroskop
    1. Rumligt overlapper både opkonvertering og MIR-stråler ved et tilpasset dikroisk spejl (DM, figur 1B), der er transmissivt til MIR og reflekterende til NIR (se materialetabel). Brug to iris til at styre justeringen: en lige efter DM og en i den fjerne ende. Brug en effektmåler efter iris til at bestemme, om MIR er centreret, og brug et NIR-kort til at lokalisere NIR-positioner.
      BEMÆRK: Efter overlapningen kan NIR-strålen bruges til at styre begge bjælker.
    2. De overlappende stråler ledes ind i et omvendt mikroskop med en integreret 325 Hz enkeltakset resonansstrålescanner (monteret på en integreret topositionsscanner (I2PS), figur 1B) (se materialetabel).
      BEMÆRK: Resonansscanneren projicerer en linje af de to overlappende stråler på bagblænden af kondensatormålet. Den er monteret på en skyder, der muliggør problemfri omkonfiguration mellem VSFG / SHG og brightfield modaliteter.
    3. Fokuser de to rumligt overlappende stråler på prøven med et rent reflekterende Schwarzschild-mål (SO, figur 1B, D) (se materialetabel).
    4. VSFG-signalet, der genereres af prøven, indsamles med et uendeligt korrigeret brydningsmål (RO, figur 1B, D) (se materialetabel).
    5. Før det kollimerede VSFG-udgangssignal gennem en lineær polarisator og derefter gennem et telecentrisk rørlinsesystem bestående af to f = 60 mm brændvidder (TL1 og TL2, figur 1B, C) (se materialetabel).
      BEMÆRK: Det forstørrede billede fra rørlinserne dannes ved monokromatorens indgangssprække (MC, figur 1B, C), og de rumligt / frekvensopløste data detekteres på en todimensionel CCD-detektor (CCD, figur 1B).
  5. SHG-tilstand
    1. For at skifte til SHG-billeddannelse skal du blokere IR-strålen og dreje spektrografens gitter til 501,5 nm for at afbilde SHG-signalet.
  6. Brightfield-tilstand
    1. Hvis du vil skifte til optisk lysfeltbilleddannelse, skal du tænde for kilden til hvidt lys (se Materialetabel). Flyt den integrerede skyder (I2PS, figur 1B) for at indsamle brightfield-billeder i modudbredelsesretningen, hvor billeddannelsesmålet (RO) fungerer som kondensatoren og kondensatormålet (SO) fungerer som billedmålet.
    2. Dann et billede af det kollimerede output fra brydningsmålet på sensorplanet på et RGB brightfield-kamera ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt rørobjektivsystem (se materialetabel).

Figure 1
Figur 1: Multimodalt hyperspektralt VSFG-mikroskop. a) Set ovenfra af kerneopsætningen. En 1025 nm pumpelaser blev sendt til en OPA for at generere en justerbar mid-IR-puls. De resterende 1025 nm blev ofte indsnævret af en etalon (E) og rumligt filtreret ind i en Gaussisk stråle af et rumligt filter (SFG). Mid-IR og 1025 nm stråler overlappes rumligt ved et tilpasset dikroisk spejl (DM) og styres gennem det omvendte mikroskop (boxed region i A). (B) De to stråler sendes til en 325 Hz resonansstrålescanner monteret på en integreret 2-positions skyder (I2PS), hvilket muliggør problemfri skift mellem brightfield og ikke-lineære optiske modaliteter. Mikroskopplatformen er udstyret med et reflekterende baseret uendelighedskorrigeret Schwarzschild-mål (SO), der fungerer som en kondensator og et brydningsbaseret uendelighedskorrigeret billeddannelsesmål (RO) monteret på et lodret nanopositioneringstrin (VNP) z-aksetrin. SO fokuserer linjen med indgående stråler, som resonansstrålescanneren reflekterer på prøven, mens RO indsamler VSFG-linjesektionen af signaler. Det er vigtigt at finjustere z-aksepositionen for RO ved 1 μm præcision for at sikre, at prøven har den bedste brændvidde for billeddannelse af høj kvalitet. VSFG-signalets kollimerede linje ledes derefter til et rørlinsesystem bestående af 2 karlinser (TL1 og TL2), der danner et forstørret billede ved monokromatorens indgangsspalter (MC). Den frekvensopløste linje af spektre afbildes derefter hyperspektralt på en ladningskoblet enhed (CCD). Efter indsamling af hver hyperspektral linje scannes prøven i aksen vinkelret på resonansstrålescannerscanningsaksen ved hjælp af NP. For at indsamle lyse feltbilleder af prøven flyttes I2PS til brightfield-positionen, og der installeres et spejl, der opfanger den hvide lyskilde (WLS). Lyset fokuseres derefter af RO og afbildes af SO. Et billede dannes derefter på sensorplanet for brightfield-kameraet (BC) øverst i det omvendte mikroskop. (C) Detaljeret visning af den optiske vej gennem rørlinseområdet ind i MC og CCD. (D) Detaljeret visning af prøvearealet mellem klagepunktsmeddelelsen og RO. Klik her for at se en større version af denne figur.

2. Hyperspektral mikroskopjustering og lodret CCD-akse rumlig kalibrering

  1. Groft optimere placeringen af prøveplanet (nanopositioner z-akse) ved hjælp af en standardprøve af ZnO (1 μm tyk) mønstersputterbelagt 15 mm x 15 mm x 0,170 mm ± 0,005 mm dæksel og bringe den i brightfield-fokus ved hjælp af brightfield-billedbehandlingsmodaliteten.
    BEMÆRK: Z-positionen for RO samt justeringen af det hvide lys skal muligvis justeres efter behov. Figur 2 viser et repræsentativt billede af ZnO på det glasmønster, der anvendes til justeringskalibrering.
  2. Flyt I2PS tilbage til den ikke-lineære belysningsarm, og optimer prøvehøjden for den maksimale ikke-resonante VSFG-intensitet, der genereres af ZnO-regionerne observeret på CCD-kameraet.
    BEMÆRK: RO's z-position skal justeres for maksimal intensitet. Det kan være nødvendigt at gentage trin 2.1 og 2.2 et par gange, før prøvens optimale højde og RO nås.
  3. Tænd for resonansstrålescanneren, og saml en linje af billederne.
  4. Saml billeder med ikke-resonansintensitet ved at scanne prøven vinkelret på strålescannerens retning. Tag lodrette udsnit af billeddataene, og fastlæg pixel: mikron-forholdet. (se figur 3 og dens forklaring).
    BEMÆRK: Afledningen af disse linjesektioner analyseres for at producere det lodrette CCD-akse pixel: mikron-forhold, der vil blive brugt til fremtidige billeder.

Figure 2
Figur 2: Repræsentativ billedkvalitet for grov justering af brightfield-billedmodalitet af et ZnO-mønster. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Arbejdsproces for kalibrering af lodret akse. Denne figur illustrerer, hvordan man konverterer CCD-pixels til lodrette rumlige dimensioner i enheden μm. (A) Et billede indsamles og rekonstrueres af ZnO-mønstret coverslip. Derefter pixelafstanden fra den ene til den anden kant af mønsteret (lille lodret bjælke i A). Da ZnO-mønsterkrydset er designet til at have en bredde på 25 μm, kan man bruge forholdet mellem fysisk bredde og pixelbredde her til at beregne det fysiske / pixeldimensionsforhold. Et repræsentativt, lodret aksekalibreret billede er vist i (B). (C) Endelig tages en lodret skive som angivet med den røde linje. (D) Derivatet af den lodrette skive tages for at opnå den rumlige opløsning. Derivatet af den lodrette skive bruges til at opnå den rumlige opløsning. Klik her for at se en større version af denne figur.

3. Hyperspektral dataindsamling

  1. Saml spektrene af en lodret linje af VSFG-signalerne på CCD'en, hvis spektre er spredt langs den vandrette akse, og rumlige positioner registreres på CCD's lodrette akse.
    BEMÆRK: Dette resulterer i et todimensionelt datasæt for en sektion med en enkelt linje.
  2. Når linjesektionen af prøven er hyperspektralt afbildet, scannes prøven i aksen vinkelret på linjescanningsaksen ved hjælp af den tredimensionelle nanopositioner (NP, figur 1).
    BEMÆRK: 3D nanopositioneren er vigtig for høj præcision og reproducerbarhed ved lokalisering af prøveområder (x-y-plan) samt for at bringe prøven i fokus (z-akse).
  3. Gentag mellem trin 3.1 og trin 3.2 for at indsamle et VSFG hyperspektralt billede.

4. Hyperspektral dataanalyse

  1. Spektralt bland dataene ved hjælp af MatLab-billedbehandlingsværktøjskassen hyperspektral billedbehandlingsbiblioteksarbejdsgang41.
    BEMÆRK: Spektral unmixing korrelerer rumlige placeringer til unikke spektre. Matlab-kode til hyperspektral dataanalyse findes i supplerende fil 1.
    1. Opret en 4-dimensionel hypercube (x = rumlig, y = rumlig, z = frekvensafhængig intensitet, ω = frekvens) ved hjælp af hypercube-funktionen i Matlab-billedbehandlingsværktøjskassen hyperspektral billeddannelsebibliotek 41.
    2. Identificer antallet af unikke spektre med funktionen countEndmembersHFC med en sandsynlighed for falsk alarm (PFA) værdi på 10-7.
    3. Identificer unikke spektre ved hjælp af nfindr-spektralblandingsfunktionen.
    4. Endelig skal du ved hjælp af sid-funktionen knytte hver pixel til et af de unikke spektre, der er identificeret i det foregående trin.
      BEMÆRK: Yderligere spektrale unmixing og matchningsmetoder kan udføres med alternative funktioner / algoritmer, der tilbydes i MatLab Hyperspectral Imaging Library41.
  2. Tilpas sumdataene for hvert isoleret ark til funktionen Voigt42 (Supplerende fil 1).
    BEMÆRK: Lorentzian-funktionen repræsenterer den rene homogene linjeformgrænse, mens den gaussiske funktion stammer fra inhomogene grænser. I virkeligheden kunne systemerne være i en kombination af homogene og inhomogene grænser, hvilket kræver en Voigt-funktion - en almindelig praksis for kondenseret fasespektroskopi, herunder VSFG.

5. Geometrisk analyse af prøven

  1. Prøvernes geometri bestemmes efter fremgangsmåden i trin 5.2-5.3. I denne undersøgelse bruges SDS@2 β-CD som eksempel. De symmetritilladte tensorelementer i χ(2) udledes på basis af C 7-symmetrien af den molekylære underenhed af SDS@2 β-CD-mesoarkprøven.
    BEMÆRK: Den tilladte symmetri χ(2) afhænger af symmetrien. For beregning af den tilladte ikke-lineære følsomhed for enhver symmetri henvises til reference43.
  2. Anvend Euler-rotationen27 til at relatere laboratorierammens målinger til molekylrammen.
    BEMÆRK: I tilfælde af SDS@2 β-CD fører dens C7-symmetri til otte uafhængige ligninger, der relaterer 8 output (labramme χ (2)) til 8 input (6 uafhængig hyperpolariserbarhed β (2) og to vinkler: Θ, hældningsvinklen i forhold til prøveplanet for alle ark og φ arkets rotation i planet (figur 4)). To ark bruges til at udtrække de fælles molekylære justeringer af de to ark. Forholdet mellem φ1 og φ2 (in-plane rotationsvinkel for de to ark) kan udtrækkes fra brightfield-billederne. I det aktuelle eksempel φ2 = φ1 + 60°. Det antages, at alle molekylære enhedsfliser i samme vinkel, så Θ1 = Θ2. Dette resulterer i 11 ukendte (9 uafhængige, herunder 6 uafhængige hyperpolariserbarhed β(2), Θ 1 og φ1 og det relative dækningsforhold mellem ark N og de to afhængige vinkler, der er φ 2 og Θ 2) for 16 kendte (8 laboratorierammepolariseringer pr. ark og to ark).
  3. Relatere den polarisationsopløste laboratorieramme χ(2) og molekylrammehyperpolariserbarhed β(2) med en neurale netværksfunktionsløser.
    BEMÆRK: Et detaljeret resumé af denne fremgangsmåde findes i reference27.
    1. Opret en lagdelt neural netværksmodel i Python44ved hjælp af Keras bestående af 200-100-50 nodestruktur og en hyperbolsk tangentaktiveringsfunktion.
    2. Der oprettes en tilfældigt genereret værdimatrix på 100000 x 11 på β(2), Θ 1, Θ 2, φ1, φ 2 og N. Den tilsvarende laboratorieramme 16 χ(2) beregnes ved hjælp af ligningen bestemt i 5.2 ved Euler-rotationer.
    3. Brug de beregnede χ(2)-værdier (i alt 100.000 x 16 værdier) som input, og lær at forudsige 11 værdier (β(2), Θ 1, Θ 2, φ1, φ 2 og N), når de leveres 16 χ(2)-værdier.
    4. Når du er trænet, skal du bruge et andet sæt på 1000 poster med både input og output til at teste den trænede model. Det forudsagte output og det sande output skal vise et lineært forhold med en hældning på 1.
    5. Til sidst leveres den eksperimentelt målte χ(2) fra to ark (hvert ark har 8 χ(2) målt), og den trænede model bruges til at forudsige hældningsvinklen Θ sammen med andre egenskaber.

Figure 4
Figur 4: Illustration af Euler-transformation. (A) Illustration af Euler-transformationen mellem laboratoriekoordinaternes (XYZ) andenordens modtagelighed χ(2) og de molekylære koordinater (xyz) hyperpolariserbarhed βijk. z-y'-z'' Euler-rotation udføres på molekylkoordinaterne med φ som rotationsvinklen i planet, θ som hældningsvinklen og ψ som vridningsvinklen. ψ er integreret ud for vilkårlige vridningsvinkler om molekylaksen. φ er ikke integreret, fordi alle molekyler roterer til en bestemt vinkel i forhold til laboratorierammen for at danne de selvmonterede ark. N er den relative overfladedækning af de to ark. (B) Visualisering af de vippede underenheder, der danner et ark bestemt af de neurale netværksresultater. Dette tal er ændret fra Wagner et al.27. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figure 5
Figur 5: Molekylær struktur, morfologi og potentiel orientering af SDS@β-CD. (A) Set ovenfra og (B) set fra siden af SDS@β-CD. C) Repræsentativ heterogen prøvefordeling af mesoskalaarkene på prøveplanet. Den molekylære underenhed kunne have forskellige orienteringer og justering på substratet, hvilket er ukendt. Dette tal er ændret fra Wagner et al.27. Klik her for at se en større version af denne figur.

Mikroskopets evne til at skelne mellem unikt organiserede molekylære strukturer og isotrop bulk demonstreres med SDS@2 β-CD-prøven23,34 (figur 5). I denne undersøgelse blev prøven fremstillet ved at tilsætte β-CD og SDS til deioniseret vand (DI) vand i forholdet 2: 1, indtil de to opløste stoffer nåede en koncentration på 10% m / m. Affjedringen blev derefter opvarmet til klarhed og afkølet til stuetemperatur natten over. CuCl2 blev tilsat i en koncentration på 1:10 CuCl2:SDS for at indstille de elektrostatiske interaktioner, og blandingen fik lov til at sidde i 3-5 dage, så SDS@2 β-CD meso-ark kunne dannes fuldt ud. Endelig blev isolerede mesoplader fremstillet ved dråbestøbning af 5 μL af pladeophænget på en 15 mm x 15 mm x 0,170 mm ± 0,005 mm dæksel, der var fastgjort til en spincoater, der arbejder ved 10.000 omdr./min.

Mesoskalaarkene dannet af deres selvmontering med en specifik C7-symmetri . Alligevel er det uklart om den molekylære orientering af den enkelte molekylære enhed i denne selvsamling, en grundlæggende viden, der kan påvirke materialets funktioner. (Figur 5C). VSFG-billeder af de selvmonterede ark spredt på en dækseddel blev taget (figur 6A). Gennem spektral identifikation (trin 4 Hyperspektral dataanalyse) ved hjælp af Matlab hyperspektral billeddannelsesfunktion blev det konstateret, at alle ark kan kategoriseres i to typer, en med højere VSFG-intensitet (blå spektre i figur 6B og ark mærket med blåt i figur 6A) og den anden med lavere intensitet. Ved at inspicere og sammenligne med det optiske billede (figur 6C, D) syntes det store ark i midten af billederne at have stablet dobbeltark og derved tilskrive den mindre VSFG-intensitet på grund af destruktiv interferens mellem de to forskellige orienteringsark. Det enkelte ark var fokuseret på at ekstrahere den enkelte molekylære enhedsorientering (blå i figur 6A). To af arkene (fremhævet med røde og blå firkanter i figur 6A) blev målt ved forskellige VSFG-polariseringer, og spektrene blev monteret ved hjælp af Voigt-funktionerne. Bemærk, at VSFG-polariseringen er beskrevet i ordresignalet, opkonvertering og MIR. For eksempel betyder SSP P-polarisering af IR, S-polarisering af opkonvertering og S-polarisering af signaler.

Figure 6
Figur 6: Polariseringsløst VSFG-billedoverlay med brightfield-modalitet . (A) Polarisationsløst (SSS) hyperspektralt VSFG-billede af SDS@2 β-CD. Lilla og lyserøde farver repræsenterer områder, hvor forskellige spektre befinder sig, og de tilsvarende spektre er plottet i (B), som er repræsentative spektre for enkelte pixels med signal-støj-forhold for henholdsvis blå og magenta spektre ~ 56 og ~ 26. Arkene i de røde og blå felter analyseres eksplicit nedenfor for at udtrække supramolekylehældningsvinklerne. (C) Brightfield-billede af samme område som det i (A). D) VSFG hyperspektralt billede overlejret med et optisk billede af et identisk område. (E) Fra venstre mod højre: PPS, PPP, SSP og SSS polarisationsløste spektre summeret over 180 og 480 pixels inden for de to enkeltark fremhævet i røde og blå felter i (A). Alle spektre havde et dominerende træk centreret ved ca. 2910 cm-1 og et signal-støj-forhold i størrelsesordenen 1000. Spektrene blev udstyret med flere Voigt-funktioner, som var repræsenteret af de skraverede områder og brugt til yderligere orienteringsanalyse. Dette tal er ændret fra Wagner et al.27. Klik her for at se en større version af denne figur.

For at ekstrahere de molekylære orienteringer blev den symmetritilladte hyperpolariserbarhed Equation 1 først bestemt, tilladt af symmetriudvælgelsesreglen, ved anvendelse af den tidligere offentliggjorte procedure43. Derefter er forholdet mellem laboratorierammen og molekylrammen afledt af Euler-rotation27. Hældningsvinklen θ ekstraheres derefter ved hjælp af den neurale netværksmetode, der er skitseret ovenfor, og hældningsvinklen viste sig at være ~ 23 ° (figur 6).

Endelig vises evnen til multimodal billeddannelse i denne platform37(figur 7). Her studeres tre forskellige prøver, nemlig SDS@2 β-CD, kollagen og L-phenylalanyl-L-phenylalanin (FF), med mikroskopet med brightfield-, SHG- og VSFG-billeddannelsesmodaliteter. Først og fremmest viste alle prøver lignende morfologier på tværs af forskellige billeddannelsesmetoder. Både SHG og VSFG viste intensitetsvariationer rumligt, hvilket mangler i optiske billeder. Fordi SHG og VSFG begge kræver ordnede ikke-centrosymmetriske strukturer, kan variationen i signalintensitet komme fra variationer i lokal molekylær orden eller molekylære orienteringer. I modsætning til SHG kan man indstille MIR-strålen på VSFG til at være resonans med forskellige vibrationstilstande. I det her viste tilfælde blev CHx vibrationstilstande undersøgt ved 3,5 μm og Amid-I-tilstand ved 6 μm. For FF blev VSFG-billeder med stærke og ensartede signaler opnået, hvilket tyder på en velordnet selvmonteret struktur for alle vibrationsgrupper - i overensstemmelse med dens krystallinske natur. I modsætning hertil viste kollagenprøven et stærkere VSFG-signal i CHx-regionen over Amid-regionen, hvilket indikerer, at prøverne er fleksible, og deres vibrationsgrupper har forskellige grader af rækkefølge.

Figure 7
Figur 7: Multimodale billeder af tre forskellige prøver. (A i-A iii) SDS@2 β-CD brightfield, SHG (PP-polarisering) og VSFG (PPP-polarisering) af henholdsvis 3,5 μm regionbilleder. Ikke-lineære billeder er overlejret med brightfield-billeder. Kemiske strukturer af SDS og 2β-CD er vist i indsatsen af ai. (B i-B iv) Frysetørret kollagen brightfield, SHG (PP polarisering), VSFG (PPP polarisering) af henholdsvis 3,5 μm og 6 μm regioner. Den kemiske struktur af den primære proteintriberrest af kollagen, sammensat af glycin, prolin og hydroxyprolin, er vist i indsatsen af Bi. (C i-Civ) FF brightfield, SHG (PP polarisering) og VSFG (PPP polarisering) af henholdsvis 3,5 μm og 6 μm regioner. Den kemiske struktur for FF-molekylære underenheder er vist i indsatsen af ci. Alle 6 μm billeder er taget under et renset nitrogeninstrumentmiljø for at fjerne dæmpning fra omgivende luftfugtighed. SDS@2 β-CD har ikke et VSFG-billede ved 6 μm, fordi det ikke har Mellem-grupper. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende fil 1: Matlab-kode til hyperspektral dataanalyse Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De mest kritiske trin er fra 1, 42 til 1, 44. Det er afgørende at justere objektivobjektivet godt for en optisk rumlig opløsning. Det er også vigtigt at indsamle det udsendte signal, relæ og projicere scanningsstrålen som en linje ved indgangsspalterne. Korrekte justeringer ville garantere den bedste opløsning og signal-støj-forhold. For en typisk prøve, som SDS@2 β-CD 100 μm x 100 μm ark, vil et billede med god opløsning (~1 μm opløsning) med et højt signal-støj-forhold tage 20 minutter. Dette er allerede hurtigere end den tidligere version af instrumentet24,26. Yderligere forbedring af dataindsamlingshastigheden kan realiseres ved hjælp af en laser med højere gentagelseshastighed.

Den nuværende begrænsning er rumlig opløsning, som kunne forbedres yderligere med endnu højere NA-objektivoptik og potentielle ikke-lineære optikbaserede superopløsningsteknikker45. Heterodyne detektion er blevet anvendt i VSFG spektroskopi for at løse sin fase og ekstrahere de molekylære orienteringer 5,46,47,48. Dette er teknisk muligt i vores eksperiment. VSFG-billeddannelse er imidlertid naturligvis afhængig af signalspredning fra prøven, hvilket forvrænger dens fase og derved komplicerer forholdet mellem molekylær orientering og fasen af VSFG-signalet.

Billeddannelse af morfologien af materialer med kemisk specificitet er udfordrende, fordi mange billeddannelsesteknikker mangler molekylære følsomheder. Hurtig hyperspektral VSFG-mikroskopi udfylder dette tomrum ved at undersøge molekylære vibrationssignaturer og afsløre molekylære justeringer af mesoskalaorganiseret stof, der er vigtige inden for materialevidenskab, kemi og biologi. I fremtiden vil belysningsoptikkens reflekterende karakter gøre det muligt at integrere andre teknikker i kerneinstrumentet, hvilket yderligere øger dets muligheder og muliggør multimodale billeder af kemiske, biologiske og materialeprøver.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Instrumentudviklingen støttes af Grant NSF CHE-1828666. ZW, JCW og WX støttes af National Institutes of Health, National Institute of General Medical Sciences, Grant 1R35GM138092-01. BY støttes af Youth Innovation Promotion Association, Chinese Academy of Sciences (CAS, 2021183).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x Camera Por Thorlabs WFA4100 connect a camera to a microscope or optical system
25.0 mm Right-Angle Prism Mirror, Protected Gold Thorlabs MRA25-M01 reflect light and produce retroreflection, redirecting light back along its original path
3” Universal Post Holder-5 Pack Thorlabs UPH3-P5 hold and support posts of various sizes and configurations
30 mm to 60 mm Cage Plate, 4 mm Thick Thorlabs LCP4S convert between a 30 mm cage system and a 60 mm cage system
500 mm Tall Cerna Body with Epi Arm Thorlabs CEA1500 provide the function of enabling top illumination techniques in microscopy
60 mm Cage Mounted Ø50.0 mm Iris Thorlabs LCP50S control the amount of light passing through an optical system
60 mm Cage Mounting Bracket Thorlabs LCP01B mount and position a 60 mm cage system in optical setups
Air spaced Etalon SLS Optics Ltd. Customized generate narrow-band 1030 nm light 
Cage Plate Mounting Bracket Thorlabs KCB2 hold and adjust mirrors at a precise angle
CCD Andor Technologies Newton  2D CCD for frequency and spatial resolution
Collinear Optical Parametric Amplifier Light Conversion Orpheus-One-HP Tunable MID light generator
Copper Chloride Thermo Fischer Scientific A16064.30 Self-assembly component
Customized Dichroic Mirror Newport Customized selectively reflects or transmits light based on its wavelength or polarization
Ext to M32 Int Adapter Thorlabs SM1A34 provide compatibility and facilitating the connection between components with different thread types
Infinity Corrected Refractive Objective Zeiss 420150-9900-000 Refractive Objective
Infinity Corrected Schwarzschild Objective Pike Technologies Inc. 891-0007 Reflective objective
Laser Carbide, Light-Conversion C18212 Laser source
M32x0.75 External to Internal RMS Thorlabs M32RMSS adapt or convert the threading size or type of microscope objectives 
M32x0.75 External to M27x0.75 Internal Engraving Thorlabs M32M27S adapt or convert the threading size or type of microscope objectives 
Manual Mid-Height Condenser Focus Module Thorlabs ZFM1030 adjust the focus of an optical element
Monochromator Andor Technologies Shamrock 500i Provides frequency resolution for each line scan
Motorized module with 1" Travel for Edge-Mounted Arms Thorlabs ZFM2020 control the vertical positon of the imaging objective
Nanopositioner Mad City Labs Inc. MMP3 3D sample stage
Resonant Scanner EOPC SC-25 325Hz resonant beam scanner
RGB Color CCD Camera Thorlabs DCU224C Brightfield camera, discontinued but other cameras will work just as well
RGB tube lens Thorlabs ITL200 white light collection
Right Angle Kinematic Breadboard Thorlabs OPX2400 incorporate a sliding mechanism with two fixed positions
Right Angle Kinematic Mirror Mount, 30 mm Thorlabs KCB1 hold and adjust mirrors at a precise angle
Right Angle Kinematic Mirror Mount, 60 mm Thorlabs KCB2 hold and adjust mirrors at a precise angle
SM2, 60 mm Cage Arm for Cerna Focusing Stage Thorlabs CSA2100 securely mount and position condensers
Snap on Cage Cover for 60 mm Cage, 24 in Long, Thorlabs C60L24 enclose and protect the components inside the cage
Sodium dodecyl sulfate Thermo Fischer Scientific J63394.AK Self-assembly component
Three-Chnnale Controller and Knob Box for 1" Cerna Travel Stages Thorlabs MCM3001 control ZFM2020
Tube lens Thorlabs LA1380-AB - N-BK7 SFG signal collection
Visible LED Set Thorlabs WFA1010 provide illumination in imaging setup
Whitelight Source Thorlabs WFA1010 Whitelight illumination source for brightfield imaging
WPH05M-1030 - Ø1/2" Zero-Order Half-Wave Plate, Ø1" Mount, 1030 nm  Thorlabs WPH05M-1030 alter the polarization state of light passing through it
WPLQ05M-3500 - Ø1/2" Mounted Low-Order Quarter-Wave Plate, 3.5 µm  Thorlabs WPLQ05M-3500 alter the polarization state of light passing through it
X axis Long Travel Steel Extended Contact Slide Stages Optosigma TSD-65122CUU positioning stages that offer extended travel in the horizontal (X) direction
XT95 4in Rail Carrier Thorlabs XT95RC4 mount and position optical components
X-Y Axis Translation Stage w/ 360 deg. Rotation Thorlabs XYR1 precise movement and positioning of objects in two dimensions, along with the ability to rotate the platform
XY(1/2") Linear Translator with Central SM1 Thru Hole Thorlabs XYT1 provide precise movement and positioning in two dimensions
Yb doped Solid State Laser Light Conversion CB3-40W Seed laser
β-Cyclodextrin Thermo Fischer Scientific J63161.22 Self-assembly component

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhu, X. D., Suhr, H., Shen, Y. R. Surface vibrational spectroscopy by infrared-visible sum frequency generation. Physical Review B. 35 (6), 3047-3050 (1987).
  2. Shen, Y. R. Surface properties probed by second-harmonic and sum-frequency generation. Nature. 337 (6207), 519-525 (1987).
  3. Li, Y., Shrestha, M., Luo, M., Sit, I., Song, M., Grassian, V. H., Xiong, W. Salting up of proteins at the air/water interface. Langmuir. 35 (43), 13815-13820 (2019).
  4. Wang, C., Li, Y., Xiong, W. Extracting molecular responses from ultrafast charge dynamics at material interfaces. Journal of Materials Chemistry C. 8 (35), 12062-12067 (2020).
  5. Nihonyanagi, S., Mondal, J. A., Yamaguchi, S., Tahara, T. Structure and dynamics of interfacial water studied by heterodyne-detected vibrational sum-frequency generation. Annual Review of Physical Chemistry. 64 (1), 579-603 (2013).
  6. Nihonyanagi, S., Yamaguchi, S., Tahara, T. Ultrafast dynamics at water interfaces studied by vibrational sum frequency generation spectroscopy. Chemical Reviews. 117 (16), 10665-10693 (2017).
  7. Singh, P. C., Nihonyanagi, S., Yamaguchi, S., Tahara, T. Ultrafast vibrational dynamics of water at a charged interface revealed by two-dimensional heterodyne-detected vibrational sum frequency generation. The Journal of Chemical Physics. 137 (9), 094706 (2012).
  8. Jubb, A. M., Hua, W., Allen, H. C. Environmental chemistry at vapor/water interfaces: insights from vibrational sum frequency generation spectroscopy. Annual Review of Physical Chemistry. 63 (1), 107-130 (2012).
  9. Ishiyama, T., Sato, Y., Morita, A. Interfacial structures and vibrational spectra at liquid/liquid boundaries: molecular dynamics study of water/carbon tetrachloride and water/1,2-dichloroethane interfaces. The Journal of Physical Chemistry C. 116 (40), 21439-21446 (2012).
  10. Sapi, A., Liu, F., Cai, X., Thompson, C. M., Wang, H., An, K., Krier, J. M., Somorjai, G. A. Comparing the catalytic oxidation of ethanol at the solid-gas and solid-liquid interfaces over size-controlled pt nanoparticles: striking differences in kinetics and mechanism. Nano Letters. 14 (11), 6727-6730 (2014).
  11. Chen, X., Wang, J., Sniadecki, J. J., Even, M. A., Chen, Z. Probing α-helical and β-sheet structures of peptides at solid/liquid interfaces with SFG. Langmuir. 21 (7), 2662-2664 (2015).
  12. Dramstad, T. A., Wu, Z., Gretz, G. M., Massari, A. M. Thin films and bulk phases conucleate at the interfaces of pentacene thin films. The Journal of Physical Chemistry C. 125 (30), 16803-16809 (2021).
  13. Xiang, B., Li, Y., Pham, C. H., Paesani, F., Xiong, W. Ultrafast direct electron transfer at organic semiconductor and metal interfaces. Science Advances. 3 (11), e1701508 (2017).
  14. Livingstone, R. A., Nagata, Y., Bonn, M., Backus, E. H. G. Two types of water at the water-surfactant interface revealed by time-resolved vibrational spectroscopy. Journal of the American Chemical Society. 137 (47), 14912-14919 (2015).
  15. Wagner, J. C., Hunter, K. M., Paesani, F., Xiong, W. Water capture mechanisms at zeolitic imidazolate framework interfaces. Journal of the American Chemical Society. 143 (50), 21189-21194 (2021).
  16. Montenegro, A., Dutta, C., Mammetkuliev, M., Shi, H., Hou, B., Bhattacharyya, D., Zhao, B., Cronin, S. B., Benderskii, A. V. Asymmetric response of interfacial water to applied electric fields. Nature. 594 (7861), 62-65 (2021).
  17. Nihonyanagi, S., Ishiyama, T., Lee, T., Yamaguchi, S., Bonn, M., Morita, A., Tahara, T. Unified molecular view of the air/water interface based on experimental and theoretical χ(2) spectra of an isotopically diluted water surface. Journal of the American Chemical Society. 133 (42), 16875-16880 (2011).
  18. Shen, Y. R., Ostroverkhov, V. Sum-frequency vibrational spectroscopy on water interfaces: polar orientation of water molecules at interfaces. Chemical Reviews. 106 (4), 1140-1154 (2006).
  19. Hosseinpour, S., Roeters, S. J., Bonn, M., Peukert, W., Woutersen, S., Weidner, T. Structure and dynamics of interfacial peptides and proteins from vibrational sum-frequency generation spectroscopy. Chemical Reviews. 120 (7), 3420-3465 (2020).
  20. Wang, H., Xiong, W. Vibrational sum-frequency generation hyperspectral microscopy for molecular self-assembled systems. Annual Review of Physical Chemistry. 72 (1), 279-306 (2021).
  21. Wang, H. -F., Velarde, L., Gan, W., Fu, L. Quantitative sum-frequency generation vibrational spectroscopy of molecular surfaces and interfaces: lineshape, polarization, and orientation. Annual Review of Physical Chemistry. 66 (1), 189-216 (2015).
  22. Inoue, K., Ahmed, M., Nihonyanagi, S., Tahara, T. Reorientation-induced relaxation of free oh at the air/water interface revealed by ultrafast heterodyne-detected nonlinear spectroscopy. Nature Communications. 11 (1), 5344 (2020).
  23. Wang, H., Gao, T., Xiong, W. Self-phase-stabilized heterodyne vibrational sum frequency generation microscopy. ACS Photonics. 4 (7), 1839-1845 (2017).
  24. Wang, H., Xiong, W. Revealing the molecular physics of lattice self-assembly by vibrational hyperspectral imaging. Langmuir. 38 (10), 3017-3031 (2022).
  25. Raghunathan, V., Han, Y., Korth, O., Ge, N. -H., Potma, E. O. Rapid vibrational imaging with sum frequency generation microscopy. Optics Letters. 36 (19), 3891 (2011).
  26. Wang, H., Wagner, J. C., Chen, W., Wang, C., Xiong, W. Spatially dependent h-bond dynamics at interfaces of water/biomimetic self-assembled lattice materials. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (38), 23385-23392 (2020).
  27. Wagner, J. C., Wu, Z., Wang, H., Xiong, W. Imaging orientation of a single molecular hierarchical self-assembled sheet: the combined power of a vibrational sum frequency generation microscopy and neural network. The Journal of Physical Chemistry B. 126 (37), 7192-7201 (2022).
  28. Han, Y., Hsu, J., Ge, N. -H., Potma, E. O. Polarization-sensitive sum-frequency generation microscopy of collagen fibers. The Journal of Physical Chemistry B. 119 (8), 3356-3365 (2015).
  29. Chung, C. -Y., Potma, E. O. Biomolecular imaging with coherent nonlinear vibrational microscopy. Annual Review of Physical Chemistry. 64 (1), 77-99 (2013).
  30. Potma, E. O. Advances in vibrationally resonant sum-frequency generation microscopy. Optics in the Life Sciences Congress. , OSA: Washington, DC, 2017. p NM4C.2 (2017).
  31. Han, Y., Raghunathan, V., Feng, R. R., Maekawa, H., Chung, C. -Y. Y., Feng, Y., Potma, E. O., Ge, N. -H. H. Mapping molecular orientation with phase sensitive vibrationally resonant sum-frequency generation microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 117 (20), 6149-6156 (2013).
  32. Hsu, J., Haninnen, A., Ge, N. -H., Potma, E. O. Molecular imaging with sum-frequency generation microscopy. Optics in the Life Sciences. , OSA: Washington, DC, 2015. p NT4C.4 (2015).
  33. Hanninen, A., Shu, M. W., Potma, E. O. Hyperspectral imaging with laser-scanning sum-frequency generation microscopy. Biomedical Optics Express. 8 (9), 4230 (2017).
  34. Wang, H., Chen, W., Wagner, J. C., Xiong, W. Local ordering of lattice self-assembled SDS@2β-CD materials and adsorbed water revealed by vibrational sum frequency generation microscope. The Journal of Physical Chemistry B. 123 (29), 6212-6221 (2019).
  35. Cimatu, K., Baldelli, S. Chemical imaging of corrosion: sum frequency generation imaging microscopy of cyanide on gold at the solid−liquid interface. Journal of the American Chemical Society. 130 (25), 8030-8037 (2008).
  36. Shah, S. A., Baldelli, S. Chemical imaging of surfaces with sum frequency generation vibrational spectroscopy. Accounts of Chemical Research. 53 (6), 1139-1150 (2020).
  37. Wagner, J. ackson C., Zishan, W. u, Xiong, W. Multimodal nonlinear vibrational hyperspectral imaging. ChemRxiv. , (2023).
  38. Yan, C., Wagner, J., Wang, C., Ren, J., Lee, C., Wan, Y., Wang, S., Xiong, W. Multi-dimensional widefield infrared-encoded spontaneous emission microscopy: distinguishing chromophores by ultrashort infrared pulses. ChemRxiv. , (2023).
  39. Lin, Y., Fromel, M., Guo, Y., Guest, R., Choi, J., Li, Y., Kaya, H., Pester, C. W., Kim, S. H. Elucidating interfacial chain conformation of superhydrophilic polymer brushes by vibrational sum frequency generation spectroscopy. Langmuir. 38 (48), 14704-14711 (2022).
  40. Choi, J., Lee, J., Makarem, M., Huang, S., Kim, S. H. Numerical simulation of vibrational sum frequency generation intensity for non-centrosymmetric domains interspersed in an amorphous matrix: a case study for cellulose in plant cell wall. The Journal of Physical Chemistry B. 126 (35), 6629-6641 (2022).
  41. Matlab Image Processing Toolbox Hyperspectral Imaging Library. , The Mathworks, Inc., Natick, MA USA. Google Scholar Forthcoming.
  42. Armstrong, B. H. Spectrum line profiles: the Voigt function. Journal of Quantitative Spectroscopy and Radiative Transfer. 7 (1), 61-88 (1967).
  43. Wu, Z., Xiong, W. Neumann's principle based eigenvector approach for deriving non-vanishing tensor elements for nonlinear optics. The Journal of Chemical Physics. 157 (13), 134702 (2022).
  44. Chollet, F. Keras Neural Network Library. https://github.com/fchollet/keras accessed Apr 12. , (2021).
  45. Vicidomini, G., Bianchini, P., Diaspro, A. STED super-resolved microscopy. Nature Methods. 15 (3), 173-182 (2018).
  46. Xiong, W., Laaser, J. E., Mehlenbacher, R. D., Zanni, M. T. Adding a dimension to the infrared spectra of interfaces using heterodyne detected 2D sum-frequency generation (HD 2D SFG) spectroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (52), 20902-20907 (2011).
  47. Lukas, M., Backus, E. H. G., Bonn, M., Grechko, M. Passively stabilized phase-resolved collinear sfg spectroscopy using a displaced sagnac interferometer. The Journal of Physical Chemistry A. 126 (6), 951-956 (2022).
  48. Ji, N., Ostroverkhov, V., Chen, C., Shen, Y. Phase-sensitive sum-frequency vibrational spectroscopy and its application to studies of interfacial alkyl chains. Journal of the American Chemical Society. 129 (33), 10056-10057 (2007).

Tags

Kemi udgave 202 infrarød billeddannelse ikke-lineær optik strukturegenskab selvsamling vibrationssumfrekvensgenerering sumfrekvensgenereringsmikroskopi hyperspektral billeddannelse materialekarakterisering hierarkisk organisation
Multimodal ikke-lineær hyperspektral kemisk billeddannelse ved hjælp af linjescanning vibrationssumfrekvensgenereringsmikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wagner, J. C., Yang, B., Wu, Z.,… More

Wagner, J. C., Yang, B., Wu, Z., Xiong, W. Multimodal Nonlinear Hyperspectral Chemical Imaging Using Line-Scanning Vibrational Sum-Frequency Generation Microscopy. J. Vis. Exp. (202), e65388, doi:10.3791/65388 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter