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Chemistry

Imagem Química Hiperespectral Não Linear Multimodal Usando Microscopia de Geração de Soma e Frequência Vibracional de Varredura de Linha

Published: December 1, 2023 doi: 10.3791/65388
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1,3,4
1Department of Chemistry and Biochemistry, UC San Diego, 2State Key Laboratory of Molecular Reaction Dynamics, Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, 3Materials Science and Engineering Program, UC San Diego, 4Department of Electrical and Computer Engineering, UC San Diego

Summary

Uma estrutura de imagem hiperespectral rápida e multimodal foi desenvolvida para obter imagens de geração de soma e frequência vibracional de banda larga (VSFG), juntamente com modalidades de imagem de segunda geração harmônica (SHG) de campo claro. Devido à frequência do infravermelho ser ressonante com vibrações moleculares, o conhecimento microscópico estrutural e morfológico mesoscópico é revelado de amostras permitidas por simetria.

Abstract

A geração de soma de frequência vibracional (VSFG), um sinal óptico não-linear de segunda ordem, tem sido tradicionalmente usada para estudar moléculas em interfaces como uma técnica de espectroscopia com uma resolução espacial de ~100 μm. No entanto, a espectroscopia não é sensível à heterogeneidade de uma amostra. Para estudar amostras mesoscopicamente heterogêneas, nós, juntamente com outros, empurramos o limite de resolução da espectroscopia VSFG para o nível de ~1 μm e construímos o microscópio VSFG. Esta técnica de imagem não só pode resolver morfologias de amostras através de imagens, mas também gravar um espectro VSFG de banda larga em cada pixel das imagens. Por ser uma técnica óptica não linear de segunda ordem, sua regra de seleção permite a visualização de estruturas automontadas não centrossimétricas ou quirais comumente encontradas em biologia, ciência dos materiais, bioengenharia, entre outras. Neste artigo, o público será guiado por um projeto de transmissão invertida que permite a obtenção de imagens de amostras não fixas. Este trabalho também mostra que a microscopia VSFG pode resolver informações geométricas químico-específicas de folhas auto-montadas individuais combinando-as com um solver de função de rede neural. Por fim, as imagens obtidas sob configurações de campo brilhante, SHG e VSFG de várias amostras discutem brevemente as informações únicas reveladas pelas imagens VSFG.

Introduction

A geração de soma de frequência vibracional (VSFG), uma técnica óptica não linear de segunda ordem1,2, tem sido usada extensivamente como uma ferramenta de espectroscopia para perfilar quimicamente amostras permitidas por simetria 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13, 14,15,16,17,18,19,20,21,22. Tradicionalmente, os VSFG têm sido aplicados a sistemas interfaciais 8,9,10,11 (isto é, gás-líquido, líquido-líquido, gás-sólido, sólido-líquido), que não possuem simetria de inversão - um requisito para a atividade do VSFG. Esta aplicação do VSFG tem fornecido uma riqueza de detalhes moleculares de interfaces enterradas 12,13, configurações de moléculas de água em interfaces 14,15,16,17,18 e espécies químicas em interfaces 19,20,21,22.

Embora o VSFG tenha sido poderoso na determinação de espécies moleculares e configurações em interfaces, seu potencial na medição de estruturas moleculares de materiais sem centros de inversão não foi realizado. Isso ocorre em parte porque os materiais podem ser heterogêneos em seu ambiente químico, composições e arranjo geométrico, e um espectrômetro VSFG tradicional tem uma grande área de iluminação da ordem de 100 μm2. Assim, a espectroscopia VSFG tradicional relata informações médias da amostra sobre uma área de iluminação típica de 100 μm2. Essa média de conjunto pode levar a cancelamentos de sinal entre domínios bem ordenados com orientações opostas e descaracterização de heterogeneidades locais 15,20,23,24.

Com os avanços em alta abertura numérica (NA), objetivas de microscópio baseadas em reflexo (geometrias de Schwarzschild e Cassegrain), que são quase livres de aberrações cromáticas, o tamanho do foco dos dois feixes em experimentos VSFG pode ser reduzido de 100 μm 2 para 1-2 μm2 e, em alguns casos, submícron25. Incluindo esse avanço tecnológico, nosso grupo e outros desenvolveram o VSFG em uma plataforma de microscopia 20,23,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36. Recentemente, implementamos um layout óptico invertido e um esquema de detecção de banda larga37, que permite uma coleção perfeita de imagens multimodais (VSFG, segunda geração harmônica (SHG) e óptica de campo brilhante). A imagem multimodalidade permite a inspeção rápida de amostras usando imagens ópticas, correlacionando vários tipos de imagens e localizando as posições do sinal nas imagens da amostra. Com a óptica de iluminação acromática e a escolha da fonte de iluminação a laser pulsada, esta plataforma óptica permite a integração perfeita futura de técnicas adicionais, como microscopia de fluorescência38 e microscopia Raman, entre outras.

Nesse novo arranjo, amostras como organizações hierárquicas e uma classe de automontagens moleculares (AMEs) têm sido estudadas. Esses materiais incluem colágeno e biomiméticos, onde tanto a composição química quanto a organização geométrica são importantes para a função final do material. Por ser um sinal óptico não-linear de segunda ordem, o VSFG é especificamente sensível a arranjos intermoleculares39,40, como distância intermolecular ou ângulos de torção, tornando-se uma ferramenta ideal para revelar tanto composições químicas quanto arranjos moleculares. Este trabalho descreve as modalidades VSFG, SHG e campo claro do instrumento central que consiste em um laser de estado sólido de cavidade dopada com itérbio que bombeia um amplificador paramétrico óptico (OPA), um microscópio invertido multimodal construído em casa e analisador de frequência monocromador acoplado a um detector bidimensional charged coupled device (CCD)27. Um passo a passo de construção e procedimentos de alinhamento, e uma lista completa de peças da configuração, são fornecidos. Uma análise aprofundada de uma MSA, cuja subunidade molecular fundamental é composta por uma molécula de sulfato de sódio-dodecil (SDS), um surfactante comum, e duas moléculas de β-ciclodextrina (β-CD), conhecidas como SDS@2 β-CD aqui, também são fornecidas como um exemplo para mostrar como o VSFG pode revelar detalhes geométricos específicos de moléculas de matéria organizada. Também foi demonstrado que detalhes geométricos químicos específicos da MSA podem ser determinados com uma abordagem de solucionador de funções de redes neurais.

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Protocol

1. Microscópio VSFG de varredura de linha hiperespectral

  1. Sistema laser
    1. Use um sistema de laser pulsado (ver Tabela de Materiais) centrado em 1025 nm ± 5 nm. O laser é regulado em 40 W, 200 kHz (200 μJ/pulso) com uma largura de pulso de ~290 fs.
      NOTA: A taxa de repetição exata pode variar, e um laser de alta taxa de repetição geralmente funciona melhor para este microscópio VSFG.
    2. Guie a saída do laser de semente em um amplificador paramétrico óptico comercial (OPA) para gerar um feixe de infravermelho médio (MIR) (veja Tabela de Materiais). Sintonize o MIR com a frequência de interesses (Figura 1A).
      NOTA: No presente estudo, a MIR está centrada em 3450 nm ± 85 nm (~2900 ± 72 cm-1) com duração de pulso de ~290 fs e energia de pulso de ~6 μJ, que engloba parte da região -CHx grupo funcional.
  2. Feixe de conversão ascendente
    1. Passe o feixe residual de 1025 nm do OPA através de um etalon de Fabry-Perot (ver Tabela de Materiais) para produzir um feixe de conversão ascendente espectralmente estreito com um FWHM de ~4,75 cm-1.
    2. Filtre espacialmente o feixe estreito de 1025 nm com um orifício de safira de 8 μm.
      NOTA: O feixe de 1025 nm pode ser visualizado usando uma placa NIR.
    3. Controle a polarização do pulso de 1025 nm com uma placa de onda λ/2 (ver Tabela de Materiais).
  3. Feixe MIR
    1. Guiar o feixe MIR através de um estágio de atraso para controle fino da sobreposição temporal.
    2. Controle a polarização do MIR com uma placa de onda λ/2.
  4. Microscópio VSFG
    1. Sobrepõem-se espacialmente os feixes de conversão ascendente e MIR em um espelho dicroico personalizado (DM, Figura 1B) que é transmissivo para MIR e reflexivo para NIR (veja Tabela de Materiais). Use duas íris para guiar o alinhamento: uma logo após o DM e outra na extremidade oposta. Use um medidor de energia após a íris para determinar se o MIR está centralizado e use uma placa NIR para localizar as posições NIR.
      NOTA: Após a sobreposição, o feixe NIR pode ser usado para guiar ambos os feixes.
    2. Direcione os feixes sobrepostos para um microscópio invertido com um scanner de feixe ressonante de eixo único integrado de 325 Hz (montado em um scanner integrado de duas posições (I2PS), Figura 1B) (consulte a Tabela de Materiais).
      NOTA: O scanner ressonante projeta uma linha dos dois feixes sobrepostos na abertura traseira da objetiva do condensador. Ele é montado em um controle deslizante que permite a reconfiguração perfeita entre as modalidades VSFG/SHG e brightfield.
    3. Focalize os dois feixes espacialmente sobrepostos na amostra com uma objetiva de Schwarzschild puramente reflexiva (SO, Figura 1B,D) (ver Tabela de Materiais).
    4. Coletar o sinal VSFG gerado pela amostra com uma objetiva refrativa corrigida infinitamente (RO, Figura 1B,D) (ver Tabela de Materiais).
    5. Guie o sinal VSFG de saída colimada através de um polarizador linear e, em seguida, através de um sistema de lentes de tubo telecêntrico composto por duas lentes focais f = 60 mm (TL1 e TL2, Figura 1B,C) (ver Tabela de Materiais).
      NOTA: A imagem ampliada das lentes do tubo é formada na fenda de entrada do monocromador (MC, Figura 1B,C), e os dados resolvidos espacialmente/frequência são detectados em um detector CCD bidimensional (CCD, Figura 1B).
  5. Modo SHG
    1. Para mudar para imagens SHG, bloqueie o feixe IR e gire a grade do espectrógrafo para 501,5 nm para obter imagens do sinal SHG.
  6. Modo Brightfield
    1. Para alternar para imagens ópticas de campo brilhante, ligue a fonte de luz branca (consulte Tabela de materiais). Mova o controle deslizante integrado (I2PS, Figura 1B) para coletar imagens de campo brilhante na direção de contrapropagação, com a objetiva de imagem (RO) atuando como condensador e a objetiva do condensador (SO) atuando como a objetiva de imagem.
    2. Forme uma imagem da saída colimada da objetiva refrativa no plano do sensor de uma câmera de campo brilhante RGB usando um sistema de lente de tubo disponível comercialmente (consulte Tabela de Materiais).

Figure 1
Figura 1: Microscópio VSFG hiperespectral multimodal. (A) Vista superior da configuração principal. Um laser de bomba de 1025 nm foi enviado a uma OPA para gerar um pulso de infravermelho médio ajustável. O resíduo de 1025 nm foi frequentemente estreitado por um etalon (E) e espacialmente filtrado em um feixe gaussiano por um filtro espacial (SFG). Os feixes de IV médio e 1025 nm são sobrepostos espacialmente em um espelho dicroico (DM) personalizado e guiados através do microscópio invertido (região in box em A). (B) Os dois feixes são enviados para um scanner de feixe ressonante de 325 Hz montado em um controle deslizante integrado de 2 posições (I2PS), permitindo a comutação perfeita entre as modalidades óptica de campo brilhante e não linear. A plataforma do microscópio é equipada com uma objetiva de Schwarzschild (SO) de Schwarzschild corrigida infinitamente baseada em reflexiva atuando como um condensador e uma objetiva de imagem (RO) corrigida ao infinito baseada em refração montada em um estágio do eixo z de nanoposicionamento vertical (VNP). O SO focaliza a linha de feixes de entrada que o scanner de feixe ressonante reflete na amostra, enquanto o RO coleta a seção de sinais da linha VSFG. É importante controlar finamente a posição do eixo z da OR com precisão de 1 μm para garantir que a amostra esteja na melhor condição focal para imagens de alta qualidade. A linha colimada do sinal VSFG é então direcionada para um sistema de lentes tubulares composto por 2 lentes tub (TL1 e TL2), formando uma imagem ampliada na fenda de entrada do monocromador (MC). A linha de espectros resolvida em frequência é então hiperespectralmente imageada em um dispositivo acoplado à carga (CCD). Após a coleta de cada linha hiperespectral, a amostra é escaneada no eixo perpendicular ao eixo de varredura do scanner de feixe ressonante usando o NP. Para coletar imagens de campo brilhante da amostra, o I2PS é movido para a posição de campo brilhante e um espelho interceptando a fonte de luz branca (WLS) é instalado. A luz é então focalizada pelo RO e fotografada pelo SO. Uma imagem é então formada no plano do sensor da câmera de campo brilhante (BC) na parte superior do microscópio invertido. (C) Visão detalhada do caminho óptico através da área da lente do tubo para o MC e CCD. (D) Vista detalhada da área amostral entre as OS e RO. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Alinhamento do microscópio hiperespectral e calibração espacial vertical do eixo CCD

  1. Otimize aproximadamente a posição do plano da amostra (nano posicionador eixo z) usando uma amostra padrão de ZnO (1 μm de espessura) padrão de pulverização revestida 15 mm x 15 mm x 0,170 mm ± lamínula de cobertura de 0,005 mm e colocando-a em foco de campo brilhante usando a modalidade de imagem de campo brilhante.
    NOTA: A posição z da RO, bem como o alinhamento da luz branca, pode precisar ser ajustada conforme necessário. Uma imagem representativa do ZnO no padrão de vidro usado para calibração do alinhamento é mostrada na Figura 2.
  2. Mova o I2PS de volta para o braço de iluminação não linear e otimize a altura da amostra para a intensidade máxima de VSFG não ressonante gerada pelas regiões de ZnO observadas na câmera CCD.
    NOTA: A posição z da RO deve ser ajustada para a intensidade máxima. Pode-se ter que iterar os passos 2.1 e 2.2 algumas vezes antes que a altura ideal da amostra e as OR sejam atingidas.
  3. Ligue o scanner de feixe ressonante e colete uma linha das imagens.
  4. Colete imagens de intensidade não ressonante escaneando a amostra perpendicularmente à direção do scanner de feixe. Faça cortes verticais dos dados da imagem e estabeleça a relação pixel:mícron. (consulte a Figura 3 e sua legenda).
    NOTA: A derivada dessas seções de linha é analisada para produzir a relação pixel:mícron do eixo CCD vertical que será usada para imagens futuras.

Figure 2
Figura 2: Qualidade de imagem representativa para alinhamento rugoso da modalidade de imagem de campo claro de um padrão ZnO. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Fluxo de trabalho de calibração do eixo vertical. Esta figura ilustra como converter os pixels CCD em dimensões espaciais verticais na unidade de μm. (A) Uma imagem é coletada e reconstruída da lamínula de cobertura padronizada de ZnO. Em seguida, a distância de pixel de uma para as outras bordas do padrão (pequena barra vertical em A). Como a cruz do padrão ZnO é projetada para ter uma largura de 25 μm, pode-se usar a razão entre largura física e largura de pixel aqui para calcular a razão de dimensão física/pixel. Uma imagem representativa calibrada no eixo vertical é mostrada em (B). (C) Por último, toma-se uma fatia vertical como indicado pela linha vermelha. (D) A derivada do corte vertical é tomada para obter a resolução espacial. A derivada do corte vertical é utilizada para obter a resolução espacial. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Coleta de dados hiperespectrais

  1. Coletar os espectros de uma linha vertical dos sinais VSFG no CCD, cujos espectros estão dispersos ao longo do eixo horizontal e as posições espaciais são registradas no eixo vertical do CCD.
    Observação : isso resulta em um conjunto de dados bidimensional para uma seção de linha única.
  2. Depois que a seção de linha da amostra for obtida com imagens hiperespectralmente, digitalize a amostra no eixo perpendicular ao eixo de varredura de linha usando o nanoposicionador tridimensional (NP, Figura 1).
    NOTA: O posicionador nano 3D é importante para alta precisão e reprodutibilidade na localização de regiões de amostra (plano x-y), bem como trazer a amostra em foco (eixo z).
  3. Itere entre as etapas 3.1 e 3.2 para coletar uma imagem hiperespectral VSFG.

4. Análise hiperespectral dos dados

  1. Desmisture espectralmente os dados usando o fluxo de trabalho da biblioteca de imagens hiperespectrais da caixa de ferramentas de imagem do MatLab41.
    NOTA: A desmistura espectral correlaciona localizações espaciais a espectros únicos. O código Matlab para análise de dados hiperespectrais é fornecido no Arquivo Suplementar 1.
    1. Crie um hipercubo de 4 dimensões (x = espacial, y = espacial, z = intensidade dependente da frequência, ω = frequência) usando a função de hipercubo na biblioteca de imagens hiperespectrais da caixa de ferramentas de processamento de imagens do Matlab41.
    2. Identifique o número de espectros únicos com a função countEndmembersHFC com um valor de probabilidade de alarme falso (PFA) de 10-7.
    3. Identifique espectros únicos usando a função de desmistura espectral nfindr .
    4. Finalmente, usando a função sid , associe cada pixel a um dos espectros exclusivos identificados na etapa anterior.
      NOTA: Métodos adicionais de desmistura e correspondência espectral podem ser feitos com funções/algoritmos alternativos oferecidos na MatLab Hyperspectral Imaging Library41.
  2. Ajuste os dados de soma de cada folha isolada à função Voigt42 (Arquivo Suplementar 1).
    NOTA: A função lorentziana representa o limite de linha homogênea pura, enquanto a função gaussiana se origina de limites não homogêneos. Na realidade, os sistemas poderiam estar em uma combinação de limites homogêneos e não homogêneos, o que requer uma função Voigt - uma prática comum para espectroscopia de fase condensada, incluindo VSFG.

5. Análise geométrica da amostra

  1. Determinar a geometria das amostras de acordo com o procedimento mencionado nos pontos 5.2-5.3. Neste estudo, SDS@2 β-CD é usado como exemplo. Derivar os elementos tensores permitidos por simetria de χ(2) com base na simetria C7 da subunidade molecular da amostra de mesofolhas de SDS@2 β-CD.
    NOTA: A simetria permitida χ(2) depende da simetria. Para calcular a suscetibilidade não linear permitida de qualquer simetria, consulte a referência43.
  2. Aplique a rotação de Euler27 para relacionar as medidas do quadro de laboratório com o quadro molecular.
    NOTA: No caso do SDS@2 β-CD, sua simetria C7 leva a oito equações independentes relacionando 8 saídas (quadro de laboratório χ(2)) a 8 entradas (6 hiperpolarizabilidade independente β(2), e dois ângulos: Θ, o ângulo de inclinação em relação ao plano da amostra de todas as folhas e, φ, a rotação no plano da folha (Figura 4)). Duas folhas são usadas para extrair os alinhamentos moleculares comuns das duas folhas. As relações entre φ1 e φ2 (ângulo de rotação no plano das duas folhas) podem ser extraídas das imagens de campo brilhante. No exemplo atual, φ2 = φ1 + 60°. Supõe-se que todas as unidades moleculares estejam no mesmo ângulo, então Θ1 = Θ2. Isso resulta em 11 incógnitas (9 independentes, incluindo 6 hiperpolarizabilidade independente β(2), Θ 1 e φ1, e a razão de cobertura relativa entre as folhas N e os dois ângulos dependentes, que são φ 2, e Θ 2) para 16 conhecidos (8 polarizações de quadro de laboratório por folha e duas folhas).
  3. Relacione o quadro de laboratório χ(2) e a hiperpolarizabilidade do quadro molecular β(2) resolvidos pela polarização com um solucionador de função de rede neural.
    NOTA: Um resumo detalhado dessa abordagem pode ser encontrado na referência27.
    1. Crie um modelo de rede neural em camadas no Python44usando Keras composto por uma estrutura de nó 200-100-50 e uma função de ativação de tangente hiperbólica.
    2. Crie uma matriz de 100000 x 11 gerada aleatoriamente de valores de β(2), Θ 1, Θ 2, φ1, φ 2 e N. Calcule o quadro de laboratório correspondente 16 χ(2), usando a equação determinada em 5.2 por rotações de Euler.
    3. Use os valores χ(2) calculados (um total de 100.000 por 16 valores) como entrada, e aprenda a prever 11 valores (β(2), Θ 1, Θ 2, φ1, φ 2 e N) quando fornecidos 16 valores χ(2).
    4. Uma vez treinado, use outro conjunto de 1000 entradas com as entradas e saídas para testar o modelo treinado. A saída prevista e a saída verdadeira devem mostrar uma relação linear com uma inclinação de 1.
    5. Por fim, forneça o χ(2) medido experimentalmente a partir de duas folhas (cada folha tem 8 χ(2 ) medido) e use o modelo treinado para prever o ângulo de inclinação Θ, juntamente com outras propriedades.

Figure 4
Figura 4: Ilustração da transformação de Euler. (A) Ilustração da transformação de Euler entre as coordenadas de laboratório (XYZ) suscetibilidade de segunda ordem χ(2) e as coordenadas moleculares (xyz) hiperpolarizabilidade βijk. A rotação de Euler z-y'-z'' é realizada nas coordenadas moleculares, com φ como o ângulo de rotação no plano, θ como o ângulo de inclinação e ψ como o ângulo de torção. ψ é integrado para ângulos de torção arbitrários em torno do eixo molecular. φ não é integrado porque todas as moléculas giram para um ângulo específico em relação à estrutura do laboratório para formar as folhas auto-montadas. N é a cobertura superficial relativa das duas folhas. (B) Visualização das subunidades inclinadas formando uma folha determinada pelos resultados da rede neural. Esse valor foi modificado de Wagner et al.27. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Representative Results

Figure 5
Figura 5: Estrutura molecular, morfologia e orientação potencial do SDS@β-CD. (A) Vista superior e (B) Estrutura química lateral do SDS@β-CD. (C) Distribuição representativa e heterogênea das folhas de mesoescala no plano amostral. A subunidade molecular poderia ter diferentes orientações e alinhamento sobre o substrato, o que é desconhecido. Esse valor foi modificado de Wagner et al.27. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A capacidade do microscópio em discriminar entre estruturas moleculares exclusivamente organizadas e volume isotrópico é demonstrada com a amostra de SDS@2 β-CD23,34 (Figura 5). Neste estudo, a amostra foi preparada adicionando-β-CD e SDS à água deionizada (DI) na proporção de 2:1 até que os dois solutos atingissem a concentração de 10% m/m. A suspensão foi então aquecida até a claridade e resfriada até a temperatura ambiente durante a noite. CuCl2 foi adicionado a uma concentração de 1:10 CuCl2:SDS para sintonizar as interações eletrostáticas e a mistura foi deixada descansar por 3-5 dias para que as mesofolhas de SDS@2 β-CD se formassem completamente. Por fim, mesochapas isoladas foram produzidas por gota fundindo 5 μL da suspensão da chapa em uma lamínula de 15 mm x 15 mm x 0,170 mm ± lamínula de 0,005 mm afixada em um revestidor giratório operando a 10.000 rpm.

As folhas de mesoescala formaram-se a partir de sua auto-montagem com uma simetria específica de C7. No entanto, não está claro sobre a orientação molecular da unidade molecular única nesta auto-montagem, um conhecimento fundamental que pode influenciar as funções do material. (Figura 5C). Foram capturadas imagens VSFG das folhas automontadas dispersas em uma lamínula (Figura 6A). Através da identificação espectral (etapa 4 Análise dos dados hiperespectrais) utilizando a função de imagem hiperespectral Matlab, verificou-se que todas as folhas podem ser categorizadas em dois tipos, um com maior intensidade de VSFG (espectros azuis na Figura 6B e folhas marcadas em azul na Figura 6A), e outro com menor intensidade. Ao inspecionar e comparar com a imagem óptica (Figura 6C,D), a folha grande no centro das imagens parecia ter folhas duplas empilhadas, atribuindo assim a menor intensidade VSFG devido à interferência destrutiva entre as duas folhas de orientação diferentes. A folha única foi focalizada para extrair a orientação da unidade molecular única (azuis na Figura 6A). Duas das folhas (destacadas em quadrados vermelho e azul na Figura 6A) foram medidas por várias polarizações VSFG, e os espectros foram ajustados usando as funções de Voigt. Observe que a polarização VSFG é descrita no sinal de ordem, conversão ascendente e MIR. Por exemplo, SSP significa polarização P de IR, polarização S de conversão ascendente e polarização S de sinais.

Figure 6
Figura 6: Polarização resolvida VSFG sobreposição de imagem com modalidade de campo brilhante. (A) Imagem VSFG hiperespectral resolvida por polarização (SSS) de SDS@2 β-CD. As cores roxo e rosa representam áreas onde diferentes espectros residem, e os espectros correspondentes são plotados em (B), que são espectros representativos para pixels únicos com relação sinal-ruído para espectros azul e magenta ~56 e ~26, respectivamente. As folhas nas caixas vermelha e azul são analisadas explicitamente abaixo para extrair os ângulos de inclinação da supramolécula. (C) Imagem de campo brilhante da mesma área que a de (A). (D) Imagem hiperespectral VSFG sobreposta a uma imagem óptica de área idêntica. (E) Da esquerda para a direita: espectros de polarização PPS, PPP, SSP e SSS somados em 180 e 480 pixels dentro das duas folhas únicas destacadas em caixas vermelhas e azuis em (A). Todos os espectros tinham uma característica dominante centrada em aproximadamente 2910 cm-1 e uma relação sinal-ruído da ordem de 1000. Os espectros foram ajustados com múltiplas funções de Voigt, que foram representadas pelas áreas sombreadas, e usados para análise de orientação posterior. Esse valor foi modificado de Wagner et al.27. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Em seguida, para extrair as orientações moleculares, determinou-se, primeiramente, a hiperpolarizabilidade permitida pela simetria, Equation 1 permitida pela regra de seleção de simetria, utilizando-se o procedimento previamente publicado43. Em seguida, a relação entre o quadro de laboratório e o quadro molecular é derivada da rotação de Euler27. O ângulo de inclinação θ é então extraído usando o método de rede neural descrito acima, e o ângulo de inclinação foi encontrado como sendo ~23° (Figura 6).

Por fim, mostra-se a capacidade de imagem multimodal nesta plataforma37(Figura 7). Três amostras diferentes, a saber, SDS@2 β-CD, colágeno e L-fenilalanil-L-fenilalanina (FF), são estudadas com o microscópio com as modalidades de imagem de campo claro, SHG e VSFG. Em primeiro lugar, todas as amostras mostraram morfologias semelhantes em diferentes modalidades de imagem. Tanto a SHG quanto a VSFG apresentaram variações de intensidade espacial, o que está ausente nas imagens ópticas. Como SHG e VSFG requerem estruturas não-centrossimétricas ordenadas, a variação na intensidade do sinal pode vir de variações na ordenação molecular local ou orientações moleculares. Ao contrário do SHG, pode-se sintonizar o feixe MIR do VSFG para ser ressonante com diferentes modos vibracionais. No caso apresentado, os modos vibracionais CHx foram estudados a 3,5 μm e o modo Amid-I a 6 μm. Para FF, imagens VSFG com sinais fortes e uniformes foram obtidas, sugerindo uma estrutura auto-montada bem ordenada para todos os grupos vibracionais - concordando com sua natureza cristalina. Em contraste, a amostra de colágeno apresentou um sinal VSFG mais forte na região CHx sobre a região Amida, indicando que as amostras são flexíveis e seus grupos vibracionais têm diferentes graus de ordem.

Figure 7
Figura 7: Imagens multimodais de três amostras diferentes. (A i-A iii) SDS@2 β-CD brightfield, SHG (polarização PP) e VSFG (polarização PPP) de imagens de região de 3,5 μm, respectivamente. As imagens não lineares são sobrepostas com imagens de campo brilhante. As estruturas químicas de SDS e 2β-CD são mostradas no inset de ai. (B i-B iv) Campo brilhante de colágeno liofilizado, SHG (polarização PP), VSFG (polarização PPP) de 3,5 μm e 6 μm respectivamente. A estrutura química do resíduo primário do colágeno, composto por glicina, prolina e hidroxiprolina, é mostrada no inset de Bi. (C i-Civ) FF campo brilhante, SHG (polarização PP) e VSFG (polarização PPP) de 3,5 μm e 6 μm respectivamente. A estrutura química para as subunidades moleculares FF é mostrada no inset de ci. Todas as imagens de 6 μm são tiradas sob um ambiente de instrumento de nitrogênio purgado para remover a atenuação da umidade do ar ambiente. SDS@2 β-CD não tem uma imagem VSFG a 6 μm porque não tem grupos Amid . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo suplementar 1: Código Matlab para análise de dados hiperespectrais Clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

As etapas mais críticas são de 1,42 a 1,44. É fundamental alinhar bem a lente objetiva para uma resolução espacial óptica. Também é importante coletar o sinal emitido, relé e projetar o feixe de varredura como uma linha nas fendas de entrada. Alinhamentos adequados garantiriam a melhor resolução e relação sinal-ruído. Para uma amostra típica, como folhas de SDS@2 β-CD de 100 μm por 100 μm, uma imagem de boa resolução (~1 μm de resolução) com uma alta relação sinal-ruído levaria 20 minutos. Isso já é mais rápido do que a versão anterior do instrumento24,26. Um aumento adicional da velocidade de aquisição de dados pode ser realizado por um laser de maior taxa de repetição.

A limitação atual é a resolução espacial, que poderia ser melhorada com óptica objetiva NA ainda maior e potenciais técnicas de super-resolução baseadas em óptica não linear45. A detecção de heterodinos tem sido aplicada na espectroscopia VSFG para resolver sua fase e extrair as orientações moleculares 5,46,47,48. Isso é tecnicamente factível em nosso experimento. No entanto, a imagem VSFG depende naturalmente do espalhamento do sinal da amostra, o que embaralha sua fase e, assim, complica as relações entre a orientação molecular e a fase do sinal VSFG.

A obtenção de imagens da morfologia de materiais com especificidade química é um desafio, pois muitas técnicas de imagem carecem de sensibilidade molecular. A microscopia VSFG hiperespectral rápida preenche esse vazio investigando assinaturas vibracionais moleculares e revelando alinhamentos moleculares de matéria organizada em mesoescala que são importantes na ciência dos materiais, química e biologia. No futuro, a natureza reflexiva da óptica de iluminação permitirá que outras técnicas sejam integradas ao instrumento central, aumentando ainda mais suas capacidades e permitindo imagens multimodais de amostras químicas, biológicas e materiais.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

O desenvolvimento do instrumento é apoiado pelo Grant NSF CHE-1828666. ZW, JCW e WX são apoiados pelo National Institutes of Health, National Institute of General Medical Sciences, Grant 1R35GM138092-01. A BY é apoiada pela Youth Innovation Promotion Association, Academia Chinesa de Ciências (CAS, 2021183).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x Camera Por Thorlabs WFA4100 connect a camera to a microscope or optical system
25.0 mm Right-Angle Prism Mirror, Protected Gold Thorlabs MRA25-M01 reflect light and produce retroreflection, redirecting light back along its original path
3” Universal Post Holder-5 Pack Thorlabs UPH3-P5 hold and support posts of various sizes and configurations
30 mm to 60 mm Cage Plate, 4 mm Thick Thorlabs LCP4S convert between a 30 mm cage system and a 60 mm cage system
500 mm Tall Cerna Body with Epi Arm Thorlabs CEA1500 provide the function of enabling top illumination techniques in microscopy
60 mm Cage Mounted Ø50.0 mm Iris Thorlabs LCP50S control the amount of light passing through an optical system
60 mm Cage Mounting Bracket Thorlabs LCP01B mount and position a 60 mm cage system in optical setups
Air spaced Etalon SLS Optics Ltd. Customized generate narrow-band 1030 nm light 
Cage Plate Mounting Bracket Thorlabs KCB2 hold and adjust mirrors at a precise angle
CCD Andor Technologies Newton  2D CCD for frequency and spatial resolution
Collinear Optical Parametric Amplifier Light Conversion Orpheus-One-HP Tunable MID light generator
Copper Chloride Thermo Fischer Scientific A16064.30 Self-assembly component
Customized Dichroic Mirror Newport Customized selectively reflects or transmits light based on its wavelength or polarization
Ext to M32 Int Adapter Thorlabs SM1A34 provide compatibility and facilitating the connection between components with different thread types
Infinity Corrected Refractive Objective Zeiss 420150-9900-000 Refractive Objective
Infinity Corrected Schwarzschild Objective Pike Technologies Inc. 891-0007 Reflective objective
Laser Carbide, Light-Conversion C18212 Laser source
M32x0.75 External to Internal RMS Thorlabs M32RMSS adapt or convert the threading size or type of microscope objectives 
M32x0.75 External to M27x0.75 Internal Engraving Thorlabs M32M27S adapt or convert the threading size or type of microscope objectives 
Manual Mid-Height Condenser Focus Module Thorlabs ZFM1030 adjust the focus of an optical element
Monochromator Andor Technologies Shamrock 500i Provides frequency resolution for each line scan
Motorized module with 1" Travel for Edge-Mounted Arms Thorlabs ZFM2020 control the vertical positon of the imaging objective
Nanopositioner Mad City Labs Inc. MMP3 3D sample stage
Resonant Scanner EOPC SC-25 325Hz resonant beam scanner
RGB Color CCD Camera Thorlabs DCU224C Brightfield camera, discontinued but other cameras will work just as well
RGB tube lens Thorlabs ITL200 white light collection
Right Angle Kinematic Breadboard Thorlabs OPX2400 incorporate a sliding mechanism with two fixed positions
Right Angle Kinematic Mirror Mount, 30 mm Thorlabs KCB1 hold and adjust mirrors at a precise angle
Right Angle Kinematic Mirror Mount, 60 mm Thorlabs KCB2 hold and adjust mirrors at a precise angle
SM2, 60 mm Cage Arm for Cerna Focusing Stage Thorlabs CSA2100 securely mount and position condensers
Snap on Cage Cover for 60 mm Cage, 24 in Long, Thorlabs C60L24 enclose and protect the components inside the cage
Sodium dodecyl sulfate Thermo Fischer Scientific J63394.AK Self-assembly component
Three-Chnnale Controller and Knob Box for 1" Cerna Travel Stages Thorlabs MCM3001 control ZFM2020
Tube lens Thorlabs LA1380-AB - N-BK7 SFG signal collection
Visible LED Set Thorlabs WFA1010 provide illumination in imaging setup
Whitelight Source Thorlabs WFA1010 Whitelight illumination source for brightfield imaging
WPH05M-1030 - Ø1/2" Zero-Order Half-Wave Plate, Ø1" Mount, 1030 nm  Thorlabs WPH05M-1030 alter the polarization state of light passing through it
WPLQ05M-3500 - Ø1/2" Mounted Low-Order Quarter-Wave Plate, 3.5 µm  Thorlabs WPLQ05M-3500 alter the polarization state of light passing through it
X axis Long Travel Steel Extended Contact Slide Stages Optosigma TSD-65122CUU positioning stages that offer extended travel in the horizontal (X) direction
XT95 4in Rail Carrier Thorlabs XT95RC4 mount and position optical components
X-Y Axis Translation Stage w/ 360 deg. Rotation Thorlabs XYR1 precise movement and positioning of objects in two dimensions, along with the ability to rotate the platform
XY(1/2") Linear Translator with Central SM1 Thru Hole Thorlabs XYT1 provide precise movement and positioning in two dimensions
Yb doped Solid State Laser Light Conversion CB3-40W Seed laser
β-Cyclodextrin Thermo Fischer Scientific J63161.22 Self-assembly component

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Química imagem infravermelha óptica não linear estrutura-propriedade auto-montagem geração de soma de frequência vibracional microscopia de geração de soma de frequência imagem hiperespectral caracterização de materiais organização hierárquica
Imagem Química Hiperespectral Não Linear Multimodal Usando Microscopia de Geração de Soma e Frequência Vibracional de Varredura de Linha
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Wagner, J. C., Yang, B., Wu, Z., Xiong, W. Multimodal Nonlinear Hyperspectral Chemical Imaging Using Line-Scanning Vibrational Sum-Frequency Generation Microscopy. J. Vis. Exp. (202), e65388, doi:10.3791/65388 (2023).

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