Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Nötrofil fonksiyonuna hızlı bir genel bakış için bir dizi tarama tekniği

Published: February 9, 2024 doi: 10.3791/65329
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1, 1
1Laboratory of Protein Chemistry and Biochemistry, Department of Cell Biology, University of Brasilia, 2Institute of Physics, University of Brasilia

Summary

Bu protokol, farklı sinyal yollarından gelen fonksiyonları kapsamak için bir tarama yöntemi olarak kullanılacak bir dizi nötrofil fonksiyonel tahlil içerir. Protokol, hücre canlılığının, saflığının, reaktif oksijen türlerinin üretiminin, gerçek zamanlı göçün, fagositozun ve nötrofil hücre dışı tuzakların bir ön önerisinin ilk ve basit bir değerlendirmesini içerir.

Abstract

Nötrofiller, doğuştan gelen bağışıklık tepkisinde ilk savunma hatlarından biri olarak bilinir ve kemotaksis, ters göç, fagositoz, sitotoksik enzimlerin ve metabolitlerin degranülasyonu ve DNA'nın nötrofil hücre dışı tuzaklar (NET'ler) olarak salınması gibi birçok özel hücresel işlevi yerine getirebilir. Nötrofiller sadece kendilerini sıkı bir şekilde düzenlemekle kalmaz, aynı zamanda bağışıklık sisteminin diğer bileşenlerinin düzenlenmesine de katılırlar. Taze nötrofiller terminal olarak farklılaştığından, kısa ömürlü olduğundan ve bireyler arasında oldukça değişken olduğundan, toplanan örneklerden en iyi şekilde yararlanmak önemlidir. Araştırmacıların, değerlendirilen belirli koşullardan etkilenebilecek birçok nötrofil fonksiyonuna genel bir bakışı değerlendirmek için genellikle tarama testleri yapmaları gerekir. Bu ihtiyacı karşılamak için normal yoğunluktaki nötrofillerin tek bir izolasyon sürecini takip eden bir dizi test geliştirildi ve hız, kapsamlılık, maliyet ve doğruluk arasında bir denge arandı. Sonuçlar, derinlemesine takip çalışmalarına akıl yürütmek ve rehberlik etmek için kullanılabilir. Bu prosedür ortalama 4 saat içinde gerçekleştirilebilir ve hücre canlılığının, reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretiminin, gerçek zamanlı göçün ve cam slaytlar üzerinde mayanın fagositozunun değerlendirilmesini içerir ve omik çalışmalar gibi daha ayrıntılı yaklaşımlar için yeterli hücre bırakır. Ayrıca, prosedür, ışık mikroskobu ile gözlenen hızlı panoptik boyamadan sonra, bu şekilde daha fazla çabanın faydalı olup olmayacağını belirtmek için yeterli olsa da, spesifik belirteçlerin eksikliği ile NET'lerin bir ön önerisini kolayca gözlemlemenin bir yolunu içerir. Test edilen fonksiyonların çeşitliliği, testler arasındaki ortak noktaları birleştirerek analiz süresini ve masraflarını azaltır. Prosedür NeutroFun Screen olarak adlandırıldı ve sınırlamaları olmasına rağmen, yukarıda belirtilen faktörleri dengeler. Ayrıca, bu çalışmanın amacı kesin bir test seti değil, her laboratuvarın kaynaklarına ve taleplerine göre kolayca ayarlanabilen bir kılavuzdur.

Introduction

Nötrofiller, insan kanında en bol bulunan doğuştan gelen bağışıklık hücreleridir ve enfeksiyon ve iltihaplanmada önemli bir rol oynadıkları bilinmektedir ve doku hasarıbölgesine ilk ulaşan ilk müdahale ekipleridir 1. Son yıllarda, nötrofillerin çeşitli hastalıklarda ve homeostazı desteklemede oynadığı önemli rol giderek daha fazla kabul görmektedir2. Nötrofiller sadece kendilerini sıkı bir şekilde düzenlemekle kalmaz, aynı zamanda bağışıklık sisteminin diğer bileşenlerinin düzenlenmesine de katılırlar 3,4,5. Bu nedenle, nötrofillerin ve kemotaksis, ters göç6, fagositoz7, solunum patlaması8 ve nötrofil hücre dışı tuzakların (NET'ler) salınması7 gibi birçok olağandışı hücresel fonksiyonlarının araştırılması, analiz edilen belirli koşullar tarafından tetiklenen potansiyel nötrofil fonksiyonel, morfolojik veya moleküler değişikliklerin değerlendirilmesinin gerekli olduğu çok sayıda araştırma bağlamında zorunludur.

Yeni izole edilmiş nötrofiller terminal olarak farklılaşır, kısa ömürlüdür, oldukça dinamiktir ve kolayca aktive olur9. Bununla birlikte, nötrofil yanıtlarını etkilemeyen verimli bir depolama yöntemi henüz elde edilememiştir, bu da kesintisiz olması gereken çoklu tahlillerin gerçekleştirilmesini zorlaştırmaktadır. Ayrıca, sitometri ve/veya floresan boyama gerektiren tahlillere dayanan daha önce açıklanan fonksiyonel analizler10,11, nötrofilin geniş ve ilk değerlendirmesine ihtiyaç duyulduğunda uygun bir seçim olmayabilir.

Bu sorunları ele almak için bu protokol, hücre canlılığının, reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretiminin, gerçek zamanlı göçün ve fagositozun değerlendirilmesi de dahil olmak üzere tek bir izolasyon sürecini takiben gerçekleştirilebilecek bir dizi testi açıklar. NeutroFun Screen adı verilen bu prosedür, degranülasyon hariç önde gelen efektör aktivitelerini kapsayacak şekilde tasarlanmıştır ve 1 saatlik aktivasyon dahil olmak üzere ortalama 4 saatlik bir sürede tamamlanabilir. Ek olarak, kalan hücreler omik çalışmaları gibi daha ayrıntılı yaklaşımlar için kullanılabilir. Bu yöntemin avantajı, hız, kapsamlılık, maliyet ve doğruluk arasındaki dengede yatmaktadır.

Ayrıca, NET'lerin bir ön önerisini kolayca gözlemlemenin bir yolu vardır, belirli belirteçler olmadan, ancak bu yönde daha fazla çabanın yararlı olup olmayacağını belirtmek için yeterlidir. Test edilen fonksiyonların çeşitliliği, testler arasındaki ortak noktaları birleştirmeyi, analiz süresini ve masraflarını azaltmayı amaçlar. Bu yöntemin temel amacı, nötrofilin tepkisine genel bir bakışa izin veren hız, kapsamlılık, maliyet ve doğrulukla ilgili dengeli, işlevsel bir analiz sağlamak ve yeni uyaranların normal yoğunluklu nötrofiller üzerindeki etkilerini araştırmada yararlı bir ilk adım haline getirmektir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm deneyler, Brasilia Üniversitesi'ndeki kurumsal inceleme kurulu tarafından belirlenen etik yönergeleri sıkı bir şekilde takip etti (süreç 13364819.0.0000.5558) ve örnekler, bağışçı anonimliğini sağlamak için kodlarla tanımlandı. Hücreler, bilgilendirilmiş onam belgesini imzalayan ve aşağıdaki uygunluk kriterlerini karşılayan 18-35 yaşları arasındaki normal sağlıklı erkek donörlerden elde edildi: sigara içmeyenler / gazeteler, kronik sağlık sorunları yok ve son 14 gün içinde inflamatuar durum öyküsü yok.

1. Kan alma

  1. Heparinlemek için 0.3 mL 5.000 IU / mL heparini (Malzeme Tablosuna bakınız) steril 20 mL'lik bir şırıngaya aseptik olarak yerleştirin.
  2. Delinme bölgesinin yaklaşık 4 inç yukarısında bir venöz turnike uygulayın ve venipunktur için medyan kübital veya sefalik veni tanımlayın.
    NOT: Toplam turnike süresinin 1 dakikayı geçmemesine dikkat edin.
  3. Delinme bölgesini %70 alkolle temizleyin ve damar delme işlemini gerçekleştirin.
  4. Kanı ve heparini düzgün bir şekilde karıştırmak için kanı topladıktan sonra şırıngayı üç veya dört kez hafifçe ters çevirin.

2. Nötrofil izolasyonu

NOT: Polimorfonükleer lökositler (PMN'ler), daha önce tarif edildiği gibi11 bazı değişikliklerle kalan kırmızı kan hücrelerinin (RBC) hipotonik lizizini takiben yoğunluk gradyan santrifüjlemesi yoluyla izole edilir. Bu yöntem, tarama testlerini gerçekleştirmek için zorunlu değildir ve seçilen yöntem% >97'lik bir canlılık, PMN'lerin% <3'ünün hazırlanması veya aktivasyonu ile sonuçlandığı ve tüm testler için yeterli hücre sağladığı sürece değiştirilebilir. Hücre aktivasyonunu önlemek için bu adımların aseptik koşullar altında gerçekleştirilmesi ve endotoksin içermeyen solüsyonların kullanılması zorunludur.

  1. 50 mL'lik konik tüplerde %60 ve %70 ayırma ortamının (ticari olarak temin edilebilir; Malzeme Tablosuna bakınız) 12 mL dilüsyonları yapın.
  2. 5 mL'lik bir pipet kullanarak, %70 seyreltme üzerine %60 seyreltme seferinde 4 mL ekleyerek gradyanı aşağıdan yukarıya hazırlayın. Arayüzün karışmasını önlemek için bunu nazikçe yapın.
  3. Yoğunluk gradyanının üzerine dikkatlice 12 mL heparinize kan katmanlayın. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
    NOT: Bu adımdan itibaren, PMN aktivasyonuna kadar, kullanılan tüm reaktifler ve tüpler buzla dolu bir soğutucuda tutulmalıdır.
  4. Plazma / mononükleer hücre tabakasını atın, ardından eritrosit peletinin üzerindeki tabakayı, her birinde yaklaşık 7,5 mL olan iki adet 15 mL'lik konik tüpe yavaşça aktarın. Tüp hacmini Hank'in dengeli tuz çözeltisi ile tamamlayın (HBSS; Malzeme Tablosuna bakınız).
  5. 19 °C'de 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
  6. Hücre peletini HBSS ile yıkayın.
    1. Tüpü dökerek süpernatanı atın ve peleti 7 mL HBSS'de yavaşça yeniden süspanse edin.
    2. Tüm ayırma ortamını çıkarmak için 300 x g'da 19 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
  7. Kalan RBC'lerin hipotonik lizizini gerçekleştirin.
    1. Süpernatanı atın ve peletleri tek bir tüpte birleştirin.
    2. RBC / PMN peletini 3 mL sterilH2Oiçinde yeniden süspanse edin ve ozmolariteyi eski haline getirmek için 25 saniye içinde 3 mL HBSS (2x) ekleyin. Ardından, 19 °C'de 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
    3. Beyaz, eritrosit içermeyen bir pelet için 2.8.1 ve 2.8.2 adımlarını tekrarlayın.
      NOT: Nötrofillerin RBC yıkım ürünleri ile temasını en aza indirmek için süpernatan mümkün olan en kısa sürede çıkarılmalıdır. Alternatif olarak, ikinci hipotonik lizis, kalan RBC tabakasının nazikçe yeniden süspanse edilmesi ve kalan RBC'ler PMN peletinin üzerinde çökeleceğinden, tüm süpernatanın çıkarılmasıyla değiştirilebilir.
  8. Tüpü dökerek süpernatanı atın, kalan tampondaki PMN'leri yavaşça yeniden süspanse edin ve buz gibi soğuk bir mikrotüpe aktarın.
    NOT: Yeniden askıya alınan hücreleri bir mikropipetle aktarırken hacme açıklama eklediğinizden emin olun.
  9. Hücre süspansiyonunun 3 x 1 μL'sini temiz bir cam slayta (her biri 1 μL'lik üç oyuk) aktarın ve morfoloji ve saflık değerlendirmesi için hızlı panoptik ile boyayın (Malzeme Tablosuna bakınız)12.
    1. Hızlı panoptik ile boyamak için, slaytı beş kez panoptik fiksatif n° 1'e, altı kez eozin n° 2'ye ve iki kez hematoksilen n° 3'e daldırın ve her daldırma 1 saniye sürer.
    2. Cam sürgüyü damıtılmış suyla nazikçe yıkayın.
    3. Süzülmesine ve kurumasına izin verin.
  10. Mikroskop altında gözlemleyin ve her kuyucukta 300 rastgele hücre sayın, böylece nötrofilleri diğer granülositlerden ayırt edin.
  11. 1 μL hücre süspansiyonunu 49 μL% 0.2 tripan mavisi boyasına13 aktarın ve ölü ve canlı hücreler arasında ayrım yapan bir Neubauer odası kullanarak hücreleri sayın.
  12. Kalsiyum ve magnezyum ile desteklenmiş %50 otolog plazma ve %50 HBSS çözeltisi kullanarak hücre konsantrasyonunu 6.667 hücre/μL'ye ayarlayın. 6.667 hücre/μL süspansiyonu, negatif kontrol de dahil olmak üzere test edilecek koşullara karşılık gelen mikrotüpler arasında eşit olarak bölün.
    NOT: Model organizmada dolaşımdaki nötrofillere benzer herhangi bir hücre konsantrasyonu kullanılabilir, ancak tekrarlanabilirlik için tüm deneylerde aynı hücre konsantrasyonunun kullanılması önemlidir.

Figure 1
Resim 1: Nötrofil izolasyon protokolü. Ayırma ortamının (percoll) (A) iki konsantrasyonu istiflenir (B), daha sonra kan, ayırma gradyanının (C) üzerine katmanlanır. Santrifüjlemeden sonra PMN, iki adet 15 mL'lik tüpe (E) bölünmüş merkezi katmandadır (D). Hücre süspansiyonu HBSS'de iki kez yıkanır ve ortamı çıkarmak için santrifüjlenir (GI), daha sonra hücreler yeniden süspanse edilir ve artık RBC'ler iki tur hipotonik lizise (JM) gönderilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. Nötrofil aktivasyonu için hazırlık

  1. 1.5 mL'lik mikrotüplerde, nihai hücre konsantrasyonu 6.600 hücre / μL olacak şekilde her koşul için bir aktivasyon sistemi hazırlayın. Örneğin, 100 nM fMLP'nin (N-formil-metiyonil-lösil-fenilalanin; bkz. Malzeme Tablosu) etkilerini test etmek için, 6.667 hücre/μL süspansiyonun 495 μL'sine 5 μL 10 μM fMLP ekleyin. Negatif (uyarılmamış) kontrol için, Ca2 + ve Mg2 + içeren HBSS ekleyin.
    NOT: Bu metodolojiyi göstermek için, uyaranların aşağıdaki nihai konsantrasyonları kullanılmıştır: 100 nM fMLP, 16 μM fallaxin, doğal olarak oluşan bir antimikrobiyal peptit14 ve 100 nM PMA (forbol 12-miristat 13-asetat) (bkz.
  2. Dönmeden 37 °C'de inkübe edin.
    NOT: Fonksiyonel tahliller için tüm alikotlar, bundan sonra aktivasyon sistemi olarak anılacak olan bu hücre süspansiyonundan alınır.

4. ROS üretimini değerlendirmek için nitrotetrazolyum mavi klorür (NBT) testi

  1. NBT çalışma çözümünün hazırlanması: Her deneysel koşul için, aşağıdaki adımları kullanarak 6 mM'lik bir NBT ( Malzeme Tablosuna bakınız) çalışma çözümü hazırlayın:
    1. 0.0005 g NBT'yi 10 μL dimetil sülfoksit (DMSO) içinde çözün ve en az 15 dakika vorteksleyin.
    2. 90 μL HBSS Ca2 + Mg2 + ekleyin ve 2 dakikaya kadar girdap yapın.
      NOT: NBT ile ilgili tüm adımlar karanlıkta gerçekleştirilmelidir.
  2. NBT slayt testi gerçekleştirin.
    1. 20 dakikalık hücre aktivasyonundan sonra, hücre süspansiyonunu yavaşça karıştırın ve 2 μL PMN'yi dikkatlice temiz bir cam slayta aktarın. 37 °C'de nemlendirilmiş bir odada 20 dakika inkübe edin.
      NOT: Hücre süspansiyonunu kızağın üzerine çok fazla yaymayın; Aksi takdirde inkübasyondan önce kuruyabilir.
    2. Hücrelerin üzerine 1 μL NBT çalışma solüsyonu ekleyin ve ışıktan korunarak 20 dakika daha inkübe edin.
    3. Slaytı sıcak hava ile kurutun ve her bir kuyucuğa 1 dakika boyunca bir damla metanol ile sabitleyin. 1 dakika boyunca% 0.03 safranin ile boyayın ( Malzeme Tablosuna bakınız).
    4. Cam sürgüyü damıtılmış suyla nazikçe yıkayın.
    5. Slaytın kurumasını bekleyin ve mikroskop altında gözlemleyin.
    6. Her kuyucukta 100 rastgele hücre sayın, nötrofilleri formazan birikintileri olan ve olmayan ayırt edin.
  3. NBT spektrofotometri testi gerçekleştirin.
    1. 40 dakikalık hücre aktivasyonundan sonra, hücre süspansiyonunu yavaşça karıştırın ve aktivasyon sisteminden 90 μL PMN'yi temiz bir mikrotüpe aktarın. Ardından, 6 mM NBT çözeltisinden 20 μL'yi dikkatlice ekleyin. Karanlıkta 37 °C'de 20 dakika inkübe edin.
    2. 100 μL %10 Sodyum dodesil sülfat (SDS; Malzeme Tablosuna bakınız) ve girdap ekleyin.
    3. % 60'lık bir genlikte bir uç-sonicator kullanarak, her biri 15 s aralıklarla 15 s'lik beş döngü kullanarak sonikate. 5 dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüjleyin.
    4. Süpernatantın 60 μL'sini şeffaf tabanlı 96 oyuklu bir plakaya aktarın ve formazan ürününün emilimini 570 nm'de ölçün.

5. Fagositoz testi

  1. Aşağıda açıklandığı gibi her koşul için 33.000 maya/μL süspansiyon hazırlayın:
    1. 200 μL HBSS Ca2 + Mg2 + 'ya yaklaşık 0.75 mg kuru maya (Saccharomyces cerevisiae; Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve bir termomikserde 100 ° C'de 500 rpm ile en az 15 dakika inkübe edin.
    2. Karışımı vorteksleyerek homojenize edin ve 5 μL maya süspansiyonunu 45 μL %0.2 tripan mavisi boyaya aktarın. Bir Neubauer odası kullanarak mayaları sayın.
    3. HBSS Ca2 + Mg2 + kullanarak ilk süspansiyonun konsantrasyonunu 33.000 maya hücresi / μL'ye ayarlayın. Süspansiyonu kullanana kadar buz üzerinde tutun.
  2. 20 dakikalık hücre aktivasyonundan sonra, hücre süspansiyonunu yavaşça karıştırın ve aktivasyon sisteminin 5 μL'sini yeni bir steril mikrotüp içinde 33.000 maya / μL Saccharomyces cerevisiae süspansiyonunun 5 μL'sine aktarın.
    NOT: Nötrofil/maya oranı 1:5'tir (PMN:maya).
  3. Hemen 6 μL PMN/maya süspansiyonunu temiz bir cam lamın (her biri 2 μL) üç kuyucuğuna aktarın ve slaydı nemlendirilmiş bir odada 40 dakika inkübe edin.
    NOT: Hücre süspansiyonunu kızağın üzerine çok fazla yaymayın; Aksi takdirde, inkübasyondan önce kuruyabilir.
  4. Slaytı sıcak hava altında kurutun ve yukarıdaki adım 2.9'da açıklandığı gibi hızlı panoptik ile boyayın.
    NOT: Hızlı panoptik boyamanın üçüncü adımı, lamın mikroskopi analizi için kritik öneme sahiptir. Bu adımda lamı ≥3 saniye boyamak, mayayı nötrofil nükleer loblarından ayırt etmek zor olacağından, analiz için uygun olmayabilir.
  5. Slaytları mikroskop altında gözlemleyin, her kuyucuğun 100 rastgele nötrofilini sayın ve fagositoz için PMN'ler pozitif ve negatif arasında ayrım yapın.
    NOT: PMN hücresel zarı içinde veya onunla doğrudan temas halinde olan en az bir maya partikülü, fagositoz için bir PMN pozitif olduğunu gösterir. Maya / nötrofil oranıyla ilgileniyorsanız, yutulan maya parçacıklarının sayısını da sayın.

6. Gerçek zamanlı PMN kemotaksis testi

NOT: Migrasyon testi, aşağıdaki uyarlamalarla önceki15'te açıklanan protokole benzer şekilde gerçekleştirilir:

  1. Empedans tabanlı gerçek zamanlı hücre analizörü (RTCA) plakasının alt odasına 160 μL kemoatraktan (örneğin, fMLP, IL-8, C5 veya LTB4; Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyerek kemotaktik gradyanı hazırlayın. Negatif kontroller ve boşluklar için 160 μL HBSS Ca2 + Mg2 + ekleyin.
  2. Üst bölmeyi takın ve 25 μL HBSS Ca2 + Mg2 + ekleyin. Kemotaktik gradyanı oluşturmak için oda sıcaklığında en az 1 saat inkübe edin.
  3. 60 dakikalık hücre aktivasyonundan sonra, hücre süspansiyonunu yavaşça karıştırın ve üst bölmeye 60 μL hücre süspansiyonu yerleştirin. Boşluğa 60 μL HBSS Ca2 + Mg2 + ekleyin.
  4. RTCA plakasını yerleştirin ve RTCA yazılımını 2 saat boyunca her 60 saniyede bir hücre indeksini (CI) ölçecek şekilde programlayın.
    NOT: RTCA plakaları, daha önce açıklandığı gibi yeniden kullanım için yıkanabilir16. Özetle, RTCA odalarını ve elektrotlarını üç kez fosfat buferred salin (PBS) ile, ardından iki kez tip I ultra saf su ile yıkayın. Alt ve üst hazneyi %0.25 tripsin 0.53 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile 40 dakika inkübe edin. Üç kez ultra saf suyla yıkayın.

7. NET müstehcen tahlil

  1. 10 dakikalık hücre aktivasyonundan sonra, hücre süspansiyonunu nazikçe karıştırın ve değerlendirilmekte olan her aktivasyon sisteminden 4 μL PMN'yi temiz bir cam slaytın iki kuyucuğuna bölünerek aktarın. Nemlendirilmiş bir odada 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
  2. Kuyucuklardan birine 1 μL DNAse I ekleyin ve 37 ° C'de (ıslak bir odada) 20 dakika inkübe edin.
  3. Slaytı kurutun ve daha önce "nötrofil izolasyonu" bölümünün 2.9 adımında açıklandığı gibi hızlı panoptik ile boyayın.
  4. Slaytları mikroskop altında değerlendirin.
    NOT: Web benzeri yapıların varlığı ile karakterize edilen NET sürümünün herhangi bir belirtisini arayın. Tanımlandıktan sonra, DNAse I tedavisinin bu tür yapıları kaldırıp kaldıramayacağını doğrulayın. Bu test, varlıklarını doğrulamak için ek testler gerektiğinden, NET oluşumunu düşündürür.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu çalışmada kullanılan yoğunluğa dayalı izolasyon yöntemi (Şekil 1), önerilen deneyler için kriterleri karşılamıştır. Bu yöntemden elde edilen nötrofil parametreleri, canlılık ≥%98, saflık ≥%94 ve hücre verimi ≥1.5 x 107 olup, tarama testleri ile aktivasyon saptanmamıştır. PMN'lerin izolasyonunda iki önemli adım, antikoagülasyon ve RBC'nin uzaklaştırılmasıdır. Antikoagüle kan tüpünü veya şırıngayı yoğunluk gradyanı üzerine katmanlamadan önce hafif bir sallanmada tutmak ve hem aktivasyonu hem de kontaminasyonu önlemek için bir RBC giderme yöntemi seçmek, deney verimini ve tekrarlanabilirliğini etkileyebilir.

Nötrofil fonksiyonunun fonksiyonel genel bakışını değerlendirmek için, önerilen tarama testlerinin en az iki araştırmacı ile ortalama 4 saat sürede, 1 saat aktivasyon ve 2 saat gerçek zamanlı migrasyon izleme ile gerçekleştirilmesine izin veren bir iş akışı geliştirilmiştir.

Figure 2
Şekil 2: NeutroFun Screen iş akışı. NeutroFun Screen iş akışı, değerlendirilen belirli koşullar tarafından tetiklenen işlevsel yanıtlar panelini değerlendirmek için en az iki araştırmacının katılımını içerir. Araştırmacı 1 (R1) PMN izolasyon sürecini başlatır, ardından hücre konsantrasyonu ayarlaması ve aktivasyon sistemi inkübasyonu yapılırken, paralel olarak araştırmacı 2 (R2) ikisi arasında bölünmüş olan sonraki tahlilleri gerçekleştirmek için materyalleri hazırlar: R1 fagositoz, NET ve spektrofotometrik NBT tahlilleri gerçekleştirir; R2, gerçek zamanlı geçiş ve NBT slayt testleri gerçekleştirir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Klasik NBT testi17, NBT'nin PMN'ler tarafından üretilen ROS ile reaksiyonundan kaynaklanan formazan oluşumunun hem slayt hem de spektrofotometrik değerlendirmesi için optimize edilmiştir. Spektrofotometrik tahlil, koşullar arasında nispi nicelemeye izin verirken, mikroskopi tahlili, kristal dağılımının, morfolojinin ve formazan içeren hücre sayısının düzenliliğini değerlendiren tanımlayıcı ve yarı kantitatif analiz için yararlı olmuştur. Spektrofotometrik testin sonuçları Şekil 3A'da gösterilmiştir, bu da 100 nM PMA'nın fMLP ve kontrol gruplarına kıyasla yüksek ROS üretimini (ortalama 3: 2: 1 oranında) indüklediğini göstermektedir. NBT slayt testi sonuçları (Şekil 3B), daha önce ROS'un sitometri18 ile doğrudan ölçülmesiyle gösterildiği gibi, PMA'yı fMLP'ye (Şekil 3C) kıyasla en yoğun ROS üretimini indükleyen uyaran olarak gösteren spektrofotometrik sonuçları doğruladı. Hücre sayımı ile ilgili olarak, formazan kristalleri içeren nötrofillerin sayısı, PMA:fMLP:kontrol koşullarında 7:4:1'lik bir oran gösterdi ve ayrıca fMLP ve PMA ile aktive olan PMN'ler arasında farklı formazan dağılım modellerini ortaya çıkardı; fMLP tedavisi, yoğun bir şekilde aktive edilmiş bireysel hücrelerle sonuçlanırken, PMA, PMN'lerin çoğunda sitoplazma boyunca dağılmış formazan kristallerinin oluşumunu indükledi. Ayrıca, PMA tedavisinden sonra ekspresif hücre agregasyonu gibi koşulları farklılaştıran birkaç morfolojik özellik gözlenmiştir. Kontrol grubunda bu tür tipik aktivasyon özelliklerinin ve düşük formazan seviyelerinin olmaması, dinlenme durumunun önemli ölçüde bozulmadığını göstermiştir. Bu nedenle, NBT testinin, ROS üretimini indüklemek için belirli bir uyaranın kapasitesini ve yoğunluğunu gözden geçirmek için kullanılabilecek nötrofil ROS üretimi için basit, ucuz ve güvenilir bir test olduğu kanıtlanmıştır.

Figure 3
Şekil 3: NBT testi. (A) Nötrofil solunum patlamasının formazan absorbansı (490-630 nm) ile farklı koşullara (negatif kontrol: 100 nM fMLP ve 100 nM PMA) spektrofotometrik değerlendirmesi. Dört donörden elde edilen veriler ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunulmaktadır. * = tüm gruplar birbirinden farklıdır (p≤ 0.05); £ = CTRL ile PMA ve fMLP ile PMA karşılaştırmaları anlamlı farklılıklar göstermektedir (p≤ 0.05). (B) Slayt testi, formazan birikintilerinin yoğunluğunu, hücre içindeki konumunu ve hücre agregasyonunu karakterize ederek kalitatif olarak analiz edilebilir. Siyah oklar formazan kristallerini gösterir. Ölçek çubukları: 20 μm. (C) Optik mikroskopi ile sayılan formazan içeren PMN'lerin sayısı. Sekiz donörden elde edilen veriler ortalama ± SD. *** p < 0.0001, Student t-testi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Fagositoz slaytları, Şekil 4'te gösterildiği gibi, fagositoz oranını fagositoz yapan nötrofillerin yüzdesi olarak belirlemek için kullanıldı. Hem 100 nM fMLP hem de 16 μM antimikrobiyal peptit, görünüşte artmış bir maya yutulmasına neden olmasına rağmen, fark, kontrol grubuna kıyasla fagositozu önemli ölçüde artıran ve ikili stimülasyon üzerine bir yanıt önerebilecek ikili stimülasyona kadar istatistiksel olarak anlamlı değildi.

Figure 4
Şekil 4: Fagositoz testi. Nötrofiller fagositoz kapasitelerine göre değerlendirildi (maya içeren nötrofillerin sayımı). Maya inkübasyonundan önce 100 nM fMLP veya 16 μM antimikrobiyal peptide maruz kalma, kontrol grubuna kıyasla fagositozu arttırsa da, (A) artış istatistiksel olarak anlamlı değildi. İlginç bir şekilde, fMLP ile ilk inkübasyon, ardından antimikrobiyal peptit ilavesi, insan nötrofillerinde (CTRL ve fMLP + antimikrobiyal peptit arasındaki yıldız işareti) önemli ölçüde artmış fagositoz ile sonuçlandı. (B) Siyah oklar maya hücrelerini, yeşil oklar sadece nötrofilleri ve kırmızı oklar fagositozlu nötrofilleri gösterir. Beş donörden elde edilen veriler ortalama ± SD olarak sunulmuştur. Ölçek çubukları: 20 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Gerçek zamanlı hücre göçü sonuçlarının bir örneği, 100 nM fMLP'nin nötrofiller üzerindeki iyi bilinen kemotaktik etkisini sergileyen Şekil 5'te gösterilmektedir. Hücre göçü kinetiği, parametrelerinin karşılaştırılmasını sağlayan Gompertz modeline göre ayarlandı.

Figure 5
Şekil 5: Gerçek zamanlı hücre geçişi. Hücre indeksi, hücre göçünden kaynaklanan elektriksel empedansı yansıtır. Bu testte, fMLP, alt odaya 100 nM fMLP eklenerek nötrofil göçünün pozitif kontrolü olarak kullanıldı. Negatif bir kontrol (CTRL) alt bölmede yalnızca HBSS içeriyordu. Üst üste binen eğriler, yükselen ve alçalan eğimlere en iyi şekilde uyacak şekilde değiştirilen Gompertz modeline uyan eğriyi temsil eder. Üç donörden elde edilen veriler, ortalama ± SD.* p < 0.05, Student t-testi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Son olarak, PMN'lerin hızlı panoptik ile boyandığı, NET varlığını düşündüren basit bir optik mikroskopi testi sunulmuştur. PMA veya bazı antimikrobiyal peptitler gibi bazı spesifik NET indükleyici uyaranlar için, kısa bir aktivasyon süresinden (1 saat) sonra bile, hücrelerin yakınında ipliksi ağ benzeri yapıları gözlemlemenin mümkün olduğunu, ancak negatif kontrol ve fMLP gibi diğer koşullarda bunun mümkün olmadığını gözlemlemek mümkündür (Şekil 6). Bu iddiayı daha iyi desteklemek için, 100 nm PMA veya bir antimikrobiyal peptit ile 40 dakikalık hücre aktivasyonundan sonra DNaz I eklendi ve NET benzeri yapılar çıkarıldı (Şekil 6). Her ne kadar bu yöntem NET karakterizasyonu için uygun olmasa ve artefaktlardan etkilenebilse de, özellikle uyaranların etkilerinin bilinmediği veya yetersiz tanımlandığı bağlamlarda, NET'leri analiz etmeye yönelik daha fazla yatırımı haklı çıkarmak için ucuz, basit ve ilginç bir başlangıç noktasıdır.

Figure 6
Şekil 6: NET oluşumu düşündürücü deneyi. Bir cam slayt üzerinde 1 saatlik aktivasyondan sonra panoptik lekeli nötrofillerin kalitatif bir analizi, NET salınımını gösterebilir. CTRL (A,B) ve fMLP (C,D) grupları NET salınımı ile ilgili herhangi bir belirti göstermezken, PMA (E-H) ile aktivasyon DNaz I işlemi (I-L) ile bozulan NET benzeri yapıların oluşumunu indükledi. Bir antimikrobiyal peptidin nötrofiller üzerindeki etkilerinin araştırılması, böyle bir uyaranın NET salınımını ortaya çıkarabileceğini gösterdi, çünkü slaytlar DNaz I (Q-T) tarafından bozulan NET benzeri yapıları (MP) sundu. Kırmızı oklar NET benzeri yapıları gösterir. Ölçek çubukları: 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nötrofiller, kısa ömürlü ve henüz dondurularak saklanamayan oldukça dinamik ve duyarlı hücrelerdir19, bu da biyolojilerinin araştırılmasını zorlaştırır. Bu nedenle, canlı, zenginleştirilmiş ve dinlenen nötrofiller elde etmek için dikkatli adımlar atmak önemlidir11,20. Bu çalışma, nazik ve minimal manipülasyonun yanı sıra aktivasyon adımına kadar düşük sıcaklıkların kullanımını vurgulayan yoğunluğa dayalı bir izolasyon tekniği kullanmıştır. Ek olarak, kan işleme damar delinmesinden sonraki 30 dakika içinde gerçekleşmeli ve oda sıcaklığında saklanmalıdır. Bu çalışma, manipülasyon stresini ve deney süresini azaltmak için bir seçenek sunmaktadır. Süreci daha da basitleştirmek için, protokolde, tek bir hemoliz prosedüründen sonra RBC tabakasının hafifçe yeniden süspansiyonu ve aspirasyonu ile RBC'lerin çıkarılmasını içeren yeni bir adım (bir seçenek olarak) ekledik. Bu adım, RBC'lerin çoğunu yalnızca bir hipotonik hemoliz adımıyla ortadan kaldırdığı için manipülasyon stresini ve deney süresini azaltır. Bununla birlikte, operatör becerilerinin bu adımın etkinliğini büyük ölçüde etkilediği ve RBC'leri her zaman tamamen ortadan kaldırmayabileceği unutulmamalıdır. Ayrıca, RBC aspirasyonu nötrofil kaybına yol açabilir, ancak bu, RBC katmanına daha yakın toplanırken başlangıçta gradyandan daha fazla nötrofil geri kazanıldığından, verimi etkilemez. Bu nedenle, tahliller mümkün olan en yüksek saflığı gerektirmiyorsa veya operatör sürekli olarak iyi sonuçlar elde ettiyse RBC aspirasyonu önerilir. Burada sunulan tarama testleri için, az miktarda kirletici RBC (% <3) sonuçlara müdahale etmeyecektir.

Reaktif hazırlama da dahil olmak üzere tüm prosedürlerin zamanında gerçekleştirilmesini sağlamak için, zaman çizelgesini ve iki araştırmacı arasındaki görev dağılımını detaylandıran bir iş akışı sunulur (Şekil 2). Tüm fonksiyonel tahliller bittikten sonra, kalan hücreler, uygun lizis tamponu ve depolama ile hücre lizisi ile omik çalışmalar gibi daha ileri moleküler araştırmalar için hazırlanabilir.

ROS üretimi
Solunum patlaması, nötrofil hazırlama ve aktivasyon 18,21'in ayırt edici özelliğidir ve ROS üretimini değerlendirmek, nötrofillerin aktivasyon durumunu tahmin etmek için kullanılan yaygın bir yöntemdir. Bu çalışma, ROS üretimini iki yaklaşım kullanarak değerlendirdi: optik mikroskopi ve spektrofotometri.

NBT testi, nötrofillerde solunum patlamasını değerlendirmek için iyi bilinen bir yaklaşımdır22,23. Yaygın olarak kullanılan iki yöntem, optik mikroskopi tabanlı (veya slayt testi) ve spektrofotometri tabanlı tahlillerdir 24,25,26. Optik mikroskopi, ayrıntıların hücre düzeyinde görselleştirilmesine izin verse de, kullanıcı yanlılığına eğilimlidir. Bu nedenle, NBT slayt testi, formazan oluşum modelleri, yoğunluk ve hücre agregasyonu gibi fenotipik özelliklerle ilgili spektrofotometrik testin kalitatif bir tamamlayıcısı olarak hizmet eder.

Hem NBT lamı hem de spektrofotometrik testler için kritik adımlar, NBT ve formazan tam çözündürmedir. Üreticinin tavsiyelerinin aksine, NBT suda iyi çözünmez. Bununla birlikte, NBT'nin DMSO'da en az 15 dakika homojenleştirilmesi ve ardından su/HBSS eklenmesi ve 2 dakika vortekslenmesi tam çözünme sağlar. Ek olarak, formazanın absorbansını analiz etmek için iki kritik adıma ulaşılmalıdır: (1) PMN lizisi ile formazan kristallerinin hücrelerden salınması ve (2) formazan kristallerinin tamamen çözünmesi. Her iki adım da, hücre peletinin yakın zamandaönerildiği gibi% 10 SDS ile muamele edilmesiyle elde edildi 27, ardından 570 nm'de süpernatantın sonikasyon ve absorbans analizi yapıldı.

Ayrıca, negatif ve pozitif kontrol gruplarının NBT sonuçları, değerlendirilecek taramanın ilk basamağıdır. Bu adım dikkate değer bir fark göstermelidir, çünkü formazan yoluyla ROS üretim değerlendirmesi, izolasyon işleminin, hücrelerin dinlenme durumundaki istenmeyen değişikliklerden stimülasyon veya inhibisyon yoluyla sorumlu olup olmadığını gösterir.

Sitokrom c indirgeme28 veya akış sitometrisi29 analizi gibi diğer yöntemler genellikle ROS tespiti için kullanılır; Bununla birlikte, bir tarama yaklaşımı göz önüne alındığında, uygulamaları daha uzun bir deney süresi, belirli belirteçlerin kullanımı ve pahalı aletler gerektirir. Luminol / izolüminesans, ROS'u tespit etmek için hızlı ve uygun maliyetli bir yöntemdir ve aynı zamanda hücre içi ve hücre dışı ROS'un farklılaşmasına izin verir. Ancak bu yöntem için bir luminometre gereklidir30,31. Cihaz maliyeti bir tesisin kullanılmasıyla önlenebilse de, diğer tahlillerle aynı anda gerçekleştirilen bir tarama analizi için yine de uygun olmayacaktır.

Fagositoz
PMN/maya inkübasyonu, fagositoz yapan nötrofillerin sayısını ve nötrofil başına yutulan maya sayısını sayarak nötrofil fagositoz kapasitesi ve etkinliğine genel bir bakış sağlar. Bununla birlikte, maya partikülünün kendisi bir aktivasyon sinyali olduğundan, kontrol grubunun önceden işlenmiş PMN ile karşılaştırılması, CTRL ve fMLP ile muamele edilmiş PMN'de gösterildiği gibi, önemli değişiklikler göstermeyebilen ikili bir stimülasyon sistemi oluşturur (Şekil 4). Bununla birlikte, bu tahlil, potansiyel bir modülatörün fagositoz üzerinde herhangi bir etki yaratıp yaratmayacağını göstermede yararlıdır. Bu test kullanılarak yeni bir antimikrobiyal peptit test edildi ve sonuçlar, son zamanlarda etkili aktivasyon için gerekli olduğu tartışılan bu uyaran kombinasyonuna ilginç bir potansiyel yanıt olduğunu gösteriyor32.

Bu tahlil için kritik adım boyamadır, çünkü slayt ≥3 saniye boyunca panoptik No. 3 (hematoksilen) üzerinde tutulursa analiz güvenilmez hale gelir. Bunun nedeni, maya hücrelerinin ve nötrofil nükleer loblarının birbirinden ayırt edilememesidir. Ayrıca, bu yaklaşım, modülatörlere maruz kaldıktan sonra nötrofillerin morfoloji analizine izin verir. Akış sitometrisi, fagositoz33'ü analiz etmek için başka bir etkili tekniktir, ancak önceki konuda tartışıldığı gibi, membrana bağlı ve yutulmuş parçacıklar ve önerilen tarama seti ile ilgili diğer faktörler arasında ayrım yapma zorluğu nedeniyle sınırlamaları vardır. Burada açıklanan yöntemde de aynı sınırlama gözlenir, ancak bu, takip çalışmalarına rehberlik etmek için bir başlangıç taraması olarak düşünülmelidir.

Gerçek zamanlı geçiş
Gerçek zamanlı tarama protokolü, PMN'lerin göç kapasitesini değerlendirmek için optimize edildi. Daha önceki bir çalışma, migrasyon testinin negatif kontrol ve IL-8 tedavisi15 arasında bir fark göstermesi için RTCA plakasının alt tarafının kaplanmasının gerekli olduğunu öne sürse de, bu çalışma, kaplama ajanları eklenmeden fMLP ile tedavi edilen hücreler için yüksek güven aralığı (CI) değerleri göstermiştir. Sonuçlar, 12 dakikadan itibaren önemli migrasyon ile yüksek tekrarlanabilirlik sundu. Ayrıca, elde edilen migrasyon verilerinin eğri uydurma analizi, migrasyonun dinamiklerini anlamak için yararlı olan ve konsantrasyona bağlı olabilen veya koşullar arasında farklılık gösterebilen hücre indeksi maksimumunun yanı sıra eğimi artırma ve azaltma gibi parametreleri ortaya çıkarabilir. Nötrofil migrasyon eğrileri için en uygun (Şekil 5), fMLP'nin maksimum hücre indeksini ve artan eğimi arttırdığını gösteren düzeltilmiş Gompertz fonksiyonu34'tür.

Elektrotlardan geçen hücreleri engelleyerek deneyi tehlikeye atabilecekleri için RTCA sistemindeki kabarcıklardan kaçınmak için özel dikkat gereklidir. Sınırlayıcı bir faktör, plakaların yüksek maliyetidir. Daha ucuz teknikler hücre göçünü analiz etse de, iyi bir tekrarlanabilirlikten yoksundurlar veya Boyden odası35 gibi zor ve zaman alıcıdırlar. Bu nedenle RTCA, burada sunulan diğer tarama testleriyle uyumlu güvenilir bir migrasyon analizidir.

Ağları
Son olarak, optik mikroskopi kullanılarak NET oluşumunun ön değerlendirmesi için umut verici, kolay ve düşük maliyetli bir test geliştirilmiştir. Fagositoz kapasitesi üzerindeki etkisi test edilen spesifik bir NET indükleyici uyaran olan PMA'nın da CTRL ve fMLP gruplarına kıyasla ağ benzeri bir yapı oluşumunu indüklediği fagositoz slaytlarının gözlemlenmesinden türetilmiştir. Bu çalışma, bu yapıların NET salınımını gösterebileceğini varsayıyordu. Böyle bir hipotez, PMA ile aktive olan nötrofillerde filamentli yapıların bulunmadığı aktivasyondan sonra numunelerin DNaz I ile muamele edilmesiyle test edildi. Bu tür yapıların NET olma ihtimalinin yüksek olduğu varsayımı, PMA'nın NET oluşumunun iyi bilinen bir indükleyicisi olarak gösterilmesine36,37, NET'ler için spesifik belirteçler kullanılarak floresan mikroskobu ile benzer yapıların bulunmasına 38,39 ve DNaz I tarafından katalize edilen NET'lerin bozunmasınadayanmaktadır 40,41. Bunun NET oluşumunun doğrulanması için bir yöntem olmadığını, sadece NET'lerin varlığını gösteren bir ön tarama olduğunu vurgulamak önemlidir. Bu testin sınırlılıkları olmasına rağmen, NET'ler boyama artefaktları ile karıştırılabileceğinden, diğer fonksiyonel testlerle birlikte yapılabilen hızlı ve düşük maliyetli bir taramada NET oluşumunu önermede ilgili bir amaca hizmet eder. Taranan çalışma ile ilgili olarak tespit edildikten sonra, NET'ler daha sonra tartışıldığı gibi konfokal veya elektron mikroskobu42 ile daha fazla değerlendirilebilir.

Laboratuvarımızda, immünomodülatör aktivitelere sahip olması muhtemel olan yeni antimikrobiyal peptitler, bazı peptitlerin insan nötrofilleri üzerindeki etkilerinin daha fazla analizine daha iyi rehberlik etmek için bu tarama testleri seti ile sıklıkla değerlendirilir, çünkü bazıları ilginç ROS43, fagositoz, migrasyon ve / veya NET modülasyon özellikleri gösterir.

Sonuç olarak, NeutroFun Ekranı, çok sayıda test edilmemiş bileşikten normal yoğunluktaki nötrofil aktivitesinin potansiyel modülatörlerini tanımlamak için değerli bir araç sunar. Ancak, bu yöntemin yalnızca bir ön tarama işlevi gördüğüne dikkat etmek önemlidir. Bu ilk taramadan sonra, daha pahalı, gelişmiş ve zaman alıcı metodolojiler, veri doğrulama için bu ilk sonuçların önerdiği belirli işlevlere veya yollara yönlendirilebilir. ROS üretimi, fagositoz ve NET oluşumu için, veri doğrulama ve daha fazla nicel sonuç elde etmek için alternatif yöntemler vardır. NET görselleştirme ve miktar tayini, yakın zamanda ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, miyeloperoksidaz ve nötrofil elastaz gibi hücre dışı DNA ve granül proteinlerinin varlığını ve örtüşmesini belirleyen immünofloresan mikroskopi analizi yoluyla gerçekleştirilebilir42. ROS birçok biyolojik süreçte farklı önemli roller oynar ve bu nedenle çalışmaları oldukça yaygın ve çeşitlidir. En köklü metodolojiler arasında, enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) ve lüminesansın immünoblotlanması gibi antikorlardan yararlananlar veya DCFDA, EPR spektroskopisi ve enzimatik aktivite ölçümleri yoluyla farklı etiketleme altındaki hücrelerin akış sitometrisi gibi floresan tespiti gibi metodolojiler yer almaktadır44. Benzer şekilde, sağlam fagositoz değerlendirmesi de çeşitli şekillerde yapılır; Alternatif yöntemler arasında tek başına akış sitometrisi45,46 veya floresan mikroskobu47 ile kombine edilir. Açıklanan gerçek zamanlı hücre göçü, daha fazla doğrulama gerektirmeyen ve diğer metodolojilerin düşünemeyeceği parametreler sunan sağlam ve yeterli bir tahlildir. Bu tür yöntemlerin diğer kombinasyonları belirli senaryolara daha uygun olabilir, ancak özetle bu, birçok nötrofil aktivitesini kapsayan hızlı ve uygun fiyatlı bir kombinasyonu temsil eder.

Özetle, bu çalışma, çabaları gelişmiş metodolojilere daha iyi yönlendirmenin bir yolu olarak yeni moleküllere ve koşullara çoklu nötrofil yanıtlarını değerlendirmek için basit, hızlı ve düşük maliyetli metodolojilerden oluşan bir dizi tahlil sağlamayı amaçlamaktadır. Başlıca sınırlamalar olarak, ROS, NET ve fagositoz testlerinden elde edilen sonuçlar ön hazırlık olarak kabul edilmeli ve daha spesifik ve ayrıntılı tahlillerle daha fazla doğrulamaya ihtiyaç duyulmalıdır ve otomatik olmayan mikroskopi hücre sayımına dayananlar bilinçsiz önyargıya eğilimlidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.

Acknowledgments

Yazarlar aşağıdaki finansman kuruluşlarını kabul eder: FAPDF, CNPq, CAPES, UnB, FINEP ve FINATEC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CIM-Plate 16 Agilent  5665825001
CLARIOstar Plate Reader  BMG LABTECH US Patent Number 9,733,124
Product details: MARS Data Analysis Software
Dimethyl sulfoxide Dinâmica 1582
DNAse I Sigma - Aldrich DN 25
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate Sigma - Aldrich E5134
Fast panoptic stain Laborclin 620529
Glass slide Exacta 7102
Hank’s Balanced Salt Solution with calcium, with magnesium, without phenol red. Sigma - Aldrich 55037C
Hank’s Balanced Salt Solution without calcium chloride, magnesium sulfate and sodium bicarbonate. Sigma - Aldrich H4641
Heparin Blau  7896014655229
Laminar flow cabinet Veco VLFS-12
Microscope Zeiss 415501-0101-002 Product details: Primostar 1
Mixing Block BIOER MB-102
Neubauer improved bright-lined New Optik 1110000
N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine Sigma - Aldrich F3506
Nitroblue tetrazolium Neon CAS 298-83-9
Percoll Cytiva 17089101 separation media
Phorbol 12-myristate 13-acetate Sigma - Aldrich P8139
Phosphate buffered saline tablet Sigma - Aldrich P4417
ROTOFIX 32 A Hettich 1206
Saccharomyces cerevisiae Fleischmann
Safranin Sigma - Aldrich 50240
Sodium dodecyl sulfate Cytiva 17-1313-01
Sonicator Qsonica Q125
Trypan blue solution Vetec C.I. 23850
Vortex Genie 2 Scientific Industries, Inc. 0K-0500-902
xCELLigence Real-Time Cell Analysis (RTCA) DP (dual purpose) Agilent  380601050 Product details: RTCA system composed of detection hardware, cell plates and software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nature Immunology. 15 (7), 602-611 (2014).
  2. Groeneweg, L., Hidalgo, A. Emerging roles of infiltrating granulocytes and monocytes in homeostasis. Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (19), 3823-3830 (2020).
  3. Rosales, C., Lowell, C. A., Schnoor, M., Uribe-Querol, E. Neutrophils: their role in innate and adaptive immunity 2017. Journal of Immunology Research. 2017, 9748345 (2017).
  4. Castro, M., et al. Proteome analysis of resting human neutrophils. Protein & Peptide Letters. 13 (5), 481-487 (2006).
  5. Li, Y., et al. The regulatory roles of neutrophils in adaptive immunity. Cell Communication and Signaling. 17, 147 (2019).
  6. de Oliveira, S., Rosowski, E. E., Huttenlocher, A. Neutrophil migration in infection and wound repair: going forward in reverse. Nature Reviews Immunology. 16 (6), 378-391 (2016).
  7. Burn, G. L., Foti, A., Marsman, G., Patel, D. F., Zychlinsky, A. The neutrophil. Immunity. 54 (7), 1377-1391 (2021).
  8. El-Benna, J., et al. Priming of the neutrophil respiratory burst: role in host defense and inflammation. Immunological Reviews. 273 (1), 180-193 (2016).
  9. Castro, M. S., Cilli, E. M., Fontes, W. Combinatorial synthesis and directed evolution applied to the production of alpha-helix forming antimicrobial peptides analogues. Current Protein & Peptide Science. 7 (6), 473-478 (2006).
  10. Mihaila, A. C., et al. Transcriptional profiling and functional analysis of N1/N2 neutrophils reveal an immunomodulatory effect of S100A9-blockade on the pro-inflammatory N1 subpopulation. Frontiers in Immunology. 12, 708770 (2021).
  11. Kuhns, D. B., Priel, D. A. L., Chu, J., Zarember, K. A. Isolation and functional analysis of human neutrophils. Current Protocols in Immunology. 111 (1), 7-23 (2015).
  12. Paulíková, E., Kociková, A., Sabol, M. Modification of a panoptic method of staining isolated cells. Bratislavske Lekarske Listy. 94 (12), 638-640 (1993).
  13. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111 (1), 1-3 (2015).
  14. Libério, M. S., et al. Anti-proliferative and cytotoxic activity of pentadactylin isolated from Leptodactylus labyrinthicus on melanoma cells. Amino Acids. 40 (1), 51-59 (2011).
  15. Cano, P. M., Vargas, A., Lavoie, J. P. A real-time assay for neutrophil chemotaxis. BioTechniques. 60 (5), 245-251 (2016).
  16. Stefanowicz-Hajduk, J., Adamska, A., Bartoszewski, R., Ochocka, J. R. Reuse of E-plate cell sensor arrays in the xCELLigence Real-Time Cell Analyzer. BioTechniques. 61 (3), 117-122 (2016).
  17. Björkstén, B., Nyström, K., Lindqvist, B. The nitroblue tetrazolium (NBT) test in endemic benign (epidemic) nephropathy. Acta Medica Scandinavica. 199 (1-6), 147-150 (1976).
  18. Aquino, E., et al. Proteomic analysis of neutrophil priming by PAF. Protein & Peptide Letters. 23 (2), 142-151 (2016).
  19. Blanter, M., Gouwy, M., Struyf, S. Studying neutrophil function in vitro: cell models and environmental factors. Journal of Inflammation Research. 14, 141-162 (2021).
  20. Hsu, A. Y., Peng, Z., Luo, H., Loison, F. Isolation of human neutrophils from whole blood and buffy coats. Journal of Visualized Experiments. (175), e62837 (2021).
  21. Moghadam, Z. M., Henneke, P., Kolter, J. From flies to men: ROS and the NADPH oxidase in phagocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 628991 (2021).
  22. Pattan, S. S., Bhat, K. G., Pattar, G. D., Kuntagi, M. Comparison of three different techniques for isolation of neutrophils from blood and their utility in performing nitroblue tetrazolium test. International Journal of Basic and Applied Physiology. 8 (1), 41 (2019).
  23. Gooty, J. R., Shashirekha, A., Guntakala, V. R., Palaparthi, R. Estimation of phagocytic activity of polymorphonuclear leukocytes in chronic and aggressive periodontitis patients with nitroblue tetrazolium test. Journal of Indian Society of Periodontology. 23 (4), 316 (2019).
  24. Langer, S., et al. Clinical and laboratory profiles of 17 cases of chronic granulomatous disease in north India. Indian Journal of Hematology and Blood Transfusion. 37 (1), 45-51 (2021).
  25. Oualha, R., et al. Infection of human neutrophils with Leishmania infantum or Leishmania major strains triggers activation and differential cytokines release. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 9, 153 (2019).
  26. Zilinskas, J., Zekonis, J., Zekonis, G., Valantiejiene, A., Periokaite, R. The reduction of nitroblue tetrazolium by total blood in periodontitis patients and the aged. Stomatologijal. 9 (4), 105-108 (2007).
  27. Benov, L. Improved formazan dissolution for bacterial MTT assay. Microbiology Spectrum. 9 (3), e01637 (2021).
  28. Chen, Y., Junger, W. G. Measurement of oxidative burst in neutrophils. Methods in Molecular Biology. 844, 115-124 (2012).
  29. Richardson, M. P., Ayliffe, M. J., Helbert, M., Davies, E. G. A simple flow cytometry assay using dihydrorhodamine for the measurement of the neutrophil respiratory burst in whole blood: comparison with the quantitative nitrobluetetrazolium test. Journal of Immunological Methods. 219 (1-2), 187-193 (1998).
  30. Jancinová, V., et al. The combined luminol/isoluminol chemiluminescence method for differentiating between extracellular and intracellular oxidant production by neutrophils. Redox Report. 11 (3), 110-116 (2006).
  31. Nosál, R., et al. Pharmacological intervention with oxidative burst in human neutrophils. Interdisciplinary Toxicology. 10 (2), 56-60 (2017).
  32. Mol, S., et al. Efficient neutrophil activation requires two simultaneous activating stimuli. International Journal of Molecular Sciences. 22 (18), 10106 (2021).
  33. Schneider, L., et al. Flow cytometry evaluation of CD14/CD16 monocyte subpopulations in systemic sclerosis patients: a cross sectional controlled study. Advances in Rheumatology. 61 (1), 27 (2021).
  34. Akin, E., Pelen, N. N., Tiryaki, I. U., Yalcin, F. Parameter identification for gompertz and logistic dynamic equations. PLoS One. 15 (4), e0230582 (2020).
  35. Guy, J. B., et al. Evaluation of the cell invasion and migration process: A comparison of the video microscope-based scratch wound assay and the boyden chamber assay. Journal of Visualized Experiments. (129), e56337 (2017).
  36. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  37. de Bont, C. M., Koopman, W. J. H., Boelens, W. C., Pruijn, G. J. M. Stimulus-dependent chromatin dynamics, citrullination, calcium signalling and ROS production during NET formation. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1865, 1621-1629 (2018).
  38. Masuda, S., et al. Measurement of NET formation in vitro and in vivo by flow cytometry. Cytometry Part A. 91 (8), 822-829 (2017).
  39. Zharkova, O., et al. A flow cytometry-based assay for high-throughput detection and quantification of neutrophil extracellular traps in mixed cell populations. Cytometry Part A. 95 (3), 268-278 (2019).
  40. Hosseinnejad, A., et al. DNase I functional microgels for neutrophil extracellular trap disruption. Biomaterials Science. 10 (1), 85-99 (2022).
  41. Chrysanthopoulou, A., et al. Neutrophil extracellular traps promote differentiation and function of fibroblasts. The Journal of Pathology. 233 (3), 294-307 (2014).
  42. Tong, M., Abrahams, V. M. Visualization and quantification of neutrophil extracellular traps. Methods in Molecular Biology. 2255, 87-95 (2021).
  43. Santana, C. J. C., et al. Biological properties of a novel multifunctional host defense peptide from the skin secretion of the chaco tree frog, boana raniceps. Biomolecules. 10 (5), 790 (2020).
  44. Murphy, M. P., et al. Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo. Nature Metabolism. 4 (6), 651-662 (2022).
  45. Boero, E., et al. Use of flow cytometry to evaluate phagocytosis of staphylococcus aureus by human neutrophils. Frontiers in Immunology. 12, 635825 (2021).
  46. Karsten, C. B., et al. A versatile high-throughput assay to characterize antibody-mediated neutrophil phagocytosis. Journal of Immunological Methods. 471, 46-56 (2019).
  47. Smirnov, A., Solga, M. D., Lannigan, J., Criss, A. K. Using imaging flow cytometry to quantify neutrophil phagocytosis. Methods in Molecular Biology. 2087, 127-140 (2020).

Tags

JoVE'de Bu Ay Sayı 204
Nötrofil fonksiyonuna hızlı bir genel bakış için bir dizi tarama tekniği
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Souza Luz, I., Takaya, R., Gonzaga… More

Souza Luz, I., Takaya, R., Gonzaga Ribeiro, D., Sales Silva, N., Fontes, L., Castro, M. S., Fontes, W. A Set of Screening Techniques for a Quick Overview of the Neutrophil Function. J. Vis. Exp. (204), e65329, doi:10.3791/65329 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter