Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Et sæt screeningsteknikker til et hurtigt overblik over neutrofilfunktionen

Published: February 9, 2024 doi: 10.3791/65329
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1, 1
1Laboratory of Protein Chemistry and Biochemistry, Department of Cell Biology, University of Brasilia, 2Institute of Physics, University of Brasilia

Summary

Denne protokol indeholder et sæt neutrofile funktionelle assays, der skal bruges som screeningsmetode til at dække funktioner fra forskellige signalveje. Protokollen indeholder en indledende og enkel evaluering af cellelevedygtighed, renhed, produktion af reaktive iltarter, realtidsmigration, fagocytose og et foreløbigt forslag til neutrofile ekstracellulære fælder.

Abstract

Neutrofiler er kendt som en af de første forsvarslinjer i det medfødte immunrespons og kan udføre mange særlige cellulære funktioner, såsom kemotaxis, omvendt migration, fagocytose, degranulering af cytotoksiske enzymer og metabolitter og frigivelse af DNA som neutrofile ekstracellulære fælder (NET'er). Neutrofiler har ikke kun stramt reguleret signalering selv, men deltager også i reguleringen af andre komponenter i immunsystemet. Da friske neutrofiler er terminalt differentierede, kortvarige og meget variable blandt individer, er det vigtigt at få mest muligt ud af de indsamlede prøver. Forskere har ofte brug for at udføre screeningsanalyser for at vurdere et overblik over de mange neutrofile funktioner, der kan påvirkes af specifikke forhold under evaluering. Et sæt tests efter en enkelt isolationsproces af neutrofiler med normal densitet blev udviklet for at imødekomme dette behov og søge en balance mellem hastighed, omfattende, omkostninger og nøjagtighed. Resultaterne kan bruges til at ræsonnere og vejlede dybdegående opfølgningsundersøgelser. Denne procedure kan udføres i en gennemsnitlig tid på 4 timer og inkluderer evaluering af cellelevedygtighed, produktion af reaktive iltarter (ROS), migration i realtid og fagocytose af gær på glasglas, hvilket efterlader nok celler til mere detaljerede tilgange som omics-undersøgelser. Desuden omfatter proceduren en måde til let at observere et foreløbigt forslag til NET'er efter hurtig panoptisk farvning observeret ved lysmikroskopi med mangel på specifikke markører, omend nok til at indikere, om yderligere bestræbelser på denne måde ville være umagen værd. Mangfoldigheden af testede funktioner kombinerer fælles punkter blandt test, hvilket reducerer analysetiden og udgifterne. Proceduren blev navngivet NeutroFun Screen, og selvom den har begrænsninger, balancerer den de førnævnte faktorer. Desuden er formålet med dette arbejde ikke et bestemt testsæt, men snarere en retningslinje, der let kan tilpasses det enkelte laboratoriums ressourcer og krav.

Introduction

Neutrofiler er de mest rigelige medfødte immunceller i humant blod og er kendt for at spille en vigtig rolle i infektion og betændelse, idet de er de første respondenter, der ankommer til stedet for vævsskade1. I de senere år har der været en voksende anerkendelse af den afgørende rolle, som neutrofiler spiller i en række sygdomme og i at støtte homeostase2. Neutrofiler har ikke kun stramt reguleret signalering selv, men deltager også i reguleringen af andre komponenter i immunsystemet 3,4,5. Derfor er det bydende nødvendigt at undersøge neutrofiler og deres mange usædvanlige cellulære funktioner, såsom kemotaxis, omvendt migration6, fagocytose7, respiratorisk burst8 og frigivelse af neutrofile ekstracellulære fælder (NETs)7, i adskillige forskningssammenhænge, hvor det er nødvendigt at vurdere de potentielle neutrofile funktionelle, morfologiske eller molekylære ændringer udløst af specifikke forhold under analyse.

Frisk isolerede neutrofiler er terminalt differentierede, kortvarige, meget dynamiske og let aktiverede9. Imidlertid er der endnu ikke opnået en effektiv lagringsmetode, der ikke påvirker neutrofilresponserne, hvilket gør det udfordrende at udføre flere assays, der skal være uafbrudte. Desuden er tidligere beskrevne funktionelle analyser 10,11, baseret på assays, der kræver cytometri og / eller fluorescerende farvning, muligvis ikke et levedygtigt valg, når en bred og indledende evaluering af neutrofilen er nødvendig.

For at løse disse problemer beskriver denne protokol et sæt tests, der kan udføres efter en enkelt isolationsproces, herunder evaluering af cellelevedygtighed, produktion af reaktive iltarter (ROS), migration i realtid og fagocytose af Saccharomyces cerevisiae, hvis resultater kan bruges til at begrunde dybdegående opfølgningsundersøgelser. Denne procedure, kaldet NeutroFun Screen, blev designet til at omfatte de førende effektoraktiviteter, undtagen degranulering, og kan afsluttes i en gennemsnitlig tid på 4 timer, inklusive 1 times aktivering. Derudover kan de resterende celler bruges til mere detaljerede tilgange som omics-undersøgelser. Fordelen ved denne metode ligger i dens balance mellem hastighed, omfattende, omkostninger og nøjagtighed.

Desuden er der en måde, hvorpå man let kan observere et foreløbigt forslag om NET'er uden specifikke markører, men nok til at indikere, om yderligere bestræbelser i den retning ville være umagen værd. Mangfoldigheden af testede funktioner sigter mod at kombinere fælles punkter blandt test, hvilket reducerer analysetiden og omkostningerne. Hovedformålet med denne metode er at give en afbalanceret, funktionel analyse vedrørende hastighed, omfattende, omkostninger og nøjagtighed, der giver mulighed for et overblik over neutrofilens respons, hvilket gør det til et nyttigt indledende skridt i undersøgelsen af virkningerne af nye stimuli på neutrofiler med normal densitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimenter fulgte nøje de etiske retningslinjer, der blev fastsat af det institutionelle gennemgangsudvalg ved University of Brasilia (proces 13364819.0.0000.5558), og prøver blev identificeret med koder for at sikre donoranonymitet. Cellerne blev opnået fra normale raske mandlige donorer i alderen 18-35 år, som underskrev det informerede samtykke og opfyldte følgende kvalifikationskriterier: ikke-rygere / dampere, ingen kroniske helbredstilstande og ingen historie med inflammatoriske tilstande i de sidste 14 dage.

1. Blodindsamling

  1. Anbring 0,3 ml 5.000 IE/ml heparin aseptisk (se materialetabellen) i en steril 20 ml sprøjte for at heparinisere den.
  2. Påfør en venøs tourniquet ca. 4 ind over punkteringsstedet og identificer median cubital eller cephalic vene for venipunktur.
    BEMÆRK: Sørg for, at den samlede turneringstid ikke overstiger 1 min.
  3. Rengør punkteringsstedet med 70% alkohol og udfør venipunktur.
  4. Vend forsigtigt sprøjten tre eller fire gange efter opsamling af blodet for at blande blod og heparin korrekt.

2. Neutrofil isolering

BEMÆRK: Polymorfonukleære leukocytter (PMN'er) isoleres gennem densitetsgradientcentrifugering efterfulgt af hypotonisk lyse af de resterende røde blodlegemer (RBC), som tidligere beskrevet11 med nogle ændringer. Denne metode er ikke obligatorisk for at udføre screeningsanalyserne og kan erstattes, så længe den valgte metode resulterer i en levedygtighed på >97%, priming eller aktivering af <3% af PMN'erne og giver nok celler til alle assays, replikationer og betingelser. Det er obligatorisk at udføre disse trin under aseptiske forhold og anvende endotoksinfrie opløsninger for at undgå celleaktivering.

  1. Der fremstilles 12 ml fortyndinger af 60 % og 70 % separationsmedier (kommercielt tilgængelige; se materialetabel) i 50 ml koniske rør.
  2. Forbered gradienten fra bund til top ved at tilsætte 4 ml ad gangen med 60 % fortynding over 70 % fortyndingen ved hjælp af en 5 ml pipette. Gør dette forsigtigt for at forhindre blanding af grænsefladen.
  3. Lag forsigtigt 12 ml hepariniseret blod oven på densitetsgradienten. Der centrifugeres ved 200 x g i 15 minutter ved stuetemperatur.
    BEMÆRK: Fra dette trin og fremefter, indtil PMN-aktivering, skal alle anvendte reagenser og rør opbevares i en køler fyldt med is.
  4. Kassér plasma/mononukleært cellelag, og overfør derefter forsigtigt laget over erytrocytpelleten til to 15 ml koniske rør med ca. 7,5 ml i hver. Der fyldes op i rørvolumen med Hanks afbalancerede saltopløsning (HBSS; se materialetabel).
  5. Der centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved 19 °C.
  6. Vask cellepillen med HBSS.
    1. Supernatanten kasseres ved at hælde glasset og opslæmmes forsigtigt igen i 7 ml HBSS.
    2. Der centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved 19 °C for at fjerne alle separationsmedier.
  7. Udfør hypotonisk lyse af de resterende RBC'er.
    1. Supernatanten kasseres, og pellets kombineres i et enkelt glas.
    2. RBC/PMN-pelletten resuspenderes i 3 ml sterilH2O, og der tilsættes 3 ml HBSS (2x) inden for 25 s for at genoprette osmolariteten. Derefter centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved 19 °C.
    3. Gentag trin 2.8.1 og 2.8.2 for en hvid, erytrocytfri pellet.
      BEMÆRK: Supernatanten skal fjernes så hurtigt som muligt for at minimere neutrofilers kontakt med RBC-nedbrydningsprodukter. Alternativt kan den anden hypotoniske lyse erstattes ved forsigtigt at resuspendere det resterende RBC-lag og fjerne al supernatanten, da de resterende RBC'er vil sedimentere over PMN-pelleten.
  8. Supernatanten kasseres ved at hælde glasset, PMN'erne resuspenderes forsigtigt i den resterende buffer og overføres til et iskoldt mikroglas.
    BEMÆRK: Sørg for at annotere lydstyrken, mens du overfører de ophængte celler med en mikropipette.
  9. Overfør 3 x 1 μL af cellesuspensionen til et rent glasglas (tre huller på 1 μL hver) og pletter med hurtig panoptisk (se materialetabel) til morfologi og renhedsevaluering12.
    1. For at plette med hurtig panoptisk nedsænkes diaset fem gange i panoptisk fikseringsmiddel nr. 1, seks gange i eosin nr. 2 og to gange i hæmatoxylin nr. 3, hvor hver nedsænkning varer 1 s.
    2. Vask forsigtigt glasglasset med destilleret vand.
    3. Lad det dræne og lufttørre.
  10. Overhold under et mikroskop og tæl 300 tilfældige celler i hver brønd, og differentier således neutrofilerne fra andre granulocytter.
  11. Overfør 1 μL af cellesuspensionen til 49 μL 0,2% trypanblåt farvestof13, og tæl cellerne ved hjælp af et Neubauer-kammer, idet der skelnes mellem døde og levedygtige celler.
  12. Cellekoncentrationen justeres til 6.667 celler/μl ved hjælp af en opløsning af 50 % autologt plasma og 50 % HBSS suppleret med calcium og magnesium. Opslæmningen på 6,667 celler/μl fordeles ligeligt mellem mikroglassene svarende til de betingelser, der skal testes, inklusive den negative kontrol.
    BEMÆRK: Enhver cellekoncentration svarende til de cirkulerende neutrofiler i modelorganismen kan anvendes, men det er vigtigt at bruge den samme cellekoncentration i alle eksperimenter for reproducerbarhed.

Figure 1
Figur 1: Den neutrofile isolationsprotokol. To koncentrationer af separationsmediet (percoll) (A) stables (B), hvorefter blodet lægges oven på separationsgradienten (C). Efter centrifugering er PMN i det centrale lag (D), som er opdelt i to 15 ml rør (E). Cellesuspensionen vaskes to gange i HBSS og centrifugeres (G-I) for at fjerne mediet, derefter resuspenderes cellerne, og resterende RBC'er underkastes to runder hypotonisk lyse (J-M). Klik her for at se en større version af denne figur.

3. Forberedelse til neutrofil aktivering

  1. I 1,5 ml mikrorør skal du forberede et aktiveringssystem til hver tilstand, så den endelige cellekoncentration er 6.600 celler / μL. For at teste virkningerne af 100 nM fMLP (N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanin; se materialetabellen) tilsættes f.eks. 5 μL 10 μM fMLP til 495 μL af 6,667 celle/μL suspensionen. For den negative (ustimulerede) kontrol tilsættes HBSS indeholdende Ca2+ og Mg2+.
    BEMÆRK: For at demonstrere denne metode blev følgende endelige koncentrationer af stimuli anvendt: 100 nM fMLP, 16 μM fallaxin, et naturligt forekommende antimikrobielt peptid14 og 100 nM PMA (phorbol 12-myristat 13-acetat) (se materialetabel).
  2. Der inkuberes ved 37 °C uden rotation.
    BEMÆRK: Alle alikvoter til funktionelle assays tages fra denne cellesuspension, i det følgende benævnt aktiveringssystemet.

4. Nitrotetrazoliumblåchlorid (NBT) assay til evaluering af ROS-produktion

  1. Forberedelse af NBT-arbejdsløsning: For hver eksperimentel tilstand skal du forberede en NBT-arbejdsløsning (se materialetabel) på 6 mM ved hjælp af følgende trin:
    1. 0,0005 g NBT opløses i 10 μL dimethylsulfoxid (DMSO) og hvirvel i mindst 15 min.
    2. Tilsæt 90 μL HBSS Ca2+Mg2+ og hvirvel op til 2 min.
      BEMÆRK: Alle trin, der involverer NBT, skal udføres i mørke.
  2. Udfør NBT-diastest.
    1. Efter 20 minutters celleaktivering blandes cellesuspensionen forsigtigt og overføres forsigtigt 2 μL PMN til et rent glasglas. Der inkuberes i 20 minutter i et befugtet kammer ved 37 °C.
      BEMÆRK: Spred ikke celleophænget for meget over diaset; Ellers kan det tørre ud før inkubation.
    2. Tilsæt 1 μL af NBT-arbejdsløsningen over cellerne og inkuber yderligere i 20 minutter beskyttet mod lys.
    3. Tør diaset med varm luft og fastgør det med en dråbe methanol i hver brønd i 1 min. Plet med 0,03% safranin (se materialetabel) i 1 min.
    4. Vask forsigtigt glasglasset med destilleret vand.
    5. Lad objektglasset lufttørre og observere under et mikroskop.
    6. Tæl 100 tilfældige celler i hver brønd, differentiere neutrofiler med og uden formazan aflejringer.
  3. Udfør NBT-spektrofotometrianalyse.
    1. Efter 40 minutters celleaktivering blandes cellesuspensionen forsigtigt og overføres 90 μL PMN fra aktiveringssystemet til et rent mikrorør. Derefter tilsættes forsigtigt 20 μL af 6 mM NBT-opløsningen. Der inkuberes i mørke i 20 minutter ved 37 °C.
    2. Tilsæt 100 μL 10% natriumdodecylsulfat (SDS; se materialetabel) og hvirvel.
    3. Sonikere ved hjælp af en tip-sonikator ved en amplitude på 60%, fem cyklusser på 15 s hver med 15 s intervaller. Centrifuger ved 12.000 x g i 5 min.
    4. 60 μL af supernatanten overføres til en klarbundet plade med 96 huller, og formazanproduktets absorbans måles ved 570 nm.

5. Phagocytose assay

  1. Forbered en 33.000 gær/μl suspension for hver tilstand, som beskrevet nedenfor:
    1. Der tilsættes ca. 0,75 mg tørgær (Saccharomyces cerevisiae; se materialetabellen) til 200 μL HBSS Ca2+Mg2+ og inkuberes i en termomixer ved 100 °C med 500 o/min i mindst 15 minutter.
    2. Homogeniser blandingen ved hvirvelstrøm og overfør 5 μL gærsuspension til 45 μL 0,2% trypanblåt farvestof. Tæl gærene ved hjælp af et Neubauer-kammer.
    3. Koncentrationen af den oprindelige suspension justeres til 33.000 gærceller/μL ved hjælp af HBSS Ca2+Mg2+. Opbevar suspensionen på is indtil brug.
  2. Efter 20 minutters celleaktivering blandes cellesuspensionen forsigtigt og overføres 5 μL af aktiveringssystemet til 5 μL af 33.000 gær/μL Saccharomyces cerevisiae suspensionen i et nyt sterilt mikroglas.
    BEMÆRK: Neutrofil til gærforholdet er 1: 5 (PMN: gær).
  3. 6 μL af PMN/gæropslæmningen overføres straks til tre huller i et rent glasglas (2 μL hver), og objektglasset inkuberes i et befugtet kammer i 40 minutter.
    BEMÆRK: Spred ikke celleophænget for meget over diaset; Ellers kan det tørre ud før inkubation.
  4. Tør objektglasset under varm luft og pletter med hurtig panoptisk som beskrevet i trin 2.9 ovenfor.
    BEMÆRK: Det tredje trin i den hurtige panoptiske farvning er afgørende for mikroskopianalysen af diaset. Farvning af objektglasset i ≥3 s på dette trin kan gøre det uegnet til analyse, da det vil være vanskeligt at skelne gær fra neutrofile nukleare lapper.
  5. Overhold diasene under mikroskopet, tælle 100 tilfældige neutrofiler i hver brønd og skelne mellem PMN'er positive og negative for fagocytose.
    BEMÆRK: Mindst én gærpartikel i eller i direkte kontakt med PMN-cellemembranen indikerer en PMN-positiv for fagocytose. Hvis du er interesseret i gær / neutrofilforholdet, skal du også tælle antallet af gærpartikler, der er opslugt.

6. PMN-kemotakseanalyse i realtid

BEMÆRK: Migrationsanalysen udføres på samme måde som den protokol, der er beskrevet før15, med følgende tilpasninger:

  1. Forbered den kemotaktiske gradient ved at tilføje 160 μL kemoattractant (f.eks. fMLP, IL-8, C5 eller LTB4; se materialetabel) til det nederste kammer på en impedansbaseret realtidscelleanalysator (RTCA) plade. Ved negative kontroller og tomme felter tilsættes 160 μL HBSS Ca2+Mg2+.
  2. Fastgør det øverste kammer, og tilsæt 25 μL HBSS Ca2+Mg2+. Inkuber ved stuetemperatur i mindst 1 time for at danne den kemotaktiske gradient.
  3. Efter 60 minutters celleaktivering blandes cellesuspensionen forsigtigt og anbringes 60 μL cellesuspension i det øverste kammer. Der tilsættes 60 μL HBSS Ca2+Mg2+ til det tomme stof.
  4. Placer RTCA-pladen, og programmer RTCA-softwaren til at måle celleindekset (CI) hver 60. sek. i 2 timer.
    BEMÆRK: RTCA-pladerne kan vaskes til genbrug som tidligere beskrevet16. Sammenfattende vaskes RTCA-kamrene og elektroderne med fosfatbuferred saltvand (PBS) tre gange, derefter med type I ultrarent vand to gange. Inkuber det nedre og øvre kammer med 0,25% trypsin 0,53 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) i 40 min. Vask med ultrarent vand tre gange.

7. NET suggestiv analyse

  1. Efter 10 minutters celleaktivering blandes cellesuspensionen forsigtigt og overføres 4 μL PMN'er fra hvert aktiveringssystem, der evalueres, opdelt i to huller i et rent glasglas. Der inkuberes i et befugtet kammer ved 37 °C i 30 minutter.
  2. Der tilsættes 1 μL DNA I til et af hullerne og inkuberes i 20 minutter ved 37 °C (i et vådt kammer).
  3. Tør objektglasset og pletten med hurtig panoptik, som tidligere beskrevet i trin 2.9 i afsnittet "neutrofilisolering".
  4. Evaluer diasene under et mikroskop.
    BEMÆRK: Se efter enhver indikation af NET-frigivelse, der er kendetegnet ved tilstedeværelsen af weblignende strukturer. Når den er identificeret, skal du bekræfte, om DNAse I-behandlingen var i stand til at fjerne sådanne strukturer. Dette assay tyder på NET-dannelse, da der kræves yderligere tests for at bekræfte deres tilstedeværelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den tæthedsbaserede isolationsmetode, der blev anvendt i denne undersøgelse (figur 1), opfyldte kriterierne for de foreslåede eksperimenter. Neutrofile parametre opnået fra denne metode omfattede levedygtighed ≥98%, renhed ≥94% og celleudbytte ≥1,5 x 107, uden aktivering detekterbar ved screeningstestene. To relevante trin i isoleringen af PMN'er er antikoagulation og fjernelse af RBC. At holde det antikoagulerede blodrør eller sprøjte ved en blid rocking, før lagdeling over densitetsgradienten og vælge en RBC-fjernelsesmetode for at forhindre både aktivering og kontaminering kan påvirke eksperimentets udbytte og reproducerbarhed.

For at vurdere det funktionelle overblik over neutrofilfunktionen blev der udviklet en arbejdsgang, der gjorde det muligt at udføre de foreslåede screeningsassays med mindst to forskere i en gennemsnitlig tid på 4 timer med 1 times aktivering og 2 timers migrationsovervågning i realtid, som vist i figur 2.

Figure 2
Figur 2: NeutroFun Screen-arbejdsgangen. For at vurdere panelet af funktionelle svar udløst af specifikke forhold under evaluering inkluderer NeutroFun Screen-arbejdsgangen deltagelse af mindst to forskere. Forsker 1 (R1) starter PMN-isolationsprocessen efterfulgt af cellekoncentrationsjustering og inkubation af aktiveringssystemet, mens forsker 2 (R2) parallelt forbereder materialerne til at udføre de næste assays, som er opdelt mellem de to: R1 udfører fagocytose, netto og spektrofotometriske NBT-assays; R2 udfører migrerings- og NBT-diastest i realtid. Klik her for at se en større version af denne figur.

Det klassiske NBT-assay17 blev optimeret til både dias- og spektrofotometrisk vurdering af formazandannelsen som følge af reaktionen af NBT med ROS genereret af PMN'er. Det spektrofotometriske assay tillod relativ kvantificering blandt betingelser, mens mikroskopiassayet var nyttigt til beskrivende og semikvantitativ analyse, evaluering af regelmæssigheden af krystalfordeling, morfologi og antal celler indeholdende formazan. Resultaterne af det spektrofotometriske assay er vist i figur 3A, hvilket indikerer, at 100 nM PMA inducerede forhøjet ROS-produktion (i et gennemsnitligt forhold på 3:2:1) sammenlignet med fMLP og kontrolgrupper. NBT-diastestresultaterne (figur 3B) bekræftede de spektrofotometriske resultater og viste også PMA som den mest intense ROS-produktionsinducerende stimulus sammenlignet med fMLP (figur 3C), som tidligere demonstreret ved direkte måling af ROS ved cytometri18. Med hensyn til celletælling viste antallet af neutrofiler indeholdende formazankrystaller et forhold på 7: 4: 1 i PMA: fMLP: kontrolbetingelserne, hvilket også afslørede forskellige formazanfordelingsmønstre mellem fMLP og PMA-aktiverede PMN'er; fMLP-behandling resulterede i intensivt aktiverede individuelle celler, mens PMA inducerede dannelsen af formazankrystaller spredt gennem cytoplasmaet i størstedelen af PMN'erne. Desuden blev der observeret nogle få morfologiske egenskaber, der differentierede betingelserne, såsom ekspressiv celleaggregering efter PMA-behandling. Fraværet af sådanne typiske aktiveringskarakteristika og lave niveauer af formazan i kontrolgruppen indikerede, at hviletilstanden ikke var signifikant forstyrret. Derfor viste NBT-analysen sig at være en enkel, billig og pålidelig test for neutrofil ROS-produktion, der kan bruges til at overdække kapaciteten og intensiteten af en given stimulus til at inducere ROS-produktion.

Figure 3
Figur 3: NBT-test. (A) Den spektrofotometriske vurdering af neutrofile respirationsudbrud til forskellige betingelser (negativ kontrol: 100 nM fMLP og 100 nM PMA) ved formazan absorbans (490-630 nm). Data fra fire donorer præsenteres som gennemsnitlig ± standardafvigelse (SD). * = alle grupper er forskellige fra hinanden (s≤ 0,05); £ = Sammenligningerne CTRL versus PMA og fMLP versus PMA viser signifikante forskelle (s≤ 0,05). (B) Diastesten kan analyseres kvalitativt og karakteriserer intensiteten af formazanaflejringer, dens placering i cellen og celleaggregeringen. Sorte pile peger på formazan krystaller. Skalastænger: 20 μm. (C) Antal PMN'er indeholdende formazan, talt ved optisk mikroskopi. Data fra otte donorer præsenteret som gennemsnit ± SD. *** p < 0,0001, Student's t-test. Klik her for at se en større version af denne figur.

Phagocytose-dias blev brugt til at bestemme fagocytosehastigheden som en procentdel af neutrofiler, der udfører fagocytose, som vist i figur 4. Selvom både 100 nM fMLP og 16 μM antimikrobielt peptid inducerede en tilsyneladende øget gæropslugning, var forskellen ikke statistisk signifikant før den dobbelte stimulering, hvilket signifikant forbedrede fagocytosen sammenlignet med kontrolgruppen og kunne foreslå et respons ved dobbelt stimulering.

Figure 4
Figur 4: Phagocytose test. Neutrofiler blev evalueret ud fra deres fagocytosekapacitet (tælling af neutrofiler indeholdende gær). Selvom eksponeringen for 100 nM fMLP eller et 16 μM antimikrobielt peptid før gærinkubation forbedrede fagocytosen sammenlignet med kontrolgruppen, (A) var stigningen ikke statistisk signifikant. Interessant nok resulterede en indledende inkubation med fMLP efterfulgt af tilsætning af det antimikrobielle peptid i signifikant forbedret fagocytose i humane neutrofiler (stjerne mellem CTRL og fMLP + antimikrobielt peptid). (B) Sorte pile viser gærceller, grønne pile viser neutrofiler alene, og røde pile peger på fagocyterende neutrofiler. Data fra fem donorer præsenteret som gennemsnit ± SD. Skalabjælker: 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Et eksempel på realtidscellemigrationsresultater er vist i figur 5, der udviser den velkendte kemotaktiske effekt af 100 nM fMLP på neutrofiler. Cellemigrationskinetikken blev justeret til Gompertz-modellen, hvilket gjorde det muligt at sammenligne dens parametre.

Figure 5
Figur 5: Celleoverførsel i realtid. Celleindekset afspejler den elektriske impedans som følge af cellemigration. I dette assay blev fMLP anvendt som en positiv kontrol af neutrofilmigration ved at tilføje 100 nM fMLP til det nedre kammer. En negativ kontrol (CTRL) indeholdt kun HBSS i det nederste kammer. De overlejrede kurver repræsenterer kurven, der passer til Gompertz-modellen, modificeret til bedst at passe til stigende og faldende skråninger. Data fra tre donorer, præsenteret som gennemsnit ± SD.* p < 0,05, Student's t-test. Klik her for at se en større version af denne figur.

Endelig præsenteres en simpel optisk mikroskopitest, der tyder på tilstedeværelsen af NET, hvor PMN'erne farves med hurtig panoptik. Det er muligt at observere, at for nogle specifikke NET-inducerende stimuli, såsom PMA eller nogle antimikrobielle peptider, selv efter en kort aktiveringstid (1 time) er det muligt at observere filamentøse weblignende strukturer nær cellerne, mens dette ikke er muligt under andre forhold som den negative kontrol og fMLP (figur 6). For bedre at understøtte denne påstand blev DNase I tilføjet efter 40 minutters celleaktivering med 100 nm PMA eller et antimikrobielt peptid, hvilket fjernede de NET-lignende strukturer (figur 6). Selvom denne metode ikke er egnet til NET-karakterisering og kan påvirkes af artefakter, er det et billigt, enkelt og interessant udgangspunkt for at retfærdiggøre yderligere investeringer i analyse af NET'er, især i sammenhænge, hvor virkningerne af stimuli er ukendte eller dårligt beskrevne.

Figure 6
Figur 6: NET formation suggestive assay. En kvalitativ analyse af panoptisk farvede neutrofiler efter 1 times aktivering over et glasglas kan indikere NET-frigivelse. CTRL (A,B) og fMLP (C,D) grupper viste ingen indikation af NET-frigivelse, mens aktivering med PMA (E-H) inducerede dannelsen af NET-lignende strukturer, der blev nedbrudt ved DNase I-behandling (I-L). Undersøgelse af virkningerne af et antimikrobielt peptid på neutrofilerne viste, at en sådan stimulus muligvis kunne fremkalde NET-frigivelse, da diasene præsenterede de NET-lignende strukturer (M-P), der blev nedbrudt af DNase I (Q-T). Røde pile peger på NET-lignende strukturer. Vægtstænger: 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Neutrofiler er meget dynamiske og lydhøre celler, der er kortvarige og endnu ikke kan kryopræserveres19, hvilket gør undersøgelser af deres biologi udfordrende. Derfor er det vigtigt at følge omhyggelige trin for at opnå levedygtige, berigede og hvilende neutrofiler 11,20. Denne undersøgelse anvendte en tæthedsbaseret isolationsteknik, der understreger blid og minimal manipulation samt brugen af lave temperaturer indtil aktiveringstrinnet. Derudover skal blodbehandling ske inden for 30 minutter efter venipunktur og opbevares ved stuetemperatur. Det nuværende arbejde præsenterer en mulighed for at mindske manipulationsstress og eksperimenttid. For yderligere at forenkle processen introducerede vi et nyt trin (som en mulighed) i protokollen, som involverer fjernelse af RBC'er ved skånsom resuspension og aspiration af RBC-laget efter en enkelt hæmolyseprocedure. Dette trin reducerer manipulationsspændingen og eksperimenttiden, da det fjerner størstedelen af RBC'er med kun et hypotonisk hæmolysetrin. Det skal dog bemærkes, at operatørens færdigheder i høj grad påvirker effektiviteten af dette trin, og det kan ikke altid helt fjerne RBC'er. Desuden kan RBC-aspiration føre til tab af neutrofiler, men dette påvirker ikke udbyttet, da flere neutrofiler oprindeligt blev genvundet fra gradienten, når de blev samlet tættere på RBC-laget. Derfor anbefales RBC-aspiration, hvis analyserne ikke kræver den højest mulige renhed, eller hvis operatøren har haft konsekvent gode resultater. For de screeningstest, der præsenteres her, ville en lille mængde forurenende RBC'er (<3%) ikke forstyrre resultaterne.

For at sikre, at alle procedurer udføres rettidigt, herunder reagensforberedelse, præsenteres en arbejdsgang (figur 2), der beskriver tidslinjen og opgavefordelingen mellem to forskere. Når alle funktionelle assays er færdige, kan de resterende celler forberedes til yderligere molekylære undersøgelser, som omics-undersøgelser ved cellelyse med korrekt lysisbuffer og opbevaring.

ROS-produktion
Respiratorisk burst er et kendetegn ved neutrofil priming og aktivering18,21, og evaluering af ROS-produktion er en almindelig metode, der bruges til at estimere aktiveringsstatus for neutrofiler. Denne undersøgelse evaluerede ROS-produktion ved hjælp af to tilgange: optisk mikroskopi og spektrofotometri.

NBT-testen er en velkendt tilgang til vurdering af åndedrætsudbrud i neutrofiler22,23. To almindeligt anvendte metoder er de optiske mikroskopibaserede (eller diastest) og spektrofotometribaserede assays 24,25,26. Selvom optisk mikroskopi giver mulighed for visualisering af detaljer på celleniveau, er det tilbøjeligt til brugerbias. Derfor tjener NBT-diastesten som et kvalitativt supplement til det spektrofotometriske assay vedrørende fænotypiske træk, såsom formazandannelsesmønstre, intensitet og celleaggregering.

De kritiske trin for både NBT-dias og spektrofotometriske tests er NBT og formazan fuldstændig opløselighed. I modsætning til producentens anbefalinger opløses NBT ikke godt i vand. Imidlertid giver homogenisering af NBT i DMSO i mindst 15 minutter og derefter tilsætning af vand / HBSS og hvirvelstrøm i 2 minutter fuldstændig opløselighed. For at analysere absorbansen af formazan skal der desuden opnås to kritiske trin: (1) frigivelse af formazankrystaller fra celler ved PMN-lysis og (2) fuldstændig opløselighed af formazankrystaller. Begge trin blev opnået ved at behandle cellepelleten med 10% SDS, som for nylig foreslået27, efterfulgt af sonikerings- og absorbansanalyse af supernatanten ved 570 nm.

Desuden er NBT-resultaterne fra de negative og positive kontrolgrupper det første trin i screeningen, der skal vurderes. Dette trin må vise en bemærkelsesværdig forskel, da ROS-produktionsevaluering gennem formazan indikerer, om isolationsprocessen kan have været ansvarlig for uønskede ændringer i cellernes hvilestatus enten ved stimulering eller hæmning.

Andre metoder, såsom cytokrom c-reduktion28 eller flowcytometri29-analyse, bruges ofte til ROS-detektion; Men i betragtning af en screeningsmetode kræver deres anvendelse længere forsøgstid, brug af specifikke markører og dyre instrumenter. Kemiluminescens af luminol/isoluminol er en hurtig og omkostningseffektiv metode til påvisning af ROS, samtidig med at den tillader differentiering af intra- og ekstracellulær ROS. Der kræves dog et luminometer til denne metode30,31. Selv om instrumentomkostningerne kunne omgås ved brug af et anlæg, ville de stadig være uegnede til en screeninganalyse, der blev udført samtidig med andre analyser.

Fagocytose
PMN / gærinkubationen giver et overblik over neutrofil fagocytosekapacitet og effektivitet ved at tælle antallet af neutrofiler, der udfører fagocytose, og antallet af gær opslugt pr. Neutrofil. Da gærpartiklen i sig selv er et aktiveringssignal, udgør sammenligning af kontrolgruppen med forbehandlet PMN imidlertid et dobbelt stimuleringssystem, som muligvis ikke viser signifikante ændringer, som vist i CTRL versus fMLP-behandlet PMN (figur 4). Ikke desto mindre er dette assay nyttigt til at indikere, om en potentiel modulator ville generere nogen indvirkning på fagocytose. Et nyt antimikrobielt peptid blev testet ved hjælp af dette assay, og resultaterne indikerer et interessant potentielt respons på denne kombination af stimuli, som for nylig er blevet diskuteret som nødvendig for effektiv aktivering32.

Det kritiske trin for dette assay er farvningen, da analysen bliver upålidelig, hvis diaset holdes på panoptisk nr. 3 (hæmatoxylin) i ≥3 s. Dette skyldes, at gærcellerne og de neutrofile nukleare lobes ikke kan skelnes fra hinanden. Desuden tillader denne tilgang morfologianalyse af neutrofiler efter eksponering for modulatorer. Flowcytometri er en anden effektiv teknik til analyse af fagocytose33, selvom den har begrænsninger gennem vanskeligheden ved at skelne mellem membranbundne og opslugte partikler og andre faktorer relateret til det foreslåede screeningssæt, som diskuteret i det foregående emne. Den samme begrænsning iagttages i den metode, der er beskrevet heri, selv om dette skal betragtes som en indledende screening som rettesnor for opfølgningsundersøgelser.

Migrering i realtid
Screeningsprotokollen i realtid blev optimeret til at evaluere PMN'ernes migreringskapacitet. Selvom en tidligere undersøgelse antydede, at belægning af undersiden af RTCA-pladen var nødvendig for migrationsanalysen for at vise en forskel mellem den negative kontrol og IL-8-behandling15, viste denne undersøgelse høje konfidensintervalværdier (CI) for fMLP-behandlede celler uden tilsætning af belægningsmidler. Resultaterne viste høj reproducerbarhed med signifikant migration fra 12 min og fremefter. Desuden kan kurvetilpasningsanalyse af de opnåede migrationsdata afsløre parametre, såsom celleindeksmaksimum samt stigning og formindskelse af hældning, der er nyttige til forståelse af migrationsdynamikken og kan afhænge af koncentration eller variere mellem forhold. Den bedste tilpasning til neutrofile migrationskurver (figur 5) var til den justerede Gompertz-funktion34, hvilket viser, at fMLP øger det maksimale celleindeks og den øgede hældning.

Der kræves særlig opmærksomhed for at undgå bobler i RTCA-systemet, da de kan blokere cellerne, der passerer gennem elektroderne, hvilket kompromitterer eksperimentet. En begrænsende faktor er pladernes høje omkostninger. Selvom billigere teknikker analyserer cellemigration, mangler de god reproducerbarhed eller er vanskelige og tidskrævende, såsom Boyden-kammeret35. Derfor er RTCA en pålidelig migrationsanalyse, der er kompatibel med de andre screeningstest, der præsenteres her.

Net
Endelig blev der udviklet et lovende, let og billigt assay til en foreløbig evaluering af NET-dannelse ved hjælp af optisk mikroskopi. Det blev afledt af observationen af fagocytose-dias, hvor PMA, en specifik NET-inducerende stimulus testet for dens virkning på fagocytosekapacitet, også inducerede en weblignende strukturdannelse sammenlignet med CTRL- og fMLP-grupperne. Dette arbejde antog, at disse strukturer kunne indikere NET-frigivelse. En sådan hypotese blev testet ved at behandle prøverne med DNase I efter aktivering, hvor der ikke blev fundet filamentøse strukturer i PMA-aktiverede neutrofiler. Antagelsen om, at sådanne strukturer sandsynligvis er NET'er, er baseret på det faktum, at PMA nævnes som en velkendt inducer af NET-dannelse36,37, fund af lignende strukturer ved fluorescensmikroskopi ved hjælp af specifikke markører for NETs38,39 og nedbrydning af NET'er katalyseret af DNase I40,41. Det er vigtigt at understrege, at dette ikke er en metode til bekræftelse af NET-dannelse, men blot en foreløbig screening, der tyder på tilstedeværelsen af NET'er. Selvom denne test har begrænsninger, da NET'er kan forveksles med farvningsartefakter, tjener den et relevant formål med at foreslå NET-dannelse i en hurtig og billig screening, der kan udføres sammen med andre funktionelle tests. Når det er påvist som muligvis relevant for den undersøgelse, der screenes, kan NETs evalueres yderligere ved konfokal eller elektronmikroskopi42, som diskuteret senere.

I vores laboratorium evalueres nye antimikrobielle peptider, der sandsynligvis også har immunmodulerende aktiviteter, ofte ved hjælp af dette sæt screeningsassays for bedre at vejlede yderligere analyse af virkningerne af nogle peptider på humane neutrofiler, da nogle viser interessante ROS43, fagocytose, migration og / eller NET-modulerende egenskaber.

Afslutningsvis tilbyder NeutroFun Screen et værdifuldt værktøj til at identificere potentielle modulatorer af den normale densitet neutrofil aktivitet fra et stort antal uprøvede forbindelser. Det er dog vigtigt at bemærke, at denne metode kun tjener som en foreløbig screening. Efter denne indledende screening kan dyrere, avancerede og tidskrævende metoder dirigeres til specifikke funktioner eller veje, der foreslås af disse første resultater til datavalidering. Til ROS-produktion, fagocytose og NET-dannelse er der alternative metoder til datavalidering og for at opnå yderligere kvantitative resultater. NET visualisering og kvantificering kan udføres gennem immunofluorescensmikroskopianalyse, som bestemmer tilstedeværelsen og overlapningen af ekstracellulære DNA- og granulatproteiner, såsom myeloperoxidase og neutrofil elastase, som beskrevet detaljeret for nylig42. ROS spiller forskellige afgørende roller i mange biologiske processer, og derfor er deres undersøgelse meget udbredt og forskelligartet. Blandt de mest etablerede metoder er dem, der gør brug af antistoffer, såsom enzymbundet immunosorbentassay (ELISA) og immunoblotting af luminescens eller fluorescensdetektion - såsom flowcytometri af celler under forskellig mærkning gennem DCFDA, EPR-spektroskopi og enzymatiske aktivitetsmålinger44. Tilsvarende udføres robust fagocytoseevaluering også på flere måder; De alternative metoder inkluderer flowcytometri alene45,46 eller kombineret med fluorescensmikroskopi47. Den beskrevne cellemigration i realtid er et robust og tilstrækkeligt assay, der ikke kræver yderligere validering og præsenterer parametre, som andre metoder ikke kan overveje. Andre kombinationer af sådanne metoder passer bedre til specifikke scenarier, men sammenfattende repræsenterer dette en hurtig og overkommelig kombination, der omfatter mange neutrofile aktiviteter.

Sammenfattende har denne undersøgelse til formål at tilvejebringe et sæt assays bestående af enkle, hurtige og billige metoder til evaluering af flere neutrofile reaktioner på nye molekyler og tilstande som en måde at bedre rette indsatsen mod avancerede metoder. Som væsentlige begrænsninger bør resultaterne fra ROS-, NET- og fagocytose-assays betragtes som foreløbige og har brug for yderligere validering ved mere specifikke og detaljerede assays, og dem, der er afhængige af ikke-automatiseret mikroskopicelletælling, er tilbøjelige til ubevidst bias.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.

Acknowledgments

Forfatterne anerkender følgende finansieringsorganer: FAPDF, CNPq, CAPES, UnB, FINEP og FINATEC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CIM-Plate 16 Agilent  5665825001
CLARIOstar Plate Reader  BMG LABTECH US Patent Number 9,733,124
Product details: MARS Data Analysis Software
Dimethyl sulfoxide Dinâmica 1582
DNAse I Sigma - Aldrich DN 25
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate Sigma - Aldrich E5134
Fast panoptic stain Laborclin 620529
Glass slide Exacta 7102
Hank’s Balanced Salt Solution with calcium, with magnesium, without phenol red. Sigma - Aldrich 55037C
Hank’s Balanced Salt Solution without calcium chloride, magnesium sulfate and sodium bicarbonate. Sigma - Aldrich H4641
Heparin Blau  7896014655229
Laminar flow cabinet Veco VLFS-12
Microscope Zeiss 415501-0101-002 Product details: Primostar 1
Mixing Block BIOER MB-102
Neubauer improved bright-lined New Optik 1110000
N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine Sigma - Aldrich F3506
Nitroblue tetrazolium Neon CAS 298-83-9
Percoll Cytiva 17089101 separation media
Phorbol 12-myristate 13-acetate Sigma - Aldrich P8139
Phosphate buffered saline tablet Sigma - Aldrich P4417
ROTOFIX 32 A Hettich 1206
Saccharomyces cerevisiae Fleischmann
Safranin Sigma - Aldrich 50240
Sodium dodecyl sulfate Cytiva 17-1313-01
Sonicator Qsonica Q125
Trypan blue solution Vetec C.I. 23850
Vortex Genie 2 Scientific Industries, Inc. 0K-0500-902
xCELLigence Real-Time Cell Analysis (RTCA) DP (dual purpose) Agilent  380601050 Product details: RTCA system composed of detection hardware, cell plates and software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nature Immunology. 15 (7), 602-611 (2014).
  2. Groeneweg, L., Hidalgo, A. Emerging roles of infiltrating granulocytes and monocytes in homeostasis. Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (19), 3823-3830 (2020).
  3. Rosales, C., Lowell, C. A., Schnoor, M., Uribe-Querol, E. Neutrophils: their role in innate and adaptive immunity 2017. Journal of Immunology Research. 2017, 9748345 (2017).
  4. Castro, M., et al. Proteome analysis of resting human neutrophils. Protein & Peptide Letters. 13 (5), 481-487 (2006).
  5. Li, Y., et al. The regulatory roles of neutrophils in adaptive immunity. Cell Communication and Signaling. 17, 147 (2019).
  6. de Oliveira, S., Rosowski, E. E., Huttenlocher, A. Neutrophil migration in infection and wound repair: going forward in reverse. Nature Reviews Immunology. 16 (6), 378-391 (2016).
  7. Burn, G. L., Foti, A., Marsman, G., Patel, D. F., Zychlinsky, A. The neutrophil. Immunity. 54 (7), 1377-1391 (2021).
  8. El-Benna, J., et al. Priming of the neutrophil respiratory burst: role in host defense and inflammation. Immunological Reviews. 273 (1), 180-193 (2016).
  9. Castro, M. S., Cilli, E. M., Fontes, W. Combinatorial synthesis and directed evolution applied to the production of alpha-helix forming antimicrobial peptides analogues. Current Protein & Peptide Science. 7 (6), 473-478 (2006).
  10. Mihaila, A. C., et al. Transcriptional profiling and functional analysis of N1/N2 neutrophils reveal an immunomodulatory effect of S100A9-blockade on the pro-inflammatory N1 subpopulation. Frontiers in Immunology. 12, 708770 (2021).
  11. Kuhns, D. B., Priel, D. A. L., Chu, J., Zarember, K. A. Isolation and functional analysis of human neutrophils. Current Protocols in Immunology. 111 (1), 7-23 (2015).
  12. Paulíková, E., Kociková, A., Sabol, M. Modification of a panoptic method of staining isolated cells. Bratislavske Lekarske Listy. 94 (12), 638-640 (1993).
  13. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111 (1), 1-3 (2015).
  14. Libério, M. S., et al. Anti-proliferative and cytotoxic activity of pentadactylin isolated from Leptodactylus labyrinthicus on melanoma cells. Amino Acids. 40 (1), 51-59 (2011).
  15. Cano, P. M., Vargas, A., Lavoie, J. P. A real-time assay for neutrophil chemotaxis. BioTechniques. 60 (5), 245-251 (2016).
  16. Stefanowicz-Hajduk, J., Adamska, A., Bartoszewski, R., Ochocka, J. R. Reuse of E-plate cell sensor arrays in the xCELLigence Real-Time Cell Analyzer. BioTechniques. 61 (3), 117-122 (2016).
  17. Björkstén, B., Nyström, K., Lindqvist, B. The nitroblue tetrazolium (NBT) test in endemic benign (epidemic) nephropathy. Acta Medica Scandinavica. 199 (1-6), 147-150 (1976).
  18. Aquino, E., et al. Proteomic analysis of neutrophil priming by PAF. Protein & Peptide Letters. 23 (2), 142-151 (2016).
  19. Blanter, M., Gouwy, M., Struyf, S. Studying neutrophil function in vitro: cell models and environmental factors. Journal of Inflammation Research. 14, 141-162 (2021).
  20. Hsu, A. Y., Peng, Z., Luo, H., Loison, F. Isolation of human neutrophils from whole blood and buffy coats. Journal of Visualized Experiments. (175), e62837 (2021).
  21. Moghadam, Z. M., Henneke, P., Kolter, J. From flies to men: ROS and the NADPH oxidase in phagocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 628991 (2021).
  22. Pattan, S. S., Bhat, K. G., Pattar, G. D., Kuntagi, M. Comparison of three different techniques for isolation of neutrophils from blood and their utility in performing nitroblue tetrazolium test. International Journal of Basic and Applied Physiology. 8 (1), 41 (2019).
  23. Gooty, J. R., Shashirekha, A., Guntakala, V. R., Palaparthi, R. Estimation of phagocytic activity of polymorphonuclear leukocytes in chronic and aggressive periodontitis patients with nitroblue tetrazolium test. Journal of Indian Society of Periodontology. 23 (4), 316 (2019).
  24. Langer, S., et al. Clinical and laboratory profiles of 17 cases of chronic granulomatous disease in north India. Indian Journal of Hematology and Blood Transfusion. 37 (1), 45-51 (2021).
  25. Oualha, R., et al. Infection of human neutrophils with Leishmania infantum or Leishmania major strains triggers activation and differential cytokines release. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 9, 153 (2019).
  26. Zilinskas, J., Zekonis, J., Zekonis, G., Valantiejiene, A., Periokaite, R. The reduction of nitroblue tetrazolium by total blood in periodontitis patients and the aged. Stomatologijal. 9 (4), 105-108 (2007).
  27. Benov, L. Improved formazan dissolution for bacterial MTT assay. Microbiology Spectrum. 9 (3), e01637 (2021).
  28. Chen, Y., Junger, W. G. Measurement of oxidative burst in neutrophils. Methods in Molecular Biology. 844, 115-124 (2012).
  29. Richardson, M. P., Ayliffe, M. J., Helbert, M., Davies, E. G. A simple flow cytometry assay using dihydrorhodamine for the measurement of the neutrophil respiratory burst in whole blood: comparison with the quantitative nitrobluetetrazolium test. Journal of Immunological Methods. 219 (1-2), 187-193 (1998).
  30. Jancinová, V., et al. The combined luminol/isoluminol chemiluminescence method for differentiating between extracellular and intracellular oxidant production by neutrophils. Redox Report. 11 (3), 110-116 (2006).
  31. Nosál, R., et al. Pharmacological intervention with oxidative burst in human neutrophils. Interdisciplinary Toxicology. 10 (2), 56-60 (2017).
  32. Mol, S., et al. Efficient neutrophil activation requires two simultaneous activating stimuli. International Journal of Molecular Sciences. 22 (18), 10106 (2021).
  33. Schneider, L., et al. Flow cytometry evaluation of CD14/CD16 monocyte subpopulations in systemic sclerosis patients: a cross sectional controlled study. Advances in Rheumatology. 61 (1), 27 (2021).
  34. Akin, E., Pelen, N. N., Tiryaki, I. U., Yalcin, F. Parameter identification for gompertz and logistic dynamic equations. PLoS One. 15 (4), e0230582 (2020).
  35. Guy, J. B., et al. Evaluation of the cell invasion and migration process: A comparison of the video microscope-based scratch wound assay and the boyden chamber assay. Journal of Visualized Experiments. (129), e56337 (2017).
  36. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  37. de Bont, C. M., Koopman, W. J. H., Boelens, W. C., Pruijn, G. J. M. Stimulus-dependent chromatin dynamics, citrullination, calcium signalling and ROS production during NET formation. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1865, 1621-1629 (2018).
  38. Masuda, S., et al. Measurement of NET formation in vitro and in vivo by flow cytometry. Cytometry Part A. 91 (8), 822-829 (2017).
  39. Zharkova, O., et al. A flow cytometry-based assay for high-throughput detection and quantification of neutrophil extracellular traps in mixed cell populations. Cytometry Part A. 95 (3), 268-278 (2019).
  40. Hosseinnejad, A., et al. DNase I functional microgels for neutrophil extracellular trap disruption. Biomaterials Science. 10 (1), 85-99 (2022).
  41. Chrysanthopoulou, A., et al. Neutrophil extracellular traps promote differentiation and function of fibroblasts. The Journal of Pathology. 233 (3), 294-307 (2014).
  42. Tong, M., Abrahams, V. M. Visualization and quantification of neutrophil extracellular traps. Methods in Molecular Biology. 2255, 87-95 (2021).
  43. Santana, C. J. C., et al. Biological properties of a novel multifunctional host defense peptide from the skin secretion of the chaco tree frog, boana raniceps. Biomolecules. 10 (5), 790 (2020).
  44. Murphy, M. P., et al. Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo. Nature Metabolism. 4 (6), 651-662 (2022).
  45. Boero, E., et al. Use of flow cytometry to evaluate phagocytosis of staphylococcus aureus by human neutrophils. Frontiers in Immunology. 12, 635825 (2021).
  46. Karsten, C. B., et al. A versatile high-throughput assay to characterize antibody-mediated neutrophil phagocytosis. Journal of Immunological Methods. 471, 46-56 (2019).
  47. Smirnov, A., Solga, M. D., Lannigan, J., Criss, A. K. Using imaging flow cytometry to quantify neutrophil phagocytosis. Methods in Molecular Biology. 2087, 127-140 (2020).

Tags

Denne måned i JoVE nummer 204
Et sæt screeningsteknikker til et hurtigt overblik over neutrofilfunktionen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Souza Luz, I., Takaya, R., Gonzaga… More

Souza Luz, I., Takaya, R., Gonzaga Ribeiro, D., Sales Silva, N., Fontes, L., Castro, M. S., Fontes, W. A Set of Screening Techniques for a Quick Overview of the Neutrophil Function. J. Vis. Exp. (204), e65329, doi:10.3791/65329 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter