Summary
Questo protocollo presenta una serie di saggi funzionali dei neutrofili da utilizzare come metodo di screening per coprire le funzioni di diverse vie di segnalazione. Il protocollo include una valutazione iniziale e semplice della vitalità cellulare, della purezza, della produzione di specie reattive dell'ossigeno, della migrazione in tempo reale, della fagocitosi e di un suggerimento preliminare di trappole extracellulari per neutrofili.
Abstract
I neutrofili sono noti come una delle prime linee di difesa nella risposta immunitaria innata e possono svolgere molte funzioni cellulari particolari, come la chemiotassi, la migrazione inversa, la fagocitosi, la degranulazione di enzimi e metaboliti citotossici e il rilascio di DNA come trappole extracellulari per neutrofili (NET). I neutrofili non solo hanno una segnalazione strettamente regolata, ma partecipano anche alla regolazione di altri componenti del sistema immunitario. Poiché i neutrofili freschi sono terminalmente differenziati, di breve durata e altamente variabili tra gli individui, è importante sfruttare al meglio i campioni raccolti. I ricercatori hanno spesso bisogno di eseguire saggi di screening per valutare una panoramica delle numerose funzioni dei neutrofili che possono essere influenzate da condizioni specifiche in fase di valutazione. Per rispondere a questa esigenza è stata sviluppata una serie di test che seguono un singolo processo di isolamento di neutrofili a densità normale, cercando un equilibrio tra velocità, completezza, costi e precisione. I risultati possono essere utilizzati per ragionare e guidare studi di follow-up approfonditi. Questa procedura può essere eseguita in un tempo medio di 4 ore e include la valutazione della vitalità cellulare, la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS), la migrazione in tempo reale e la fagocitosi del lievito su vetrini, lasciando un numero sufficiente di cellule per approcci più dettagliati come gli studi omici. Inoltre, la procedura include un modo per osservare facilmente un suggerimento preliminare di NET dopo una rapida colorazione panottica osservata dalla microscopia ottica, con una mancanza di marcatori specifici, anche se sufficienti per indicare se ulteriori sforzi in questo modo varrebbero la pena. La diversità delle funzioni testate combina punti comuni tra i test, riducendo i tempi e i costi di analisi. La procedura è stata chiamata NeutroFun Screen e, pur avendo delle limitazioni, bilancia i fattori sopra citati. Inoltre, lo scopo di questo lavoro non è un set di test definito, ma piuttosto una linea guida che può essere facilmente adattata alle risorse e alle esigenze di ciascun laboratorio.
Introduction
I neutrofili sono le cellule immunitarie innate più abbondanti nel sangue umano e sono noti per svolgere un ruolo importante nelle infezioni e nell'infiammazione, essendo i primi soccorritori ad arrivare al sitodel danno tissutale. Negli ultimi anni, c'è stato un crescente riconoscimento del ruolo cruciale che i neutrofili svolgono in una varietà di malattie e nel sostenere l'omeostasi2. I neutrofili non solo hanno una segnalazione strettamente regolata, ma partecipano anche alla regolazione di altri componenti del sistema immunitario 3,4,5. Pertanto, lo studio dei neutrofili e delle loro numerose funzioni cellulari insolite, come la chemiotassi, la migrazione inversa6, la fagocitosi7, il burst respiratorio8 e il rilascio di trappole extracellulari per neutrofili (NET)7, è fondamentale in numerosi contesti di ricerca in cui è necessario valutare i potenziali cambiamenti funzionali, morfologici o molecolari dei neutrofili innescati da specifiche condizioni in analisi.
I neutrofili appena isolati sono terminalmente differenziati, di breve durata, altamente dinamici e facilmente attivabili9. Tuttavia, non è stato ancora raggiunto un metodo di conservazione efficiente che non influisca sulle risposte dei neutrofili, rendendo difficile l'esecuzione di più saggi che devono essere ininterrotti. Inoltre, le analisi funzionali10,11 precedentemente descritte, basate su saggi che richiedono citometria e/o colorazione fluorescente, potrebbero non essere una scelta praticabile quando è necessaria un'ampia e iniziale valutazione del neutrofilo.
Per affrontare questi problemi, questo protocollo descrive una serie di test che possono essere eseguiti a seguito di un singolo processo di isolamento, tra cui la valutazione della vitalità cellulare, la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS), la migrazione in tempo reale e la fagocitosi di Saccharomyces cerevisiae, i cui risultati possono essere utilizzati per ragionare studi di follow-up approfonditi. Questa procedura, denominata NeutroFun Screen, è stata progettata per comprendere le principali attività effettrici, ad eccezione della degranulazione, e può essere completata in un tempo medio di 4 ore, inclusa 1 ora di attivazione. Inoltre, le cellule rimanenti possono essere utilizzate per approcci più dettagliati come gli studi omici. Il vantaggio di questo metodo risiede nel suo equilibrio tra velocità, completezza, costo e precisione.
Inoltre, c'è un modo per osservare facilmente un suggerimento preliminare di NET, senza marcatori specifici, ma sufficiente per indicare se ulteriori sforzi in quella direzione varrebbero la pena. La diversità delle funzioni testate ha lo scopo di combinare punti comuni tra i test, riducendo i tempi e i costi di analisi. L'obiettivo principale di questo metodo è quello di fornire un'analisi funzionale bilanciata per quanto riguarda la velocità, la completezza, il costo e l'accuratezza che consenta una panoramica della risposta del neutrofilo, rendendolo un utile passo iniziale nello studio degli effetti di nuovi stimoli sui neutrofili a densità normale.
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Protocol
Tutti gli esperimenti hanno seguito rigorosamente le linee guida etiche stabilite dal comitato di revisione istituzionale dell'Università di Brasilia (processo 13364819.0.0000.5558) e i campioni sono stati identificati da codici per garantire l'anonimato del donatore. Le cellule sono state ottenute da donatori maschi sani normali di età compresa tra 18 e 35 anni, che hanno firmato il consenso informato e hanno soddisfatto i seguenti criteri di idoneità: non fumatori/vapers, nessuna condizione di salute cronica e nessuna storia di condizioni infiammatorie negli ultimi 14 giorni.
1. Prelievo di sangue
- Mettere asetticamente 0,3 mL di eparina da 5.000 UI/mL (vedere Tabella dei materiali) in una siringa sterile da 20 mL per eparinizzarla.
- Applicare un laccio emostatico venoso a circa 4 pollici sopra il sito di puntura e identificare la vena cubitale o cefalica mediana per la venipuntura.
NOTA: Assicurarsi che il tempo totale del laccio emostatico non superi 1 minuto. - Pulire il sito della puntura con alcol al 70% ed eseguire la puntura venosa.
- Capovolgere delicatamente la siringa tre o quattro volte dopo aver raccolto il sangue per mescolare correttamente il sangue e l'eparina.
2. Isolamento dei neutrofili
NOTA: I leucociti polimorfonucleati (PMN) vengono isolati mediante centrifugazione in gradiente di densità seguita da lisi ipotonica dei restanti globuli rossi (RBC), come descritto in precedenza11 con alcune modifiche. Questo metodo non è obbligatorio per eseguire i saggi di screening e può essere sostituito a condizione che il metodo scelto si traduca in una vitalità del >97%, nell'innesco o nell'attivazione del <3% dei PMN e produca cellule sufficienti per tutti i saggi, le repliche e le condizioni. L'esecuzione di questi passaggi in condizioni asettiche e l'utilizzo di soluzioni prive di endotossine sono obbligatorie per evitare l'attivazione cellulare.
- Effettuare diluizioni da 12 mL di terreni di separazione al 60% e al 70% (disponibili in commercio; vedere la tabella dei materiali) in provette coniche da 50 mL.
- Preparare il gradiente dal basso verso l'alto aggiungendo 4 mL alla volta della diluizione del 60% rispetto alla diluizione del 70%, utilizzando una pipetta da 5 mL. Fallo delicatamente per evitare di confondere l'interfaccia.
- Stratificare accuratamente 12 mL di sangue eparinizzato sopra il gradiente di densità. Centrifugare a 200 x g per 15 min a temperatura ambiente.
NOTA: Da questa fase in poi, fino all'attivazione del PMN, tutti i reagenti e le provette utilizzate devono essere conservati in un refrigeratore riempito di ghiaccio. - Scartare lo strato plasma/cellula mononucleata, quindi trasferire delicatamente lo strato sopra il pellet eritrocitario in due provette coniche da 15 mL con circa 7,5 mL ciascuna. Aumentare il volume della provetta con la soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS; vedere la tabella dei materiali).
- Centrifugare a 300 x g per 5 min a 19 °C.
- Lavare il pellet cellulare con HBSS.
- Scartare il surnatante versando la provetta e risospendere delicatamente il pellet in 7 mL di HBSS.
- Centrifugare a 300 x g per 5 minuti a 19 °C per rimuovere tutti i mezzi di separazione.
- Eseguire la lisi ipotonica dei restanti globuli rossi.
- Scartare il surnatante e unire i pellet in un unico tubo.
- Risospendere il pellet RBC/PMN in 3 mL di H2O sterile e aggiungere 3 mL di HBSS (2x) entro 25 s per ripristinare l'osmolarità. Quindi, centrifugare a 300 x g per 5 minuti a 19 °C.
- Ripetere i passaggi 2.8.1 e 2.8.2 per un pellet bianco privo di eritrociti.
NOTA: Il surnatante deve essere rimosso il prima possibile per ridurre al minimo il contatto dei neutrofili con i prodotti di degradazione dei globuli rossi. In alternativa, la seconda lisi ipotonica può essere sostituita risospendendo delicatamente lo strato di globuli rossi residui e rimuovendo tutto il surnatante, poiché i restanti globuli rossi sedimenteranno sopra il pellet PMN.
- Scartare il surnatante versando la provetta, risospendere delicatamente i PMN nel tampone rimanente e trasferirli in una microprovetta ghiacciata.
NOTA: Assicurarsi di annotare il volume durante il trasferimento delle cellule risospese con una micropipetta. - Trasferire 3 x 1 μL della sospensione cellulare su un vetrino pulito (tre pozzetti da 1 μL ciascuno) e colorare con un panottico veloce (vedere la tabella dei materiali) per la valutazione della morfologia e della purezza12.
- Per colorare con il panottico veloce, immergere il vetrino cinque volte nel fissativo panottico n° 1, sei volte nell'eosina n° 2 e due volte nell'ematossilina n° 3, con ogni immersione della durata di 1 s.
- Lavare delicatamente il vetrino con acqua distillata.
- Lasciar scolare e asciugare all'aria.
- Osservate al microscopio e contate 300 cellule casuali in ogni pozzetto, differenziando così i neutrofili dagli altri granulociti.
- Trasferire 1 μL della sospensione cellulare a 49 μL di colorante blu tripano13 allo 0,2% e contare le cellule utilizzando una camera di Neubauer, distinguendo tra cellule morte e vitali.
- Regolare la concentrazione cellulare a 6.667 cellule/μL utilizzando una soluzione di plasma autologo al 50% e HBSS al 50% integrata con calcio e magnesio. Dividere equamente le 6.667 cellule/μL di sospensione tra le microprovette corrispondenti alle condizioni da testare, compreso il controllo negativo.
NOTA: È possibile utilizzare qualsiasi concentrazione cellulare simile ai neutrofili circolanti nell'organismo modello, ma è importante utilizzare la stessa concentrazione cellulare in tutti gli esperimenti per la riproducibilità.
Figura 1: Il protocollo di isolamento dei neutrofili. Due concentrazioni del mezzo di separazione (percoll) (A) vengono impilate (B), quindi il sangue viene stratificato sopra il gradiente di separazione (C). Dopo la centrifugazione, il PMN si trova nello strato centrale (D), che è diviso in due provette da 15 mL (E). La sospensione cellulare viene lavata due volte in HBSS e centrifugata (G-I) per rimuovere il terreno, quindi le cellule vengono risospese e i globuli rossi residui vengono sottoposti a due cicli di lisi ipotonica (J-M). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
3. Preparazione per l'attivazione dei neutrofili
- In microprovette da 1,5 mL, preparare un sistema di attivazione per ogni condizione in modo che la concentrazione cellulare finale sia di 6.600 cellule/μL. Ad esempio, per testare gli effetti della fMLP 100 nM (N-formil-metionil-leucil-fenilalanina; vedere la tabella dei materiali), aggiungere 5 μL di 10 μM fMLP a 495 μL della sospensione di 6.667 cellule/μL. Per il controllo negativo (non stimolato), aggiungere HBSS contenente Ca2+ e Mg2+.
NOTA: Per dimostrare questa metodologia, sono state utilizzate le seguenti concentrazioni finali degli stimoli: 100 nM fMLP, 16 μM di fallaxina, un peptide antimicrobico14 presente in natura, e 100 nM PMA (forbolo 12-miristato 13-acetato) (vedi Tabella dei materiali). - Incubare a 37 °C senza rotazione.
NOTA: Tutte le aliquote per i saggi funzionali sono prelevate da questa sospensione cellulare, di seguito denominata sistema di attivazione.
4. Saggio del cloruro blu di nitrotetrazolio (NBT) per la valutazione della produzione di ROS
- Preparazione della soluzione di lavoro NBT: Per ogni condizione sperimentale, preparare una soluzione di lavoro NBT (vedi Tabella dei materiali) di 6 mM seguendo le seguenti fasi:
- Sciogliere 0,0005 g di NBT in 10 μL di dimetilsolfossido (DMSO) e vortice per almeno 15 min.
- Aggiungere 90 μL di HBSS Ca2+Mg2+ e vorticare fino a 2 min.
NOTA: Tutti i passaggi che coinvolgono NBT devono essere eseguiti al buio.
- Eseguire il test del vetrino NBT.
- Dopo 20 minuti di attivazione cellulare, mescolare delicatamente la sospensione cellulare e trasferire con cautela 2 μL di PMN su un vetrino pulito. Incubare per 20 minuti in camera umidificata a 37 °C.
NOTA: Non stendere troppo la sospensione cellulare sul vetrino; in caso contrario, potrebbe seccarsi prima dell'incubazione. - Aggiungere 1 μL della soluzione di lavoro NBT sulle cellule e incubare ulteriormente per 20 minuti al riparo dalla luce.
- Asciugare il vetrino con aria calda e fissarlo con una goccia di metanolo in ogni pozzetto per 1 min. Colorare con safranina allo 0,03% (vedi Tabella dei Materiali) per 1 min.
- Lavare delicatamente il vetrino con acqua distillata.
- Lasciare asciugare il vetrino all'aria e osservarlo al microscopio.
- Contare 100 cellule casuali in ogni pozzetto, differenziando i neutrofili con e senza depositi di formazano.
- Dopo 20 minuti di attivazione cellulare, mescolare delicatamente la sospensione cellulare e trasferire con cautela 2 μL di PMN su un vetrino pulito. Incubare per 20 minuti in camera umidificata a 37 °C.
- Eseguire il test di spettrofotometria NBT.
- Dopo 40 minuti di attivazione cellulare, mescolare delicatamente la sospensione cellulare e trasferire 90 μL di PMN dal sistema di attivazione a un microtubo pulito. Quindi, aggiungere con cautela 20 μL della soluzione NBT 6 mM. Incubare al buio per 20 minuti a 37 °C.
- Aggiungere 100 μL di sodio dodecil solfato al 10% (SDS; vedere la tabella dei materiali) e vortice.
- Sonicare utilizzando un sonicatore a punta con un'ampiezza del 60%, cinque cicli di 15 s ciascuno con intervalli di 15 s. Centrifugare a 12.000 x g per 5 min.
- Trasferire 60 μL del surnatante su una piastra a 96 pozzetti a fondo trasparente e misurare l'assorbanza del prodotto formazan a 570 nm.
5. Saggio di fagocitosi
- Preparare una sospensione di 33.000 lieviti/μL per ogni condizione, come descritto di seguito:
- Aggiungere circa 0,75 mg di lievito secco (Saccharomyces cerevisiae; vedi tabella dei materiali) a 200 μL di HBSS Ca2+Mg2+ e incubare in un termomiscelatore a 100 °C a 500 giri/min per almeno 15 minuti.
- Omogeneizzare la miscela mediante vortex e trasferire 5 μL di sospensione di lievito in 45 μL di colorante blu tripano allo 0,2%. Contare i lieviti con una camera di Neubauer.
- Regolare la concentrazione della sospensione iniziale a 33.000 cellule di lievito/μL utilizzando HBSS Ca2+Mg2+. Tenere la sospensione sul ghiaccio fino all'uso.
- Dopo 20 minuti di attivazione cellulare, mescolare delicatamente la sospensione cellulare e trasferire 5 μL del sistema di attivazione a 5 μL dei 33.000 lieviti/μL di sospensione di Saccharomyces cerevisiae in una nuova microprovetta sterile.
NOTA: Il rapporto neutrofili/lieviti è 1:5 (PMN:lievito). - Trasferire immediatamente 6 μL di sospensione di PMN/lievito in tre pozzetti di un vetrino pulito (2 μL ciascuno) e incubare il vetrino in una camera umidificata per 40 minuti.
NOTA: Non stendere troppo la sospensione cellulare sul vetrino; in caso contrario, potrebbe seccarsi prima dell'incubazione. - Asciugare il vetrino sotto l'aria calda e macchiare con un panottico rapido, come descritto al punto 2.9 sopra.
NOTA: La terza fase della colorazione rapida del panottico è fondamentale per l'analisi microscopica del vetrino. Colorare il vetrino per ≥3 s in questa fase può renderlo inadatto all'analisi, poiché sarà difficile differenziare il lievito dai lobi nucleari dei neutrofili. - Osservare i vetrini al microscopio, contando 100 neutrofili casuali di ciascun pozzetto e discriminando tra PMN positivi e negativi per la fagocitosi.
NOTA: Almeno una particella di lievito all'interno o a diretto contatto con la membrana cellulare PMN indica un PMN positivo per la fagocitosi. Se sei interessato al rapporto lievito/neutrofili, conta anche il numero di particelle di lievito inghiottite.
6. Saggio di chemiotassi PMN in tempo reale
NOTA: Il test di migrazione viene eseguito in modo simile al protocollo descritto in precedenza15, con i seguenti adattamenti:
- Preparare il gradiente chemiotattico aggiungendo 160 μL di chemioattrattivo (ad es. fMLP, IL-8, C5 o LTB4; vedere la tabella dei materiali) alla camera inferiore di una piastra RTCA (Real Time Cell Analyzer) basata sull'impedenza. Per i controlli negativi e i bianchi, aggiungere 160 μL di HBSS Ca2+Mg2+.
- Collegare la camera superiore e aggiungere 25 μL di HBSS Ca2+Mg2+. Incubare a temperatura ambiente per almeno 1 ora per formare il gradiente chemiotattico.
- Dopo 60 minuti di attivazione cellulare, mescolare delicatamente la sospensione cellulare e posizionare 60 μL di sospensione cellulare nella camera superiore. Aggiungere 60 μL di HBSS Ca2+Mg2+ al bianco.
- Posizionare la piastra RTCA e programmare il software RTCA per misurare l'indice di cella (CI) ogni 60 s per 2 ore.
NOTA: Le piastre RTCA possono essere lavate per il riutilizzo come descritto in precedenza16. In sintesi, lavare le camere RTCA e gli elettrodi con soluzione salina fosfatata (PBS) tre volte, quindi con acqua ultrapura di tipo I due volte. Incubare la camera inferiore e superiore con tripsina 0,25% 0,53 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) per 40 minuti. Lavare con acqua ultrapura tre volte.
7. Saggio suggestivo NET
- Dopo 10 minuti di attivazione cellulare, miscelare delicatamente la sospensione cellulare e trasferire 4 μL di PMN da ciascun sistema di attivazione in esame, diviso in due pozzetti di un vetrino pulito. Incubare in camera umidificata a 37 °C per 30 min.
- Aggiungere 1 μL di DNAsi I in uno dei pozzetti e incubare per 20 minuti a 37 °C (in camera umida).
- Asciugare il vetrino e la macchia con un panottico veloce, come descritto in precedenza nel passaggio 2.9 della sezione "Isolamento dei neutrofili".
- Valutare i vetrini al microscopio.
NOTA: Cercare qualsiasi indicazione di rilascio di NET, caratterizzata dalla presenza di strutture simili a Web. Una volta identificato, verificare se il trattamento con DNAsi I è stato in grado di rimuovere tali strutture. Questo test è indicativo della formazione di NET, poiché sono necessari ulteriori test per confermarne la presenza.
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Representative Results
Il metodo di isolamento basato sulla densità utilizzato in questo studio (Figura 1) ha soddisfatto i criteri per gli esperimenti proposti. I parametri dei neutrofili ottenuti con questo metodo includevano vitalità ≥98%, purezza ≥94% e resa cellulare ≥1,5 x 107, senza alcuna attivazione rilevabile dai test di screening. Due fasi rilevanti nell'isolamento dei PMN sono l'anticoagulazione e la rimozione dei globuli rossi. Mantenere la provetta o la siringa anticoagulata a una leggera oscillazione prima di stratificare il gradiente di densità e scegliere un metodo di rimozione dei globuli rossi per prevenire sia l'attivazione che la contaminazione può influenzare la resa e la riproducibilità dell'esperimento.
Per valutare la panoramica funzionale della funzione dei neutrofili, è stato sviluppato un flusso di lavoro che ha permesso di eseguire i saggi di screening proposti con almeno due ricercatori in un tempo medio di 4 ore, con 1 ora di attivazione e 2 ore di monitoraggio della migrazione in tempo reale, come mostrato in Figura 2.
Figura 2: Il flusso di lavoro di NeutroFun Screen. Per valutare il pannello di risposte funzionali innescate da specifiche condizioni in fase di valutazione, il flusso di lavoro di NeutroFun Screen prevede la partecipazione di almeno due ricercatori. Il ricercatore 1 (R1) avvia il processo di isolamento del PMN, seguito dall'aggiustamento della concentrazione cellulare e dall'incubazione del sistema di attivazione, mentre in parallelo, il ricercatore 2 (R2) prepara i materiali per eseguire i saggi successivi, che sono divisi tra i due: R1 esegue saggi di fagocitosi, NET e NBT spettrofotometrici; R2 esegue la migrazione in tempo reale e i test dei vetrini NBT. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Il classico saggio NBT17 è stato ottimizzato sia per la valutazione su vetrino che per la valutazione spettrofotometrica della formazione di formazano derivante dalla reazione di NBT con i ROS generati dai PMN. Il saggio spettrofotometrico ha permesso la quantificazione relativa tra le condizioni, mentre il saggio di microscopia è stato utile per l'analisi descrittiva e semiquantitativa, valutando la regolarità della distribuzione dei cristalli, la morfologia e il numero di cellule contenenti formazano. I risultati del test spettrofotometrico sono mostrati nella Figura 3A, indicando che 100 nM di PMA hanno indotto un'elevata produzione di ROS (in un rapporto medio di 3:2:1) rispetto alla fMLP e ai gruppi di controllo. I risultati del test NBT (Figura 3B) hanno corroborato i risultati spettrofotometrici, mostrando anche il PMA come lo stimolo più intenso che induce la produzione di ROS rispetto all'fMLP (Figura 3C), come precedentemente dimostrato dalla misurazione diretta dei ROS mediante citometria18. Per quanto riguarda la conta cellulare, il numero di neutrofili contenenti cristalli di formazano ha mostrato un rapporto di 7:4:1 nelle condizioni di controllo PMA:fMLP:, rivelando anche diversi modelli di distribuzione del formazano tra fMLP e PMN attivati da PMA; Il trattamento con fMLP ha portato a singole cellule intensamente attivate, mentre la PMA ha indotto la formazione di cristalli di formazano sparsi in tutto il citoplasma nella maggior parte delle PMN. Inoltre, sono state osservate alcune caratteristiche morfologiche che differenziano le condizioni, come l'aggregazione cellulare espressiva dopo il trattamento con PMA. L'assenza di tali caratteristiche di attivazione tipiche e bassi livelli di formazano nel gruppo di controllo hanno indicato che lo stato di riposo non era significativamente disturbato. Pertanto, il test NBT si è dimostrato un test semplice, economico e affidabile per la produzione di ROS neutrofili che può essere utilizzato per esaminare la capacità e l'intensità di un dato stimolo per indurre la produzione di ROS.
Figura 3: Test NBT. (A) Valutazione spettrofotometrica del burst respiratorio dei neutrofili in diverse condizioni (controllo negativo: 100 nM fMLP e 100 nM PMA) mediante assorbanza del formazano (490-630 nm). I dati di quattro donatori sono presentati come media ± deviazione standard (DS). * = tutti i gruppi sono diversi l'uno dall'altro (p≤ 0,05); £ = I confronti CTRL rispetto a PMA e fMLP rispetto a PMA mostrano differenze significative (p≤ 0,05). (B) Il test del vetrino può essere analizzato qualitativamente, caratterizzando l'intensità dei depositi di formazano, la sua posizione all'interno della cellula e l'aggregazione cellulare. Le frecce nere indicano i cristalli di formazan. Barre di scala: 20 μm. (C) Numero di PMN contenenti formazano, contati al microscopio ottico. I dati di otto donatori presentati come media ± DS. *** p < 0,0001, test t di Student. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
I vetrini di fagocitosi sono stati utilizzati per determinare il tasso di fagocitosi come percentuale di neutrofili che eseguono la fagocitosi, come mostrato nella Figura 4. Sebbene sia il peptide antimicrobico da 100 nM fMLP che quello da 16 μM abbiano indotto un apparentemente aumento dell'inghiottimento del lievito, la differenza non era statisticamente significativa fino alla doppia stimolazione, che ha aumentato significativamente la fagocitosi rispetto al gruppo di controllo e potrebbe suggerire una risposta alla doppia stimolazione.
Figura 4: Test di fagocitosi. I neutrofili sono stati valutati in base alla loro capacità di fagocitosi (conteggio dei neutrofili contenenti lievito). Sebbene l'esposizione a 100 nM di fMLP o a un peptide antimicrobico da 16 μM prima dell'incubazione del lievito abbia aumentato la fagocitosi rispetto al gruppo di controllo, (A) l'aumento non è stato statisticamente significativo. È interessante notare che un'incubazione iniziale con fMLP, seguita dall'aggiunta del peptide antimicrobico, ha portato a un aumento significativo della fagocitosi nei neutrofili umani (asterisco tra CTRL e il peptide antimicrobico fMLP+). (B) Le frecce nere mostrano le cellule di lievito, le frecce verdi mostrano solo i neutrofili e le frecce rosse indicano i neutrofili fagocitosanti. I dati di cinque donatori sono presentati come media ± DS. Barre della scala: 20 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Un esempio di risultati di migrazione cellulare in tempo reale è mostrato nella Figura 5, che mostra il ben noto effetto chemiotattico di 100 nM fMLP sui neutrofili. La cinetica di migrazione cellulare è stata adattata al modello di Gompertz, consentendo il confronto dei suoi parametri.
Figura 5: Migrazione cellulare in tempo reale. L'indice cellulare riflette l'impedenza elettrica risultante dalla migrazione cellulare. In questo saggio, la fMLP è stata utilizzata come controllo positivo della migrazione dei neutrofili aggiungendo 100 nM di fMLP alla camera inferiore. Un controllo negativo (CTRL) conteneva solo HBSS nella camera inferiore. Le curve sovrapposte rappresentano la curva che si adatta al modello di Gompertz, modificata per adattarsi al meglio ai pendii ascendenti e discendenti. Dati di tre donatori, presentati come media ± DS.* p < 0,05, test t di Student. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Infine, viene presentato un semplice test di microscopia ottica suggestivo della presenza di NET, in cui i PMN vengono colorati con fast panoptic. E' possibile osservare che per alcuni stimoli specifici che inducono NET, come il PMA o alcuni peptidi antimicrobici, anche dopo un breve tempo di attivazione (1 h) è possibile osservare strutture filamentose simili a ragnatele in prossimità delle cellule, mentre ciò non è possibile in altre condizioni come il controllo negativo e la fMLP (Figura 6). Per supportare meglio questa affermazione, la DNasi I è stata aggiunta dopo 40 minuti di attivazione cellulare con PMA a 100 nm o un peptide antimicrobico, rimuovendo le strutture simili a NET (Figura 6). Sebbene questo metodo non sia adatto per la caratterizzazione dei NET e possa essere influenzato dagli artefatti, è un punto di partenza economico, semplice e interessante per giustificare ulteriori investimenti nell'analisi dei NET, specialmente in contesti in cui gli effetti degli stimoli sono sconosciuti o scarsamente descritti.
Figura 6: Saggio suggestivo di formazione di NET. Un'analisi qualitativa dei neutrofili colorati con panottica dopo 1 ora di attivazione su un vetrino può indicare il rilascio di NET. I gruppi CTRL (A,B) e fMLP (C,D) non hanno mostrato alcuna indicazione di rilascio di NET, mentre l'attivazione con PMA (E-H) ha indotto la formazione di strutture simili a NET che sono state degradate dal trattamento con DNasi I (I-L). L'indagine sugli effetti di un peptide antimicrobico sui neutrofili ha mostrato che un tale stimolo potrebbe essere in grado di suscitare il rilascio di NET, poiché i vetrini presentavano le strutture simili a NET (M-P) che sono state degradate dalla DNasi I (Q-T). Le frecce rosse puntano a strutture simili a NET. Barre della scala: 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
I neutrofili sono cellule altamente dinamiche e reattive che hanno vita breve e non possono ancora essere crioconservate19, rendendo difficili le indagini sulla loro biologia. Pertanto, è essenziale seguire attente misure per ottenere neutrofili vitali, arricchiti e a riposo11,20. Questo studio ha impiegato una tecnica di isolamento basata sulla densità che enfatizza la manipolazione delicata e minima, nonché l'uso di basse temperature fino alla fase di attivazione. Inoltre, l'elaborazione del sangue deve avvenire entro 30 minuti dalla venipuntura ed essere conservata a temperatura ambiente. Il presente lavoro presenta un'opzione per diminuire lo stress da manipolazione e il tempo di esperimento. Per semplificare ulteriormente il processo, abbiamo introdotto una nuova fase (opzionale) nel protocollo, che prevede la rimozione dei globuli rossi mediante risospensione delicata e aspirazione dello strato di globuli rossi dopo una singola procedura di emolisi. Questo passaggio riduce lo stress da manipolazione e il tempo dell'esperimento, poiché rimuove la maggior parte dei globuli rossi con una sola fase di emolisi ipotonica. Tuttavia, va notato che le abilità dell'operatore influiscono notevolmente sull'efficacia di questo passaggio e potrebbe non sempre rimuovere completamente i globuli rossi. Inoltre, l'aspirazione dei globuli rossi può portare a una perdita di neutrofili, ma ciò non influisce sulla resa, poiché più neutrofili sono stati inizialmente recuperati dal gradiente quando si sono raccolti più vicino allo strato dei globuli rossi. Pertanto, l'aspirazione dei globuli rossi è consigliata se i test non richiedono la massima purezza possibile o se l'operatore ha ottenuto costantemente buoni risultati. Per i test di screening qui presentati, una piccola quantità di globuli rossi contaminanti (<3%) non interferirebbe con i risultati.
Per garantire che tutte le procedure vengano eseguite a tempo debito, compresa la preparazione dei reagenti, viene presentato un flusso di lavoro (Figura 2) che descrive in dettaglio la tempistica e la divisione dei compiti tra due ricercatori. Una volta terminati tutti i saggi funzionali, le cellule rimanenti possono essere preparate per ulteriori indagini molecolari, come gli studi omici mediante lisi cellulare con un adeguato tampone di lisi e conservazione.
Produzione ROS
L'esplosione respiratoria è un segno distintivo del priming e dell'attivazione dei neutrofili18,21 e la valutazione della produzione di ROS è un metodo comune utilizzato per stimare lo stato di attivazione dei neutrofili. Questo studio ha valutato la produzione di ROS utilizzando due approcci: microscopia ottica e spettrofotometria.
Il test NBT è un approccio ben noto per valutare il burst respiratorio nei neutrofili22,23. Due metodi comunemente usati sono i saggi basati sulla microscopia ottica (o test su vetrino) e basati sulla spettrofotometria 24,25,26. Sebbene la microscopia ottica consenta la visualizzazione dei dettagli a livello cellulare, è soggetta a pregiudizi dell'utente. Pertanto, il test NBT su vetrino funge da complemento qualitativo al test spettrofotometrico per quanto riguarda le caratteristiche fenotipiche, come i modelli di formazione del formazano, l'intensità e l'aggregazione cellulare.
I passaggi critici sia per il vetrino NBT che per i test spettrofotometrici sono la solubilizzazione completa di NBT e formazano. Contrariamente alle raccomandazioni del produttore, l'NBT non si scioglie bene in acqua. Tuttavia, l'omogeneizzazione dell'NBT in DMSO per almeno 15 minuti e quindi l'aggiunta di acqua/HBSS e il vortex per 2 minuti forniscono una solubilizzazione completa. Inoltre, per analizzare l'assorbanza del formazano, è necessario raggiungere due passaggi critici: (1) rilascio di cristalli di formazano dalle cellule mediante lisi PMN e (2) completa solubilizzazione dei cristalli di formazano. Entrambe le fasi sono state ottenute trattando il pellet cellulare con SDS al 10%, come recentemente suggerito27, seguito da analisi di sonicazione e assorbanza del surnatante a 570 nm.
Inoltre, i risultati NBT dei gruppi di controllo negativo e positivo sono il primo passo dello screening da valutare. Questo passaggio deve mostrare una notevole differenza, poiché la valutazione della produzione di ROS attraverso formazan indica se il processo di isolamento potrebbe essere stato responsabile di cambiamenti indesiderati nello stato di riposo delle cellule sia per stimolazione che per inibizione.
Altri metodi, come la riduzione del citocromo c28 o l'analisi della citometriaa flusso 29, sono spesso utilizzati per la rilevazione dei ROS; Tuttavia, considerando un approccio di screening, la loro applicazione richiede un tempo di sperimentazione più lungo, l'uso di marcatori specifici e strumenti costosi. La chemiluminescenza del luminolo/isoluminolo è un metodo rapido ed economico per rilevare i ROS, consentendo anche la differenziazione dei ROS intra ed extracellulari. Tuttavia, per questo metodo è necessario un luminometro 30,31. Sebbene il costo dello strumento possa essere aggirato con l'uso di una struttura, sarebbe comunque inadatto per un'analisi di screening eseguita contemporaneamente ad altri test.
Fagocitosi
L'incubazione PMN/lievito fornisce una panoramica della capacità e dell'efficacia della fagocitosi dei neutrofili contando il numero di neutrofili che eseguono la fagocitosi e il numero di lieviti inghiottiti per neutrofilo. Tuttavia, poiché la particella di lievito stessa è un segnale di attivazione, il confronto del gruppo di controllo con il PMN pretrattato costituisce un doppio sistema di stimolazione, che potrebbe non mostrare cambiamenti significativi, come mostrato nel PMN trattato con CTRL rispetto a quello trattato con fMLP (Figura 4). Tuttavia, questo test è utile per indicare se un potenziale modulatore genererebbe un impatto sulla fagocitosi. Un nuovo peptide antimicrobico è stato testato utilizzando questo test e i risultati indicano un'interessante risposta potenziale a questa combinazione di stimoli, che è stata recentemente discussa come necessaria per un'attivazione efficiente32.
La fase critica per questo test è la colorazione, in quanto l'analisi diventa inaffidabile se il vetrino viene tenuto sul panottico n. 3 (ematossilina) per ≥3 s. Questo perché le cellule di lievito e i lobi nucleari dei neutrofili non possono essere distinti l'uno dall'altro. Inoltre, questo approccio consente l'analisi morfologica dei neutrofili dopo l'esposizione a modulatori. La citometria a flusso è un'altra tecnica efficiente per analizzare la fagocitosi33, sebbene abbia dei limiti dovuti alla difficoltà di discriminare tra particelle legate alla membrana e particelle inghiottite e ad altri fattori correlati al set di screening proposto, come discusso nell'argomento precedente. La stessa limitazione si osserva nel metodo qui descritto, sebbene questo sia da considerarsi come uno screening iniziale per guidare gli studi di follow-up.
Migrazione in tempo reale
Il protocollo di screening in tempo reale è stato ottimizzato per valutare la capacità di migrazione dei PMN. Sebbene uno studio precedente suggerisse che il rivestimento della parte inferiore della piastra RTCA fosse necessario affinché il test di migrazione mostrasse una differenza tra il controllo negativo e il trattamento con IL-815, questo studio ha mostrato valori elevati dell'intervallo di confidenza (CI) per le cellule trattate con fMLP senza l'aggiunta di agenti di rivestimento. I risultati hanno presentato un'elevata riproducibilità con una migrazione significativa da 12 minuti in poi. Inoltre, l'analisi dell'adattamento della curva dei dati di migrazione ottenuti può rivelare parametri, come l'indice massimo delle celle e l'aumento e la diminuzione della pendenza, che sono utili per comprendere la dinamica della migrazione e possono dipendere dalla concentrazione o differire tra le condizioni. L'adattamento migliore per le curve di migrazione dei neutrofili (Figura 5) è stato quello della funzione di Gompertz aggiustata34, che mostra che la fMLP aumenta l'indice cellulare massimo e l'aumento della pendenza.
Particolare attenzione è necessaria per evitare bolle nel sistema RTCA in quanto possono bloccare il passaggio delle celle attraverso gli elettrodi, compromettendo l'esperimento. Un fattore limitante è l'alto costo delle piastre. Sebbene le tecniche più economiche analizzino la migrazione cellulare, mancano di una buona riproducibilità o sono difficili e richiedono molto tempo, come la camera di Boyden35. Pertanto, RTCA è un'analisi di migrazione affidabile compatibile con gli altri test di screening qui presentati.
Reti
Infine, è stato sviluppato un saggio promettente, facile e a basso costo per una valutazione preliminare della formazione di NET utilizzando la microscopia ottica. È stato derivato dall'osservazione di vetrini di fagocitosi, in cui PMA, uno stimolo specifico che induce NET testato per il suo effetto sulla capacità di fagocitosi, ha anche indotto la formazione di una struttura simile a una ragnatela rispetto ai gruppi CTRL e fMLP. Questo lavoro ha ipotizzato che tali strutture potessero indicare il rilascio di NET. Tale ipotesi è stata testata trattando i campioni con DNasi I dopo l'attivazione, dove non sono state trovate strutture filamentose nei neutrofili attivati da PMA. L'ipotesi che tali strutture siano probabilmente NET si basa sul fatto che il PMA è citato come un noto induttore della formazione di NET36,37, sulla scoperta di strutture simili mediante microscopia a fluorescenza utilizzando marcatori specifici per NET38,39 e sulla degradazione di NET catalizzata dalla DNasi I40,41. E' importante sottolineare che non si tratta di un metodo per la conferma della formazione di NET, ma solo di uno screening preliminare che suggerisce la presenza di NET. Sebbene questo test abbia dei limiti, in quanto i NET possono essere confusi con gli artefatti di colorazione, ha uno scopo rilevante nel suggerire la formazione di NET in uno screening rapido e a basso costo che può essere eseguito insieme ad altri test funzionali. Una volta individuati come possibilmente rilevanti per lo studio sottoposto a screening, i NET possono essere ulteriormente valutati mediante microscopia confocale o elettronica42, come discusso in seguito.
Nel nostro laboratorio, nuovi peptidi antimicrobici, anch'essi suscettibili di avere attività immunomodulatorie, sono frequentemente valutati da questa serie di saggi di screening per guidare meglio ulteriori analisi degli effetti di alcuni peptidi sui neutrofili umani, in quanto alcuni mostrano interessanti proprietà di ROS43, fagocitosi, migrazione e/o modulazione NET.
In conclusione, il NeutroFun Screen offre uno strumento prezioso per identificare potenziali modulatori dell'attività neutrofila a densità normale da un gran numero di composti non testati. Tuttavia, è importante notare che questo metodo serve solo come screening preliminare. Dopo questo screening iniziale, le metodologie più costose, avanzate e dispendiose in termini di tempo possono essere indirizzate verso funzioni o percorsi specifici suggeriti da questi primi risultati per la convalida dei dati. Per la produzione di ROS, la fagocitosi e la formazione di NET, esistono metodi alternativi per la validazione dei dati e per ottenere ulteriori risultati quantitativi. La visualizzazione e la quantificazione NET possono essere eseguite attraverso l'analisi al microscopio a immunofluorescenza, che determina la presenza e la sovrapposizione di DNA extracellulare e proteine granulari, come la mieloperossidasi e l'elastasi neutrofila, come descritto in dettaglio di recente42. I ROS svolgono diversi ruoli cruciali in molti processi biologici, e quindi il loro studio è molto diffuso e diversificato. Tra le metodologie più consolidate vi sono quelle che fanno uso di anticorpi, come il saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) e l'immunoblotting della luminescenza, o la rilevazione della fluorescenza, come la citometria a flusso di cellule sotto diverse marcature, attraverso DCFDA, spettroscopia EPR e misurazioni dell'attività enzimatica44. Allo stesso modo, anche una robusta valutazione della fagocitosi viene effettuata in diversi modi; I metodi alternativi includono la citometria a flussoda sola 45,46 o combinata con la microscopia a fluorescenza47. La migrazione cellulare in tempo reale descritta è un saggio robusto e sufficiente che non richiede ulteriori validazioni e presenta parametri che altre metodologie non possono contemplare. Altre combinazioni di tali metodi potrebbero adattarsi meglio a scenari specifici, ma in sintesi, questa rappresenta una combinazione veloce e conveniente che comprende molte attività dei neutrofili.
In sintesi, questo studio mira a fornire una serie di saggi costituiti da metodologie semplici, veloci e a basso costo per valutare le risposte multiple dei neutrofili a nuove molecole e condizioni come un modo per indirizzare meglio gli sforzi verso metodologie avanzate. Come principali limitazioni, i risultati dei test ROS, NET e fagocitosi dovrebbero essere considerati preliminari e necessitano di un'ulteriore convalida da parte di saggi più specifici ed elaborati, e quelli che si basano sulla conta delle cellule al microscopio non automatizzato sono soggetti a pregiudizi inconsci.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano le seguenti agenzie di finanziamento: FAPDF, CNPq, CAPES, UnB, FINEP e FINATEC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CIM-Plate 16 | Agilent | 5665825001 | |
| CLARIOstar Plate Reader | BMG LABTECH | US Patent Number 9,733,124 Product details: MARS Data Analysis Software |
|
| Dimethyl sulfoxide | Dinâmica | 1582 | |
| DNAse I | Sigma - Aldrich | DN 25 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma - Aldrich | E5134 | |
| Fast panoptic stain | Laborclin | 620529 | |
| Glass slide | Exacta | 7102 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution with calcium, with magnesium, without phenol red. | Sigma - Aldrich | 55037C | |
| Hank’s Balanced Salt Solution without calcium chloride, magnesium sulfate and sodium bicarbonate. | Sigma - Aldrich | H4641 | |
| Heparin | Blau | 7896014655229 | |
| Laminar flow cabinet | Veco | VLFS-12 | |
| Microscope | Zeiss | 415501-0101-002 | Product details: Primostar 1 |
| Mixing Block | BIOER | MB-102 | |
| Neubauer improved bright-lined | New Optik | 1110000 | |
| N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine | Sigma - Aldrich | F3506 | |
| Nitroblue tetrazolium | Neon | CAS 298-83-9 | |
| Percoll | Cytiva | 17089101 | separation media |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma - Aldrich | P8139 | |
| Phosphate buffered saline tablet | Sigma - Aldrich | P4417 | |
| ROTOFIX 32 A | Hettich | 1206 | |
| Saccharomyces cerevisiae | Fleischmann | ||
| Safranin | Sigma - Aldrich | 50240 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Cytiva | 17-1313-01 | |
| Sonicator | Qsonica | Q125 | |
| Trypan blue solution | Vetec | C.I. 23850 | |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries, Inc. | 0K-0500-902 | |
| xCELLigence Real-Time Cell Analysis (RTCA) DP (dual purpose) | Agilent | 380601050 | Product details: RTCA system composed of detection hardware, cell plates and software |
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