Summary
このプロトコルは異なったシグナリング細道からの機能をカバーするスクリーニング方法として使用されるべき一組の好中球の機能試金を特色にする。プロトコルは好中球の細胞外トラップの細胞生存率、純度、活性酸素種の生産、実時間移動、食作用および予備の提案の初期および簡単な評価を含んでいる。
Abstract
好中球は、自然免疫応答における防御の最前線の1つとして知られており、走化性、逆遊走、食作用、細胞傷害性酵素および代謝産物の脱顆粒、好中球細胞外トラップ(NET)としてのDNAの放出など、多くの特定の細胞機能を実行することができます。好中球は、それ自体が厳密に制御されたシグナル伝達を持っているだけでなく、免疫系の他の構成要素の制御にも関与しています。新鮮な好中球は末期分化型で、寿命が短く、個人差が大きいため、採取したサンプルを最大限に活用することが重要です。研究者は、評価中の特定の条件によって影響を受ける可能性のある多くの好中球機能の概要を評価するために、スクリーニングアッセイを実施する必要があることがよくあります。このニーズに対応するために、正常密度好中球の単一の単離プロセスに続く一連のテストが開発され、速度、包括性、コスト、および精度のバランスが模索されました。この結果は、詳細な追跡調査の推論と指針として使用できます。この手順は平均4時間で実施でき、スライドガラス上での細胞生存率、活性酸素種(ROS)産生、リアルタイム移動、酵母の食作用の評価が含まれ、オミクス研究などのより詳細なアプローチに十分な細胞を残します。さらに、この手順には、光学顕微鏡で観察された高速パノプティック染色後のNETの予備的な提案を簡単に観察する方法が含まれていますが、特定のマーカーはありませんが、その方法でさらに努力する価値があるかどうかを示すのに十分です。テストする機能の多様性は、テスト間の共通点を組み合わせ、分析時間とコストを削減します。この手順はNeutroFun Screenと名付けられ、制限はありますが、前述の要素のバランスが取れています。さらに、この作業の目的は、明確なテストセットではなく、各ラボのリソースと要求に合わせて簡単に調整できるガイドラインです。
Introduction
好中球は、ヒトの血液中に最も多く存在する自然免疫細胞であり、感染や炎症に大きな役割を果たすことが知られており、組織損傷部位に最初に到達する応答者です1。近年、好中球がさまざまな疾患において、また恒常性維持(ホメオスタシス)を支える重要な役割を担っているという認識が高まっています2。好中球は、それ自体が厳密に制御されたシグナル伝達を持っているだけでなく、免疫系の他の構成要素の調節にも関与しています3,4,5。したがって、好中球と、走化性、逆遊走6、食作用7、呼吸バースト8、好中球細胞外トラップ(NET)7の放出など、好中球とその多くの異常な細胞機能を調べることは、分析中の特定の条件によって引き起こされる潜在的な好中球の機能的、形態学的、または分子的変化を評価する必要がある多くの研究状況で不可欠です。
単離されたばかりの好中球は、末端分化型で、寿命が短く、動的で、活性化しやすい9。しかし、好中球の応答に影響を与えない効率的な保存法はまだ達成されておらず、中断のない複数のアッセイを行うことは困難です。さらに、サイトメトリーおよび/または蛍光染色を必要とするアッセイに基づく、以前に記載された機能解析10,11は、好中球の広範かつ初期評価が必要な場合には実行可能な選択肢ではないかもしれない。
これらの問題に対処するために、このプロトコルでは、細胞生存率、活性酸素種(ROS)産生、リアルタイム移動、 出芽酵母の食作用の評価など、単一の分離プロセスに続いて実施できる一連のテストを記述しており、その結果を使用して詳細なフォローアップ研究を推論することができます。NeutroFun Screenと名付けられたこの手順は、脱顆粒を除く主要なエフェクター活動を網羅するように設計されており、1時間の活性化を含む平均4時間で完了することができます。さらに、残りの細胞は、オミクス研究などのより詳細なアプローチに使用できます。この方法の利点は、速度、包括性、コスト、および精度のバランスにあります。
さらに、NETの予備的な提案を、特定のマーカーなしで簡単に観察する方法がありますが、その方向でのさらなる努力が価値があるかどうかを示すのに十分です。テストされる機能の多様性は、テスト間の共通点を組み合わせることを目的としており、分析時間とコストを削減します。この方法の主な目的は、好中球の応答の概要を可能にする速度、包括性、コスト、および精度に関するバランスの取れた機能分析を提供することであり、正常密度好中球に対する新しい刺激の影響を調査する際の有用な最初のステップになります。
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Protocol
すべての実験は、ブラジリア大学の治験審査委員会(プロセス13364819.0.0000.5558)によって設定された倫理ガイドラインに厳密に従い、サンプルはドナーの匿名性を確保するためのコードによって識別されました。細胞は、インフォームドコンセントに署名し、次の適格基準を満たした18〜35歳の正常な健康な男性ドナーから取得されました:非喫煙者/ベイパー、慢性的な健康状態なし、および過去14日間の炎症状態の病歴なし。
1.採血
- 0.3 mL の 5,000 IU/mL ヘパリン( 材料表を参照)を滅菌 20 mL シリンジに無菌的に入れてヘパリン化します。
- 穿刺部位の上に約4インチの静脈止血帯を適用し、静脈穿刺用の正中肘静脈または橈側静脈を特定します。
注意: 止血帯の合計時間が1分を超えないようにしてください。 - 穿刺部位を70%アルコールで洗浄し、静脈穿刺を行います。
- 血液を採取した後、シリンジを3〜4回静かに反転させて、血液とヘパリンを適切に混合します。.
2. 好中球の単離
注:多形核白血球(PMN)は、密度勾配遠心分離とそれに続く残りの赤血球(RBC)の低張溶解によって単離されます。この分析法は、スクリーニングアッセイの実施に必須ではなく、選択した分析法が生存率>97%、PMNのプライミングまたは活性化が<3%となり、すべてのアッセイ、反復、および条件に十分な細胞が得られれば、置き換えることができます。これらのステップを無菌条件下で実施し、エンドトキシンフリー溶液を使用することは、細胞の活性化を避けるために必須です。
- 60%および70%の分離培地(市販品、 材料表を参照)を12 mLに希釈して、50 mLのコニカルチューブに入れます。
- 5 mL ピペットを使用して、60% 希釈と 70% 希釈で一度に 4 mL を添加し、下から上にグラジエントを調製します。インターフェイスが混ざらないように、これを静かに行ってください。
- 密度勾配の上に12 mLのヘパリン処理血液を慎重に重ねます。室温で200 x g で15分間遠心分離します。
注:このステップ以降、PMNが活性化されるまで、使用するすべての試薬とチューブは、氷で満たされたクーラーボックスに保管する必要があります。 - 血漿/単核球層を廃棄し、赤血球ペレットの上の層を、それぞれ約7.5 mLの入った2本の15 mLコニカルチューブに静かに移します。ハンクの平衡塩溶液(HBSS、 材料表を参照)でチューブ容量を構成します。
- 19°Cで5分間、300 x g で遠心分離します。
- 細胞ペレットをHBSSで洗浄します。
- チューブを注ぐことで上清を廃棄し、ペレットを7 mLのHBSSに静かに再懸濁します。
- 19°Cで300 x g で5分間遠心分離し、すべての分離媒体を除去します。
- 残りの赤血球の低張溶解を実行します。
- 上澄みを捨て、ペレットを1本のチューブに入れます。
- RBC/PMNペレットを3 mLの滅菌H2Oに再懸濁し、25秒以内に3 mLのHBSS(2x)を加えて浸透圧を回復させます。その後、19°Cで5分間、300 x g で遠心分離します。
- 手順2.8.1と2.8.2を繰り返して、赤血球を含まない白色のペレットを作ります。
注:好中球と赤血球分解生成物との接触を最小限に抑えるために、上清をできるだけ早く除去する必要があります。あるいは、2回目の低張溶解は、残りのRBCがPMNペレットの上に沈殿するため、残留RBC層を静かに再懸濁し、すべての上清を除去することによって置き換えることができます。
- チューブを注ぐことで上清を廃棄し、残りのバッファーにPMNを静かに再懸濁し、氷冷したマイクロチューブに移します。
注:再懸濁した細胞をマイクロピペットで移す際は、必ずボリュームに注釈を付けてください。 - 3 x 1 μLの細胞懸濁液を清潔なスライドガラス(各1 μLのウェル3つ)に移し、形態および純度評価のために高速パノプティック( 材料表を参照)で染色します12。
- 高速パノプティックで染色するには、スライドをパノプティック固定液 n° 1 に 5 回、エオシン n° 2 に 6 回、ヘマトキシリン n° 3 に 2 回浸漬し、各浸漬を 1 秒間持続させます。
- スライドガラスを蒸留水でやさしく洗います。
- 水気を切り、風乾させます。
- 顕微鏡で観察し、各ウェルで300個のランダムな細胞を数え、好中球を他の顆粒球と区別します。
- 細胞懸濁液1 μLを49 μLの0.2%トリパンブルー色素13に移し、ノイバウアーチャンバーを使用して細胞をカウントし、死細胞と生細胞を区別します。
- 50%自家血漿と50%HBSSの溶液にカルシウムとマグネシウムを添加して、細胞濃度を6,667細胞/μLに調整します。6,667細胞/μLの懸濁液を、ネガティブコントロールを含む試験条件に対応するマイクロチューブに均等に分配します。
注:モデル生物の循環好中球に類似した細胞濃度を使用できますが、再現性のためにすべての実験で同じ細胞濃度を使用することが重要です。
図1:好中球分離プロトコル。2 つの濃度の分離培地(パーコール)(A)をスタックし(B)、次に分離グラジエントの上に血液を層状にします(C)。遠心分離後、PMNは中央層(D)にあり、2つの15 mLチューブ(E)に分割されます。細胞懸濁液をHBSSで2回洗浄し、遠心分離(G-I)して培地を除去し、次に細胞を再懸濁し、残ったRBCを2回の低張溶解(J-M)にかけます。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
3. 好中球活性化の準備
- 1.5 mLのマイクロチューブに、最終的な細胞濃度が6,600細胞/μLになるように、各条件の活性化系を調製します。例えば、100 nM fMLP(N-ホルミル-メチオニル-ロイシル-フェニルアラニン、 材料表を参照)の効果を試験するには、6,667 cells/μL 懸濁液の 495 μL に 5 μL の 10 μM fMLP を加えます。ネガティブ(非刺激)コントロールには、Ca2+ とMg2+を含むHBSSを添加します。
注:この方法論を実証するために、100 nM fMLP、16 μM のファラキシン、天然に存在する抗菌ペプチド14、および 100 nM PMA(ホルボール 12-ミリスチン酸 13-アセテート)の刺激の最終濃度を使用しました( 材料表を参照)。 - 回転せずに37°Cでインキュベートします。
注:機能アッセイ用のすべてのアリコートは、この細胞懸濁液(以下、活性化システムと呼びます)から採取されます。
4. ROS産生評価のためのニトロテトラゾリウム青色塩化物(NBT)アッセイ
- NBT作動溶液の調製:各実験条件について、以下のステップを用いて6 mMのNBT( 材料表を参照)作動溶液を調製します。
- 0.0005 g の NBT を 10 μL のジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解し、少なくとも 15 分間ボルテックスします。
- 90 μL の HBSS Ca2+Mg2+ を加え、最大 2 分間ボルテックスします。
注意: NBTに関連するすべての手順は、暗闇の中で実行する必要があります。
- NBTスライドテストを実行します。
- 細胞活性化の20分後、細胞懸濁液を穏やかに混合し、2 μLのPMNを清潔なスライドガラスに慎重に移します。37°Cの加湿チャンバーで20分間インキュベートします。
注:細胞懸濁液をスライド上に広げすぎないでください。そうしないと、インキュベーション前に乾燥する可能性があります。 - 細胞上に1μLのNBTワーキング溶液を加え、光から保護してさらに20分間インキュベートします。
- スライドを熱風で乾燥させ、各ウェルにメタノールを一滴垂らして1分間固定します。0.03%サフラニン( 材料表参照)で1分間染色します。
- スライドガラスを蒸留水でやさしく洗います。
- スライドを風乾させ、顕微鏡で観察します。
- 各ウェルで100個のランダムな細胞を数え、ホルマザン沈着物の有無にかかわらず好中球を分化します。
- 細胞活性化の20分後、細胞懸濁液を穏やかに混合し、2 μLのPMNを清潔なスライドガラスに慎重に移します。37°Cの加湿チャンバーで20分間インキュベートします。
- NBT分光光度法アッセイを実施します。
- 細胞活性化を40分間行った後、細胞懸濁液を穏やかに混合し、活性化系から90 μLのPMNを清潔なマイクロチューブに移します。次に、20 μL の 6 mM NBT 溶液を慎重に添加します。暗所で37°Cで20分間インキュベートします。
- 100 μL の 10% ドデシル硫酸ナトリウム (SDS、 材料表を参照) を加え、ボルテックスします。
- 60%の振幅でチップソニケーターを使用して、それぞれ15秒間隔で15秒の5サイクルを超音波処理します。12,000 x g で5分間遠心分離します。
- 上清 60 μL を底が透明な 96 ウェルプレートに移し、570 nm でのホルマザン生成物の吸光度を測定します。
5. 食作用アッセイ
- 以下に説明するように、各条件について33,000酵母/μL懸濁液を調製します。
- 約0.75 mgの乾燥酵母 (出芽酵母、 材料表参照)を200 μLのHBSS Ca2+Mg2+ に加え、100°C、500rpmのサーモミキサーで少なくとも15分間インキュベートします。
- ボルテックスにより混合物をホモジナイズし、酵母懸濁液5 μLを0.2%トリパンブルー色素45 μLに移します。ノイバウアーチャンバーを使用して酵母をカウントします。
- HBSS Ca2+Mg2+を用いて、初期懸濁液の濃度を33,000酵母細胞/μLに調整します。使用するまで懸濁液を氷上に保管してください。
- 細胞活性化の20分後、細胞懸濁液を穏やかに混合し、活性化系5 μLを33,000酵母/μL出 芽 酵母懸濁液5 μLに移し、新しい滅菌マイクロチューブに入れます。
注:好中球と酵母の比率は1:5(PMN:酵母)です。 - 直ちに6 μLのPMN/酵母懸濁液を清潔なスライドガラスの3つのウェル(各2 μL)に移し、加湿チャンバー内で40分間インキュベートします。
注:細胞懸濁液をスライド上に広げすぎないでください。そうしないと、インキュベーション前に乾燥する可能性があります。 - スライドを熱風で乾燥させ、上記のステップ2.9で説明したように、高速パノプティックで染色します。
注:高速パノプティック染色の第3ステップは、スライドの顕微鏡分析に不可欠です。このステップでスライドを≥3秒間染色すると、酵母と好中球核ローブの鑑別が困難になるため、分析に適さなくなる可能性があります。 - スライドを顕微鏡で観察し、各ウェルの100個のランダムな好中球を数え、食作用の陽性と陰性のPMNを区別します。
注:PMN細胞膜内またはPMN細胞膜と直接接触している少なくとも1つの酵母粒子は、食作用に対してPMN陽性であることを示します。酵母/好中球比に興味がある場合は、飲み込まれた酵母粒子の数も数えます。
6. リアルタイムPMN走化性アッセイ
注:移行アッセイは、previoulsy15に記載されているプロトコルと同様に、次の適応で実行されます。
- 160 μL の走化性グラジエント(fMLP、IL-8、C5、LTB4 など、材料 表を参照)をインピーダンスベースリアルタイムセルアナライザー(RTCA)プレートの下チャンバーに添加して、走化性グラジエントを調製します。ネガティブコントロールおよびブランクには、160 μL の HBSS Ca2+Mg2+ を添加します。
- 上部チャンバーを取り付け、25 μL の HBSS Ca2+Mg2+ を添加します。室温で少なくとも1時間インキュベートして、走化性グラジエントを形成します。
- 細胞活性化の60分後、細胞懸濁液を静かに混合し、60 μLの細胞懸濁液を上部チャンバーに入れます。60 μLのHBSSCa2+Mg2+ をブランクに加えます。
- RTCAプレートをセットし、60秒ごとに2時間セルインデックス(CI)を測定するようにRTCAソフトウェアをプログラムします。
注意: RTCAプレートは、前述のように洗浄して再利用できます16。要約すると、RTCAチャンバーと電極をリン酸塩ブファー生理食塩水(PBS)で3回洗浄し、次にタイプI超純水で2回洗浄します。下部チャンバーと上部チャンバーを0.25%トリプシン、0.53 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)で40分間インキュベートします。超純水で3回洗います。
7. NET暗示アッセイ
- 細胞活性化の10分後、細胞懸濁液を静かに混合し、評価中の各活性化システムから4 μLのPMNを移し、2つのウェルに分けて清浄なスライドガラスに移します。加湿チャンバー内で37°Cで30分間インキュベートします。
- ウェルの1つに1 μLのDNAse Iを加え、37°C(ウェットチャンバー内)で20分間インキュベートします。
- スライドを乾燥させ、「好中球の単離」セクションのステップ2.9で前述したように、高速パノプティックで染色します。
- スライドを顕微鏡で評価します。
注 : Web のような構造の存在を特徴とする NET リリースの兆候を探します。同定されたら、DNAse I処理がそのような構造を除去できるかどうかを確認します。このアッセイは、NETの存在を確認するために追加のテストが必要であるため、NET形成を示唆しています。
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Representative Results
この研究で使用した密度ベースの分離法(図1)は、提案された実験の基準を満たしていました。この方法から得られた好中球パラメータには、生存率≥98%、純度≥94%、および細胞収量≥1.5 x 107が含まれていましたが、スクリーニングテストでは検出可能な活性化はありませんでした。PMNの単離における2つの関連するステップは、抗凝固療法と赤血球除去です。抗凝固処理された血液チューブまたはシリンジを穏やかなロッキングに保ち、密度勾配を重ねて重ね、活性化と汚染の両方を防ぐために赤血球除去方法を選択すると、実験の収率と再現性に影響を与える可能性があります。
好中球機能の機能的概要を評価するために、 図2に示すように、提案されたスクリーニングアッセイを少なくとも2人の研究者で平均4時間、活性化1時間、リアルタイム遊走モニタリング2時間で実施できるワークフローを開発しました。
図2:NeutroFun Screenのワークフロー 評価中の特定の条件によって引き起こされる機能的応答のパネルを評価するために、NeutroFun Screenワークフローには少なくとも2人の研究者の参加が含まれています。研究者1(R1)はPMN単離プロセスを開始し、続いて細胞濃度調整と活性化システムのインキュベーションを行い、並行して研究者2(R2)は次のアッセイを実施するための材料を準備し、R1は食作用、NET、および分光光度NBTアッセイを行います。R2は、リアルタイムの移行とNBTスライド・テストを実行します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
従来のNBTアッセイ17は、PMNによって生成されたROSとNBTの反応から生じるホルマザン形成のスライドおよび分光光度法の両方の評価に最適化されました。分光光度法法は条件間の相対定量を可能にし、顕微鏡法は記述的および半定量的分析に有用であり、結晶分布、形態、およびホルマザンを含む細胞数の規則性を評価しました。分光光度分析の結果を図3Aに示し、100 nM PMAはfMLPおよび対照群と比較してROS産生の上昇(平均比3:2:1)を誘発したことを示しています。NBTスライドテストの結果(図3B)は、分光光度法の結果を裏付けており、サイトメトリー18によるROSの直接測定によって以前に実証されたように、PMAがfMLP(図3C)と比較して最も強いROS産生誘導刺激であることも示しました。細胞計数に関しては、ホルマザン結晶を含む好中球の数は、PMA:fMLP:コントロール条件で7:4:1の比率を示し、fMLPとPMA活性化PMNの間で異なるホルマザン分布パターンも明らかになりました。fMLP処理により、個々の細胞が集中的に活性化されたのに対し、PMAは、大部分のPMNにおいて細胞質全体に散在するホルマザン結晶の形成を誘導した。さらに、PMA処理後の発現細胞凝集など、条件を区別するいくつかの形態学的特徴が観察されました。対照群におけるそのような典型的な活性化特性の欠如および低レベルのホルマザンは、安静状態が有意に乱されていないことを示しました。したがって、NBTアッセイは、好中球ROS産生のための簡単で安価で信頼性の高いテストであることが証明され、ROS産生を誘導する特定の刺激の能力と強度を概観するために使用できます。
図3:NBTテスト。 (A)ホルマザン吸光度(490-630 nm)によるさまざまな条件(ネガティブコントロール:100 nM fMLPおよび100 nM PMA)に対する好中球呼吸バーストの分光光度評価。4 人のドナーからのデータは、標準偏差 (SD) ±平均として表示されます。* = すべてのグループは互いに異なる (p≤ 0.05);£ = CTRLとPMAの比較、およびfMLPとPMAの比較では、有意差(p≤0.05)が示されています。(B)スライドテストは定性的に分析でき、ホルマザン沈着物の強度、細胞内の位置、および細胞凝集を特徴付けることができます。黒い矢印はホルマザン結晶を指しています。スケールバー:20μm。 (C)ホルマザンを含むPMNの数を光学顕微鏡でカウント。8人のドナーからのデータは、平均±SDとして提示されました。 *** p < 0.0001、学生のt検定。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4に示すように、貪食スライドを使用して、食作用を行う好中球の割合として食作用率を決定しました。100 nM fMLPと16 μMの抗菌ペプチドはどちらも酵母の飲み込みを明らかに増加させましたが、この差は二重刺激まで統計的に有意ではなく、対照群と比較して食作用が有意に増強され、二重刺激に対する反応を示唆している可能性があります。
図4:食作用試験。 好中球は、その食作用能力(酵母を含む好中球の計数)によって評価されました。酵母インキュベーション前の100 nM fMLPまたは16 μMの抗菌ペプチドへの曝露は、対照群と比較して食作用を増強したが、(A)増加は統計的に有意ではなかった。興味深いことに、fMLPとの最初のインキュベーションとそれに続く抗菌ペプチドの添加により、ヒト好中球の食作用が有意に亢進しました(CTRLとfMLP+抗菌ペプチドの間のアスタリスク)。(B)黒矢印は酵母細胞、緑矢印は好中球のみ、赤矢印は好中球を貪食する。5人のドナーからのデータは、平均±SDとして提示されました。 スケールバー:20 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
リアルタイムの細胞遊走結果の例を 図5に示し、好中球に対する100 nM fMLPのよく知られた走化性効果を示しています。 細胞遊走速度論をゴンペルツモデルに調整し、そのパラメータの比較を可能にした。
図5:リアルタイムの細胞移動。 セル インデックスは、セルの移動によって生じる電気インピーダンスを反映します。このアッセイでは、fMLPを100 nM fMLPを下チャンバーに添加することにより、好中球移動のポジティブコントロールとして使用しました。ネガティブコントロール(CTRL)では、下部チャンバーにHBSSのみが含まれていました。重ね合わせた曲線は、ゴンペルツモデルにフィットする曲線を表し、上り坂と下り坂に最も適合するように修正されています。3人のドナーからのデータ、平均±SD.* p < 0.05、スチューデントのt検定として提示。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
最後に、NETの存在を示唆する簡単な光学顕微鏡検査が提示され、そこではPMNが高速パノプティックで染色されます。PMAや一部の抗菌ペプチドなど、特定のNET誘導刺激に対しては、短い活性化時間(1時間)の後でも、細胞の近くに糸状のウェブ状構造を観察することができますが、ネガティブコントロールやfMLPなどの他の条件では観察できません(図6)。この主張を裏付けるために、100 nm PMAまたは抗菌ペプチドで40分間細胞を活性化した後にDNase Iを添加し、NET様構造を除去しました(図6)。この手法はNETの特性評価には適さず、アーチファクトの影響を受ける可能性がありますが、特に刺激の影響が不明または記述が不十分な状況では、NETの解析へのさらなる投資を正当化するための安価で単純で興味深い出発点です。
図6:NET形成示唆アッセイ。スライドガラス上で1時間活性化した後のパノプティック染色好中球の定性分析は、NET放出を示している可能性があります。CTRL(A,B)群とfMLP(C,D)群はNET放出の兆候を示さなかったが、PMA(E-H)による活性化は、DNase I処理(I-L)によって分解されたNET様構造の形成を誘導した。好中球に対する抗菌ペプチドの効果を調べたところ、DNase I(Q-T)によって分解されたNET様構造(M-P)がスライドに示されていたため、このような刺激がNET放出を誘発できる可能性があることが示されました。赤い矢印は NET に似た構造を示しています。スケールバー:10 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
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Discussion
好中球は非常に動的で応答性の高い細胞であり、寿命が短く、まだ凍結保存できないため19、その生物学の調査は困難です。したがって、生存可能で濃縮された安静中の好中球を得るためには、慎重な手順に従うことが不可欠です11,20。この研究では、穏やかで最小限の操作と、活性化ステップまでの低温の使用に重点を置いた密度ベースの分離技術を採用しました。さらに、血液処理は静脈穿刺後30分以内に行われ、室温で保存する必要があります。本研究は、操作ストレスと実験時間を減らすためのオプションを提示します。プロセスをさらに簡素化するために、1回の溶血手順の後にRBC層を穏やかに再懸濁および吸引することにより赤血球を除去する新しいステップを(オプションとして)プロトコルに導入しました。このステップは、1つの低張溶血ステップのみで大部分の赤血球を除去するため、操作ストレスと実験時間を短縮します。ただし、オペレーターのスキルはこのステップの有効性に大きく影響し、必ずしも赤血球を完全に除去するとは限らないことに注意する必要があります。さらに、赤血球吸引は好中球の損失につながる可能性がありますが、赤血球層に近づくと、より多くの好中球が勾配から最初に回収されたため、収量には影響しません。したがって、アッセイが可能な限り高い純度を必要としない場合、またはオペレーターが一貫して良好な結果を得ている場合は、赤血球吸引が推奨されます。ここで紹介するスクリーニング検査では、少量の汚染物質RBC(<3%)は結果に干渉しません。
試薬調製を含むすべての手順が適切な時間内に実行されるように、2人の研究者間のタイムラインとタスクの分担を詳細に説明するワークフロー(図2)が提示されます。すべての機能アッセイが終了したら、残りの細胞は、適切な溶解バッファーと保管による細胞溶解によるオミクス研究など、さらなる分子研究のために調製することができます。
ROS生産
呼吸バーストは好中球のプライミングと活性化の特徴であり18,21、ROS産生の評価は好中球の活性化状態を推定するために使用される一般的な方法です。この研究では、光学顕微鏡法と分光光度法の2つのアプローチを使用してROS生成を評価しました。
NBT検査は、好中球の呼吸バーストを評価するためのよく知られたアプローチです22,23。一般的に使用される2つの方法は、光学顕微鏡ベース(またはスライドテスト)と分光光度法ベースのアッセイです24,25,26。光学顕微鏡は細胞レベルで細部を可視化することができますが、ユーザーのバイアスがかかりやすいという欠点があります。したがって、NBTスライドテストは、ホルマザン形成パターン、強度、細胞凝集などの表現型の特徴に関する分光光度測定法の定性的な補完として機能します。
NBTスライド試験と分光光度法試験の重要なステップは、NBTとホルマザンの完全可溶化です。メーカーの推奨に反して、NBTは水によく溶けません。ただし、DMSOでNBTを少なくとも15分間均質化した後、水/HBSSを添加して2分間ボルテックスすると、完全に可溶化します。さらに、ホルマザンの吸光度を分析するには、(1)PMN溶解による細胞からのホルマザン結晶の放出と、(2)ホルマザン結晶の完全な可溶化という2つの重要なステップを達成する必要があります。両方のステップは、最近示唆されたように、細胞ペレットを10%SDSで処理することによって達成されました27、続いて超音波処理および570nmでの上清の吸光度分析。
さらに、陰性対照群と陽性対照群のNBT結果は、評価されるスクリーニングの最初のステップです。ホルマザンによるROS産生評価は、単離プロセスが刺激または阻害のいずれかによって細胞の休止状態の望ましくない変化に関与している可能性があるかどうかを示すため、このステップは顕著な違いを示すに違いありません。
シトクロムc還元28またはフローサイトメトリー29分析などの他の方法が、ROS検出によく使用されます。しかし、スクリーニングアプローチを考慮すると、その適用には、より長い実験時間、特定のマーカーの使用、および高価な機器が必要です。ルミノール/イソルミノールの化学発光は、ROSを検出するための迅速で費用対効果の高い方法であり、細胞内および細胞外のROSの鑑別も可能にします。ただし、この方法にはルミノメーターが必要です30,31。装置のコストは施設を使用することで回避できますが、他のアッセイと同時に実施されるスクリーニング分析には適していません。
食作用
PMN/酵母インキュベーションは、貪食を行う好中球の数と好中球あたりに飲み込まれた酵母の数をカウントすることにより、好中球の食作用能力と有効性の概要を提供します。ただし、酵母粒子自体が活性化シグナルであるため、対照群と前処理PMNを比較すると、CTRLとfMLP処理PMNに示されているように、有意な変化を示さない二重刺激システムが構成されます(図4)。それにもかかわらず、このアッセイは、潜在的なモジュレーターが食作用に何らかの影響を与えるかどうかを示すのに有用である。このアッセイを用いて新規の抗菌ペプチドが試験され、その結果は、この刺激の組み合わせに対する興味深い潜在的な応答を示しており、最近では効率的な活性化のために必要であると議論されている32。
このアッセイの重要なステップは染色であり、スライドをパノプティックNo.3(ヘマトキシリン)上に≥3秒間保持すると分析の信頼性が低下します。これは、酵母細胞と好中球核葉が互いに区別できないためです。さらに、このアプローチにより、モジュレーターへの曝露後の好中球の形態解析が可能になります。フローサイトメトリーは、食作用33を分析するための別の効率的な手法であるが、前のトピックで説明したように、膜結合粒子と包入粒子の区別の難しさや、提案されたスクリーニングセットに関連する他の要因による制限がある。本明細書に記載の方法においても同様の制限が観察されるが、これはフォローアップ研究を導くための初期スクリーニングとみなされるべきである。
リアルタイム移行
リアルタイムスクリーニングプロトコルは、PMNの移行能力を評価するために最適化されました。以前の研究では、ネガティブコントロールとIL-8処理の違いを示すために、遊走アッセイにRTCAプレートの下側をコーティングする必要があることが示唆されていました15が、この研究では、コーティング剤を添加せずにfMLP処理細胞で高い信頼区間(CI)値が示されました。結果は、12分以降に有意な移行を伴う高い再現性を示しました。さらに、得られた移動データのカーブフィッティング分析により、セル指数の最大値や傾きの増減など、移動のダイナミクスを理解するのに役立ち、濃度に依存したり、条件によって異なる可能性のあるパラメータを明らかにすることができます。好中球遊走曲線(図5)に最も適合したのは、調整されたゴンペルツ関数34であり、fMLPが最大細胞指数を増加させ、傾きを増加させることを示した。
RTCAシステム内の気泡は、電極を通過する細胞をブロックし、実験を損なう可能性があるため、特に注意が必要です。制限要因は、プレートのコストが高いことです。より安価な手法は細胞遊走を解析するが、それらは良好な再現性を欠くか、またはボイデンチャンバー35のように困難で時間がかかる。したがって、RTCAは、ここで紹介する他のスクリーニング検査と互換性のある信頼性の高い移行分析です。
ネット
最後に、光学顕微鏡を用いて、NET形成の予備評価のための有望で簡便かつ低コストのアッセイが開発されました。これは、食作用スライドの観察から得られたもので、食作用能力への影響について試験された特定のNET誘導刺激であるPMAも、CTRLおよびfMLP群と比較してウェブ状の構造形成を誘導しました。この研究では、これらの構造がNETリリースを示している可能性があるという仮説を立てました。このような仮説は、活性化後にサンプルをDNase Iで処理することによって検証されましたが、PMA活性化好中球では糸状構造は見つかりませんでした。このような構造がNETである可能性が高いという仮定は、PMAがNET形成のよく知られた誘導因子として引用されているという事実36,37、NETsの特異的マーカーを用いた蛍光顕微鏡法による類似構造の発見38,39、およびDNase Iによって触媒されるNETの分解40,41に基づいている.ここで強調しておきたいのは、これはNETの形成を確認するための方法ではなく、NETの存在を示唆する予備的なスクリーニングに過ぎないということです。この検査には限界があり、NETは染色アーチファクトと混同される可能性があるため、他の機能検査と併用できる迅速で低コストのスクリーニングでNETの形成を示唆する上で、関連する目的を果たします。一旦、スクリーニングされている研究に関連する可能性があると検出されると、NETは、後述するように、共焦点または電子顕微鏡42によってさらに評価することができる。
私たちの研究室では、免疫調節活性を持つ可能性が高い新しい抗菌ペプチドは、興味深いROS43、食作用、遊走、および/またはNET調節特性を示すものもあるため、ヒト好中球に対するいくつかのペプチドの影響のさらなる分析をよりよく導くために、この一連のスクリーニングアッセイによって頻繁に評価されています。
結論として、NeutroFun Screenは、多数の未試験化合物から正常密度好中球活性の潜在的なモジュレーターを特定するための貴重なツールを提供します。ただし、この方法は予備的なスクリーニングとしてのみ機能することに注意することが重要です。この最初のスクリーニングの後、より高価で、高度で、時間のかかる方法論を、データ検証のためにこれらの最初の結果によって示唆された特定の機能または経路に向けることができます。ROS産生、食作用、およびNET形成には、データ検証とさらなる定量的結果を得るための代替方法があります。NETの可視化および定量化は、最近詳細に記述されたように、骨髄ペルオキシダーゼおよび好中球エラスターゼなどの細胞外DNAおよび顆粒タンパク質の存在および重複を決定する免疫蛍光顕微鏡分析を通じて行うことができる42。ROSは多くの生物学的プロセスにおいてさまざまな重要な役割を担っているため、その研究は非常に広範で多様です。最も確立された方法論の中には、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)や発光のイムノブロッティングなどの抗体を利用する方法論や、DCFDA、ESR分光法、酵素活性測定による異なる標識下での細胞のフローサイトメトリーなどの蛍光検出があります44。同様に、堅牢な食作用の評価もいくつかの方法で行われます。代替法としては、フローサイトメトリー単独45,46、または蛍光顕微鏡法47と組み合わせた方法がある。記載されているリアルタイム細胞遊走は、さらなるバリデーションを必要とせず、他の方法論では考えられないパラメータを提示する、頑健で十分なアッセイです。このような方法の他の組み合わせは、特定のシナリオにより適している可能性がありますが、要約すると、これは多くの好中球活性を包含する迅速で手頃な組み合わせを表しています。
要約すると、この研究は、高度な方法論に向けて取り組みをより適切に向ける方法として、新しい分子および条件に対する複数の好中球応答を評価するための、単純、迅速、低コストの方法論で構成される一連のアッセイを提供することを目的としています。主な制限として、ROS、NET、および食作用アッセイの結果は予備的なものと見なす必要があり、より特異的で精巧なアッセイによるさらなる検証が必要であり、非自動顕微鏡検査細胞数に依存するものは無意識のバイアスに陥りがちです。
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Disclosures
著者らは、利益相反がないことを宣言します。
Acknowledgments
著者らは、FAPDF、CNPq、CAPES、UnB、FINEP、およびFINATECの助成機関に謝意を表します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CIM-Plate 16 | Agilent | 5665825001 | |
| CLARIOstar Plate Reader | BMG LABTECH | US Patent Number 9,733,124 Product details: MARS Data Analysis Software |
|
| Dimethyl sulfoxide | Dinâmica | 1582 | |
| DNAse I | Sigma - Aldrich | DN 25 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma - Aldrich | E5134 | |
| Fast panoptic stain | Laborclin | 620529 | |
| Glass slide | Exacta | 7102 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution with calcium, with magnesium, without phenol red. | Sigma - Aldrich | 55037C | |
| Hank’s Balanced Salt Solution without calcium chloride, magnesium sulfate and sodium bicarbonate. | Sigma - Aldrich | H4641 | |
| Heparin | Blau | 7896014655229 | |
| Laminar flow cabinet | Veco | VLFS-12 | |
| Microscope | Zeiss | 415501-0101-002 | Product details: Primostar 1 |
| Mixing Block | BIOER | MB-102 | |
| Neubauer improved bright-lined | New Optik | 1110000 | |
| N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine | Sigma - Aldrich | F3506 | |
| Nitroblue tetrazolium | Neon | CAS 298-83-9 | |
| Percoll | Cytiva | 17089101 | separation media |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma - Aldrich | P8139 | |
| Phosphate buffered saline tablet | Sigma - Aldrich | P4417 | |
| ROTOFIX 32 A | Hettich | 1206 | |
| Saccharomyces cerevisiae | Fleischmann | ||
| Safranin | Sigma - Aldrich | 50240 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Cytiva | 17-1313-01 | |
| Sonicator | Qsonica | Q125 | |
| Trypan blue solution | Vetec | C.I. 23850 | |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries, Inc. | 0K-0500-902 | |
| xCELLigence Real-Time Cell Analysis (RTCA) DP (dual purpose) | Agilent | 380601050 | Product details: RTCA system composed of detection hardware, cell plates and software |
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