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Immunology and Infection

न्यूट्रोफिल फ़ंक्शन के त्वरित अवलोकन के लिए स्क्रीनिंग तकनीकों का एक सेट

Published: February 9, 2024 doi: 10.3791/65329
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1, 1
1Laboratory of Protein Chemistry and Biochemistry, Department of Cell Biology, University of Brasilia, 2Institute of Physics, University of Brasilia

Summary

इस प्रोटोकॉल में विभिन्न सिग्नलिंग मार्गों से कार्यों को कवर करने के लिए स्क्रीनिंग विधि के रूप में उपयोग किए जाने वाले न्यूट्रोफिल कार्यात्मक परख का एक सेट है। प्रोटोकॉल सेल व्यवहार्यता, शुद्धता, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पादन, वास्तविक समय प्रवास, फागोसाइटोसिस, और न्यूट्रोफिल बाह्य जाल का एक प्रारंभिक सुझाव का एक प्रारंभिक और सरल मूल्यांकन भी शामिल है.

Abstract

न्यूट्रोफिल को जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में रक्षा की पहली पंक्तियों में से एक के रूप में जाना जाता है और कई विशेष सेलुलर कार्यों को कर सकता है, जैसे कि केमोटैक्सिस, रिवर्स माइग्रेशन, फागोसाइटोसिस, साइटोटॉक्सिक एंजाइम और मेटाबोलाइट्स का क्षरण, और न्यूट्रोफिल बाह्य जाल (एनईटीएस) के रूप में डीएनए की रिहाई। न्यूट्रोफिल ने न केवल खुद को कसकर विनियमित किया है, बल्कि प्रतिरक्षा प्रणाली के अन्य घटकों के नियमन में भी भाग लेते हैं। चूंकि ताजा न्यूट्रोफिल व्यक्तियों के बीच टर्मिनल रूप से विभेदित, अल्पकालिक और अत्यधिक परिवर्तनशील होते हैं, इसलिए एकत्रित नमूनों का अधिकतम लाभ उठाना महत्वपूर्ण है। शोधकर्ताओं को अक्सर कई न्यूट्रोफिल कार्यों के अवलोकन का आकलन करने के लिए स्क्रीनिंग परख करने की आवश्यकता होती है जो मूल्यांकन के तहत विशिष्ट स्थितियों से प्रभावित हो सकते हैं। सामान्य घनत्व न्यूट्रोफिल की एकल अलगाव प्रक्रिया के बाद परीक्षणों का एक सेट इस आवश्यकता को संबोधित करने के लिए विकसित किया गया था, गति, व्यापकता, लागत और सटीकता के बीच संतुलन की मांग करना। परिणामों का उपयोग गहन अनुवर्ती अध्ययनों के कारण और मार्गदर्शन के लिए किया जा सकता है। इस प्रक्रिया को 4 घंटे के औसत समय में किया जा सकता है और इसमें सेल व्यवहार्यता, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) उत्पादन, वास्तविक समय प्रवास, और ग्लास स्लाइड पर खमीर के फागोसाइटोसिस का मूल्यांकन शामिल है, जिससे ओमिक्स अध्ययन जैसे अधिक विस्तृत दृष्टिकोणों के लिए पर्याप्त कोशिकाएं निकलती हैं। इसके अलावा, प्रक्रिया में विशिष्ट मार्करों की कमी के साथ, प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा देखे गए तेज पैनोप्टिक धुंधला होने के बाद एनईटीएस के प्रारंभिक सुझाव का आसानी से निरीक्षण करने का एक तरीका शामिल है, हालांकि यह इंगित करने के लिए पर्याप्त है कि इस तरह से आगे के प्रयास सार्थक होंगे या नहीं। परीक्षण किए गए कार्यों की विविधता परीक्षणों के बीच सामान्य बिंदुओं को जोड़ती है, विश्लेषण समय और व्यय को कम करती है। प्रक्रिया को NeutroFun Screen नाम दिया गया था, और हालांकि सीमाएं होने के बावजूद, यह उपरोक्त कारकों को संतुलित करती है। इसके अलावा, इस काम का उद्देश्य एक निश्चित परीक्षण सेट नहीं है, बल्कि एक दिशानिर्देश है जिसे आसानी से प्रत्येक प्रयोगशाला के संसाधनों और मांगों के लिए समायोजित किया जा सकता है।

Introduction

न्यूट्रोफिल मानव रक्त में सबसे प्रचुर मात्रा में जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाएं हैं और संक्रमण और सूजन में एक प्रमुख भूमिका निभाने के लिए जाने जाते हैं,ऊतक क्षति 1 की साइट पर पहुंचने वाले पहले उत्तरदाता हैं। हाल के वर्षों में, महत्वपूर्ण भूमिका की बढ़ती मान्यता रही है कि न्यूट्रोफिल विभिन्न प्रकार की बीमारियों में खेलते हैं और होमियोस्टेसिस2 का समर्थन करते हैं। न्यूट्रोफिल ने न केवल खुद को कसकर विनियमित किया है, बल्कि प्रतिरक्षा प्रणाली 3,4,5 के अन्य घटकों के नियमन में भी भाग लेते हैं। इसलिए, न्यूट्रोफिल और उनके कई असामान्य सेलुलर फ़ंक्शंस, जैसे कि केमोटैक्सिस, रिवर्स माइग्रेशन6, फागोसाइटोसिस7, श्वसन फट8, और न्यूट्रोफिल बाह्य कोशिकीय जाल (एनईटीएस)7की रिहाई की जांच करना, कई शोध संदर्भों में अनिवार्य है जहां विश्लेषण के तहत विशिष्ट परिस्थितियों द्वारा ट्रिगर किए गए संभावित न्यूट्रोफिल कार्यात्मक, रूपात्मक या आणविक परिवर्तनों का आकलन करना आवश्यक है।

हौसले से पृथक न्यूट्रोफिल टर्मिनल विभेदित, अल्पकालिक, अत्यधिक गतिशील और आसानी सेसक्रिय 9 होते हैं। हालांकि, एक कुशल भंडारण विधि जो न्यूट्रोफिल प्रतिक्रियाओं को प्रभावित नहीं करती है, अभी तक हासिल नहीं की गई है, जिससे कई परख करना चुनौतीपूर्ण हो जाता है जो निर्बाध होना चाहिए। इसके अलावा, पहले वर्णित कार्यात्मक विश्लेषण10,11, साइटोमेट्री और / या फ्लोरोसेंट धुंधला की आवश्यकता होती है कि assays के आधार पर, एक व्यवहार्य विकल्प नहीं हो सकता है जब न्यूट्रोफिल का एक व्यापक और प्रारंभिक मूल्यांकन की जरूरत है.

इन मुद्दों को हल करने के लिए, यह प्रोटोकॉल परीक्षणों के एक सेट का वर्णन करता है जिसे एकल अलगाव प्रक्रिया के बाद किया जा सकता है, जिसमें सेल व्यवहार्यता, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) उत्पादन, वास्तविक समय प्रवास, और सैक्रोमाइसेस सेरेविसिया के फागोसाइटोसिस का मूल्यांकन शामिल है, जिनके परिणाम गहराई से अनुवर्ती अध्ययनों का कारण बन सकते हैं। न्यूट्रोफन स्क्रीन नाम की इस प्रक्रिया को डिग्रेनुलेशन को छोड़कर, प्रमुख प्रभावक गतिविधियों को शामिल करने के लिए डिज़ाइन किया गया था, और इसे सक्रियण के 1 घंटे सहित 4 घंटे के औसत समय में पूरा किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, शेष कोशिकाओं का उपयोग ओमिक्स अध्ययन जैसे अधिक विस्तृत दृष्टिकोणों के लिए किया जा सकता है। इस पद्धति का लाभ गति, व्यापकता, लागत और सटीकता के बीच इसके संतुलन में निहित है।

इसके अलावा, विशिष्ट मार्करों के बिना, एनईटीएस के प्रारंभिक सुझाव को आसानी से देखने का एक तरीका है, लेकिन यह इंगित करने के लिए पर्याप्त है कि क्या उस दिशा में आगे के प्रयास सार्थक होंगे। परीक्षण किए गए कार्यों की विविधता का उद्देश्य परीक्षणों के बीच सामान्य बिंदुओं को संयोजित करना, विश्लेषण समय और व्यय को कम करना है। इस विधि का मुख्य लक्ष्य गति, व्यापकता, लागत और सटीकता के बारे में एक संतुलित, कार्यात्मक विश्लेषण प्रदान करना है जो न्यूट्रोफिल की प्रतिक्रिया के अवलोकन की अनुमति देता है, जिससे यह सामान्य घनत्व न्यूट्रोफिल पर उपन्यास उत्तेजनाओं के प्रभावों की जांच करने में एक उपयोगी प्रारंभिक कदम बन जाता है।

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Protocol

सभी प्रयोगों ने ब्रासीलिया विश्वविद्यालय (प्रक्रिया 13364819.0.0000.5558) में संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा निर्धारित नैतिक दिशानिर्देशों का सख्ती से पालन किया, और दाता गुमनामी सुनिश्चित करने के लिए कोड द्वारा नमूनों की पहचान की गई। कोशिकाओं को 18-35 वर्ष की आयु के सामान्य स्वस्थ पुरुष दाताओं से प्राप्त किया गया था, जिन्होंने सूचित सहमति पर हस्ताक्षर किए और निम्नलिखित पात्रता मानदंडों को पूरा किया: धूम्रपान न करने वाले / वाष्प, कोई पुरानी स्वास्थ्य स्थिति नहीं, और पिछले 14 दिनों में भड़काऊ स्थितियों का कोई इतिहास नहीं।

1. रक्त संग्रह

  1. एसेप्टिक रूप से 5,000 आईयू/एमएल हेपरिन ( सामग्री की तालिकादेखें) के 0.3 एमएल को एक बाँझ 20 एमएल सिरिंज में हेपरिनाइज़ करने के लिए रखें।
  2. पंचर साइट के ऊपर लगभग 4 में एक शिरापरक टूर्निकेट लागू करें और वेनिपंक्चर के लिए मध्य क्यूबिटल या सेफेलिक नस की पहचान करें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि कुल टूर्निकेट समय 1 मिनट से अधिक नहीं है।
  3. पंचर साइट को 70% अल्कोहल से साफ करें और वेनिपंक्चर करें।
  4. रक्त और हेपरिन को ठीक से मिलाने के लिए रक्त एकत्र करने के बाद सिरिंज को तीन या चार बार धीरे से उल्टा करें।

2. न्यूट्रोफिल अलगाव

नोट: पॉलीमोर्फोन्यूक्लियर ल्यूकोसाइट्स (पीएमएन) को घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन के माध्यम से अलग किया जाता है, जिसके बाद शेष लाल रक्त कोशिकाओं (आरबीसी) के हाइपोटोनिक लसीका होते हैं, जैसा कि पहले कुछ बदलावों के साथ11 वर्णित था। यह विधि स्क्रीनिंग परख करने के लिए अनिवार्य नहीं है, और इसे तब तक बदला जा सकता है जब तक कि चुनी गई विधि के परिणामस्वरूप >97% की व्यवहार्यता, पीएमएन के <3% प्राइमिंग या सक्रियण हो, और सभी परख, प्रतिकृति और शर्तों के लिए पर्याप्त कोशिकाएं पैदा होती हैं। सड़न रोकनेवाला परिस्थितियों में इन चरणों को करना और एंडोटॉक्सिन मुक्त समाधानों का उपयोग करना सेल सक्रियण से बचने के लिए अनिवार्य है।

  1. 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में 60% और 70% पृथक्करण मीडिया (व्यावसायिक रूप से उपलब्ध; सामग्री की तालिकादेखें) के 12 एमएल कमजोर पड़ने बनाओ।
  2. 5 एमएल विंदुक का उपयोग करके, 70% कमजोर पड़ने पर 60% कमजोर पड़ने के समय में 4 एमएल जोड़कर नीचे से ऊपर तक ढाल तैयार करें। इंटरफ़ेस को मिलाने से रोकने के लिए इसे धीरे से करें।
  3. घनत्व ढाल के शीर्ष पर हेपरिनाइज्ड रक्त के 12 एमएल को ध्यान से परत करें। कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
    नोट: इस कदम से आगे, पीएमएन सक्रियण तक, उपयोग किए जाने वाले सभी अभिकर्मकों और ट्यूबों को बर्फ से भरे कूलर में रखा जाना चाहिए।
  4. प्लाज्मा / मोनोन्यूक्लियर सेल परत त्यागें, फिर एरिथ्रोसाइट गोली के ऊपर की परत को दो 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में प्रत्येक में लगभग 7.5 एमएल के साथ धीरे से स्थानांतरित करें। हांक के संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस; सामग्री की तालिकादेखें) के साथ ट्यूब की मात्रा बनाएं।
  5. 19 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 300 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
  6. HBSS के साथ सेल गोली धो लें.
    1. ट्यूब डालने का कार्य द्वारा सतह पर तैरनेवाला त्यागें और धीरे HBSS के 7 एमएल में गोली resuspend.
    2. सभी जुदाई मीडिया को हटाने के लिए 19 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 300 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
  7. शेष आरबीसी के हाइपोटोनिक लसीका का प्रदर्शन करें।
    1. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और एक ही ट्यूब में छर्रों गठबंधन.
    2. बाँझ एच2ओ के 3 एमएल में आरबीसी/पीएमएन गोली को फिर से निलंबित करें और परासरण को बहाल करने के लिए 25 एस के भीतर एचबीएसएस (2x) के 3 एमएल जोड़ें। फिर, 19 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 300 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
    3. एक सफेद, एरिथ्रोसाइट मुक्त गोली के लिए चरण 2.8.1 और 2.8.2 दोहराएं।
      नोट: आरबीसी टूटने वाले उत्पादों के साथ न्यूट्रोफिल के संपर्क को कम करने के लिए सतह पर तैरनेवाला को जल्द से जल्द हटा दिया जाना चाहिए। वैकल्पिक रूप से, दूसरे हाइपोटोनिक लसीका को अवशिष्ट आरबीसी परत को धीरे से निलंबित करके और सभी सतह पर तैरनेवाला को हटाकर प्रतिस्थापित किया जा सकता है, क्योंकि शेष आरबीसी पीएमएन गोली के ऊपर तलछट करेंगे।
  8. ट्यूब डालने का कार्य द्वारा सतह पर तैरनेवाला त्यागें, धीरे शेष बफर में पीएमएन resuspended है, और एक बर्फ ठंड माइक्रोट्यूब के लिए उन्हें हस्तांतरण.
    नोट: एक micropipette के साथ resuspended कोशिकाओं को स्थानांतरित करते समय मात्रा एनोटेट करने के लिए सुनिश्चित करें.
  9. कोशिका निलंबन के 3 x 1 माइक्रोन को एक साफ ग्लास स्लाइड (1 माइक्रोन प्रत्येक के तीन कुओं) में स्थानांतरित करें और आकृति विज्ञान और शुद्धता मूल्यांकन12 के लिए तेजी से पैनोप्टिक (सामग्री की तालिकादेखें) के साथ दाग दें।
    1. तेजी से पैनोप्टिक के साथ दाग करने के लिए, पैनोप्टिक लगानेवाला एन ° 1 में पांच बार स्लाइड को विसर्जित करें, ईोसिन एन ° 2 में छह बार, और हेमटोक्सिलिन एन ° 3 में दो बार, प्रत्येक विसर्जन 1 एस तक चलने के साथ।
    2. धीरे आसुत जल के साथ गिलास स्लाइड धो लें.
    3. छानने और हवा में सूखने दें।
  10. एक माइक्रोस्कोप के नीचे निरीक्षण करें और प्रत्येक कुएं में 300 यादृच्छिक कोशिकाओं की गणना करें, इस प्रकार न्यूट्रोफिल को अन्य ग्रैनुलोसाइट्स से अलग करें।
  11. सेल निलंबन के 1 माइक्रोन को 0.2% ट्राइपैन ब्लू डाई13 के 49 माइक्रोन में स्थानांतरित करें और मृत और व्यवहार्य कोशिकाओं के बीच अंतर करते हुए, न्यूबॉयर कक्ष का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें।
  12. 50% ऑटोलॉगस प्लाज्मा और 50% एचबीएसएस कैल्शियम और मैग्नीशियम के साथ पूरक 50% एचबीएसएस के समाधान का उपयोग करके सेल एकाग्रता को 6,667 कोशिकाओं/μL में समायोजित करें। नकारात्मक नियंत्रण सहित परीक्षण की जाने वाली स्थितियों के अनुरूप माइक्रोट्यूब के बीच समान रूप से 6,667 कोशिकाओं/μL निलंबन को विभाजित करें।
    नोट: मॉडल जीव में परिसंचारी न्यूट्रोफिल के समान किसी भी सेल एकाग्रता का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन प्रजनन क्षमता के लिए सभी प्रयोगों में एक ही सेल एकाग्रता का उपयोग करना महत्वपूर्ण है।

Figure 1
चित्रा 1: न्यूट्रोफिल अलगाव प्रोटोकॉल। पृथक्करण मीडिया (पेर्कोल) (ए) की दो सांद्रता (बी) खड़ी होती है, फिर रक्त को पृथक्करण ढाल (सी) के शीर्ष पर स्तरित किया जाता है। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, पीएमएन केंद्रीय परत (डी) में है, जिसे दो 15 एमएल ट्यूबों (ई) में विभाजित किया गया है। सेल निलंबन एचबीएसएस में दो बार धोया जाता है और मीडिया को हटाने के लिए centrifuged (G-I) है, तो कोशिकाओं resuspended हैं, और अवशिष्ट आरबीसी hypotonic lysis (J-M) के दो दौर के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

3. न्यूट्रोफिल सक्रियण के लिए तैयारी

  1. 1.5 एमएल माइक्रोट्यूब में, प्रत्येक स्थिति के लिए एक सक्रियण प्रणाली तैयार करें ताकि अंतिम सेल एकाग्रता 6,600 कोशिकाओं / उदाहरण के लिए, 100 एनएम एफएमएलपी (एन-फॉर्माइल-मेथियोनील-ल्यूसिल-फेनिलएलनिन; सामग्री की तालिकादेखें) के प्रभावों का परीक्षण करने के लिए, 6,667 सेल/μL निलंबन के 495 माइक्रोन में 10 माइक्रोन fMLP के 5 माइक्रोन जोड़ें। नकारात्मक (unstimulated) नियंत्रण के लिए, सीए2 + और मिलीग्राम2 + युक्त HBSS जोड़ें.
    नोट: इस पद्धति को प्रदर्शित करने के लिए, उत्तेजनाओं के निम्नलिखित अंतिम सांद्रता का उपयोग किया गया था: 100 एनएम एफएमएलपी, 16 माइक्रोन फॉलेक्सिन, स्वाभाविक रूप से होने वाली रोगाणुरोधी पेप्टाइड14, और 100 एनएम पीएमए (फोरबोल 12-मायरिस्टेट 13-एसीटेट) ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  2. रोटेशन के बिना 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    नोट: कार्यात्मक परख के लिए सभी विभाज्य इस सेल निलंबन से लिए जाते हैं, इसके बाद सक्रियण प्रणाली के रूप में संदर्भित किया जाता है।

4. आरओएस उत्पादन के मूल्यांकन के लिए नाइट्रोटेट्राजोलियम ब्लू क्लोराइड (एनबीटी) परख

  1. एनबीटी काम समाधान की तैयारी: प्रत्येक प्रयोगात्मक हालत के लिए, निम्न चरणों का उपयोग कर 6 मिमी के एक एनबीटी ( सामग्री की तालिकादेखें) काम समाधान तैयार करें:
    1. कम से कम 15 मिनट के लिए डाइमिथाइल सल्फ़ोक्साइड (डीएमएसओ) और भंवर के 10 माइक्रोन में 0.0005 ग्राम एनबीटी भंग करें।
    2. HBSS Ca2+Mg2+ के 90 माइक्रोन और 2 मिन तक भंवर जोड़ें।
      नोट: एनबीटी से जुड़े सभी चरणों को अंधेरे में किया जाना चाहिए।
  2. एनबीटी स्लाइड परीक्षण करें।
    1. सेल सक्रियण के 20 मिनट के बाद, धीरे सेल निलंबन मिश्रण और ध्यान से एक साफ गिलास स्लाइड करने के लिए पीएमएन के 2 माइक्रोन हस्तांतरण. 37 डिग्री सेल्सियस पर एक humidified कक्ष में 20 मिनट के लिए सेते हैं.
      नोट: सेल निलंबन को स्लाइड पर बहुत अधिक न फैलाएं; अन्यथा यह इनक्यूबेशन से पहले सूख सकता है।
    2. कोशिकाओं पर एनबीटी काम समाधान के 1 माइक्रोन जोड़ें और प्रकाश से संरक्षित 20 मिनट के लिए आगे सेते हैं।
    3. गर्म हवा के साथ स्लाइड सूखी और 1 मिनट के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से में मेथनॉल की एक बूंद के साथ इसे ठीक. 1 मिनट के लिए 0.03% सैफरैनिन ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ दाग।
    4. धीरे आसुत जल के साथ गिलास स्लाइड धो लें.
    5. स्लाइड हवा शुष्क करने के लिए और एक खुर्दबीन के तहत निरीक्षण की अनुमति दें.
    6. प्रत्येक कुएं में 100 यादृच्छिक कोशिकाओं की गणना करें, फॉर्मज़ान जमा के साथ और बिना न्यूट्रोफिल को अलग करें।
  3. एनबीटी स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री परख करें।
    1. सेल सक्रियण के 40 मिनट के बाद, धीरे सेल निलंबन मिश्रण और एक साफ माइक्रोट्यूब के लिए सक्रियण प्रणाली से पीएमएन के 90 माइक्रोन हस्तांतरण. फिर, ध्यान से 6 मिमी एनबीटी समाधान के 20 माइक्रोन जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए अंधेरे में सेते हैं.
    2. 10% सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस; सामग्री की तालिकादेखें) और भंवर के 100 माइक्रोन जोड़ें।
    3. 60% के आयाम पर एक टिप-सोनिकेटर का उपयोग करके सोनिकेट करें, 15 एस के पांच चक्र प्रत्येक 15 एस अंतराल के साथ। 5 मिनट के लिए 12,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
    4. सतह पर तैरनेवाला के 60 माइक्रोन को एक स्पष्ट-तल 96-अच्छी प्लेट में स्थानांतरित करें और 570 एनएम पर फॉर्मेज़ान उत्पाद के अवशोषण को मापें।

5. फागोसाइटोसिस परख

  1. प्रत्येक स्थिति के लिए 33,000 यीस्ट/μL सस्पेंशन तैयार करें, जैसा कि नीचे वर्णित है:
    1. HBSS Ca2+Mg2+ के 200 μL में लगभग 0.75 मिलीग्राम सूखा खमीर (Saccharomyces cerevisiae; सामग्री की तालिकादेखें) जोड़ें और कम से कम 15 मिनट के लिए 500 rpm के साथ 100 °C पर थर्मोमिक्सर में इनक्यूबेट करें।
    2. भंवर द्वारा मिश्रण को समरूप बनाएं और खमीर निलंबन के 5 माइक्रोन को 0.2% ट्राइपैन ब्लू डाई के 45 माइक्रोन में स्थानांतरित करें। एक Neubauer कक्ष का उपयोग खमीर गिनती.
    3. HBSS Ca 33,000+Mg 2+ का उपयोग करके प्रारंभिक निलंबन की एकाग्रता को 2 खमीर कोशिकाओं/μL में समायोजित करें। उपयोग होने तक निलंबन को बर्फ पर रखें।
  2. सेल सक्रियण के 20 मिनट के बाद, धीरे से सेल निलंबन मिश्रण और सक्रियण प्रणाली के 5 माइक्रोन को 33,000 खमीर / μL Saccharomyces cerevisiae निलंबन के 5 माइक्रोन में एक नए बाँझ माइक्रोट्यूब में स्थानांतरित करें।
    नोट: खमीर अनुपात के लिए न्यूट्रोफिल 1: 5 (पीएमएन: खमीर) है।
  3. तुरंत पीएमएन/खमीर निलंबन के 6 माइक्रोन को एक साफ ग्लास स्लाइड (2 माइक्रोन प्रत्येक) के तीन कुओं में स्थानांतरित करें और स्लाइड को 40 मिनट के लिए एक आर्द्र कक्ष में इनक्यूबेट करें।
    नोट: सेल निलंबन को स्लाइड पर बहुत अधिक न फैलाएं; अन्यथा, यह इनक्यूबेशन से पहले सूख सकता है।
  4. गर्म हवा के नीचे स्लाइड को सुखाएं और तेज पैनोप्टिक के साथ दाग दें, जैसा कि ऊपर चरण 2.9 में वर्णित है।
    नोट: तेजी से पैनोप्टिक धुंधला हो जाना का तीसरा चरण स्लाइड के माइक्रोस्कोपी विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण है। इस चरण में ≥3 s के लिए स्लाइड धुंधला यह विश्लेषण के लिए अयोग्य प्रस्तुत कर सकते हैं, क्योंकि यह न्यूट्रोफिल परमाणु पालियों से खमीर अंतर करने के लिए मुश्किल हो जाएगा.
  5. माइक्रोस्कोप के नीचे स्लाइड का निरीक्षण करें, प्रत्येक कुएं के 100 यादृच्छिक न्यूट्रोफिल की गिनती करें और फागोसाइटोसिस के लिए पीएमएन सकारात्मक और नकारात्मक के बीच भेदभाव करें।
    नोट: पीएमएन सेलुलर झिल्ली के भीतर या सीधे संपर्क में कम से कम एक खमीर कण फागोसाइटोसिस के लिए पीएमएन पॉजिटिव इंगित करता है। यदि खमीर/न्यूट्रोफिल अनुपात में रुचि है, तो खमीर कणों की संख्या की भी गणना करें।

6. वास्तविक समय पीएमएन केमोटैक्सिस परख

नोट: माइग्रेशन परख निम्नलिखित अनुकूलन के साथ पिछले15 वर्णित प्रोटोकॉल के समान किया जाता है:

  1. एक प्रतिबाधा-आधारित वास्तविक समय सेल विश्लेषक (आरटीसीए) प्लेट के निचले कक्ष में केमोएट्रैक्टेंट (जैसे, एफएमएलपी, आईएल -8, सी 5, या एलटीबी 4; सामग्री की तालिका देखें) के 160 माइक्रोन जोड़कर केमोटैक्टिक ढाल तैयार करें। नकारात्मक नियंत्रण और रिक्त स्थान के लिए, HBSS Ca2+Mg2+ के 160 माइक्रोन जोड़ें।
  2. ऊपरी कक्ष संलग्न करें और एचबीएसएस सीए2 + मिलीग्राम2 + के 25 माइक्रोन जोड़ें। कीमोटैक्टिक ढाल बनाने के लिए कम से कम 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
  3. सेल सक्रियण के 60 मिनट के बाद, धीरे सेल निलंबन मिश्रण और ऊपरी कक्ष में सेल निलंबन के 60 माइक्रोन जगह. HBSS Ca2+Mg2+ के 60 माइक्रोन को रिक्त स्थान पर जोड़ें।
  4. RTCA प्लेट प्लेस र RTCA सफ्टवेयर प्रोग्राम सेल सूचकांक को मापने के लिए (सीआई) प्रत्येक 60 s 2 घंटे के लिए.
    नोट: RTCA प्लेटहरू पुन्हा प्रयोगको लागि धुन सकिन्छ जसले पहिले वर्णनगरिएको अनुसार 16. सारांश में, आरटीसीए कक्षों और इलेक्ट्रोड को फॉस्फेट-बुफर्ड खारा (पीबीएस) के साथ तीन बार धोएं, फिर टाइप I अल्ट्राप्योर पानी के साथ दो बार। 40 मिनट के लिए 0.25% ट्रिप्सिन 0.53 मिमी एथिलीनडायमिनेटेट्राएसेटिक एसिड (ईडीटीए) के साथ निचले और ऊपरी कक्ष को इनक्यूबेट करें। अल्ट्राप्योर पानी से तीन बार धोएं।

7. नेट विचारोत्तेजक परख

  1. सेल सक्रियण के 10 मिनट के बाद, धीरे सेल निलंबन मिश्रण और मूल्यांकन के तहत प्रत्येक सक्रियण प्रणाली से पीएमएन के 4 माइक्रोन हस्तांतरण, एक साफ गिलास स्लाइड के दो कुओं में विभाजित. 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक humidified कक्ष में सेते हैं.
  2. डीएनए मैं कुओं में से एक के लिए डीएनए के 1 माइक्रोन जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस (एक गीला कक्ष में) पर 20 मिनट के लिए सेते हैं.
  3. स्लाइड सूखी और तेजी से panoptic के साथ दाग, के रूप में पहले "न्यूट्रोफिल अलगाव" अनुभाग के चरण 2.9 में वर्णित.
  4. एक खुर्दबीन के तहत स्लाइड का मूल्यांकन.
    नोट: नेट रिलीज के किसी भी संकेत की तलाश करें, जो वेब जैसी संरचनाओं की उपस्थिति की विशेषता है। एक बार पहचाने जाने के बाद, पुष्टि करें कि क्या डीएनए I उपचार ऐसी संरचनाओं को हटाने में सक्षम था। यह परख नेट गठन का विचारोत्तेजक है, क्योंकि उनकी उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए अतिरिक्त परीक्षणों की आवश्यकता होती है।

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Representative Results

इस अध्ययन (चित्रा 1) में इस्तेमाल घनत्व आधारित अलगाव विधि प्रस्तावित प्रयोगों के लिए मानदंडों को पूरा किया. इस विधि से प्राप्त न्यूट्रोफिल मापदंडों व्यवहार्यता शामिल ≥98%, शुद्धता ≥94%, और सेल उपज ≥1.5 एक्स 107, कोई सक्रियण स्क्रीनिंग परीक्षण द्वारा detectable के साथ. पीएमएन के अलगाव में दो प्रासंगिक कदम एंटीकोआग्यूलेशन और आरबीसी हटाने हैं। घनत्व ढाल पर लेयरिंग से पहले एक कोमल रॉकिंग पर एंटीकोआगुलेटेड रक्त ट्यूब या सिरिंज रखते हुए और सक्रियण और संदूषण दोनों को रोकने के लिए आरबीसी हटाने की विधि का चयन प्रयोग उपज और प्रजनन क्षमता को प्रभावित कर सकता है।

न्यूट्रोफिल फ़ंक्शन के कार्यात्मक अवलोकन का आकलन करने के लिए, एक वर्कफ़्लो विकसित किया गया था जिसने प्रस्तावित स्क्रीनिंग परख को 4 घंटे के औसत समय में कम से कम दो शोधकर्ताओं के साथ करने की अनुमति दी थी, जिसमें 1 घंटे की सक्रियता और वास्तविक समय माइग्रेशन मॉनिटरिंग के 2 घंटे थे, जैसा कि दिखाया गया है चित्रा 2.

Figure 2
चित्र 2: NeutroFun स्क्रीन वर्कफ़्लो। मूल्यांकन के तहत विशिष्ट स्थितियों द्वारा ट्रिगर की गई कार्यात्मक प्रतिक्रियाओं के पैनल का आकलन करने के लिए, न्यूट्रोफन स्क्रीन वर्कफ़्लो में कम से कम दो शोधकर्ताओं की भागीदारी शामिल है। शोधकर्ता 1 (आर 1) पीएमएन अलगाव प्रक्रिया शुरू करता है, इसके बाद सेल एकाग्रता समायोजन और सक्रियण प्रणाली इनक्यूबेशन, जबकि समानांतर में, शोधकर्ता 2 (आर 2) अगले परख करने के लिए सामग्री तैयार करता है, जो दोनों के बीच विभाजित हैं: आर 1 फागोसाइटोसिस, नेट और स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक एनबीटी परख करता है; R2 रीयल-टाइम माइग्रेशन और NBT स्लाइड परीक्षण करता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

क्लासिक एनबीटी परख17 को पीएमएन द्वारा उत्पन्न आरओएस के साथ एनबीटी की प्रतिक्रिया के परिणामस्वरूप फॉर्मज़ान गठन के स्लाइड और स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक मूल्यांकन दोनों के लिए अनुकूलित किया गया था। स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक परख ने स्थितियों के बीच सापेक्ष मात्रा का ठहराव करने की अनुमति दी, जबकि माइक्रोस्कोपी परख वर्णनात्मक और अर्ध-मात्रात्मक विश्लेषण के लिए उपयोगी थी, क्रिस्टल वितरण, आकृति विज्ञान और फॉर्मज़ान युक्त कोशिकाओं की संख्या की नियमितता का मूल्यांकन करती थी। स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक परख के परिणाम चित्रा 3 ए में दिखाए गए हैं, यह दर्शाता है कि 100 एनएम पीएमए ने एफएमएलपी और नियंत्रण समूहों की तुलना में ऊंचा आरओएस उत्पादन (3: 2: 1 के औसत अनुपात में) प्रेरित किया। एनबीटी स्लाइड परीक्षण के परिणाम (चित्रा 3बी) ने स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक परिणामों की पुष्टि की, पीएमए को एफएमएलपी(चित्रा 3सी)की तुलना में सबसे तीव्र आरओएस उत्पादन-उत्प्रेरण उत्तेजना के रूप में भी दिखाया, जैसा कि पहले साइटोमेट्री18द्वारा आरओएस के प्रत्यक्ष माप द्वारा प्रदर्शित किया गया था। सेल गिनती के संबंध में, फॉर्मेज़ान क्रिस्टल युक्त न्यूट्रोफिल की संख्या ने पीएमए: एफएमएलपी: नियंत्रण स्थितियों में 7: 4: 1 का अनुपात दिखाया, साथ ही एफएमएलपी और पीएमए-सक्रिय पीएमएन के बीच विभिन्न फॉर्मज़ान वितरण पैटर्न का खुलासा किया; fMLP उपचार के परिणामस्वरूप व्यक्तिगत कोशिकाओं को गहन रूप से सक्रिय किया गया, जबकि PMA ने अधिकांश PMN में साइटोप्लाज्म में बिखरे हुए फॉर्मेज़ान क्रिस्टल के गठन को प्रेरित किया। इसके अलावा, कुछ रूपात्मक विशेषताओं है कि शर्तों विभेदित मनाया गया, इस तरह के पीएमए उपचार के बाद अभिव्यंजक सेल एकत्रीकरण के रूप में. इस तरह की विशिष्ट सक्रियण विशेषताओं की अनुपस्थिति और नियंत्रण समूह पर फॉर्मेज़ान के निम्न स्तर ने संकेत दिया कि आराम की स्थिति काफी परेशान नहीं थी। इसलिए, एनबीटी परख न्यूट्रोफिल आरओएस उत्पादन के लिए एक सरल, सस्ती और विश्वसनीय परीक्षण साबित हुई जिसका उपयोग आरओएस उत्पादन को प्रेरित करने के लिए किसी दिए गए उत्तेजना की क्षमता और तीव्रता का अवलोकन करने के लिए किया जा सकता है।

Figure 3
चित्रा 3: एनबीटी परीक्षण। (ए) फॉर्मज़ान अवशोषण (490-630 एनएम) द्वारा विभिन्न स्थितियों (नकारात्मक नियंत्रण: 100 एनएम एफएमएलपी और 100 एनएम पीएमए) के लिए न्यूट्रोफिल श्वसन फट का स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक मूल्यांकन। चार दाताओं के डेटा को मानक विचलन (एसडी) ± मतलब के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। * = सभी समूह एक दूसरे से भिन्न हैं (p≤ 0.05); £ = तुलना CTRL बनाम PMA और fMLP बनाम PMA महत्वपूर्ण अंतर दिखाती है (p≤ 0.05)। (बी) स्लाइड परीक्षण का गुणात्मक विश्लेषण किया जा सकता है, जो फॉर्मज़ान जमा की तीव्रता, सेल के भीतर इसके स्थान और सेल एकत्रीकरण की विशेषता है। काले तीर फॉर्मज़ान क्रिस्टल की ओर इशारा करते हैं। स्केल बार: 20 माइक्रोन। (सी) ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी द्वारा गिना जाता है formazan युक्त PMN की संख्या. आठ दाताओं के डेटा को एसडी ± औसत के रूप में प्रस्तुत किया गया। *** पी < 0.0001, छात्र का टी-टेस्ट। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

फागोसाइटोसिस स्लाइड का उपयोग फागोसाइटोसिस करने वाले न्यूट्रोफिल के प्रतिशत के रूप में फागोसाइटोसिस दर निर्धारित करने के लिए किया गया था, जैसा कि चित्र 4में दिखाया गया है। हालांकि 100 एनएम एफएमएलपी और 16 माइक्रोन रोगाणुरोधी पेप्टाइड दोनों ने स्पष्ट रूप से बढ़ी हुई खमीर निगलने को प्रेरित किया, अंतर दोहरी उत्तेजना तक सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण नहीं था, जिसने नियंत्रण समूह की तुलना में फागोसाइटोसिस को काफी बढ़ाया और दोहरी उत्तेजना पर प्रतिक्रिया का सुझाव दे सकता है।

Figure 4
चित्रा 4: फागोसाइटोसिस परीक्षण। न्यूट्रोफिल का मूल्यांकन उनकी फागोसाइटोसिस क्षमता (खमीर युक्त न्यूट्रोफिल की गिनती) द्वारा किया गया था। हालांकि खमीर से पहले 100 एनएम एफएमएलपी या 16 माइक्रोन रोगाणुरोधी पेप्टाइड के संपर्क में इनक्यूबेशन नियंत्रण समूह की तुलना में फागोसाइटोसिस में वृद्धि हुई, (ए) वृद्धि सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण नहीं थी। दिलचस्प बात यह है कि एफएमएलपी के साथ एक प्रारंभिक इनक्यूबेशन, इसके बाद रोगाणुरोधी पेप्टाइड के अलावा, मानव न्यूट्रोफिल (सीटीआरएल और एफएमएलपी + रोगाणुरोधी पेप्टाइड के बीच तारांकन) में फागोसाइटोसिस में काफी वृद्धि हुई। (बी) काले तीर खमीर कोशिकाओं को दिखाते हैं, हरे तीर अकेले न्यूट्रोफिल दिखाते हैं, और लाल तीर फागोसाइटोज़िंग न्यूट्रोफिल को इंगित करते हैं। पांच दाताओं से डेटा एसडी ± मतलब के रूप में प्रस्तुत स्केल सलाखों: 20 माइक्रोन. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

वास्तविक समय सेल माइग्रेशन परिणामों का एक उदाहरण चित्रा 5 में दिखाया गया है, न्यूट्रोफिल पर 100 एनएम fMLP के प्रसिद्ध कीमोटैक्टिक प्रभाव का प्रदर्शन। सेल माइग्रेशन कैनेटीक्स को गोम्पर्ट्ज़ मॉडल में समायोजित किया गया था, जिससे इसके मापदंडों की तुलना की जा सके।

Figure 5
चित्रा 5: वास्तविक समय सेल माइग्रेशन। सेल इंडेक्स सेल माइग्रेशन के परिणामस्वरूप विद्युत प्रतिबाधा को दर्शाता है। इस परख में, fMLP निचले कक्ष में 100 एनएम fMLP जोड़कर न्यूट्रोफिल प्रवास के सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। एक नकारात्मक नियंत्रण (CTRL) में निचले कक्ष में केवल HBSS होता है। आरोपित वक्र गोम्पर्ट्ज़ मॉडल के लिए वक्र फिटिंग का प्रतिनिधित्व करते हैं, जो आरोही और अवरोही ढलानों को सबसे अच्छा फिट करने के लिए संशोधित किया गया है। तीन दाताओं से डेटा, एसडी ± माध्य के रूप में प्रस्तुत किया गया.* पी < 0.05, छात्र का टी-टेस्ट। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अंत में, नेट की उपस्थिति का एक सरल ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी परीक्षण प्रस्तुत किया जाता है, जिसमें पीएमएन तेजी से पैनोप्टिक के साथ दाग होते हैं। यह निरीक्षण करना संभव है कि कुछ विशिष्ट नेट-उत्प्रेरण उत्तेजनाओं के लिए, जैसे पीएमए या कुछ रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स, यहां तक कि थोड़े सक्रियण समय (1 एच) के बाद भी कोशिकाओं के पास फिलामेंटस वेब जैसी संरचनाओं का निरीक्षण करना संभव है, जबकि यह नकारात्मक नियंत्रण और एफएमएलपी (चित्रा 6) जैसी अन्य स्थितियों में संभव नहीं है। बेहतर इस दावे का समर्थन करने के लिए, DNase मैं 100 एनएम पीएमए या एक रोगाणुरोधी पेप्टाइड के साथ सेल सक्रियण के 40 मिनट के बाद जोड़ा गया था, नेट जैसी संरचनाओं (चित्रा 6) को हटाने. यद्यपि यह विधि नेट लक्षण वर्णन के लिए उपयुक्त नहीं है और कलाकृतियों से प्रभावित हो सकती है, यह एनईटीएस के विश्लेषण में आगे के निवेश को सही ठहराने के लिए एक सस्ता, सरल और दिलचस्प प्रारंभिक बिंदु है, विशेष रूप से उन संदर्भों में जहां उत्तेजनाओं के प्रभाव अज्ञात या खराब वर्णित हैं।

Figure 6
चित्रा 6: नेट गठन विचारोत्तेजक परख। एक ग्लास स्लाइड पर सक्रियण के 1 घंटे के बाद पैनोप्टिक-सना हुआ न्यूट्रोफिल का गुणात्मक विश्लेषण नेट रिलीज का संकेत दे सकता है। CTRL (A, B) और fMLP (C,D) समूहों ने NET रिलीज़ का कोई संकेत नहीं दिखाया, जबकि PMA (E-H) के साथ सक्रियण ने NET-जैसी संरचनाओं के गठन को प्रेरित किया जो DNase I उपचार (I-L) द्वारा अपमानित किए गए थे। न्यूट्रोफिल पर एक रोगाणुरोधी पेप्टाइड के प्रभावों की जांच से पता चला है कि इस तरह की उत्तेजना नेट रिलीज को प्राप्त करने में सक्षम हो सकती है, क्योंकि स्लाइड्स ने एनईटी जैसी संरचनाओं (एमपी) को प्रस्तुत किया था जो डीएनएएस I (क्यू-टी) द्वारा अपमानित किए गए थे। लाल तीर नेट जैसी संरचनाओं की ओर इशारा करते हैं। स्केल बार: 10 माइक्रोन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

न्यूट्रोफिल अत्यधिक गतिशील और उत्तरदायी कोशिकाएं हैं जो अल्पकालिक हैं और अभी तक क्रायोप्रिजर्वनहीं हो सकती हैं, जिससे उनके जीव विज्ञान में जांच चुनौतीपूर्ण हो जाती है। इसलिए, व्यवहार्य, समृद्ध, और आराम न्यूट्रोफिल11,20 प्राप्त करने के लिए सावधान कदम का पालन करने के लिए आवश्यक है. इस अध्ययन ने घनत्व-आधारित अलगाव तकनीक को नियोजित किया जो कोमल और न्यूनतम हेरफेर पर जोर देता है, साथ ही सक्रियण चरण तक कम तापमान का उपयोग करता है। इसके अतिरिक्त, रक्त प्रसंस्करण वेनिपंक्चर के बाद 30 मिनट के भीतर होना चाहिए और कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जाना चाहिए। वर्तमान कार्य हेरफेर, तनाव और प्रयोग के समय को कम करने का विकल्प प्रस्तुत करता है। प्रक्रिया को और सरल बनाने के लिए, हमने प्रोटोकॉल में एक नया कदम (एक विकल्प के रूप में) पेश किया, जिसमें एकल हेमोलिसिस प्रक्रिया के बाद आरबीसी परत के कोमल निलंबन और आकांक्षा द्वारा आरबीसी को हटाना शामिल है। यह कदम हेरफेर तनाव और प्रयोग के समय को कम करता है, क्योंकि यह केवल एक हाइपोटोनिक हेमोलिसिस चरण के साथ अधिकांश आरबीसी को हटा देता है। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि ऑपरेटर कौशल इस चरण की प्रभावशीलता को बहुत प्रभावित करते हैं, और यह हमेशा आरबीसी को पूरी तरह से हटा नहीं सकता है। इसके अलावा, आरबीसी आकांक्षा से न्यूट्रोफिल का नुकसान हो सकता है, लेकिन यह उपज को प्रभावित नहीं करता है, क्योंकि आरबीसी परत के करीब इकट्ठा होने पर अधिक न्यूट्रोफिल शुरू में ढाल से बरामद किए गए थे। इसलिए, आरबीसी आकांक्षा की सिफारिश की जाती है यदि परख को उच्चतम संभव शुद्धता की आवश्यकता नहीं होती है, या यदि ऑपरेटर के लगातार अच्छे परिणाम आए हैं। यहां प्रस्तुत स्क्रीनिंग परीक्षणों के लिए, दूषित आरबीसी (<3%) की एक छोटी मात्रा परिणामों में हस्तक्षेप नहीं करेगी।

यह सुनिश्चित करने के लिए कि अभिकर्मक तैयारी सहित सभी प्रक्रियाओं को नियत समय में किया जाता है, एक वर्कफ़्लो प्रस्तुत किया जाता है (चित्र 2) जो दो शोधकर्ताओं के बीच समयरेखा और कार्यों के विभाजन का विवरण देता है। सभी कार्यात्मक परख समाप्त होने के बाद, शेष कोशिकाओं को आगे आणविक जांच के लिए तैयार किया जा सकता है, जैसे उचित लाइसिस बफर और भंडारण के साथ सेल लाइसिस द्वारा ओमिक्स अध्ययन।

आरओएस उत्पादन
श्वसन फट न्यूट्रोफिल भड़काना और सक्रियण18,21 की एक बानगी है, और आरओएस उत्पादन का मूल्यांकन न्यूट्रोफिल की सक्रियता स्थिति का अनुमान लगाने के लिए इस्तेमाल किया एक आम तरीका है. इस अध्ययन ने दो दृष्टिकोणों का उपयोग करके आरओएस उत्पादन का मूल्यांकन किया: ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी और स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री।

एनबीटी परीक्षण न्यूट्रोफिल22,23 में श्वसन फट का आकलन करने के लिए एक प्रसिद्ध दृष्टिकोण है. दो आमतौर पर इस्तेमाल किया तरीकों ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी आधारित (या स्लाइड परीक्षण) और स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री आधारित परख24,25,26 हैं. हालांकि ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी सेल स्तर पर विवरण के दृश्य के लिए अनुमति देता है, यह उपयोगकर्ता पूर्वाग्रह के लिए प्रवण है. इसलिए, एनबीटी स्लाइड परीक्षण फेनोटाइपिक विशेषताओं के बारे में स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक परख के गुणात्मक पूरक के रूप में कार्य करता है, जैसे कि फॉर्मज़ान गठन पैटर्न, तीव्रता और सेल एकत्रीकरण।

एनबीटी स्लाइड और स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक परीक्षणों दोनों के लिए महत्वपूर्ण कदम एनबीटी और फॉर्मज़ान पूर्ण घुलनशीलता हैं। निर्माता की सिफारिशों के विपरीत, एनबीटी पानी में अच्छी तरह से नहीं घुलता है। हालांकि, कम से कम 15 मिनट के लिए डीएमएसओ में एनबीटी को समरूप बनाना और फिर 2 मिनट के लिए पानी/एचबीएसएस और भंवर जोड़ना पूर्ण घुलनशीलता प्रदान करता है। इसके अलावा, फॉर्मज़ान के अवशोषण का विश्लेषण करने के लिए, दो महत्वपूर्ण चरणों को प्राप्त किया जाना चाहिए: (1) पीएमएन लसीका द्वारा कोशिकाओं से फॉर्मेज़ान क्रिस्टल की रिहाई और (2) फ़ॉर्मज़ान क्रिस्टल का पूर्ण घुलनशीलकरण। दोनों चरणों को 10% एसडीएस के साथ सेल गोली का इलाज करके हासिल किया गया था, जैसा कि हाल ही में27 का सुझाव दिया गया था, इसके बाद 570 एनएम पर सतह पर तैरनेवाला के सोनिकेशन और अवशोषण विश्लेषण किया गया था।

इसके अलावा, नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण समूहों के एनबीटी परिणाम मूल्यांकन किए जाने वाले स्क्रीनिंग का पहला चरण हैं। इस कदम को एक उल्लेखनीय अंतर दिखाना चाहिए, क्योंकि फॉर्मज़ान के माध्यम से आरओएस उत्पादन मूल्यांकन इंगित करता है कि क्या अलगाव प्रक्रिया उत्तेजना या निषेध द्वारा कोशिकाओं की आराम की स्थिति में अवांछित परिवर्तनों के लिए जिम्मेदार हो सकती है।

अन्य तरीके, जैसे साइटोक्रोम सी कमी28 या प्रवाह साइटोमेट्री29 विश्लेषण, अक्सर आरओएस का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है; हालांकि एक स्क्रीनिंग दृष्टिकोण पर विचार करते हुए, उनके आवेदन के लिए एक लंबे समय तक प्रयोग समय, विशिष्ट मार्करों का उपयोग और महंगे उपकरणों की आवश्यकता होती है। ल्यूमिनोल/आइसोलुमिनॉल का केमिलुमिनेसेंस आरओएस का पता लगाने के लिए एक तेज़ और लागत प्रभावी तरीका है, जबकि इंट्रा- और बाह्य आरओएस के भेदभाव की भी अनुमति देता है। हालांकि, इस विधि30,31 के लिए एक ल्यूमिनोमीटर की आवश्यकता होती है। हालांकि साधन लागत एक सुविधा के उपयोग से दरकिनार किया जा सकता है, यह अभी भी एक स्क्रीनिंग विश्लेषण अन्य assays के साथ एक साथ प्रदर्शन के लिए अयोग्य होगा.

फागोसाइटोसिस
पीएमएन/खमीर इनक्यूबेशन फागोसाइटोसिस करने वाले न्यूट्रोफिल की संख्या और प्रति न्यूट्रोफिल में घिरे यीस्ट की संख्या की गणना करके न्यूट्रोफिल फागोसाइटोसिस क्षमता और प्रभावकारिता का अवलोकन प्रदान करता है। हालांकि, खमीर कण ही एक सक्रियण संकेत है, पूर्व इलाज पीएमएन के साथ नियंत्रण समूह की तुलना में एक दोहरी उत्तेजना प्रणाली का गठन होता है, जो महत्वपूर्ण परिवर्तन प्रदर्शित नहीं कर सकता है, जैसा कि सीटीआरएल बनाम एफएमएलपी-उपचारित पीएमएन(चित्रा 4)में दिखाया गया है। फिर भी, यह परख यह इंगित करने में उपयोगी है कि क्या एक संभावित न्यूनाधिक फागोसाइटोसिस पर कोई प्रभाव उत्पन्न करेगा। एक उपन्यास रोगाणुरोधी पेप्टाइड इस परख का उपयोग कर परीक्षण किया गया था, और परिणाम उत्तेजनाओं, जो हाल ही में कुशल सक्रियण32 के लिए आवश्यक के रूप में चर्चा की गई है के इस संयोजन के लिए एक दिलचस्प संभावित प्रतिक्रिया का संकेत मिलता है.

इस परख के लिए महत्वपूर्ण कदम धुंधला हो जाना है, क्योंकि विश्लेषण अविश्वसनीय हो जाता है यदि स्लाइड को ≥3 एस के लिए पैनोप्टिक नंबर 3 (हेमेटोक्सिलिन) पर रखा जाता है। ऐसा इसलिए है क्योंकि खमीर कोशिकाओं और न्यूट्रोफिल परमाणु लोब को एक दूसरे से अलग नहीं किया जा सकता है। इसके अलावा, यह दृष्टिकोण मॉड्यूलेटर के संपर्क में आने के बाद न्यूट्रोफिल के आकृति विज्ञान विश्लेषण की अनुमति देता है। फ्लो साइटोमेट्री फागोसाइटोसिस33 का विश्लेषण करने के लिए एक और कुशल तकनीक है, हालांकि इसमें झिल्ली-बाध्य और संलग्न कणों और प्रस्तावित स्क्रीनिंग सेट से संबंधित अन्य कारकों के बीच भेदभाव करने में कठिनाई के माध्यम से सीमाएं हैं, जैसा कि पिछले विषय में चर्चा की गई है। यहां वर्णित विधि में एक ही सीमा देखी गई है, हालांकि इसे अनुवर्ती अध्ययनों का मार्गदर्शन करने के लिए प्रारंभिक स्क्रीनिंग के रूप में माना जाना है।

वास्तविक समय माइग्रेशन
पीएमएन की माइग्रेशन क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए वास्तविक समय स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया गया था। हालांकि पिछले एक अध्ययन ने सुझाव दिया था कि आरटीसीए प्लेट के नीचे कोटिंग नकारात्मक नियंत्रण और आईएल -8 उपचार15 के बीच एक अंतर दिखाने के लिए प्रवास परख के लिए आवश्यक था, इस अध्ययन ने कोटिंग एजेंटों के अलावा के बिना एफएमएलपी-उपचारित कोशिकाओं के लिए उच्च आत्मविश्वास अंतराल (सीआई) मूल्यों को दिखाया। परिणामों ने 12 मिनट से महत्वपूर्ण प्रवास के साथ उच्च प्रजनन क्षमता प्रस्तुत की। इसके अलावा, प्राप्त माइग्रेशन डेटा का वक्र फिटिंग विश्लेषण मापदंडों को प्रकट कर सकता है, जैसे कि सेल इंडेक्स अधिकतम के साथ-साथ ढलान में वृद्धि और कमी, जो माइग्रेशन की गतिशीलता को समझने के लिए उपयोगी हैं, और एकाग्रता पर निर्भर हो सकते हैं या स्थितियों के बीच भिन्न हो सकते हैं। न्यूट्रोफिल माइग्रेशन घटता (चित्रा 5) के लिए सबसे अच्छा फिटिंग समायोजित गोम्पर्ट्ज़ फ़ंक्शन34 के लिए था, जिसमें दिखाया गया था कि एफएमएलपी अधिकतम सेल इंडेक्स और बढ़ी हुई ढलान को बढ़ाता है।

आरटीसीए प्रणाली में बुलबुले से बचने के लिए विशेष ध्यान देने की आवश्यकता है क्योंकि वे प्रयोग से समझौता करते हुए इलेक्ट्रोड से गुजरने वाली कोशिकाओं को अवरुद्ध कर सकते हैं। एक सीमित कारक प्लेटों की उच्च लागत है। हालांकि सस्ती तकनीकें सेल माइग्रेशन का विश्लेषण करती हैं, लेकिन उनमें अच्छी प्रजनन क्षमता की कमी होती है या बॉयडेन चैंबर35 जैसे कठिन और समय लेने वाले होते हैं। इसलिए, आरटीसीए एक विश्वसनीय माइग्रेशन विश्लेषण है जो यहां प्रस्तुत अन्य स्क्रीनिंग परीक्षणों के साथ संगत है।

जाल
अंत में, ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके नेट गठन के प्रारंभिक मूल्यांकन के लिए एक आशाजनक, आसान और कम लागत वाली परख विकसित की गई थी। यह फागोसाइटोसिस स्लाइड के अवलोकन से प्राप्त किया गया था, जिसमें पीएमए, फागोसाइटोसिस क्षमता पर इसके प्रभाव के लिए परीक्षण किए गए एक विशिष्ट नेट-उत्प्रेरण उत्तेजना ने सीटीआरएल और एफएमएलपी समूहों की तुलना में एक वेब जैसी संरचना गठन को भी प्रेरित किया। इस काम ने अनुमान लगाया कि वे संरचनाएं नेट रिलीज का संकेत दे सकती हैं। सक्रियण के बाद DNase I के साथ नमूनों का इलाज करके इस तरह की परिकल्पना का परीक्षण किया गया था, जहां पीएमए-सक्रिय न्यूट्रोफिल में कोई फिलामेंटस संरचनाएं नहीं पाई गई थीं। धारणा है कि इस तरह की संरचनाओं नेट होने की संभावना है तथ्य यह है कि पीएमए नेट गठन36,37 के एक प्रसिद्ध inducer के रूप में उद्धृत किया जाता है, नेट38,39 के लिए विशिष्ट मार्करों का उपयोग प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा इसी तरह संरचनाओं की खोज और नेट के गिरावट DNase मैं40,41 द्वारा उत्प्रेरित. यह जोर देना महत्वपूर्ण है कि यह नेट गठन की पुष्टि के लिए एक विधि नहीं है, बल्कि केवल एक प्रारंभिक स्क्रीनिंग है जो एनईटी की उपस्थिति का सुझाव देती है। यद्यपि इस परीक्षण की सीमाएं हैं, क्योंकि एनईटीएस को धुंधला कलाकृतियों के साथ भ्रमित किया जा सकता है, यह एक तेज और कम लागत वाली स्क्रीनिंग में नेट गठन का सुझाव देने में एक प्रासंगिक उद्देश्य प्रदान करता है जिसे अन्य कार्यात्मक परीक्षणों के साथ मिलकर किया जा सकता है। एक बार जांच की जा रही अध्ययन के लिए संभवतः प्रासंगिक के रूप में पता चला है, एनईटीएस को आगे कॉन्फोकल या इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी42 द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है, जैसा कि बाद में चर्चा की गई है।

हमारी प्रयोगशाला में, उपन्यास रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स, इम्यूनोमॉड्यूलेटरी गतिविधियों की भी संभावना है, अक्सर स्क्रीनिंग परख के इस सेट द्वारा मूल्यांकन किया जाता है ताकि मानव न्यूट्रोफिल पर कुछ पेप्टाइड्स के प्रभावों के आगे विश्लेषण का बेहतर मार्गदर्शन किया जा सके, क्योंकि कुछ दिलचस्प आरओएस43, फागोसाइटोसिस, माइग्रेशन और / या नेट मॉड्यूलेटिंग गुण दिखाते हैं।

अंत में, NeutroFun स्क्रीन बड़ी संख्या में अपरीक्षित यौगिकों से सामान्य घनत्व न्यूट्रोफिल गतिविधि के संभावित मॉड्यूलेटर की पहचान करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण प्रदान करता है। हालांकि, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि यह विधि केवल प्रारंभिक स्क्रीनिंग के रूप में कार्य करती है। इस प्रारंभिक स्क्रीनिंग के बाद, अधिक महंगी, उन्नत और समय लेने वाली पद्धतियों को डेटा सत्यापन के लिए इन पहले परिणामों द्वारा सुझाए गए विशिष्ट कार्यों या मार्गों के लिए निर्देशित किया जा सकता है। आरओएस उत्पादन, फागोसाइटोसिस और नेट गठन के लिए, डेटा सत्यापन के लिए वैकल्पिक तरीके हैं और आगे मात्रात्मक परिणाम प्राप्त करने के लिए। नेट दृश्य और मात्रा का ठहराव immunofluorescence माइक्रोस्कोपी विश्लेषण के माध्यम से किया जा सकता है, जो उपस्थिति और myeloperoxidase और न्यूट्रोफिल इलास्टेज के रूप में myeloperoxidase और न्यूट्रोफिल इलास्टेज के रूप में बाह्य डीएनए और ग्रेन्युल प्रोटीन, की ओवरलैप निर्धारित करता है, के रूप में विस्तार से हाल ही में42. आरओएस कई जैविक प्रक्रियाओं में विभिन्न महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, और इसलिए उनका अध्ययन अत्यधिक व्यापक और विविध है। सबसे स्थापित पद्धतियों में वे हैं जो एंटीबॉडी का उपयोग करते हैं, जैसे एंजाइम से जुड़े इम्युनोसॉरबेंट परख (एलिसा) और ल्यूमिनेसेंस की इम्यूनोब्लोटिंग, या प्रतिदीप्ति का पता लगाना-जैसे कि डीसीएफडीए, ईपीआर स्पेक्ट्रोस्कोपी, और एंजाइमेटिक गतिविधि माप44 के माध्यम से विभिन्न लेबलिंग के तहत कोशिकाओं की प्रवाह साइटोमेट्री। इसी तरह, मजबूत फागोसाइटोसिस मूल्यांकन भी कई तरीकों से किया जाता है; वैकल्पिक तरीकों में अकेले फ्लो साइटोमेट्री45,46 या प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी47 के साथ संयुक्त शामिल हैं। वर्णित वास्तविक समय सेल माइग्रेशन एक मजबूत और पर्याप्त परख है कि आगे सत्यापन की आवश्यकता नहीं है और अन्य तरीकों पर विचार नहीं कर सकते हैं कि मापदंडों प्रस्तुत करता है. इस तरह के तरीकों के अन्य संयोजन विशिष्ट परिदृश्यों के लिए बेहतर हो सकते हैं, लेकिन संक्षेप में, यह एक तेज और सस्ती संयोजन का प्रतिनिधित्व करता है जिसमें कई न्यूट्रोफिल गतिविधियां शामिल हैं।

संक्षेप में, इस अध्ययन का उद्देश्य उन्नत पद्धतियों की ओर बेहतर प्रत्यक्ष प्रयासों के तरीके के रूप में उपन्यास अणुओं और स्थितियों के लिए कई न्यूट्रोफिल प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन करने के लिए सरल, तेज और कम लागत वाली पद्धतियों से युक्त परख का एक सेट प्रदान करना है। प्रमुख सीमाओं के रूप में, आरओएस से परिणाम, नेट, और फागोसाइटोसिस परख प्रारंभिक माना जाना चाहिए और अधिक विशिष्ट और विस्तृत assays द्वारा आगे सत्यापन की जरूरत है, और जो गैर स्वचालित माइक्रोस्कोपी सेल गिनती पर भरोसा बेहोश पूर्वाग्रह के लिए प्रवण हैं.

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Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

लेखक निम्नलिखित फंडिंग एजेंसियों को स्वीकार करते हैं: FAPDF, CNPq, CAPES, UnB, FINEP, और FINATEC।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CIM-Plate 16 Agilent  5665825001
CLARIOstar Plate Reader  BMG LABTECH US Patent Number 9,733,124
Product details: MARS Data Analysis Software
Dimethyl sulfoxide Dinâmica 1582
DNAse I Sigma - Aldrich DN 25
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate Sigma - Aldrich E5134
Fast panoptic stain Laborclin 620529
Glass slide Exacta 7102
Hank’s Balanced Salt Solution with calcium, with magnesium, without phenol red. Sigma - Aldrich 55037C
Hank’s Balanced Salt Solution without calcium chloride, magnesium sulfate and sodium bicarbonate. Sigma - Aldrich H4641
Heparin Blau  7896014655229
Laminar flow cabinet Veco VLFS-12
Microscope Zeiss 415501-0101-002 Product details: Primostar 1
Mixing Block BIOER MB-102
Neubauer improved bright-lined New Optik 1110000
N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine Sigma - Aldrich F3506
Nitroblue tetrazolium Neon CAS 298-83-9
Percoll Cytiva 17089101 separation media
Phorbol 12-myristate 13-acetate Sigma - Aldrich P8139
Phosphate buffered saline tablet Sigma - Aldrich P4417
ROTOFIX 32 A Hettich 1206
Saccharomyces cerevisiae Fleischmann
Safranin Sigma - Aldrich 50240
Sodium dodecyl sulfate Cytiva 17-1313-01
Sonicator Qsonica Q125
Trypan blue solution Vetec C.I. 23850
Vortex Genie 2 Scientific Industries, Inc. 0K-0500-902
xCELLigence Real-Time Cell Analysis (RTCA) DP (dual purpose) Agilent  380601050 Product details: RTCA system composed of detection hardware, cell plates and software

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References

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Souza Luz, I., Takaya, R., Gonzaga… More

Souza Luz, I., Takaya, R., Gonzaga Ribeiro, D., Sales Silva, N., Fontes, L., Castro, M. S., Fontes, W. A Set of Screening Techniques for a Quick Overview of the Neutrophil Function. J. Vis. Exp. (204), e65329, doi:10.3791/65329 (2024).

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