Summary
이 프로토콜은 다양한 신호 전달 경로의 기능을 포괄하는 스크리닝 방법으로 사용되는 호중구 기능 분석 세트를 특징으로 합니다. 이 프로토콜에는 세포 생존율, 순도, 활성 산소 종 생산, 실시간 이동, 식세포작용 및 호중구 세포외 트랩에 대한 예비 제안에 대한 초기 및 간단한 평가가 포함됩니다.
Abstract
호중구는 선천성 면역 반응의 첫 번째 방어선 중 하나로 알려져 있으며 화학주성, 역이동, 식세포작용, 세포독성 효소 및 대사 산물의 탈과립화, 호중구 세포외 트랩(NET)으로서의 DNA 방출과 같은 많은 특정 세포 기능을 수행할 수 있습니다. 호중구는 스스로 신호를 엄격하게 조절할 뿐만 아니라 면역 체계의 다른 구성 요소를 조절하는 데에도 참여합니다. 신선한 호중구는 말기에서 분화되고, 수명이 짧으며, 개인마다 매우 다양하기 때문에 수집된 샘플을 최대한 활용하는 것이 중요합니다. 연구자들은 종종 평가 중인 특정 조건의 영향을 받을 수 있는 많은 호중구 기능의 개요를 평가하기 위해 스크리닝 분석을 수행해야 합니다. 정상 밀도 호중구의 단일 분리 공정에 따른 일련의 테스트는 속도, 포괄성, 비용 및 정확성 간의 균형을 추구하여 이러한 요구를 해결하기 위해 개발되었습니다. 결과는 심층적인 후속 연구를 추론하고 안내하는 데 사용할 수 있습니다. 이 절차는 평균 4시간 내에 수행할 수 있으며 세포 생존율, 활성 산소종(ROS) 생산, 실시간 이동 및 유리 슬라이드에서 효모의 식균작용 평가가 포함되어 오믹스 연구와 같은 보다 자세한 접근 방식을 위한 충분한 세포를 남깁니다. 더욱이, 이 절차에는 광학 현미경으로 관찰된 빠른 panoptic 염색 후 NET의 예비 제안을 쉽게 관찰할 수 있는 방법이 포함되어 있으며, 특정 마커가 부족하지만 이러한 방식으로 추가 노력을 기울일 가치가 있는지 여부를 나타내기에 충분합니다. 테스트된 기능의 다양성은 테스트 간의 공통점을 결합하여 분석 시간과 비용을 줄입니다. 이 절차는 NeutroFun Screen으로 명명되었으며 한계가 있지만 앞서 언급한 요소의 균형을 맞춥니다. 또한 이 작업의 목적은 명확한 테스트 세트가 아니라 각 실험실의 리소스와 요구 사항에 맞게 쉽게 조정할 수 있는 지침입니다.
Introduction
호중구는 인간의 혈액에서 가장 풍부한 선천성 면역 세포로, 감염과 염증에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 조직 손상 부위에 가장 먼저 도착한다1. 최근 몇 년 동안 호중구가 다양한 질병과 항상성을 지원하는 데 중요한 역할을 한다는 인식이 높아지고있습니다 2. 호중구는 스스로 신호를 엄격하게 조절할 뿐만 아니라 면역 체계의 다른 구성 요소의 조절에도 참여합니다 3,4,5. 따라서 호중구와 호중구의 많은 특이한 세포 기능(예: 화학주성, 역이동6, 식세포작용7, 호흡파열8, 호중구 세포외 트랩(NET)7 방출)을 조사하는 것은 분석 중인 특정 조건에 의해 유발되는 잠재적인 호중구의 기능적, 형태학적 또는 분자적 변화를 평가해야 하는 수많은 연구 상황에서 필수적입니다.
갓 분리된 호중구는 말기 분화되고, 수명이 짧으며, 매우 역동적이고, 쉽게 활성화된다9. 그러나 호중구 반응에 영향을 미치지 않는 효율적인 보관 방법은 아직 달성되지 않았기 때문에 중단 없이 여러 분석을 수행하는 것이 어렵습니다. 더욱이, 세포 분석 및/또는 형광 염색을 필요로 하는 분석에 기초한 이전에 기술된 기능 분석(10,11)은 호중구의 광범위하고 초기 평가가 필요한 경우 실행 가능한 선택이 아닐 수 있다.
이러한 문제를 해결하기 위해 이 프로토콜은 세포 생존율, 활성산소종(ROS) 생산, 실시간 이동 및 맥주효모균의 식세포작용 평가를 포함하여 단일 분리 프로세스 후에 수행할 수 있는 일련의 테스트를 설명하며, 그 결과는 심층 후속 연구를 추론하는 데 사용할 수 있습니다. NeutroFun Screen이라고 명명된 이 절차는 탈과립을 제외한 주요 이펙터 활동을 포함하도록 설계되었으며 활성화 1시간을 포함하여 평균 4시간 내에 완료할 수 있습니다. 또한 나머지 세포는 오믹스 연구와 같은 보다 상세한 접근 방식에 사용할 수 있습니다. 이 방법의 장점은 속도, 포괄성, 비용 및 정확성 간의 균형에 있습니다.
또한 특정 마커 없이 NET의 예비 제안을 쉽게 관찰할 수 있는 방법이 있지만 해당 방향으로의 추가 노력이 가치가 있는지 여부를 나타내기에 충분합니다. 테스트되는 기능의 다양성은 테스트 간의 공통점을 결합하여 분석 시간과 비용을 줄이는 것을 목표로 합니다. 이 방법의 주요 목표는 호중구의 반응에 대한 개요를 허용하는 속도, 포괄성, 비용 및 정확도에 관한 균형 잡힌 기능적 분석을 제공하여 정상 밀도 호중구에 대한 새로운 자극의 영향을 조사하는 데 유용한 초기 단계가 되는 것입니다.
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Protocol
모든 실험은 브라질리아 대학의 기관 검토 위원회에서 정한 윤리 지침(프로세스 13364819.0.0000.5558)을 엄격히 따랐으며, 샘플은 기증자의 익명성을 보장하기 위해 코드로 식별되었습니다. 세포는 정보에 입각한 동의서에 서명하고 비흡연자/베이퍼, 만성 질환 없음, 지난 14일 동안 염증성 질환 병력이 없는 18-35세의 건강한 남성 기증자로부터 얻었습니다.
1. 채혈
- 5,000IU/mL 헤파린 0.3mL( 재료 표 참조)를 멸균 20mL 주사기에 무균 상태로 넣어 헤파린화합니다.
- 천자 부위 위쪽에 약 4인치의 정맥 지혈대를 적용하고 정맥 천자를 위해 정중 입방체 또는 두부 정맥을 식별합니다.
알림: 총 지혈대 시간이 1분을 초과하지 않는지 확인하십시오. - 70% 알코올로 펑크 부위를 청소하고 정맥 천자를 수행합니다.
- 혈액을 채취한 후 주사기를 서너 번 부드럽게 뒤집어 혈액과 헤파린을 적절히 섞습니다.
2. 호중구 분리
참고: 다형핵 백혈구(PMN)는 밀도 구배 원심분리 후 나머지 적혈구(RBC)의 저긴장 용해를 통해 분리되며, 앞서 설명한바와 같이 11 에서 약간의 변화가 있습니다. 이 방법은 스크리닝 분석을 수행하는 데 필수는 아니며, 선택한 방법이 >97%의 생존율, PMN의 <3%의 프라이밍 또는 활성화, 모든 분석, 복제 및 조건에 충분한 세포를 생성하는 한 대체할 수 있습니다. 세포 활성화를 피하기 위해 무균 조건에서 이러한 단계를 수행하고 내독소가 없는 용액을 사용하는 것이 필수입니다.
- 50mL 코니컬 튜브에 60% 및 70% 분리 배지(시판, 재료 표 참조)를 12mL 희석합니다.
- 5mL 피펫을 사용하여 70% 희석액에 대해 60% 희석할 때 한 번에 4mL를 추가하여 아래에서 위로 그래디언트를 준비합니다. 인터페이스가 섞이지 않도록 부드럽게 수행하십시오.
- 밀도 구배 위에 헤파린화된 혈액 12mL를 조심스럽게 겹쳐 놓습니다. 실온에서 200 x g 에서 15분 동안 원심분리합니다.
알림: 이 단계부터 PMN이 활성화될 때까지 사용된 모든 시약과 튜브는 얼음으로 채워진 쿨러에 보관해야 합니다. - 혈장/단핵 세포층을 폐기한 다음 적혈구 펠릿 위의 층을 각각 약 7.5mL가 들어 있는 두 개의 15mL 원뿔형 튜브로 부드럽게 옮깁니다. Hank의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS, 재료 표 참조)으로 튜브 부피를 구성합니다.
- 300 x g 에서 19°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
- HBSS로 세포 펠릿을 세척하십시오.
- 튜브를 부어 상층액을 버리고 펠릿을 7mL의 HBSS에 부드럽게 재현탁시킵니다.
- 19°C에서 5분 동안 300 x g 으로 원심분리하여 모든 분리 매질을 제거합니다.
- 나머지 적혈구의 저긴장성 용해를 수행합니다.
- 상층액을 버리고 펠릿을 단일 튜브에 결합합니다.
- 멸균 H2O3mL에 RBC/PMN 펠릿을 재현탁하고 25초 이내에 HBSS 3mL(2x)를 추가하여 삼투압을 복원합니다. 그런 다음 300 x g 에서 19°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
- 적혈구가 없는 흰색 펠릿에 대해 2.8.1 및 2.8.2단계를 반복합니다.
알림: 호중구와 RBC 분해 산물의 접촉을 최소화하기 위해 상층액을 가능한 한 빨리 제거해야 합니다. 대안적으로, 두 번째 저긴장성 용해는 잔류 적혈구층을 부드럽게 재현탁하고 모든 상층액을 제거함으로써 대체될 수 있는데, 이는 나머지 적혈구가 PMN 펠릿 위에 침전되기 때문이다.
- 튜브를 부어 상층액을 버리고 남은 완충액에 PMN을 부드럽게 재현탁시킨 다음 얼음처럼 차가운 마이크로 튜브로 옮깁니다.
알림: 마이크로피펫으로 재현탁 세포를 옮기는 동안 부피에 주석을 달아야 합니다. - 셀 현탁액 3 x 1μL를 깨끗한 유리 슬라이드(각각 1μL의 웰 3개)로 옮기고 형태 및 순도 평가를 위해 빠른 파놉틱( 재료 표 참조)으로 염색합니다12.
- 빠른 파놉틱으로 염색하려면 슬라이드를 파놉틱 고정제 1번에, 에오신 2번에, 헤마톡실린 3번에 2번, 침지할 때마다 1초 동안 지속됩니다.
- 유리 슬라이드를 증류수로 부드럽게 씻으십시오.
- 물기를 빼고 자연 건조하십시오.
- 현미경으로 관찰하고 각 웰에서 300개의 무작위 세포를 세어 호중구를 다른 과립구와 구별합니다.
- 세포 현탁액 1μL를 0.2% 트리판 블루 염료13의 49μL로 옮기고 Neubauer 챔버를 사용하여 세포를 계수하여 죽은 세포와 생존 가능한 세포를 구별합니다.
- 칼슘과 마그네슘이 보충된 50% 자가 혈장과 50% HBSS 용액을 사용하여 세포 농도를 6,667 cells/μL로 조정합니다. 6,667 cells/μL 현탁액을 음성 대조군을 포함하여 테스트할 조건에 해당하는 마이크로튜브 간에 균등하게 나눕니다.
참고: 모델 유기체의 순환 호중구와 유사한 모든 세포 농도를 사용할 수 있지만 재현성을 위해 모든 실험에서 동일한 세포 농도를 사용하는 것이 중요합니다.
그림 1: 호중구 분리 프로토콜. 두 농도의 분리 배지(percoll)(A)를 적층한 다음(B) 분리 구배(C) 위에 혈액을 층상합니다. 원심분리 후 PMN은 두 개의 15mL 튜브(E)로 나뉘는 중앙층(D)에 있습니다. 세포 현탁액을 HBSS에서 두 번 세척하고 원심분리(G-I)하여 배지를 제거한 다음 세포를 재현탁시키고 잔류 적혈구를 두 차례의 저긴장성 용해(J-M)에 제출합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
3. 호중구 활성화를 위한 준비
- 1.5mL 마이크로튜브에서 최종 세포 농도가 6,600 cells/μL가 되도록 각 조건에 대한 활성화 시스템을 준비합니다. 예를 들어, 100nM fMLP(N-포르밀-메티오닐-류실-페닐알라닌, 재료 표 참조)의 효과를 테스트하려면 6,667 cell/μL 현탁액의 495μL에 10μM fMLP 5μL를 추가합니다. 음성(자극되지 않은) 대조군의 경우 Ca2+ 및 Mg2+를 함유한 HBSS를 추가합니다.
참고: 이 방법론을 입증하기 위해 100nM fMLP, 16μM의 팔락신, 자연 발생 항균 펩타이드14 및 100nM PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate)와 같은 자극의 최종 농도를 사용했습니다( 재료 표 참조). - 회전 없이 37°C에서 배양합니다.
참고: 기능적 분석을 위한 모든 부분 표본은 이 세포 현탁액에서 채취되며, 이하 활성화 시스템이라고 합니다.
4. ROS 생산 평가를 위한 니트로테트라졸륨 블루 클로라이드(NBT) 분석
- NBT 작업 용액 준비: 각 실험 조건에 대해 다음 단계를 사용하여 6mM의 NBT( 재료 표 참조) 작업 용액을 준비합니다.
- 0.0005g의 NBT를 10μL의 디메틸설폭사이드(DMSO)에 녹이고 최소 15분 동안 소용돌이에 넣습니다.
- 90μL의 HBSS Ca2+Mg2+ 를 넣고 최대 2분 동안 소용돌이칩니다.
알림: NBT와 관련된 모든 단계는 어두운 곳에서 수행해야 합니다.
- NBT 슬라이드 테스트를 수행합니다.
- 20분 동안 세포를 활성화한 후 세포 현탁액을 부드럽게 혼합하고 2μL의 PMN을 깨끗한 유리 슬라이드에 조심스럽게 옮깁니다. 37°C의 가습 챔버에서 20분 동안 배양합니다.
알림: 셀 서스펜션을 슬라이드 위에 너무 많이 펴지 마십시오. 그렇지 않으면 배양 전에 건조될 수 있습니다. - 세포 위에 NBT 작업 용액 1μL를 추가하고 빛으로부터 보호된 상태에서 20분 동안 추가로 배양합니다.
- 뜨거운 공기로 슬라이드를 말리고 각 웰에 메탄올 한 방울로 1분 동안 고정합니다. 0.03% 사프라닌( 재료 표 참조)으로 1분 동안 염색합니다.
- 유리 슬라이드를 증류수로 부드럽게 씻으십시오.
- 슬라이드를 자연 건조시키고 현미경으로 관찰하십시오.
- 각 웰에서 100개의 무작위 세포를 세어 포름마잔 침전물이 있는 호중구와 없는 호중구를 구별합니다.
- 20분 동안 세포를 활성화한 후 세포 현탁액을 부드럽게 혼합하고 2μL의 PMN을 깨끗한 유리 슬라이드에 조심스럽게 옮깁니다. 37°C의 가습 챔버에서 20분 동안 배양합니다.
- NBT 분광광도계 분석을 수행합니다.
- 세포 활성화 40분 후 세포 현탁액을 부드럽게 혼합하고 활성화 시스템에서 깨끗한 마이크로튜브로 90μL의 PMN을 전달합니다. 그런 다음 6mM NBT 용액 20μL를 조심스럽게 추가합니다. 37°C에서 20분 동안 어두운 곳에서 배양합니다.
- 100μL의 10% 소듐 도데실 설페이트(SDS, 재료 표 참조)와 와류를 추가합니다.
- 진폭 60 %에서 팁 초음파 발생기를 사용하여 초음파 처리, 각각 15 초 간격으로 15 초의 5 사이클. 12,000 x g 에서 5분 동안 원심분리기
- 상층액 60μL를 투명한 바닥 96웰 플레이트로 옮기고 570nm에서 포르마잔 생성물의 흡광도를 측정합니다.
5. 식세포작용 분석
- 아래 설명에 따라 각 조건에 대해 33,000 yeasts/μL 현탁액을 준비합니다.
- 약 0.75mg의 건조 효모 (Saccharomyces cerevisiae, 재료 표 참조)를 200μL의 HBSS Ca2+Mg2+ 에 넣고 100°C의 열혼합기에서 500rpm으로 최소 15분 동안 배양합니다.
- 와류에 의해 혼합물을 균질화하고 5 μL의 효모 현탁액을 0.2 % 트리판 블루 염료의 45 μL로 옮깁니다. Neubauer 챔버를 사용하여 효모를 계산합니다.
- HBSS Ca2+Mg2+를 사용하여 초기 현탁액의 농도를 33,000 효모 세포/μL로 조정합니다. 사용할 때까지 서스펜션을 얼음 위에 두십시오.
- 세포 활성화 20분 후 세포 현탁액을 부드럽게 혼합하고 활성화 시스템의 5μL를 33,000 yeast/μL 맥주효모 균 현탁액 5μL로 새로운 멸균 마이크로튜브에 전달합니다.
알림: 호중구 대 효모 비율은 1:5(PMN:효모)입니다. - PMN/효모 현탁액 6μL를 깨끗한 유리 슬라이드(각각 2μL)의 웰 3개에 즉시 옮기고 가습 챔버에서 40분 동안 슬라이드를 배양합니다.
알림: 셀 서스펜션을 슬라이드 위에 너무 많이 펴지 마십시오. 그렇지 않으면 배양 전에 건조될 수 있습니다. - 위의 2.9단계에서 설명한 대로 뜨거운 공기로 슬라이드를 건조시키고 빠른 파놉틱으로 염색합니다.
참고: 빠른 판옵틱 염색의 세 번째 단계는 슬라이드의 현미경 분석에 매우 중요합니다. 이 단계에서 슬라이드를 ≥3초 동안 염색하면 효모와 호중구 핵엽을 구별하기 어렵기 때문에 분석에 적합하지 않을 수 있습니다. - 현미경으로 슬라이드를 관찰하여 각 웰의 무작위 호중구 100개를 세고 식세포작용에 대한 PMN 양성과 음성을 구별합니다.
참고: PMN 세포막 내 또는 PMN 세포막과 직접 접촉하는 하나 이상의 효모 입자는 식세포작용에 대한 PMN 양성을 나타냅니다. 효모/호중구 비율에 관심이 있는 경우 삼킨 효모 입자의 수도 계산하십시오.
6. 실시간 PMN 화학주성 분석
참고: 이동 분석은15 이전에 설명된 프로토콜과 유사하게 수행되며 다음과 같은 조정이 있습니다.
- 임피던스 기반 실시간 세포 분석기(RTCA) 플레이트의 하부 챔버에 160μL의 화학 유인제(예: fMLP, IL-8, C5 또는 LTB4, 재료 표 참조)를 추가하여 화학주성 그래디언트를 준비합니다. 음성 대조군 및 블랭크의 경우 160μL의 HBSS Ca2+Mg2+를 추가합니다.
- 상부 챔버를 부착하고 25μL의 HBSS Ca2+Mg2+를 추가합니다. 화학주성 그래디언트를 형성하기 위해 실온에서 최소 1시간 동안 배양합니다.
- 세포 활성화 60분 후 세포 현탁액을 부드럽게 혼합하고 60μL의 세포 현탁액을 상부 챔버에 놓습니다. 블랭크에 HBSS Ca2+Mg2+ 60μL를 추가합니다.
- RTCA 플레이트를 놓고 60시간 동안 2초마다 세포 지수(CI)를 측정하도록 RTCA 소프트웨어를 프로그래밍합니다.
알림: RTCA 플레이트는 앞서 설명한 대로 재사용을 위해 세척할 수 있습니다16. 요약하면, RTCA 챔버와 전극을 인산염 부퍼 식염수(PBS)로 세 번 세척한 다음 유형 I 초순수로 두 번 세척합니다. 하부 및 상부 챔버를 0.25% 트립신 0.53mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)으로 40분 동안 배양합니다. 초순수로 세 번 씻으십시오.
7. NET 암시 분석
- 세포 활성화 10분 후 세포 현탁액을 부드럽게 혼합하고 평가 중인 각 활성화 시스템에서 4μL의 PMN을 깨끗한 유리 슬라이드의 두 웰로 나눠 전달합니다. 37°C의 가습 챔버에서 30분 동안 배양합니다.
- 웰 중 하나에 1μL의 DNAse I를 추가하고 37°C(습식 챔버)에서 20분 동안 배양합니다.
- 슬라이드를 건조시키고 이전에 "호중구 분리" 섹션의 2.9단계에서 설명한 대로 빠른 파놉틱으로 염색합니다.
- 현미경으로 슬라이드를 평가합니다.
참고: 거미줄과 같은 구조가 있는 NET 릴리스의 징후를 찾습니다. 일단 확인되면 DNAse I 처리가 이러한 구조를 제거할 수 있는지 확인합니다. 이 분석은 존재를 확인하기 위해 추가 테스트가 필요하기 때문에 NET 형성을 시사합니다.
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Representative Results
이 연구에서 사용된 밀도 기반 분리 방법(그림 1)은 제안된 실험의 기준을 충족했습니다. 이 방법에서 얻은 호중구 매개변수에는 생존율≥98%, 순도 ≥94% 및 세포 수율 ≥1.5 x 107이 포함되었으며 스크리닝 테스트로 활성화가 감지되지 않았습니다. PMN 분리의 두 가지 관련 단계는 항응고와 적혈구 제거입니다. 밀도 구배 위에 겹겹이 쌓이기 전에 항응고 혈액 튜브 또는 주사기를 부드럽게 흔들어 놓고 활성화와 오염을 모두 방지하기 위해 RBC 제거 방법을 선택하면 실험 수율과 재현성에 영향을 미칠 수 있습니다.
호중구 기능의 기능적 개요를 평가하기 위해 그림 2와 같이 평균 4시간 동안 최소 2명의 연구원과 함께 제안된 스크리닝 분석을 수행할 수 있는 워크플로우가 개발되었으며, 1시간의 활성화와 2시간의 실시간 이동 모니터링이 가능합니다.
그림 2: NeutroFun Screen 워크플로우. 평가 중인 특정 조건에 의해 트리거된 기능적 반응 패널을 평가하기 위해 NeutroFun Screen 워크플로우에는 최소 2명의 연구원이 참여합니다. 연구원 1(R1)은 PMN 분리 과정을 시작한 후 세포 농도 조정 및 활성화 시스템 배양을 수행하고, 동시에 연구원 2(R2)는 다음 분석을 수행하기 위한 재료를 준비합니다. R2는 실시간 마이그레이션 및 NBT 슬라이드 테스트를 수행합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
고전적인 NBT 분석법(17)은 PMN에 의해 생성된 ROS와 NBT의 반응으로 인한 포르마잔 형성의 슬라이드 및 분광광도계 평가 모두에 최적화되었습니다. 분광광도계 분석은 조건 간의 상대적 정량화를 가능하게 하는 반면, 현미경 분석은 결정 분포의 규칙성, 형태 및 포르마잔을 포함하는 세포 수를 평가하는 기술 및 반정량 분석에 유용했습니다. 분광광도계 분석의 결과는 그림 3A에 나와 있으며, 이는 100nM PMA가 fMLP 및 대조군에 비해 ROS 생성률 상승(평균 3:2:1 비율)을 유도했음을 나타냅니다. NBT 슬라이드 테스트 결과(그림 3B)는 분광광도계 결과를 확증했으며, 이전에 세포분석(18)에 의한 ROS의 직접 측정에 의해 입증된 바와 같이 PMA가 fMLP(그림 3C)에 비해 가장 강렬한 ROS 생성 유도 자극임을 보여주었습니다. 세포 계수와 관련하여, 포마잔 결정을 함유한 호중구의 수는 PMA:fMLP:대조군 조건에서 7:4:1의 비율을 보였으며, fMLP와 PMA 활성화 PMN 간에 서로 다른 포름마잔 분포 패턴을 나타냈습니다. fMLP 처리는 개별 세포를 집중적으로 활성화시키는 반면, PMA는 대부분의 PMN에서 세포질 전체에 흩어져 있는 포르마잔 결정의 형성을 유도했습니다. 또한, PMA 처리 후 발현 세포 응집과 같은 조건을 구별하는 몇 가지 형태학적 특성이 관찰되었습니다. 대조군에서 이러한 전형적인 활성화 특성의 부재와 낮은 수준의 포르마잔은 휴지 상태가 크게 방해받지 않았음을 나타냅니다. 따라서 NBT 분석은 ROS 생성을 유도하기 위해 주어진 자극의 용량과 강도를 개관하는 데 사용할 수 있는 호중구 ROS 생성에 대한 간단하고 저렴하며 신뢰할 수 있는 테스트임이 입증되었습니다.
그림 3: NBT 테스트. (A) 포마잔 흡광도(490-630nm)에 의한 다양한 조건(음성 대조군: 100nM fMLP 및 100nM PMA)에 대한 호중구 호흡 파열의 분광 광도계 평가. 4명의 기증자의 데이터는 평균 ± 표준 편차(SD)로 표시됩니다. * = 모든 그룹이 서로 다릅니다(p≤ 0.05). £ = CTRL과 PMA 및 fMLP와 PMA를 비교하면 유의미한 차이가 있습니다(p≤ 0.05). (B) 슬라이드 테스트는 포름마잔 침전물의 강도, 세포 내 위치 및 세포 응집을 특성화하여 정성적으로 분석할 수 있습니다. 검은색 화살표는 포마잔 결정을 가리킵니다. 스케일 바: 20 μm. (C) 광학 현미경으로 계산한 포르마잔을 포함하는 PMN의 수. 평균 ± SD로 제시된 8명의 기증자의 데이터. *** p < 0.0001, 스튜던트 t-검정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
식세포작용 슬라이드는 그림 4와 같이 식세포작용을 수행하는 호중구의 백분율로 식세포작용 비율을 결정하는 데 사용되었습니다. 100nM fMLP와 16μM 항균 펩타이드 모두 효모 삼킴을 증가시켰지만, 대조군에 비해 식세포작용이 유의하게 향상되고 이중 자극에 대한 반응을 시사할 수 있는 이중 자극이 있을 때까지 그 차이는 통계적으로 유의하지 않았습니다.
그림 4: 식세포작용 테스트. 호중구는 식세포작용 능력(효모를 함유한 호중구의 계수)에 의해 평가되었습니다. 효모 배양 전에 100nM fMLP 또는 16μM 항균 펩타이드에 노출되면 대조군에 비해 식균작용이 향상되었지만, (A) 증가는 통계적으로 유의하지 않았습니다. 흥미롭게도, fMLP를 사용한 초기 배양 후 항균 펩타이드를 첨가한 결과, 인간 호중구에서 식균작용이 크게 향상되었습니다(CTRL과 fMLP+ 항균 펩타이드 사이의 별표). (B) 검은색 화살표는 효모 세포를 나타내고, 녹색 화살표는 호중구만을 나타내고, 빨간색 화살표는 식세포 호중구를 나타냅니다. 평균 ± SD로 제시된 5명의 기증자 데이터. 스케일 바: 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
실시간 세포 이동 결과의 예는 호중구에 대한 100nM fMLP의 잘 알려진 화학주성 효과를 나타내는 그림 5에 나와 있습니다. 세포 이동 역학은 Gompertz 모델에 맞게 조정되어 매개 변수를 비교할 수 있습니다.
그림 5: 실시간 셀 이동. 셀 인덱스는 셀 이동으로 인한 전기 임피던스를 반영합니다. 이 분석에서 fMLP는 하부 챔버에 100nM fMLP를 추가하여 호중구 이동의 양성 대조군으로 사용되었습니다. 네거티브 대조군(CTRL)은 하부 챔버에 HBSS만 포함했습니다. 중첩된 곡선은 오르막 및 내리막 경사에 가장 잘 맞도록 수정된 Gompertz 모형에 대한 곡선 피팅을 나타냅니다. 평균 ± SD.* p < 0.05로 제시된 3명의 기증자 데이터, 스튜던트 t-검정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
마지막으로, NET의 존재를 암시하는 간단한 광학 현미경 테스트가 제시되며, 여기서 PMN은 빠른 파놉틱으로 염색됩니다. PMA 또는 일부 항균 펩타이드와 같은 일부 특정 NET 유도 자극의 경우 짧은 활성화 시간(1시간) 후에도 세포 근처에서 사상체 거미줄과 같은 구조를 관찰할 수 있는 반면, 음성 대조군 및 fMLP와 같은 다른 조건에서는 불가능함을 관찰할 수 있습니다(그림 6). 이 주장을 더 잘 뒷받침하기 위해 100nm PMA 또는 항균 펩타이드로 세포 활성화 40분 후에 DNase I을 추가하여 NET 유사 구조를 제거했습니다(그림 6). 이 방법은 NET 특성화에 적합하지 않고 아티팩트의 영향을 받을 수 있지만, 특히 자극의 효과를 알 수 없거나 제대로 설명되지 않은 상황에서 NET 분석에 대한 추가 투자를 정당화할 수 있는 저렴하고 간단하며 흥미로운 출발점입니다.
그림 6: NET 형성 암시 분석. 유리 슬라이드에서 활성화 1시간 후 panoptic-stained 호중구의 정성 분석은 NET 방출을 나타낼 수 있습니다. CTRL(A,B) 및 fMLP(C,D) 그룹은 NET 방출의 징후를 나타내지 않은 반면, PMA(E-H)를 사용한 활성화는 DNase I 처리(I-L)에 의해 분해된 NET 유사 구조의 형성을 유도했습니다. 호중구에 대한 항균 펩타이드의 효과에 대한 조사는 슬라이드가 DNase I(Q-T)에 의해 분해된 NET 유사 구조(M-P)를 제시했기 때문에 이러한 자극이 NET 방출을 유도할 수 있음을 보여주었습니다. 빨간색 화살표는 NET과 유사한 구조를 가리킵니다. 스케일 바: 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
호중구는 수명이 짧고 아직 냉동 보존할 수 없는 매우 역동적이고 반응성이 뛰어난 세포입니다19 따라서 생물학에 대한 조사가 어렵습니다. 그러므로, 생존 가능하고, 풍부하고, 안정된 호중구를 얻기 위해 신중한 단계를 따르는 것이 필수적이다11,20. 이 연구는 부드럽고 최소한의 조작과 활성화 단계까지 저온의 사용을 강조하는 밀도 기반 격리 기술을 사용했습니다. 또한 혈액 처리는 정맥 천자 후 30분 이내에 이루어져야 하며 실온에서 보관해야 합니다. 본 연구는 조작 스트레스와 실험 시간을 줄일 수 있는 옵션을 제시합니다. 이 과정을 더욱 단순화하기 위해, 우리는 프로토콜에 새로운 단계(옵션)를 도입했는데, 이는 단일 용혈 절차 후 적혈구층의 부드러운 재현탁 및 흡인에 의해 적혈구를 제거하는 것을 포함합니다. 이 단계는 단 한 번의 저긴장성 용혈 단계로 대부분의 적혈구를 제거하므로 조작 스트레스와 실험 시간을 줄여줍니다. 그러나 작업자 기술은 이 단계의 효율성에 큰 영향을 미치며 항상 적혈구를 완전히 제거하지는 않을 수 있습니다. 또한, 적혈구 흡인은 호중구의 손실로 이어질 수 있지만, 적혈구층에 더 가깝게 수집할 때 더 많은 호중구가 처음에 그래디언트에서 회수되었기 때문에 수율에 영향을 미치지 않습니다. 따라서 분석에 가능한 가장 높은 순도가 필요하지 않거나 작업자가 지속적으로 좋은 결과를 얻은 경우 RBC 흡인을 권장합니다. 여기에 제시된 스크리닝 테스트의 경우 소량의 오염 물질 적혈구(<3%)가 결과를 방해하지 않습니다.
시약 준비를 포함한 모든 절차가 적시에 수행되도록 하기 위해 두 연구원 간의 작업 및 작업 분담 일정을 자세히 설명하는 워크플로우(그림 2)가 제공됩니다. 모든 기능 분석이 완료된 후 나머지 세포는 적절한 용해 완충액 및 보관을 통한 세포 용해에 의한 오믹스 연구와 같은 추가 분자 조사를 위해 준비할 수 있습니다.
ROS 생산
호흡 파열은 호중구 프라이밍 및 활성화의 특징이며,18,21, ROS 생성 평가는 호중구의 활성화 상태를 추정하는 데 사용되는 일반적인 방법입니다. 이 연구는 광학 현미경과 분광 광도법의 두 가지 접근 방식을 사용하여 ROS 생산을 평가했습니다.
NBT 검사는 호중구의 호흡 파열을 평가하는 잘 알려진 접근법이다22,23. 일반적으로 사용되는 두 가지 방법은 광학 현미경 기반 (또는 슬라이드 테스트) 및 분광 광도 측정 기반 분석(24,25,26)입니다. 광학 현미경을 사용하면 세포 수준에서 세부 사항을 시각화할 수 있지만 사용자 편향이 발생하기 쉽습니다. 따라서 NBT 슬라이드 테스트는 포름마잔 형성 패턴, 강도 및 세포 응집과 같은 표현형 특징에 관한 분광광도계 분석을 정성적으로 보완하는 역할을 합니다.
NBT 슬라이드와 분광광도계 테스트의 중요한 단계는 NBT 및 포르마잔 완전 용해입니다. 제조업체의 권장 사항과 달리 NBT는 물에 잘 녹지 않습니다. 그러나 DMSO에서 NBT를 최소 15분 동안 균질화한 다음 물/HBSS를 첨가하고 2분 동안 와류를 생성하면 완전한 용해가 가능합니다. 또한 포르마잔의 흡광도를 분석하려면 (1) PMN 용해에 의한 세포에서 포르마잔 결정의 방출과 (2) 포르마잔 결정의 완전한 용해라는 두 가지 중요한 단계를 달성해야 합니다. 두 단계 모두 세포 펠릿을 10 % SDS로 처리함으로써 달성되었습니다., 최근에 제안된 바와 같이,27, 570 nm에서 상층액의 초음파 처리 및 흡광도 분석이 뒤따랐다.
또한, 음성 및 양성 대조군의 NBT 결과는 평가할 스크리닝의 첫 번째 단계입니다. 포르마잔을 통한 ROS 생산 평가는 분리 과정이 자극 또는 억제에 의해 세포의 휴지 상태에 원치 않는 변화를 일으켰는지 여부를 나타내기 때문에 이 단계는 현저한 차이를 보여야 합니다.
시토크롬 c 환원(28) 또는 유세포 분석(29)과 같은 다른 방법들은 종종 ROS 검출에 사용된다; 그러나 스크리닝 접근 방식을 고려할 때 적용에는 더 긴 실험 시간, 특정 마커 사용 및 값비싼 기기가 필요합니다. 루미놀/이소루미놀의 화학발광은 ROS를 검출하는 동시에 세포 내 및 세포 외 ROS를 분화할 수 있는 빠르고 비용 효율적인 방법입니다. 그러나, 이 방법(30,31)에는 광도계가 필요하다. 시설을 사용하면 기기 비용을 피할 수 있지만 다른 분석과 동시에 수행되는 스크리닝 분석에는 여전히 적합하지 않습니다.
식세포작용(Phagocytosis)
PMN/효모 배양은 식세포작용을 수행하는 호중구의 수와 호중구당 삼켜진 효모의 수를 계산하여 호중구 식균작용 용량 및 효능에 대한 개요를 제공합니다. 그러나 효모 입자 자체가 활성화 신호이기 때문에 대조군과 전처리된 PMN을 비교하면 이중 자극 시스템이 구성되며, CTRL과 fMLP 처리된 PMN의 비교에서 볼 수 있듯이 큰 변화가 나타나지 않을 수 있습니다(그림 4). 그럼에도 불구하고, 이 분석법은 잠재적인 조절제가 식세포작용에 대한 어떠한 영향도 발생시킬 것인지 여부를 나타내는 데 유용합니다. 새로운 항균 펩티드가 이 분석을 사용하여 시험되었고, 그 결과는 이러한 자극의 조합에 대한 흥미로운 잠재적 반응을 나타내며, 이는 효율적인 활성화를 위해 필요한 것으로 최근에 논의되었다32.
이 분석의 중요한 단계는 염색인데, 슬라이드를 panoptic No. 3(hematoxylin)에 ≥3초 동안 유지하면 분석의 신뢰성이 떨어지기 때문입니다. 이는 효모 세포와 호중구 핵엽을 서로 구별할 수 없기 때문입니다. 또한, 이 접근법은 조절제에 노출된 후 호중구의 형태 분석을 가능하게 합니다. 유세포 분석은 식세포작용(phagocytosis)을 분석하기 위한 또 다른 효율적인 기법이지만(33), 이전 주제에서 논의한 바와 같이, 막에 결합된 입자와 삼켜진 입자 및 제안된 스크리닝 세트와 관련된 다른 요인을 구별하는 데 어려움이 있어 한계가 있습니다. 본 명세서에 기술된 방법에서도 동일한 제한이 관찰되지만, 이는 후속 연구를 안내하기 위한 초기 스크리닝으로 고려되어야 한다.
실시간 마이그레이션
실시간 스크리닝 프로토콜은 PMN의 마이그레이션 용량을 평가하기 위해 최적화되었습니다. 이전 연구에서는 음성 대조군과 IL-8 처리간의 차이를 보여주기 위해 이동 분석을 위해 RTCA 플레이트의 밑면을 코팅해야 한다고 제안했지만, 이 연구에서는 코팅제를 추가하지 않고 fMLP 처리된 세포에 대해 높은 신뢰 구간(CI) 값을 보여주었습니다. 그 결과 12분 이후 상당한 이동과 함께 높은 재현성을 보였습니다. 또한, 획득한 이동 데이터의 곡선 피팅 분석은 이동의 역학을 이해하는 데 유용한 세포 인덱스 최대값 및 기울기 증가 및 감소와 같은 매개변수를 나타낼 수 있으며, 농도에 따라 달라지거나 조건에 따라 다를 수 있습니다. 호중구 이동 곡선(그림 5)에 가장 적합한 것은 조정된 Gompertz 함수34에 대한 것으로, fMLP가 최대 세포 지수와 증가된 기울기를 증가시킨다는 것을 보여줍니다.
RTCA 시스템의 기포는 전극을 통과하는 세포를 차단하여 실험을 손상시킬 수 있으므로 특별한 주의가 필요합니다. 제한 요인은 플레이트의 높은 비용입니다. 보다 저렴한 기술들이 세포 이동을 분석하지만, 이들은 양호한 재현성이 결여되어 있거나, 보이든 챔버(Boyden chamber)(35)와 같이 어렵고 시간이 많이 걸린다. 따라서 RTCA는 여기에 제시된 다른 선별 검사와 호환되는 신뢰할 수 있는 마이그레이션 분석입니다.
그물
마지막으로, NET 형성의 예비 평가를 위한 유망하고 쉽고 저렴한 분석법이 광학 현미경을 사용하여 개발되었습니다. 이는 식세포작용 슬라이드를 관찰한 결과, 식세포작용 능력에 대한 효과를 테스트한 특정 NET 유도 자극인 PMA도 CTRL 및 fMLP 그룹에 비해 거미줄과 같은 구조 형성을 유도했습니다. 이 작업에서는 이러한 구조가 NET 릴리스를 나타낼 수 있다는 가설을 세웠습니다. 이러한 가설은 활성화 후 샘플을 DNase I으로 처리하여 테스트되었으며, PMA 활성화 호중구에서는 사상체 구조가 발견되지 않았습니다. 이러한 구조가 NET일 가능성이 높다는 가정은 PMA가 NET 형성36,37의 잘 알려진 유도 인자로 인용된다는 사실, NET에 대한 특정 마커를 사용한 형광 현미경 검사에 의한 유사한 구조의 발견 및 DNase I40,41에 의해 촉매되는 NET의 분해에 근거합니다. 이것은 NET 형성을 확인하는 방법이 아니라 NET의 존재를 암시하는 예비 스크리닝일 뿐이라는 점을 강조하는 것이 중요합니다. 이 검사는 NET을 염색 아티팩트와 혼동할 수 있기 때문에 한계가 있지만, 다른 기능 검사와 함께 수행할 수 있는 빠르고 저렴한 스크리닝에서 NET 형성을 제안하는 데 중요한 역할을 합니다. 일단 스크리닝되고 있는 연구와 관련될 가능성이 있는 것으로 검출되면, NET은 후술하는 바와 같이, 공초점 또는 전자 현미경(42)에 의해 추가로 평가될 수 있다.
우리 연구실에서는 면역 조절 활성을 가질 가능성이 있는 새로운 항균 펩타이드가 이 스크리닝 분석 세트에 의해 자주 평가되어 일부 펩타이드가 인간 호중구에 미치는 영향에 대한 추가 분석을 더 잘 안내할 수 있으며, 일부는 흥미로운 ROS43, 식균작용, 이동 및/또는 NET 조절 특성을 보여줍니다.
결론적으로, NeutroFun Screen은 테스트되지 않은 많은 화합물에서 정상 밀도 호중구 활성의 잠재적 조절자를 식별하는 데 유용한 도구를 제공합니다. 그러나 이 방법은 예비 스크리닝 역할만 한다는 점에 유의해야 합니다. 이 초기 스크리닝 후에는 더 비싸고 시간이 많이 소요되는 고급 방법론을 데이터 검증을 위한 이러한 첫 번째 결과에서 제안하는 특정 기능 또는 경로로 안내할 수 있습니다. ROS 생성, 식세포작용 및 NET 형성을 위해 데이터 검증 및 추가 정량적 결과를 얻기 위한 대체 방법이 있습니다. NET 시각화 및 정량화는 최근42에서 자세히 설명한 바와 같이 골수과산화효소 및 호중구 엘라스타제와 같은 세포외 DNA 및 과립 단백질의 존재 및 중첩을 결정하는 면역형광 현미경 분석을 통해 수행할 수 있습니다. ROS는 많은 생물학적 과정에서 서로 다른 중요한 역할을 하므로 ROS에 대한 연구는 매우 광범위하고 다양합니다. 가장 확립된 방법론 중에는 효소 결합 면역 흡착 분석(ELISA) 및 발광의 면역블로팅과 같은 항체를 사용하는 방법론 또는 DCFDA, EPR 분광법 및 효소 활성 측정을 통한 다양한 표지 하에서 세포의 유세포 분석과 같은 형광 검출이 있습니다44. 유사하게, 강력한 식균작용 평가도 여러 가지 방법으로 수행됩니다. 대안적인 방법으로는 유세포 분석법 단독45,46 또는 형광 현미경 검사(47)와 결합하는 방법이 있습니다. 설명된 실시간 세포 이동은 추가 검증이 필요하지 않고 다른 방법론으로는 고려할 수 없는 파라미터를 제시하는 강력하고 충분한 분석법입니다. 이러한 방법의 다른 조합은 특정 시나리오에 더 적합할 수 있지만, 요약하면 이것은 많은 호중구 활동을 포괄하는 빠르고 저렴한 조합을 나타냅니다.
요약하면, 이 연구는 고급 방법론에 대한 노력을 더 잘 지시하는 방법으로 새로운 분자 및 조건에 대한 여러 호중구 반응을 평가하기 위해 간단하고 빠르며 저렴한 방법론으로 구성된 일련의 분석을 제공하는 것을 목표로 합니다. 주요 한계점으로, ROS, NET 및 phagocytosis assay의 결과는 예비적인 것으로 간주되어야 하며 보다 구체적이고 정교한 assay에 의한 추가 검증이 필요하며, 자동화되지 않은 현미경 세포 계수에 의존하는 결과는 무의식적인 편향이 발생하기 쉽습니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
저자는 FAPDF, CNPq, CAPES, UnB, FINEP 및 FINATEC과 같은 자금 지원 기관을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CIM-Plate 16 | Agilent | 5665825001 | |
| CLARIOstar Plate Reader | BMG LABTECH | US Patent Number 9,733,124 Product details: MARS Data Analysis Software |
|
| Dimethyl sulfoxide | Dinâmica | 1582 | |
| DNAse I | Sigma - Aldrich | DN 25 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma - Aldrich | E5134 | |
| Fast panoptic stain | Laborclin | 620529 | |
| Glass slide | Exacta | 7102 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution with calcium, with magnesium, without phenol red. | Sigma - Aldrich | 55037C | |
| Hank’s Balanced Salt Solution without calcium chloride, magnesium sulfate and sodium bicarbonate. | Sigma - Aldrich | H4641 | |
| Heparin | Blau | 7896014655229 | |
| Laminar flow cabinet | Veco | VLFS-12 | |
| Microscope | Zeiss | 415501-0101-002 | Product details: Primostar 1 |
| Mixing Block | BIOER | MB-102 | |
| Neubauer improved bright-lined | New Optik | 1110000 | |
| N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine | Sigma - Aldrich | F3506 | |
| Nitroblue tetrazolium | Neon | CAS 298-83-9 | |
| Percoll | Cytiva | 17089101 | separation media |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma - Aldrich | P8139 | |
| Phosphate buffered saline tablet | Sigma - Aldrich | P4417 | |
| ROTOFIX 32 A | Hettich | 1206 | |
| Saccharomyces cerevisiae | Fleischmann | ||
| Safranin | Sigma - Aldrich | 50240 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Cytiva | 17-1313-01 | |
| Sonicator | Qsonica | Q125 | |
| Trypan blue solution | Vetec | C.I. 23850 | |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries, Inc. | 0K-0500-902 | |
| xCELLigence Real-Time Cell Analysis (RTCA) DP (dual purpose) | Agilent | 380601050 | Product details: RTCA system composed of detection hardware, cell plates and software |
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