Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Multimodal icke-linjär hyperspektral kemisk avbildning med hjälp av linjeskanningsvibrationssummafrekvensgenereringsmikroskopi

Published: December 1, 2023 doi: 10.3791/65388
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1,3,4
1Department of Chemistry and Biochemistry, UC San Diego, 2State Key Laboratory of Molecular Reaction Dynamics, Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, 3Materials Science and Engineering Program, UC San Diego, 4Department of Electrical and Computer Engineering, UC San Diego

Summary

Ett multimodalt, snabbt ramverk för hyperspektral avbildning utvecklades för att erhålla VSFG-bilder (Broadband Vibrational Sum-Frequency Generation), tillsammans med bildmodaliteter för ljusfält, andra harmoniska generationen (SHG). På grund av att den infraröda frekvensen är i resonans med molekylära vibrationer, avslöjas mikroskopisk strukturell och mesoskopisk morfologi kunskap om symmetritillåtna prover.

Abstract

Vibrational sum-frequency generation (VSFG), en andra ordningens icke-linjär optisk signal, har traditionellt använts för att studera molekyler vid gränsytor som en spektroskopiteknik med en rumslig upplösning på ~100 μm. Spektroskopin är dock inte känslig för heterogeniteten hos ett prov. För att studera mesoskopiskt heterogena prover pressade vi, tillsammans med andra, ner upplösningsgränsen för VSFG-spektroskopi till ~1 μm-nivå och konstruerade VSFG-mikroskopet. Denna avbildningsteknik kan inte bara lösa provmorfologier genom avbildning, utan också spela in ett bredbands-VSFG-spektrum vid varje pixel i bilderna. Eftersom det är en andra ordningens icke-linjär optisk teknik, möjliggör dess urvalsregel visualisering av icke-centrosymmetriska eller kirala självmonterade strukturer som vanligtvis finns inom bland annat biologi, materialvetenskap och bioteknik. I den här artikeln kommer publiken att guidas genom en inverterad överföringsdesign som gör det möjligt att avbilda ofixerade prover. Detta arbete visar också att VSFG-mikroskopi kan upplösa kemikaliespecifik geometrisk information om enskilda självmonterade ark genom att kombinera den med en neural nätverksfunktionslösare. Slutligen diskuterar bilderna som erhållits under brightfield-, SHG- och VSFG-konfigurationer av olika prover kortfattat den unika information som avslöjas av VSFG-avbildning.

Introduction

Vibrationssummafrekvensgenerering (VSFG), en andra ordningens icke-linjär optisk teknik1,2, har använts i stor utsträckning som ett spektroskopiverktyg för att kemiskt profilera symmetritillåtna prover 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13, 14,15,16,17,18,19,20,21,22. Traditionellt har VSFG tillämpats på gränssnittssystem 8,9,10,11 (dvs. gas-vätska, vätska-vätska, gas-fast, fast-vätska), som saknar inversionssymmetri - ett krav för VSFG-aktivitet. Denna tillämpning av VSFG har gett en mängd molekylära detaljer om begravda gränssnitt 12,13, konfigurationer av vattenmolekyler vid gränsytor 14,15,16,17,18 och kemiska arter vid gränsytor 19,20,21,22.

Även om VSFG har varit kraftfull när det gäller att bestämma molekylära arter och konfigurationer vid gränsytor, har dess potential att mäta molekylära strukturer hos material som saknar inversionscentra inte uppfyllts. Detta beror delvis på att materialen kan vara heterogena i sin kemiska miljö, sammansättning och geometriska arrangemang, och en traditionell VSFG-spektrometer har ett stort belysningsområde i storleksordningen 100 μm2. Således rapporterar traditionell VSFG-spektroskopi på ensemblemedelvärdesinformation av provet över ett typiskt 100 μm2 belysningsområde. Denna ensemblemedelvärdesberäkning kan leda till signalannulleringar mellan välordnade domäner med motsatta orienteringar och felkarakterisering av lokala heterogeniteter 15,20,23,24.

Med framsteg inom hög numerisk bländare (NA), reflektivbaserade mikroskopobjektiv (Schwarzschild- och Cassegrain-geometrier), som är nästan fria från kromatiska aberrationer, kan fokusstorleken för de två strålarna i VSFG-experiment minskas från 100 μm 2 till 1-2 μm2 och i vissa fall submikron25. Inklusive detta tekniska framsteg har vår grupp och andra utvecklat VSFG till en mikroskopiplattform 20,23,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36. Nyligen har vi implementerat en inverterad optisk layout och bredbandsdetekteringsschema37, vilket möjliggör en sömlös insamling av multimodala bilder (VSFG, andra övertonsgenerationen (SHG) och ljusfältsoptik). Den multimodala avbildningen möjliggör snabb inspektion av prover med hjälp av optisk avbildning, korrelerar olika typer av bilder tillsammans och lokaliserar signalpositioner på provbilderna. Med den akromatiska belysningsoptiken och valet av pulsad laserbelysningskälla möjliggör denna optiska plattform framtida sömlös integration av ytterligare tekniker som fluorescensmikroskopi38 och Raman-mikroskopi, bland andra.

I detta nya arrangemang har prover som hierarkiska organisationer och en klass av molekylära självsammansättningar (MSA) studerats. Dessa material inkluderar kollagen och biomimetik, där både den kemiska sammansättningen och den geometriska organisationen är viktiga för materialets slutliga funktion. Eftersom VSFG är en andra ordningens icke-linjär optisk signal, är den specifikt känslig för intermolekylära arrangemang39,40, såsom intermolekylära avstånd eller vridningsvinklar, vilket gör den till ett idealiskt verktyg för att avslöja både kemiska sammansättningar och molekylära arrangemang. Detta arbete beskriver VSFG-, SHG- och ljusfältsmodaliteterna för kärninstrumentet som består av en ytterbium-dopad hålrums-solid-state-laser som pumpar en optisk parametrisk förstärkare (OPA), ett hemmabyggt multimodalt inverterat mikroskop och monokromatorfrekvensanalysator kopplad till en tvådimensionell CCD-detektor (Charged Coupled Device)27. En steg-för-steg-procedur för konstruktion och inriktning och en komplett dellista över installationen tillhandahålls. En djupgående analys av en MSA, vars grundläggande molekylära subenhet består av en molekyl av natrium-dodecylsulfat (SDS), ett vanligt ytaktivt ämne, och två molekyler av β-cyklodextrin (β-CD), känd som SDS@2 β-CD häri, ges också som ett exempel för att visa hur VSFG kan avslöja molekylspecifika geometriska detaljer i organiserad materia. Det har också visats att kemikaliespecifika geometriska detaljer i MSA kan bestämmas med en neural nätverks funktionslösare.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. VSFG-mikroskop med hyperspektral linjeskanning

  1. Lasersystem
    1. Använd ett pulsat lasersystem (se materialtabell) centrerat vid 1025 nm ± 5 nm. Lasern är inställd på 40 W, 200 kHz (200 μJ/puls) med en pulsbredd på ~290 fs.
      OBS: Den exakta repetitionshastigheten kan variera, och en laser med hög repetitionshastighet fungerar i allmänhet bättre för detta VSFG-mikroskop.
    2. Styr utsignalen från frölasern till en kommersiell optisk parametrisk amplifier (OPA) för att generera en mid-infraröd (MIR) stråle (se materialförteckning). Ställ in MIR på frekvensen av intressen (Figur 1A).
      OBS: I den aktuella studien är MIR centrerad vid 3450 nm ± 85 nm (~2900 ± 72 cm-1) med en pulslängd på ~290 fs och pulsenergi på ~6 μJ, vilket omfattar en del av -CHx funktionell gruppregion.
  2. Uppkonverteringsstråle
    1. För den återstående 1025 nm-strålen från OPA genom en Fabry-Perot-etalon (se materialtabell) för att producera en spektralt smal uppkonverteringsstråle med en FWHM på ~4,75 cm-1.
    2. Filtrera den avsmalnade 1025 nm-strålen rumsligt med ett 8 μm safirhål.
      OBS: 1025 nm-strålen kan visualiseras med ett NIR-kort.
    3. Kontrollera polarisationen av 1025 nm-pulsen med en λ/2-vågplatta (se materialtabell).
  3. MIR-stråle
    1. Styr MIR-strålen genom ett fördröjningssteg för finkontroll av den tidsmässiga överlappningen.
    2. Styr polarisationen av MIR med en λ/2-vågplatta.
  4. VSFG-mikroskop
    1. Överlappa rumsligt både uppkonvertering och MIR-strålar vid en anpassad dikroisk spegel (DM, figur 1B) som är transmissiv till MIR och reflekterande till NIR (se materialtabell). Använd två iris för att styra inriktningen: en direkt efter DM och en längst ut. Använd en effektmätare efter iris för att avgöra om MIR är centrerad och använd ett NIR-kort för att lokalisera NIR-positioner.
      OBS: Efter överlappningen kan NIR-strålen användas för att styra båda strålarna.
    2. Rikta de överlappande strålarna in i ett inverterat mikroskop med en integrerad 325 Hz enaxlig resonansstrålskanner (monterad på en integrerad tvålägesskanner (I2PS), figur 1B) (se materialförteckning).
      OBS: Resonansskannern projicerar en linje av de två överlappande strålarna på den bakre öppningen på kondensorobjektivet. Den är monterad på ett skjutreglage som möjliggör sömlös omkonfigurering mellan VSFG/SHG- och brightfield-modaliteter.
    3. Fokusera de två rumsligt överlappande strålarna på provet med ett rent reflekterande Schwarzschild-mål (SO, figur 1B,D) (se materialtabell).
    4. Samla in VSFG-signalen som genereras av sample med ett oändlighetskorrigerat brytningsmål (RO, figur 1B,D) (se materialtabell).
    5. Styr den kollimerade VSFG-signalen genom en linjär polarisator och sedan genom ett telecentriskt rörlinssystem bestående av två f = 60 mm fokallinser (TL1 och TL2, figur 1B,C) (se materialförteckning).
      OBS: Den förstorade bilden från rörlinserna bildas vid monokromatorns ingångsslits (MC, figur 1B, C), och rumsligt/frekvensupplösta data detekteras på en tvådimensionell CCD-detektor (CCD, figur 1B).
  5. SHG-läge
    1. För att växla till SHG-avbildning, blockera IR-strålen och vrid spektrografens gitter till 501.5 nm för att avbilda SHG-signalen.
  6. Brightfield-läge
    1. För att växla till optisk bildbehandling med ljusfält, slå på den vita ljuskällan (se materialförteckning). Flytta det integrerade skjutreglaget (I2PS, figur 1B) för att samla in ljusfältsbilder i motutbredningsriktningen, med bildobjektivet (RO) som kondensorobjektiv och kondensorobjektivet (SO) som bildobjektiv.
    2. Skapa en bild av den kollimerade utsignalen från brytningsobjektivet vid sensorplanet på en RGB-ljusfältskamera med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt rörlinssystem (se materialförteckning).

Figure 1
Figur 1: Multimodalt hyperspektralt VSFG-mikroskop. (A) Toppvy över kärnkonfigurationen. En 1025 nm pumplaser skickades till en OPA för att generera en avstämbar mid-IR-puls. Residualen på 1025 nm smalnade ofta av en etalon (E) och filtrerades rumsligt till en Gaussisk stråle av ett rumsligt filter (SFG). Mid-IR- och 1025 nm-strålar överlappas rumsligt vid en anpassad dikroisk spegel (DM) och leds genom det inverterade mikroskopet (boxat område i A). (B) De två strålarna skickas till en 325 Hz resonansstråleskanner monterad på ett integrerat 2-lägesreglage (I2PS), vilket möjliggör sömlös växling mellan ljusfält och icke-linjära optiska modaliteter. Mikroskopplattformen är utrustad med ett reflektivt baserat oändlighetskorrigerat Schwarzschild-objektiv (SO) som fungerar som en kondensor och ett brytningsbaserat oändlighetskorrigerat avbildningsobjektiv (RO) monterat på ett vertikalt nanopositioneringssteg (VNP) i z-axeln. SO:n fokuserar linjen av inkommande strålar som resonansstrålskannern reflekterar på provet medan RO samlar in VSFG-linjesektionen av signaler. Det är viktigt att finjustera z-axelns position för RO med 1 μm precision för att säkerställa att provet har det bästa fokalförhållandet för högkvalitativ avbildning. Den kollimerade linjen för VSFG-signalen riktas sedan till ett rörlinssystem som består av 2 tublinser (TL1 och TL2), vilket bildar en förstorad bild vid monokromatorns (MC) ingångsslits. Den frekvensupplösta spektralinjen avbildas sedan hyperspektralt på en laddningskopplad enhet (CCD). Efter att ha samlat in varje hyperspektrallinje skannas provet i axeln vinkelrätt mot skanningsaxeln för resonansstrålskannern med hjälp av NP. För att samla in ljusfältsbilder av provet flyttas I2PS till ljusfältspositionen och en spegel som fångar upp den vita ljuskällan (WLS) installeras. Ljuset fokuseras sedan av RO och avbildas av SO. En bild bildas sedan vid ljusfältskamerans (BC) sensorplan i toppen av det inverterade mikroskopet. C) Detaljerad bild av den optiska vägen genom området med rörlinsen in i MC och CCD. (D) Detaljerad bild av provområdet mellan SO och RO. Klicka här för att se en större version av denna figur.

2. Hyperspektral mikroskopinriktning och vertikal CCD-axel rumslig kalibrering

  1. Optimera grovt provplanets position (nanolägesställarens z-axel) med hjälp av ett standardprov av ZnO (1 μm tjock) mönsterförstoftning belagd med 15 mm x 15 mm x 0,170 mm ± 0,005 mm täckglas och föra det till ljusfältsfokus med hjälp av ljusfältsavbildningsmodaliteten.
    OBS: RO:s z-position samt inriktningen av det vita ljuset kan behöva justeras vid behov. En representativ bild av ZnO på glasmönstret som används för inriktningskalibrering visas i figur 2.
  2. Flytta I2PS tillbaka till den icke-linjära belysningsarmen och optimera samplingshöjden för den maximala icke-resonanta VSFG-intensiteten som genereras av ZnO-regionerna som observeras på CCD-kameran.
    OBS: RO:s z-position måste justeras för maximal intensitet. Man kan behöva iterera steg 2.1 och 2.2 några gånger innan den optimala höjden på exemplet och RO nås.
  3. Slå på resonansstrålskannern och samla in en rad av bilderna.
  4. Samla in bilder med icke-resonansintensitet genom att skanna provet vinkelrätt mot strålskannerns riktning. Ta vertikala segment av bilddata och fastställ förhållandet mellan pixel och mikron. (se figur 3 och dess förklaring).
    OBS: Derivatan av dessa linjesektioner analyseras för att producera den vertikala CCD-axelns pixel:mikron-förhållande som kommer att användas för framtida bilder.

Figure 2
Figur 2: Representativ bildkvalitet för grov justering av ljusfältsavbildningsmodaliteten för ett ZnO-mönster. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Arbetsflöde för kalibrering av vertikal axel. Den här figuren illustrerar hur man konverterar CCD-pixlarna till vertikala rumsliga dimensioner i μm-enheten. (A) En bild samlas in och rekonstrueras av det ZnO-mönstrade täckglaset. Sedan pixelavståndet från den ena till den andra kanten av mönstret (liten vertikal stapel i A). Eftersom ZnO-mönsterkorset är utformat för att ha en bredd på 25 μm kan man använda förhållandet mellan fysisk bredd och pixelbredd här för att beräkna det fysiska/pixeldimensionsförhållandet. En representativ kalibrerad bild med vertikal axel visas i (B). (C) Slutligen tas en vertikal del som indikeras av den röda linjen. (D) Derivatan av den vertikala skivan tas för att erhålla den rumsliga upplösningen. Derivatan av den vertikala skivan används för att erhålla den rumsliga upplösningen. Klicka här för att se en större version av denna figur.

3. Hyperspektral datainsamling

  1. Samla in spektra från en vertikal linje av VSFG-signalerna på CCD:n, vars spektra är spridda längs den horisontella axeln och rumsliga positioner registreras på CCD:ns vertikala axel.
    OBS: Detta resulterar i en tvådimensionell datauppsättning för ett enradigt avsnitt.
  2. Efter att provets linjesektion har hyperspektralt avbildats, skanna provet i axeln vinkelrätt mot linjeskanningsaxeln med hjälp av den tredimensionella nanolägesställaren (NP, figur 1).
    OBS: 3D-nanolägesställaren är viktig för hög precision och reproducerbarhet för att lokalisera provregioner (xy-plan) samt för att få provet i fokus (z-axel).
  3. Iterera mellan steg 3.1 och steg 3.2 för att samla in en VSFG hyperspektral bild.

4. Hyperspektral dataanalys

  1. Blanda spektralt data med hjälp av MatLabs bildverktygslåda arbetsflöde för hyperspektral avbildningsbibliotek41.
    OBS: Spektral avblandning korrelerar rumsliga platser till unika spektra. Matlab-kod för hyperspektral dataanalys finns i tilläggsfil 1.
    1. Skapa en 4-dimensionell hyperkub (x = spatial, y = spatial, z = frekvensberoende intensitet, ω = frekvens) med hjälp av hyperkubfunktionen i Matlabs bildbehandlingsverktygslåda hyperspektral bildbibliotek41.
    2. Identifiera antalet unika spektra med funktionen countEndmembersHFC med ett PFA-värde (sannolikhet för falsklarm) på 10-7.
    3. Identifiera unika spektra med hjälp av nfindr spektral unmixing-funktionen.
    4. Slutligen, med hjälp av sid-funktionen , associera varje pixel med ett av de unika spektra som identifierades i föregående steg.
      OBS: Ytterligare spektrala avblandnings- och matchningsmetoder kan göras med alternativa funktioner/algoritmer som erbjuds i MatLab Hyperspectral Imaging Library41.
  2. Anpassa summadata för varje enskilt blad till Voigt-funktionen42 (tilläggsfil 1).
    OBS: Lorentzisk funktion representerar den rena homogena linjeformgränsen, medan Gauss-funktionen härstammar från inhomogena gränser. I verkligheten kan systemen befinna sig i en kombination av homogena och inhomogena gränser, vilket kräver en Voigt-funktion - en vanlig metod för kondenserad fasspektroskopi, inklusive VSFG.

5. Geometrisk analys av provet

  1. Bestäm provernas geometri enligt proceduren som nämns i steg 5.2-5.3. I denna studie används SDS@2 β-CD som exempel. Härled de symmetritillåtna tensorelementen i χ(2) baserat på C 7-symmetrin för den molekylära underenheten i SDS@2 β-CD-mesoarkprovet.
    OBS: Den symmetri som tillåts χ(2) beror på symmetrin. För att beräkna den tillåtna icke-linjära känsligheten för vilken symmetri som helst, se referens43.
  2. Tillämpa Eulerrotationen27 för att relatera laboratorierammätningarna till den molekylära ramen.
    OBS: I fallet med SDS@2 β-CD leder dess C7-symmetri till åtta oberoende ekvationer som relaterar 8 utgångar (labbram χ(2)) till 8 indata (6 oberoende hyperpolariserbarhet β(2) och två vinklar: Θ, lutningsvinkeln i förhållande till provplanet för alla ark, och φ, arkets rotation i planet (figur 4)). Två ark används för att extrahera de gemensamma molekylära inriktningarna för de två arken. Förhållandet mellan φ1 och φ2 (rotationsvinkeln i planet för de två arken) kan extraheras från ljusfältsbilderna. I det aktuella exemplet är φ2 = φ1 + 60°. Det antas att alla molekylära enheter i samma vinkel, så Θ1 = Θ2. Detta resulterar i 11 okända (9 oberoende, inklusive 6 oberoende hyperpolariserbarhet β(2), Θ 1 och φ1, och det relativa täckningsförhållandet mellan ark N och de två beroende vinklarna, som är φ 2 och Θ 2) för 16 kända (8 labbrampolarisationer per ark och två ark).
  3. Relatera den polarisationsupplösta labramen χ(2) och molekylära ramhyperpolariserbarheten β(2) med en neural nätverksfunktionslösare.
    OBS: En detaljerad sammanfattning av detta tillvägagångssätt finns i referens27.
    1. Skapa en skiktad neural nätverksmodell i Python44med Keras som består av 200-100-50 nodstruktur och en hyperbolisk tangentaktiveringsfunktion.
    2. Skapa en slumpmässigt genererad matris på 100000 x 11 med värdena β(2), Θ 1, Θ 2, φ1, φ 2 och N. Beräkna motsvarande labbram 16 χ(2) med hjälp av ekvationen som bestäms i 5.2 genom Euler-rotationer.
    3. Använd de beräknade χ(2)-värdena (totalt 100 000 x 16 värden) som indata och lär dig att förutsäga 11 värden (β(2), Θ 1, Θ 2, φ1, φ 2 och N) när de får 16 χ(2)-värden.
    4. När du har tränat använder du en annan uppsättning med 1000 poster med både indata och utdata för att testa den tränade modellen. Förutsagda utdata och sanna utdata ska visa ett linjärt samband med en lutning på 1.
    5. Slutligen, tillför den experimentellt uppmätta χ(2) från två ark (varje ark har 8 χ(2 ) uppmätta) och använd den tränade modellen för att förutsäga lutningsvinkeln Θ, tillsammans med andra egenskaper.

Figure 4
Figur 4: Illustration av Eulertransformationen. (A) Illustration av Eulertransformationen mellan laboratoriekoordinaterna (XYZ) andra ordningens känslighet χ(2) och de molekylära koordinaternas (xyz) hyperpolariserbarhet βijk. z-y'-z'' Euler-rotation utförs på de molekylära koordinaterna, med φ som rotationsvinkeln i planet, θ som lutningsvinkeln och ψ som vridningsvinkeln. ψ är integrerad för godtyckliga vridvinklar runt molekylaxeln. φ är inte integrerad eftersom alla molekyler roterar till en specifik vinkel i förhållande till labbramen för att bilda de självmonterade arken. N är den relativa yttäckningen av de två plåtarna. (B) Visualisering av de lutande underenheterna som bildar ett ark som bestäms av det neurala nätverkets resultat. Denna siffra har modifierats från Wagner et al.27. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figure 5
Figur 5: Molekylstruktur, morfologi och potentiell orientering av SDS@β-CD. (A) Ovanifrån och (B) Sidovy kemisk struktur av SDS@β-CD. C) Representativ heterogen provfördelning av de mesoskaliga arken på provplanet. Den molekylära subenheten kan ha olika orienteringar och inriktning på substratet, vilket är okänt. Denna siffra har modifierats från Wagner et al.27. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Mikroskopets förmåga att skilja mellan unikt organiserade molekylstrukturer och isotrop bulk demonstreras med SDS@2 β-CD-prov23,34 (figur 5). I denna studie bereddes provet genom att tillsätta β-CD och SDS till avjoniserat vatten (DI) i förhållandet 2:1 tills de två lösta ämnena nådde en koncentration på 10 % m/m. Suspensionen värmdes sedan upp till klarhet och kyldes till rumstemperatur över natten. CuCl2 tillsattes i en koncentration av 1:10 CuCl2:SDS för att ställa in de elektrostatiska interaktionerna och blandningen fick sitta i 3-5 dagar för att SDS@2 β-CD meso-ark skulle bildas helt. Slutligen tillverkades isolerade mesoplattor genom att droppgjuta 5 μL av plåtupphängningen på en 15 mm x 15 mm x 0,170 mm ± 0,005 mm täckglas fäst på en spinnbestrykare som arbetar med 10 000 varv per minut.

De mesoskaliga arken bildades genom sin självorganisering med en specifik C7-symmetri. Ändå är det oklart om den molekylära orienteringen av den enskilda molekylära enheten i denna självorganisering, en grundläggande kunskap som kan påverka materialfunktionerna. (Figur 5C). VSFG-bilder av de självmonterade arken utspridda på ett täckglas togs (Figur 6A). Genom spektral identifiering (steg 4 Hyperspektral dataanalys) med hjälp av Matlabs hyperspektrala avbildningsfunktion fann man att alla ark kan kategoriseras i två typer, en med högre VSFG-intensitet (blå spektra i figur 6B och ark märkta med blått i figur 6A), och den andra med lägre intensitet. Genom att inspektera och jämföra med den optiska bilden (Figur 6C,D) verkade det stora arket i mitten av bilderna ha staplat dubbla ark, vilket tillskrev den mindre VSFG-intensiteten på grund av destruktiv interferens mellan de två olika orienteringsarken. Det enda arket fokuserades för att extrahera orienteringen av den enda molekylära enheten (blå i figur 6A). Två av arken (markerade med röda och blå rutor i figur 6A) mättes med olika VSFG-polarisationer, och spektra anpassades med hjälp av Voigt-funktionerna. Observera att VSFG-polarisationen beskrivs i ordersignalen, uppkonverteringen och MIR. SSP betyder till exempel P-polarisation av IR, S-polarisation av uppkonvertering och S-polarisation av signaler.

Figure 6
Figur 6: Polarisationsupplöst VSFG-bildöverlägg med ljusfältsmodalitet. (A) Polarisationsupplöst (SSS) hyperspektral VSFG-bild av SDS@2 β-CD. Lila och rosa färger representerar områden där olika spektra finns, och motsvarande spektra är plottade i (B), som är representativa spektra för enstaka pixlar med signal-brusförhållande för blå och magenta-spektra ~56 respektive ~26. Arken i de röda och blå lådorna analyseras explicit nedan för att extrahera supramolekylernas lutningsvinklar. (C) Ljusfältsbild av samma område som i (A). (D) VSFG hyperspektral bild överlagrad med en optisk bild av ett identiskt område. (E) Från vänster till höger: PPS-, PPP-, SSP- och SSS-polarisationsupplösta spektra summerade över 180 och 480 pixlar inom de två enskilda arken markerade i röda och blå rutor i (A). Alla spektra hade en dominant egenskap centrerad på cirka 2910 cm-1 och ett signal-brusförhållande i storleksordningen 1000. Spektra försågs med flera Voigt-funktioner, som representerades av de skuggade områdena, och användes för vidare orienteringsanalys. Denna siffra har modifierats från Wagner et al.27. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Sedan, för att extrahera de molekylära orienteringarna, bestämdes först den symmetritillåtna hyperpolariserbarheten, Equation 1 tillåten av symmetriurvalsregeln, med hjälp av den tidigare publicerade proceduren43. Sedan härleds förhållandet mellan labbramen och den molekylära ramen från Eulers rotation27. Lutningsvinkeln θ extraheras sedan med hjälp av den neurala nätverksmetoden som beskrivs ovan, och lutningsvinkeln befanns vara ~23° (figur 6).

Slutligen visas förmågan till multimodal avbildning i denna plattform37(figur 7). Här studeras tre olika prover, nämligen SDS@2 β-CD, kollagen och L-fenylalanyl-L-fenylalanin (FF), med mikroskop med ljusfälts-, SHG- och VSFG-avbildningsmodaliteter. Först och främst visade alla prover liknande morfologier över olika avbildningsmodaliteter. Både SHG och VSFG uppvisade intensitetsvariationer spatialt, vilket saknas i optiska bilder. Eftersom SHG och VSFG båda kräver ordnade icke-centrosymmetriska strukturer, kan variationen i signalintensitet komma från variationer i lokal molekylär ordning eller molekylära orienteringar. Till skillnad från SHG kan man ställa in MIR-strålen på VSFG så att den är i resonans med olika vibrationslägen. I det fall som visas här studerades CHx vibrationsmoder vid 3,5 μm och Amid-I-läge vid 6 μm. För FF erhölls VSFG-bilder med starka och enhetliga signaler, vilket tyder på en välordnad självmonterad struktur för alla vibrationsgrupper - vilket överensstämmer med dess kristallina natur. Däremot visade kollagenprovet en starkare VSFG-signal i CHx-regionen över amidregionen, vilket indikerar att proverna är flexibla och att deras vibrationsgrupper har olika ordningsgrader.

Figure 7
Figur 7: Multimodala bilder av tre olika prover. (En i-A iii) SDS@2 β-CD-ljusfält, SHG (PP-polarisation) respektive VSFG (PPP-polarisation) av 3,5 μm regionbilder. Icke-linjära bilder överlagras med ljusfältsbilder. Kemiska strukturer för SDS och 2β-CD visas i infällningen av etti. (B i-B iv) Frystorkat kollagenljusfält, SHG (PP-polarisation), VSFG (PPP-polarisation) i 3,5 μm respektive 6 μm regioner. Den kemiska strukturen hos den primära proteintrimeråterstoden av kollagen, som består av glycin, prolin och hydroxiprolin, visas i infällningen av Bi. (C i–Civ) FF ljusfält, SHG (PP-polarisation) och VSFG (PPP-polarisation) av 3,5 μm respektive 6 μm regioner. Den kemiska strukturen för FF-molekylära subenheter visas i infällningen av ci. Alla 6 μm-bilder är tagna under en miljö med renat kväveinstrument för att avlägsna dämpning från omgivande luftfuktighet. SDS@2 β-CD har ingen VSFG-avbildning vid 6 μm eftersom den inte har några Amid-grupper. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Tilläggsfil 1: Matlab-kod för hyperspektral dataanalys Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De mest kritiska stegen är från 1,42 till 1,44. Det är viktigt att rikta in objektivlinsen väl för en optisk rumslig upplösning. Det är också viktigt att samla in den utsända signalen, reläet och projicera skanningsstrålen som en linje vid ingångsslitsarna. Korrekta justeringar skulle garantera den bästa upplösningen och signal-brusförhållandet. För ett typiskt prov, som SDS@2 β-CD 100 μm x 100 μm ark, skulle en bild med bra upplösning (~1 μm upplösning) med ett högt signal-brusförhållande ta 20 minuter. Detta är redan snabbare än den tidigare versionen av instrumentet24,26. Ytterligare förbättring av datainsamlingshastigheten kan realiseras med en laser med högre repetitionshastighet.

Den nuvarande begränsningen är den rumsliga upplösningen, som skulle kunna förbättras ytterligare med ännu högre objektiv NA-optik och potentiella icke-linjära optikbaserade superupplösningstekniker45. Heterodyndetektion har tillämpats i VSFG-spektroskopi för att lösa dess fas och extrahera de molekylära orienteringarna 5,46,47,48. Detta är tekniskt genomförbart i vårt experiment. VSFG-avbildning är dock naturligt beroende av signalspridning från provet, vilket förvränger dess fas och därmed komplicerar relationerna mellan molekylär orientering och fasen för VSFG-signalen.

Att avbilda morfologin hos material med kemisk specificitet är utmanande eftersom många avbildningstekniker saknar molekylär känslighet. Snabb hyperspektral VSFG-mikroskopi fyller detta tomrum genom att undersöka molekylära vibrationssignaturer och avslöja molekylära anpassningar av mesoskalig organiserad materia som är viktiga inom materialvetenskap, kemi och biologi. I framtiden kommer belysningsoptikens reflekterande karaktär att göra det möjligt att integrera andra tekniker i kärninstrumentet, vilket ytterligare ökar dess kapacitet och möjliggör multimodala bilder av kemiska, biologiska och materialprover.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Instrumentutvecklingen stöds av Grant NSF CHE-1828666. ZW, JCW och WX stöds av National Institutes of Health, National Institute of General Medical Sciences, Grant 1R35GM138092-01. BY stöds av Youth Innovation Promotion Association, Chinese Academy of Sciences (CAS, 2021183).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x Camera Por Thorlabs WFA4100 connect a camera to a microscope or optical system
25.0 mm Right-Angle Prism Mirror, Protected Gold Thorlabs MRA25-M01 reflect light and produce retroreflection, redirecting light back along its original path
3” Universal Post Holder-5 Pack Thorlabs UPH3-P5 hold and support posts of various sizes and configurations
30 mm to 60 mm Cage Plate, 4 mm Thick Thorlabs LCP4S convert between a 30 mm cage system and a 60 mm cage system
500 mm Tall Cerna Body with Epi Arm Thorlabs CEA1500 provide the function of enabling top illumination techniques in microscopy
60 mm Cage Mounted Ø50.0 mm Iris Thorlabs LCP50S control the amount of light passing through an optical system
60 mm Cage Mounting Bracket Thorlabs LCP01B mount and position a 60 mm cage system in optical setups
Air spaced Etalon SLS Optics Ltd. Customized generate narrow-band 1030 nm light 
Cage Plate Mounting Bracket Thorlabs KCB2 hold and adjust mirrors at a precise angle
CCD Andor Technologies Newton  2D CCD for frequency and spatial resolution
Collinear Optical Parametric Amplifier Light Conversion Orpheus-One-HP Tunable MID light generator
Copper Chloride Thermo Fischer Scientific A16064.30 Self-assembly component
Customized Dichroic Mirror Newport Customized selectively reflects or transmits light based on its wavelength or polarization
Ext to M32 Int Adapter Thorlabs SM1A34 provide compatibility and facilitating the connection between components with different thread types
Infinity Corrected Refractive Objective Zeiss 420150-9900-000 Refractive Objective
Infinity Corrected Schwarzschild Objective Pike Technologies Inc. 891-0007 Reflective objective
Laser Carbide, Light-Conversion C18212 Laser source
M32x0.75 External to Internal RMS Thorlabs M32RMSS adapt or convert the threading size or type of microscope objectives 
M32x0.75 External to M27x0.75 Internal Engraving Thorlabs M32M27S adapt or convert the threading size or type of microscope objectives 
Manual Mid-Height Condenser Focus Module Thorlabs ZFM1030 adjust the focus of an optical element
Monochromator Andor Technologies Shamrock 500i Provides frequency resolution for each line scan
Motorized module with 1" Travel for Edge-Mounted Arms Thorlabs ZFM2020 control the vertical positon of the imaging objective
Nanopositioner Mad City Labs Inc. MMP3 3D sample stage
Resonant Scanner EOPC SC-25 325Hz resonant beam scanner
RGB Color CCD Camera Thorlabs DCU224C Brightfield camera, discontinued but other cameras will work just as well
RGB tube lens Thorlabs ITL200 white light collection
Right Angle Kinematic Breadboard Thorlabs OPX2400 incorporate a sliding mechanism with two fixed positions
Right Angle Kinematic Mirror Mount, 30 mm Thorlabs KCB1 hold and adjust mirrors at a precise angle
Right Angle Kinematic Mirror Mount, 60 mm Thorlabs KCB2 hold and adjust mirrors at a precise angle
SM2, 60 mm Cage Arm for Cerna Focusing Stage Thorlabs CSA2100 securely mount and position condensers
Snap on Cage Cover for 60 mm Cage, 24 in Long, Thorlabs C60L24 enclose and protect the components inside the cage
Sodium dodecyl sulfate Thermo Fischer Scientific J63394.AK Self-assembly component
Three-Chnnale Controller and Knob Box for 1" Cerna Travel Stages Thorlabs MCM3001 control ZFM2020
Tube lens Thorlabs LA1380-AB - N-BK7 SFG signal collection
Visible LED Set Thorlabs WFA1010 provide illumination in imaging setup
Whitelight Source Thorlabs WFA1010 Whitelight illumination source for brightfield imaging
WPH05M-1030 - Ø1/2" Zero-Order Half-Wave Plate, Ø1" Mount, 1030 nm  Thorlabs WPH05M-1030 alter the polarization state of light passing through it
WPLQ05M-3500 - Ø1/2" Mounted Low-Order Quarter-Wave Plate, 3.5 µm  Thorlabs WPLQ05M-3500 alter the polarization state of light passing through it
X axis Long Travel Steel Extended Contact Slide Stages Optosigma TSD-65122CUU positioning stages that offer extended travel in the horizontal (X) direction
XT95 4in Rail Carrier Thorlabs XT95RC4 mount and position optical components
X-Y Axis Translation Stage w/ 360 deg. Rotation Thorlabs XYR1 precise movement and positioning of objects in two dimensions, along with the ability to rotate the platform
XY(1/2") Linear Translator with Central SM1 Thru Hole Thorlabs XYT1 provide precise movement and positioning in two dimensions
Yb doped Solid State Laser Light Conversion CB3-40W Seed laser
β-Cyclodextrin Thermo Fischer Scientific J63161.22 Self-assembly component

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhu, X. D., Suhr, H., Shen, Y. R. Surface vibrational spectroscopy by infrared-visible sum frequency generation. Physical Review B. 35 (6), 3047-3050 (1987).
  2. Shen, Y. R. Surface properties probed by second-harmonic and sum-frequency generation. Nature. 337 (6207), 519-525 (1987).
  3. Li, Y., Shrestha, M., Luo, M., Sit, I., Song, M., Grassian, V. H., Xiong, W. Salting up of proteins at the air/water interface. Langmuir. 35 (43), 13815-13820 (2019).
  4. Wang, C., Li, Y., Xiong, W. Extracting molecular responses from ultrafast charge dynamics at material interfaces. Journal of Materials Chemistry C. 8 (35), 12062-12067 (2020).
  5. Nihonyanagi, S., Mondal, J. A., Yamaguchi, S., Tahara, T. Structure and dynamics of interfacial water studied by heterodyne-detected vibrational sum-frequency generation. Annual Review of Physical Chemistry. 64 (1), 579-603 (2013).
  6. Nihonyanagi, S., Yamaguchi, S., Tahara, T. Ultrafast dynamics at water interfaces studied by vibrational sum frequency generation spectroscopy. Chemical Reviews. 117 (16), 10665-10693 (2017).
  7. Singh, P. C., Nihonyanagi, S., Yamaguchi, S., Tahara, T. Ultrafast vibrational dynamics of water at a charged interface revealed by two-dimensional heterodyne-detected vibrational sum frequency generation. The Journal of Chemical Physics. 137 (9), 094706 (2012).
  8. Jubb, A. M., Hua, W., Allen, H. C. Environmental chemistry at vapor/water interfaces: insights from vibrational sum frequency generation spectroscopy. Annual Review of Physical Chemistry. 63 (1), 107-130 (2012).
  9. Ishiyama, T., Sato, Y., Morita, A. Interfacial structures and vibrational spectra at liquid/liquid boundaries: molecular dynamics study of water/carbon tetrachloride and water/1,2-dichloroethane interfaces. The Journal of Physical Chemistry C. 116 (40), 21439-21446 (2012).
  10. Sapi, A., Liu, F., Cai, X., Thompson, C. M., Wang, H., An, K., Krier, J. M., Somorjai, G. A. Comparing the catalytic oxidation of ethanol at the solid-gas and solid-liquid interfaces over size-controlled pt nanoparticles: striking differences in kinetics and mechanism. Nano Letters. 14 (11), 6727-6730 (2014).
  11. Chen, X., Wang, J., Sniadecki, J. J., Even, M. A., Chen, Z. Probing α-helical and β-sheet structures of peptides at solid/liquid interfaces with SFG. Langmuir. 21 (7), 2662-2664 (2015).
  12. Dramstad, T. A., Wu, Z., Gretz, G. M., Massari, A. M. Thin films and bulk phases conucleate at the interfaces of pentacene thin films. The Journal of Physical Chemistry C. 125 (30), 16803-16809 (2021).
  13. Xiang, B., Li, Y., Pham, C. H., Paesani, F., Xiong, W. Ultrafast direct electron transfer at organic semiconductor and metal interfaces. Science Advances. 3 (11), e1701508 (2017).
  14. Livingstone, R. A., Nagata, Y., Bonn, M., Backus, E. H. G. Two types of water at the water-surfactant interface revealed by time-resolved vibrational spectroscopy. Journal of the American Chemical Society. 137 (47), 14912-14919 (2015).
  15. Wagner, J. C., Hunter, K. M., Paesani, F., Xiong, W. Water capture mechanisms at zeolitic imidazolate framework interfaces. Journal of the American Chemical Society. 143 (50), 21189-21194 (2021).
  16. Montenegro, A., Dutta, C., Mammetkuliev, M., Shi, H., Hou, B., Bhattacharyya, D., Zhao, B., Cronin, S. B., Benderskii, A. V. Asymmetric response of interfacial water to applied electric fields. Nature. 594 (7861), 62-65 (2021).
  17. Nihonyanagi, S., Ishiyama, T., Lee, T., Yamaguchi, S., Bonn, M., Morita, A., Tahara, T. Unified molecular view of the air/water interface based on experimental and theoretical χ(2) spectra of an isotopically diluted water surface. Journal of the American Chemical Society. 133 (42), 16875-16880 (2011).
  18. Shen, Y. R., Ostroverkhov, V. Sum-frequency vibrational spectroscopy on water interfaces: polar orientation of water molecules at interfaces. Chemical Reviews. 106 (4), 1140-1154 (2006).
  19. Hosseinpour, S., Roeters, S. J., Bonn, M., Peukert, W., Woutersen, S., Weidner, T. Structure and dynamics of interfacial peptides and proteins from vibrational sum-frequency generation spectroscopy. Chemical Reviews. 120 (7), 3420-3465 (2020).
  20. Wang, H., Xiong, W. Vibrational sum-frequency generation hyperspectral microscopy for molecular self-assembled systems. Annual Review of Physical Chemistry. 72 (1), 279-306 (2021).
  21. Wang, H. -F., Velarde, L., Gan, W., Fu, L. Quantitative sum-frequency generation vibrational spectroscopy of molecular surfaces and interfaces: lineshape, polarization, and orientation. Annual Review of Physical Chemistry. 66 (1), 189-216 (2015).
  22. Inoue, K., Ahmed, M., Nihonyanagi, S., Tahara, T. Reorientation-induced relaxation of free oh at the air/water interface revealed by ultrafast heterodyne-detected nonlinear spectroscopy. Nature Communications. 11 (1), 5344 (2020).
  23. Wang, H., Gao, T., Xiong, W. Self-phase-stabilized heterodyne vibrational sum frequency generation microscopy. ACS Photonics. 4 (7), 1839-1845 (2017).
  24. Wang, H., Xiong, W. Revealing the molecular physics of lattice self-assembly by vibrational hyperspectral imaging. Langmuir. 38 (10), 3017-3031 (2022).
  25. Raghunathan, V., Han, Y., Korth, O., Ge, N. -H., Potma, E. O. Rapid vibrational imaging with sum frequency generation microscopy. Optics Letters. 36 (19), 3891 (2011).
  26. Wang, H., Wagner, J. C., Chen, W., Wang, C., Xiong, W. Spatially dependent h-bond dynamics at interfaces of water/biomimetic self-assembled lattice materials. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (38), 23385-23392 (2020).
  27. Wagner, J. C., Wu, Z., Wang, H., Xiong, W. Imaging orientation of a single molecular hierarchical self-assembled sheet: the combined power of a vibrational sum frequency generation microscopy and neural network. The Journal of Physical Chemistry B. 126 (37), 7192-7201 (2022).
  28. Han, Y., Hsu, J., Ge, N. -H., Potma, E. O. Polarization-sensitive sum-frequency generation microscopy of collagen fibers. The Journal of Physical Chemistry B. 119 (8), 3356-3365 (2015).
  29. Chung, C. -Y., Potma, E. O. Biomolecular imaging with coherent nonlinear vibrational microscopy. Annual Review of Physical Chemistry. 64 (1), 77-99 (2013).
  30. Potma, E. O. Advances in vibrationally resonant sum-frequency generation microscopy. Optics in the Life Sciences Congress. , OSA: Washington, DC, 2017. p NM4C.2 (2017).
  31. Han, Y., Raghunathan, V., Feng, R. R., Maekawa, H., Chung, C. -Y. Y., Feng, Y., Potma, E. O., Ge, N. -H. H. Mapping molecular orientation with phase sensitive vibrationally resonant sum-frequency generation microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 117 (20), 6149-6156 (2013).
  32. Hsu, J., Haninnen, A., Ge, N. -H., Potma, E. O. Molecular imaging with sum-frequency generation microscopy. Optics in the Life Sciences. , OSA: Washington, DC, 2015. p NT4C.4 (2015).
  33. Hanninen, A., Shu, M. W., Potma, E. O. Hyperspectral imaging with laser-scanning sum-frequency generation microscopy. Biomedical Optics Express. 8 (9), 4230 (2017).
  34. Wang, H., Chen, W., Wagner, J. C., Xiong, W. Local ordering of lattice self-assembled SDS@2β-CD materials and adsorbed water revealed by vibrational sum frequency generation microscope. The Journal of Physical Chemistry B. 123 (29), 6212-6221 (2019).
  35. Cimatu, K., Baldelli, S. Chemical imaging of corrosion: sum frequency generation imaging microscopy of cyanide on gold at the solid−liquid interface. Journal of the American Chemical Society. 130 (25), 8030-8037 (2008).
  36. Shah, S. A., Baldelli, S. Chemical imaging of surfaces with sum frequency generation vibrational spectroscopy. Accounts of Chemical Research. 53 (6), 1139-1150 (2020).
  37. Wagner, J. ackson C., Zishan, W. u, Xiong, W. Multimodal nonlinear vibrational hyperspectral imaging. ChemRxiv. , (2023).
  38. Yan, C., Wagner, J., Wang, C., Ren, J., Lee, C., Wan, Y., Wang, S., Xiong, W. Multi-dimensional widefield infrared-encoded spontaneous emission microscopy: distinguishing chromophores by ultrashort infrared pulses. ChemRxiv. , (2023).
  39. Lin, Y., Fromel, M., Guo, Y., Guest, R., Choi, J., Li, Y., Kaya, H., Pester, C. W., Kim, S. H. Elucidating interfacial chain conformation of superhydrophilic polymer brushes by vibrational sum frequency generation spectroscopy. Langmuir. 38 (48), 14704-14711 (2022).
  40. Choi, J., Lee, J., Makarem, M., Huang, S., Kim, S. H. Numerical simulation of vibrational sum frequency generation intensity for non-centrosymmetric domains interspersed in an amorphous matrix: a case study for cellulose in plant cell wall. The Journal of Physical Chemistry B. 126 (35), 6629-6641 (2022).
  41. Matlab Image Processing Toolbox Hyperspectral Imaging Library. , The Mathworks, Inc., Natick, MA USA. Google Scholar Forthcoming.
  42. Armstrong, B. H. Spectrum line profiles: the Voigt function. Journal of Quantitative Spectroscopy and Radiative Transfer. 7 (1), 61-88 (1967).
  43. Wu, Z., Xiong, W. Neumann's principle based eigenvector approach for deriving non-vanishing tensor elements for nonlinear optics. The Journal of Chemical Physics. 157 (13), 134702 (2022).
  44. Chollet, F. Keras Neural Network Library. https://github.com/fchollet/keras accessed Apr 12. , (2021).
  45. Vicidomini, G., Bianchini, P., Diaspro, A. STED super-resolved microscopy. Nature Methods. 15 (3), 173-182 (2018).
  46. Xiong, W., Laaser, J. E., Mehlenbacher, R. D., Zanni, M. T. Adding a dimension to the infrared spectra of interfaces using heterodyne detected 2D sum-frequency generation (HD 2D SFG) spectroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (52), 20902-20907 (2011).
  47. Lukas, M., Backus, E. H. G., Bonn, M., Grechko, M. Passively stabilized phase-resolved collinear sfg spectroscopy using a displaced sagnac interferometer. The Journal of Physical Chemistry A. 126 (6), 951-956 (2022).
  48. Ji, N., Ostroverkhov, V., Chen, C., Shen, Y. Phase-sensitive sum-frequency vibrational spectroscopy and its application to studies of interfacial alkyl chains. Journal of the American Chemical Society. 129 (33), 10056-10057 (2007).

Tags

Kemi utgåva 202 infraröd avbildning icke-linjär optik struktur-egenskap självorganisering vibrationsgenerering av summafrekvenser summafrekvensgenereringsmikroskopi hyperspektral avbildning materialkarakterisering hierarkisk organisation
Multimodal icke-linjär hyperspektral kemisk avbildning med hjälp av linjeskanningsvibrationssummafrekvensgenereringsmikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wagner, J. C., Yang, B., Wu, Z.,… More

Wagner, J. C., Yang, B., Wu, Z., Xiong, W. Multimodal Nonlinear Hyperspectral Chemical Imaging Using Line-Scanning Vibrational Sum-Frequency Generation Microscopy. J. Vis. Exp. (202), e65388, doi:10.3791/65388 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter