Summary
该协议具有一组中性粒细胞功能测定，可用作筛选方法，以涵盖来自不同信号通路的功能。该协议包括对细胞活力、纯度、活性氧产生、实时迁移、吞噬作用的初步和简单评估，以及中性粒细胞细胞外陷阱的初步建议。
Abstract
中性粒细胞被称为先天免疫反应的第一道防线之一，可以执行许多特定的细胞功能，例如趋化性、反向迁移、吞噬作用、细胞毒性酶和代谢物的脱颗粒，以及 DNA 作为中性粒细胞胞外陷阱 （NET） 的释放。中性粒细胞不仅自身具有严格调节的信号传导，而且还参与免疫系统其他成分的调节。由于新鲜的中性粒细胞是终末分化的、短暂的，并且个体之间差异很大，因此充分利用收集的样本非常重要。研究人员通常需要进行筛选分析，以评估可能受评估的特定条件影响的许多中性粒细胞功能的概述。为了满足这一需求，开发了一套遵循正常密度中性粒细胞单一分离过程的测试，寻求速度、全面性、成本和准确性之间的平衡。研究结果可用于推理和指导深入的后续研究。该过程可以在平均 4 小时内进行，包括评估细胞活力、活性氧 （ROS） 产生、实时迁移和载玻片上酵母的吞噬作用，留下足够的细胞用于更详细的方法，如组学研究。此外，该程序包括一种在通过光学显微镜观察快速全景染色后轻松观察NETs初步建议的方法，尽管缺乏特异性标记，但足以表明是否值得以这种方式进行进一步的努力。测试功能的多样性结合了测试之间的共同点，减少了分析时间和费用。该程序被命名为NeutroFun Screen，虽然有局限性，但它平衡了上述因素。此外，这项工作的目的不是一个明确的测试集，而是一个可以很容易地根据每个实验室的资源和需求进行调整的指南。
Introduction
中性粒细胞是人体血液中最丰富的先天免疫细胞，已知在感染和炎症中起主要作用，是到达组织损伤部位的第一反应者1.近年来，人们越来越认识到中性粒细胞在各种疾病和支持体内平衡方面发挥的关键作用2。中性粒细胞不仅自身具有严格调节的信号传导，而且还参与免疫系统其他成分的调节3,4,5。因此，在许多研究环境中，研究中性粒细胞及其许多不寻常的细胞功能，如趋化性、反向迁移6、吞噬作用7、呼吸爆发8 和中性粒细胞胞外陷阱 （NETs） 的释放7，在许多研究环境中势在必行，需要评估由所分析的特定条件引发的潜在中性粒细胞功能、形态或分子变化。
新鲜分离的中性粒细胞是终末分化的、短命的、高动态的和容易激活的9.然而，尚未实现不影响中性粒细胞反应的有效储存方法，因此很难进行必须不间断的多种检测。此外，当需要对中性粒细胞进行广泛和初步评估时，先前描述的功能分析10,11基于需要细胞术和/或荧光染色的测定可能不是可行的选择。
为了解决这些问题，该协议描述了一组可以在单个分离过程之后进行的测试，包括评估细胞活力，活性氧（ROS）产生，实时迁移和 酿酒酵母的吞噬作用，其结果可用于推理深入的后续研究。该程序名为NeutroFun Screen，旨在包含除脱颗粒以外的主要效应器活动，并且可以在平均4小时内完成，包括1小时的激活。此外，剩余的细胞可用于更详细的方法，如组学研究。这种方法的优点在于它在速度、全面性、成本和准确性之间取得平衡。
此外，有一种方法可以很容易地观察到NET的初步建议，没有具体的标记，但足以表明是否值得朝这个方向进一步努力。测试功能的多样性旨在结合测试之间的共同点，减少分析时间和费用。该方法的主要目标是提供关于速度、全面性、成本和准确性的平衡、功能分析，从而可以概述中性粒细胞的反应，使其成为研究新刺激对正常密度中性粒细胞影响的有用的第一步。
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Protocol
所有实验都严格遵循巴西利亚大学机构审查委员会制定的伦理准则（流程13364819.0.0000.5558），并且样本通过代码进行识别，以确保捐赠者的匿名性。这些细胞是从年龄在 18-35 岁之间的正常健康男性供体中获得的，他们签署了知情同意书并符合以下资格标准：非吸烟者/电子烟使用者，没有慢性健康状况，并且在过去 14 天内没有炎症病史。
1. 采血
- 无菌地将 0.3 mL 的 5,000 IU/mL 肝素（见 材料表）放入无菌的 20 mL 注射器中以使其肝素化。
- 在穿刺部位上方约 4 处使用静脉止血带，并确定用于静脉穿刺的正中肘静脉或头静脉。
注意： 确保止血带的总时间不超过 1 分钟。 - 用 70% 酒精清洁穿刺部位并进行静脉穿刺。
- 收集血液后，轻轻将注射器倒置三到四次，以适当地混合血液和肝素。
2.中性粒细胞分离
注意：多形核白细胞 （PMN） 通过密度梯度离心分离，然后对剩余的红细胞 （RBC） 进行低渗裂解，如前所述11 有一些变化。该方法不是进行筛选测定的强制性方法，只要所选方法的存活率为 >97%，引发或激活 <3% 的 PMN，并产生足够的细胞用于所有测定、重复和条件，就可以替换该方法。在无菌条件下执行这些步骤并使用无内毒素溶液是强制性的，以避免细胞活化。
- 在 50 mL 锥形管中稀释 12 mL 60% 和 70% 分离培养基（市售;参见 材料表）。
- 使用5 mL移液管，在60%稀释液中一次加入4 mL，从下到上制备梯度。轻轻地执行此操作以防止混合接口。
- 小心地将 12 mL 肝素化血液涂在密度梯度的顶部。在室温下以200× g 离心15分钟。
注意：从这一步开始，直到PMN激活，所有使用的试剂和试管都必须保存在装满冰的冷却器中。 - 丢弃血浆/单核细胞层，然后轻轻地将红细胞沉淀上方的层转移到两个 15 mL 锥形管中，每个锥形管中约 7.5 mL。用Hank平衡盐溶液（HBSS;见 材料表）弥补管体积。
- 在19°C下以300× g 离心5分钟。
- 用HBSS洗涤细胞沉淀。
- 倒入试管弃去上清液，轻轻将沉淀重悬于7mL HBSS中。
- 在19°C下以300× g 离心5分钟以除去所有分离介质。
- 对剩余的红细胞进行低渗裂解。
- 弃去上清液，将沉淀混合在单个管中。
- 将 RBC/PMN 沉淀重悬于 3 mL 无菌 H2O 中，并在 25 秒内加入 3 mL HBSS （2x） 以恢复渗透压。然后，在19°C下以300× g 离心5分钟。
- 重复步骤 2.8.1 和 2.8.2 以获得白色、无红细胞的沉淀。
注意：必须尽快去除上清液，以尽量减少中性粒细胞与红细胞分解产物的接触。或者，可以通过轻轻重悬残留的红细胞层并去除所有上清液来代替第二次低渗裂解，因为剩余的红细胞将沉积在 PMN 沉淀上方。
- 通过倒入试管弃去上清液，轻轻地将PMN重悬于剩余的缓冲液中，并将它们转移到冰冷的微管中。
注意：确保在用微量移液管转移重悬细胞时注释体积。 - 将 3 x 1 μL 细胞悬液转移到干净的载玻片（三个孔，每个孔 1 μL）中，并用快速全景染色（参见 材料表）进行形态和纯度评估12。
- 要用快速全景染色，将载玻片浸入全景固定剂 n° 1 中 5 次，在曙红 n°2 中浸泡 6 次，在苏木精 n°3 中浸泡两次，每次浸泡持续 1 秒。
- 用蒸馏水轻轻清洗载玻片。
- 沥干并风干。
- 在显微镜下观察并计数每个孔中的300个随机细胞，从而将中性粒细胞与其他粒细胞区分开来。
- 将 1 μL 细胞悬液转移到 49 μL 0.2% 台盼蓝染料13 中，并使用 Neubauer 室对细胞进行计数，区分死细胞和活细胞。
- 使用补充有钙和镁的 50% 自体血浆和 50% HBSS 的溶液将细胞浓度调节至 6,667 个细胞/μL。将 6,667 个细胞/μL 悬浮液均匀地分配到与待测试条件相对应的微管中，包括阴性对照。
注意：可以使用与模式生物中循环中性粒细胞相似的任何细胞浓度，但在所有实验中使用相同的细胞浓度以提高可重复性很重要。
图1：中性粒细胞分离方案。将两种浓度的分离介质 （percoll） （A） 堆积 （B），然后将血液分层在分离梯度 （C） 的顶部。离心后，PMN 位于中心层 （D），该中心层分为两个 15 mL 管 （E）。将细胞悬液在HBSS中洗涤两次并离心（G-I）以除去培养基，然后将细胞重悬，并将残留的红细胞提交两轮低渗裂解（J-M）。请点击这里查看此图的较大版本.
3.中性粒细胞活化的准备
- 在 1.5 mL 微管中，为每种条件制备活化系统，使最终细胞浓度为 6,600 个细胞/μL。例如，为了测试 100 nM fMLP（N-甲酰基-甲硫酰基-亮氨酰-苯丙氨酸;参见 材料表）的作用，将 5 μL 的 10 μM fMLP 加入 495 μL 的 6,667 细胞/μL 悬浮液中。对于阴性（未刺激）对照，添加含有 Ca2+ 和 Mg2+ 的 HBSS。
注：为了证明这种方法，使用了以下刺激的最终浓度：100 nM fMLP、16 μM fallaxin、一种天然存在的抗菌肽14 和 100 nM PMA（佛波醇 12-肉豆蔻酸酯 13-乙酸酯）（参见 材料表）。 - 在37°C下孵育，不旋转。
注意：所有用于功能测定的等分试样均取自该细胞悬液，以下称为活化系统。
4. 硝基四唑蓝氯化物（NBT）测定法，用于评估ROS的产生
- NBT工作溶液的制备：对于每种实验条件，使用以下步骤制备6mM的NBT（见 材料表）工作溶液：
- 将0.0005gNBT溶于10μL二甲基亚砜（DMSO）中，涡旋至少15分钟。
- 加入 90 μL HBSS Ca2+Mg2+ 并涡旋至 2 分钟。
注意： 所有涉及 NBT 的步骤都必须在黑暗中执行。
- 执行 NBT 玻片测试。
- 细胞活化 20 分钟后，轻轻混合细胞悬液，小心地将 2 μL PMN 转移到干净的载玻片中。在37°C的加湿室中孵育20分钟。
注意：不要将细胞悬液过多地铺在载玻片上;否则，它可能会在孵化前变干。 - 在细胞上加入 1 μL NBT 工作溶液，并在避光下进一步孵育 20 分钟。
- 用热空气干燥载玻片，并在每个孔中滴一滴甲醇固定1分钟。用0.03%番红染色（见 材料表）1分钟。
- 用蒸馏水轻轻清洗载玻片。
- 让载玻片风干并在显微镜下观察。
- 在每个孔中计数100个随机细胞，区分有和没有甲臜沉积物的中性粒细胞。
- 细胞活化 20 分钟后，轻轻混合细胞悬液，小心地将 2 μL PMN 转移到干净的载玻片中。在37°C的加湿室中孵育20分钟。
- 进行NBT分光光度法测定。
- 细胞活化 40 分钟后，轻轻混合细胞悬液，并将 90 μL PMN 从活化系统转移到干净的微管中。然后，小心地加入 20 μL 的 6 mM NBT 溶液。在37°C下在黑暗中孵育20分钟。
- 加入 100 μL 10% 十二烷基硫酸钠 （SDS;见 材料表） 并涡旋。
- 使用尖端超声仪以 60% 的振幅进行超声处理，五个周期，每个周期 15 秒，间隔 15 秒。以12,000× g 离心5分钟。
- 将 60 μL 上清液转移到透明底 96 孔板中，并在 570 nm 处测量甲瓒产物的吸光度。
5. 吞噬作用测定
- 为每种情况制备 33,000 个酵母/μL 的悬浮液，如下所述：
- 将约0.75mg干酵母 （酿酒酵母;参见 材料表）加入200μLHBSS Ca2 + Mg中 ，并在100°C下以500rpm孵育至少15分钟。
- 通过涡旋将混合物匀浆，并将 5 μL 酵母悬浮液转移到 45 μL 0.2% 台盼蓝染料中。使用Neubauer室对酵母进行计数。
- 使用HBSS Ca2 + Mg2+将初始悬浮液的浓度调节至33,000个酵母细胞/ μL。将悬浮液放在冰上直至使用。
- 细胞活化 20 分钟后，轻轻混合细胞悬液，并将 5 μL 活化系统转移到新的无菌微管中的 5 μL 33,000 酵母/μL 酿酒酵母 悬浮液中。
注意：中性粒细胞与酵母的比例为 1：5（PMN：酵母）。 - 立即将 6 μL PMN/酵母悬浮液转移到干净载玻片的三个孔中（每个孔 2 μL），并将载玻片在加湿室中孵育 40 分钟。
注意：不要将细胞悬液过多地铺在载玻片上;否则，它可能会在孵化前变干。 - 如上述步骤 2.9 所述，在热空气中干燥载玻片并用快速全景染色。
注：快速全景染色的第三步对于载玻片的显微镜分析至关重要。在此步骤中对载玻片染色 ≥3 秒可能使其不适合分析，因为很难区分酵母菌和中性粒细胞核叶。 - 在显微镜下观察载玻片，计算每个孔的100个随机中性粒细胞，并区分吞噬作用阳性和阴性的PMN。
注意：PMN 细胞膜内或直接接触的至少一个酵母颗粒表明 PMN 对吞噬作用呈阳性。如果对酵母/中性粒细胞比率感兴趣，也要计算吞噬的酵母颗粒的数量。
6. 实时PMN趋化性测定
注：迁移测定的执行方式与前15条所述的方案类似，具有以下调整：
- 通过向基于阻抗的实时细胞分析仪 （RTCA） 板的下腔室中加入 160 μL 化学引诱剂（例如 fMLP、IL-8、C5 或 LTB4;参见 材料表）来制备趋化梯度。对于阴性对照和空白，加入 160 μL HBSS Ca2+Mg2+。
- 连接上腔室并加入 25 μL HBSS Ca2+Mg2+。在室温下孵育至少1小时以形成趋化梯度。
- 细胞活化 60 分钟后，轻轻混合细胞悬液，并将 60 μL 细胞悬液放入上腔室。向空白中加入 60 μL HBSS Ca2+Mg2+ 。
- 放置RTCA板并对RTCA软件进行编程，以每60秒测量一次细胞指数（CI），持续2小时。
注意： 如前所述，RTCA 板可以清洗以重复使用16.总之，用磷酸盐盐水（PBS）清洗RTCA室和电极三次，然后用I型超纯水清洗两次。用0.25%胰蛋白酶0.53mM乙二胺四乙酸（EDTA）孵育下腔室和上腔室40分钟。用超纯水清洗三次。
7. 神经内分泌瘤提示性检测
- 细胞活化 10 分钟后，轻轻混合细胞悬液，并从每个被评估的活化系统中转移 4 μL PMN，分成两个干净载玻片的孔。在37°C的加湿室中孵育30分钟。
- 向其中一个孔中加入1μLDNAse I，并在37°C（在湿室中）孵育20分钟。
- 干燥载玻片并用快速全景染色，如先前在“中性粒细胞分离”部分的步骤2.9中所述。
- 在显微镜下评估载玻片。
注意：寻找任何NET释放的迹象，其特征是存在网状结构。一旦确定，确认DNAse I处理是否能够去除这些结构。该测定提示 NET 形成，因为需要额外的测试来确认它们的存在。
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Representative Results
本研究中使用的基于密度的分离方法（图1）符合所提出的实验标准。从该方法获得的中性粒细胞参数包括活力≥98%、纯度≥94%和细胞产量≥1.5 x 107，筛选试验未检测到活化。分离 PMN 的两个相关步骤是抗凝和去除红细胞。在密度梯度上分层之前，将抗凝血管或注射器保持在轻轻摇晃状态，并选择红细胞去除方法来防止活化和污染，可能会影响实验产量和可重复性。
为了评估中性粒细胞功能的功能概述，开发了一种工作流程，允许在平均 4 小时内与至少两名研究人员一起进行拟议的筛选测定，其中 1 小时激活和 2 小时实时迁移监测，如 图 2 所示。
图 2：NeutroFun Screen 工作流程。 为了评估由评估的特定条件触发的功能反应组，NeutroFun Screen工作流程包括至少两名研究人员的参与。研究人员 1 （R1） 开始 PMN 分离过程，然后进行细胞浓度调整和活化系统孵育，同时，研究人员 2 （R2） 准备材料以进行下一次测定，这些测定分为两者：R1 进行吞噬作用、NET 和分光光度法 NBT 测定;R2 执行实时迁移和 NBT 玻片测试。 请点击这里查看此图的较大版本.
经典的 NBT 测定17 经过优化，用于对 NBT 与 PMN 产生的 ROS 反应产生的甲臜形成进行载玻片和分光光度法评估。分光光度法测定允许在不同条件下进行相对定量，而显微镜测定可用于描述性和半定量分析，评估晶体分布、形态和含有甲瓒的细胞数量的规律性。分光光度法测定的结果如 图3A所示，表明与fMLP组和对照组相比，100 nM PMA诱导ROS产生升高（平均比例为3：2：1）。NBT载玻片测试结果（图3B）证实了分光光度法结果，还显示与fMLP（图3C）相比，PMA是最强烈的ROS产生诱导刺激，正如先前通过细胞术18直接测量ROS所证明的那样。在细胞计数方面，在PMA：fMLP：对照条件下，含有甲瓒晶体的中性粒细胞数量呈7：4：1的比例，也揭示了fMLP和PMA激活的PMN之间不同的甲瓒分布模式;fMLP处理导致密集激活的单个细胞，而PMA诱导了散布在大多数PMN细胞质中的甲臜晶体的形成。此外，还观察到一些区分这些条件的形态学特征，例如PMA处理后的表达性细胞聚集。对照组缺乏这种典型的活化特征和低水平的甲瓒表明静息状态没有受到明显干扰。因此，NBT 测定被证明是一种简单、廉价且可靠的中性粒细胞 ROS 产生的测试，可用于概述给定刺激诱导 ROS 产生的能力和强度。
图3：NBT测试。 （A）通过甲瓒吸光度（490-630nm）对不同条件下（阴性对照：100 nM fMLP和100 nM PMA）的中性粒细胞呼吸爆发进行分光光度法评估。来自四个供体的数据以平均值±标准差 （SD） 表示。* = 所有组彼此不同 （p≤ 0.05）;£ = CTRL 与 PMA 和 fMLP 与 PMA 的比较显示出显着差异 （p≤ 0.05）。（B） 可以对载玻片试验进行定性分析，表征甲臜沉积物的强度、其在细胞内的位置和细胞聚集。黑色箭头指向甲臜晶体。比例尺：20μm。 （C） 含有甲瓒的PMN数量，通过光学显微镜计数。来自 8 位捐赠者的数据呈现为平均值± SD。 *** p < 0.0001，学生 t 检验。 请点击这里查看此图的较大版本.
吞噬载玻片用于确定吞噬率作为进行吞噬作用的中性粒细胞的百分比，如 图 4 所示。尽管 100 nM fMLP 和 16 μM 抗菌肽都诱导了明显增加的酵母吞噬，但在双重刺激之前，差异没有统计学意义，与对照组相比，这显着增强了吞噬作用，并可能表明双重刺激后的反应。
图4：吞噬作用试验。 通过中性粒细胞的吞噬能力（含酵母的中性粒细胞计数）评估中性粒细胞。尽管与对照组相比，在酵母孵育前暴露于100nM fMLP或16μM抗菌肽增强了吞噬作用，但（A）增加无统计学意义。有趣的是，最初与 fMLP 孵育，然后添加抗菌肽，导致人中性粒细胞的吞噬作用显着增强（CTRL 和 fMLP+ 抗菌肽之间的星号）。（B） 黑色箭头表示酵母细胞，绿色箭头表示仅中性粒细胞，红色箭头表示吞噬中性粒细胞。来自五个供体的数据以平均值±标准差表示。 比例尺：20 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
图5显示了实时细胞迁移结果的一个例子，显示了100 nM fMLP对中性粒细胞的众所周知的趋化作用。 将细胞迁移动力学调整为 Gompertz 模型，从而能够比较其参数。
图 5：实时细胞迁移。 细胞指数反映了细胞迁移产生的电阻抗。在该测定中，通过向下腔室中加入 100 nM fMLP 将 fMLP 用作中性粒细胞迁移的阳性对照。阴性对照 （CTRL） 在下腔室中仅含有 HBSS。叠加曲线表示拟合 Gompertz 模型的曲线，经过修改以最佳拟合上升和下降斜率。来自三个捐赠者的数据，表示为平均值± SD.* p < 0.05，学生 t 检验。 请点击这里查看此图的较大版本.
最后，提出了一种提示NET存在的简单光学显微镜测试，其中PMNs被快速全景染色。可以观察到，对于某些特定的NET诱导刺激，例如PMA或某些抗菌肽，即使在较短的激活时间（1小时）之后，也可以观察到细胞附近的丝状网状结构，而这在其他条件下是不可能的，如阴性对照和fMLP（图6）。为了更好地支持这一说法，在用100nm PMA或抗菌肽活化40分钟后加入DNase I，去除NET样结构（图6）。尽管这种方法不适合NET表征，并且可能会受到伪影的影响，但它是一个廉价、简单和有趣的起点，可以证明进一步投资分析NET是合理的，特别是在刺激的影响未知或描述不佳的情况下。
图6：NET形成提示性测定。在载玻片上活化 1 小时后对全景染色的中性粒细胞进行定性分析可能表明 NET 释放。CTRL （A，B） 和 fMLP （C，D） 组未显示任何 NET 释放迹象，而 PMA （E-H） 激活诱导 NET 样结构的形成，这些结构被 DNase I 处理 （I-L） 降解。对抗菌肽对中性粒细胞影响的研究表明，这种刺激可能能够引起NET释放，因为载玻片呈现了被DNase I（Q-T）降解的NET样结构（M-P）。红色箭头指向类似NET的结构。比例尺：10μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
中性粒细胞是高度动态和反应性的细胞，寿命短，尚不能冷冻保存19，这使得对其生物学的研究具有挑战性。因此，必须遵循谨慎的步骤来获得可存活、富集和静息的中性粒细胞11,20。本研究采用了基于密度的隔离技术，强调温和和最小的操作，以及在活化步骤之前使用低温。此外，血液处理必须在静脉穿刺后 30 分钟内进行，并在室温下储存。本工作提出了一种减少操作压力和实验时间的选择。为了进一步简化该过程，我们在方案中引入了一个新步骤（作为选项），该步骤涉及在单次溶血程序后通过温和的重悬和抽吸红细胞层来去除红细胞。该步骤减少了操作压力和实验时间，因为它只需一个低渗溶血步骤即可去除大多数红细胞。然而，应该注意的是，操作人员的技能极大地影响了这一步的有效性，并且可能并不总是完全去除红细胞。此外，红细胞抽吸可导致中性粒细胞的损失，但这并不影响产量，因为当收集到更靠近红细胞层时，最初从梯度中回收了更多的中性粒细胞。因此，如果检测不需要尽可能高的纯度，或者操作者一直有良好的结果，则建议进行红细胞抽吸。对于此处介绍的筛选测试，少量污染物红细胞（<3%）不会干扰结果。
为确保所有程序在适当的时候执行，包括试剂制备，提供了一个工作流程（图2），详细说明了两个研究人员之间的时间表和任务分工。完成所有功能测定后，可以准备剩余的细胞进行进一步的分子研究，例如通过适当的裂解缓冲液和储存进行细胞裂解的组学研究。
ROS生产
呼吸爆发是中性粒细胞启动和激活的标志18,21，评估 ROS 产生是用于估计中性粒细胞激活状态的常用方法。本研究使用光学显微镜和分光光度法两种方法评估了ROS的产生。
NBT 测试是评估中性粒细胞呼吸爆发的众所周知的方法22,23。两种常用的方法是基于光学显微镜（或载玻片测试）和基于分光光度法的测定24,25,26。尽管光学显微镜允许在细胞水平上可视化细节，但它容易引起用户偏见。因此，NBT 载玻片试验可作为分光光度法测定的定性补充，涉及表型特征，例如甲臜形成模式、强度和细胞聚集。
NBT载玻片和分光光度法测试的关键步骤是NBT和甲瓒完全溶解。与制造商的建议相反，NBT不能很好地溶于水。然而，在DMSO中匀浆NBT至少15分钟，然后加入水/ HBSS并涡旋2分钟可完全溶解。此外，为了分析甲瓒的吸光度，必须实现两个关键步骤：（1）通过PMN裂解从细胞中释放甲瓒晶体和（2）完全溶解甲瓒晶体。这两个步骤都是通过用 10% SDS 处理细胞沉淀来实现的，如最近建议的那样27，然后在 570 nm 处对上清液进行超声处理和吸光度分析。
此外，阴性和阳性对照组的NBT结果是要评估的筛选的第一步。这一步必须显示出显着的差异，因为通过甲瓒的ROS生产评估表明分离过程是否可能是通过刺激或抑制导致细胞静息状态发生不需要的变化的原因。
其他方法，如细胞色素c还原28或流式细胞术29分析，通常用于ROS检测;然而，考虑到筛选方法，它们的应用需要更长的实验时间、使用特定的标记物和昂贵的仪器。鲁米诺/异铝的化学发光是一种快速且具有成本效益的检测 ROS 的方法，同时还可以区分细胞内和细胞外 ROS。然而，这种方法需要光度计30,31。尽管使用设施可以规避仪器成本，但它仍然不适合与其他检测同时进行的筛选分析。
吞噬作用
PMN/酵母孵育通过计算进行吞噬作用的中性粒细胞数量和每个中性粒细胞吞噬的酵母数量，概述了中性粒细胞吞噬能力和功效。然而，由于酵母颗粒本身是一个活化信号，将对照组与预处理的PMN进行比较构成了一个双重刺激系统，其可能不会显示显着变化，如CTRL与fMLP处理的PMN所示（图4）。然而，该测定有助于表明潜在的调节剂是否会对吞噬作用产生任何影响。使用该测定法测试了一种新型抗菌肽，结果表明对这种刺激组合的有趣潜在反应，最近讨论了有效激活所需的刺激32。
该测定的关键步骤是染色，因为如果载玻片在全景 3 号（苏木精）上保持 ≥3 秒，分析将变得不可靠。这是因为酵母细胞和中性粒细胞核叶无法相互区分。此外，这种方法允许在暴露于调节剂后对中性粒细胞进行形态分析。流式细胞术是分析吞噬作用的另一种有效技术33，尽管它存在局限性，难以区分膜结合和吞噬的颗粒以及与所提出的筛选集相关的其他因素，如上一主题所述。在本文描述的方法中观察到相同的局限性，尽管这被视为指导后续研究的初步筛选。
实时迁移
对实时筛选方案进行优化，以评估PMN的迁移能力。尽管先前的一项研究表明，迁移测定需要涂覆RTCA板的底面才能显示阴性对照和IL-8处理之间的差异15，但该研究显示，在不添加包衣剂的情况下，fMLP处理的细胞的置信区间（CI）值很高。结果显示，重现性高，从12 min开始迁移显著。此外，对获得的迁移数据进行曲线拟合分析可以揭示参数，例如细胞指数最大值以及斜率的增加和减少，这些参数有助于理解迁移的动态，并且可能取决于浓度或条件之间的差异。中性粒细胞迁移曲线的最佳拟合（图5）是调整后的Gompertz函数34，表明fMLP增加了最大细胞指数和增加的斜率。
需要特别注意避免RTCA系统中的气泡，因为它们会阻塞通过电极的细胞，从而影响实验。一个限制因素是板材的高成本。尽管分析细胞迁移的技术比较便宜，但它们缺乏良好的可重复性，或者困难且耗时，例如Boyden chamber35。因此，RTCA是一种可靠的迁移分析，与此处介绍的其他筛选测试兼容。
网
最后，使用光学显微镜开发了一种有前途、简单且低成本的检测方法，用于初步评估 NET 的形成。它来自对吞噬作用载玻片的观察，其中与 CTRL 和 fMLP 组相比，PMA（一种特定的 NET 诱导刺激物，测试了其对吞噬能力的影响）也诱导了网状结构的形成。这项工作假设这些结构可能表明NET释放。通过在激活后用 DNase I 处理样品来检验这一假设，其中在 PMA 激活的中性粒细胞中没有发现丝状结构。这种结构可能是NET的假设是基于以下事实：PMA被认为是NET形成的众所周知的诱导剂36,37，使用NETs的特异性标记物通过荧光显微镜发现相似的结构38,39以及由DNase I40,41催化的NETs降解.需要强调的是，这不是确认NET形成的方法，而只是表明NET存在的初步筛选。尽管该测试有局限性，因为NET可能与染色伪影混淆，但它在快速和低成本的筛选中建议NET形成具有相关目的，可以与其他功能测试一起进行。一旦检测到可能与正在筛选的研究相关，NETs可以通过共聚焦或电子显微镜42进一步评估，如下所述。
在我们的实验室中，新型抗菌肽，也可能具有免疫调节活性，经常通过这组筛选测定进行评估，以更好地指导进一步分析某些肽对人类中性粒细胞的影响，因为有些肽显示出有趣的ROS43，吞噬作用，迁移和/或NET调节特性。
总之，NeutroFun Screen提供了一个有价值的工具，用于从大量未经测试的化合物中识别正常密度中性粒细胞活性的潜在调节剂。但是，需要注意的是，这种方法仅作为初步筛选。经过初步筛选后，可以将更昂贵、更先进、更耗时的方法引导到这些初步结果所建议的特定功能或途径进行数据验证。对于ROS的产生、吞噬作用和NET的形成，有其他方法可以进行数据验证并获得进一步的定量结果。NET可视化和定量可以通过免疫荧光显微镜分析进行，该分析确定细胞外DNA和颗粒蛋白（如髓过氧化物酶和中性粒细胞弹性蛋白酶）的存在和重叠，如最近详细描述的那样42。ROS在许多生物过程中起着不同的关键作用，因此它们的研究非常广泛和多样化。其中最成熟的方法是利用抗体的方法，例如酶联免疫吸附测定 （ELISA） 和发光的免疫印迹，或荧光检测（例如不同标记下的细胞的流式细胞术）通过 DCFDA、EPR 光谱和酶活性测量44。同样，稳健的吞噬作用评估也以多种方式进行;替代方法包括单独使用流式细胞术45,46或结合荧光显微镜47。所描述的实时细胞迁移是一种可靠且充分的检测方法，不需要进一步验证，并提供了其他方法无法考虑的参数。这些方法的其他组合可能更适合特定情况，但总而言之，这代表了一种快速且经济实惠的组合，包括许多中性粒细胞活性。
总之，本研究旨在提供一套由简单、快速和低成本方法组成的检测方法，以评估多种中性粒细胞对新分子和条件的反应，以更好地指导先进方法的努力。作为主要局限性，ROS、NET 和吞噬作用检测的结果应被视为初步结果，需要通过更具体和更精细的检测进一步验证，而那些依赖非自动显微镜细胞计数的检测容易出现无意识偏差。
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Disclosures
作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
作者感谢以下资助机构：FAPDF、CNPq、CAPES、UnB、FINEP 和 FINATEC。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CIM-Plate 16 | Agilent | 5665825001 | |
| CLARIOstar Plate Reader | BMG LABTECH | US Patent Number 9,733,124 Product details: MARS Data Analysis Software |
|
| Dimethyl sulfoxide | Dinâmica | 1582 | |
| DNAse I | Sigma - Aldrich | DN 25 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma - Aldrich | E5134 | |
| Fast panoptic stain | Laborclin | 620529 | |
| Glass slide | Exacta | 7102 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution with calcium, with magnesium, without phenol red. | Sigma - Aldrich | 55037C | |
| Hank’s Balanced Salt Solution without calcium chloride, magnesium sulfate and sodium bicarbonate. | Sigma - Aldrich | H4641 | |
| Heparin | Blau | 7896014655229 | |
| Laminar flow cabinet | Veco | VLFS-12 | |
| Microscope | Zeiss | 415501-0101-002 | Product details: Primostar 1 |
| Mixing Block | BIOER | MB-102 | |
| Neubauer improved bright-lined | New Optik | 1110000 | |
| N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine | Sigma - Aldrich | F3506 | |
| Nitroblue tetrazolium | Neon | CAS 298-83-9 | |
| Percoll | Cytiva | 17089101 | separation media |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma - Aldrich | P8139 | |
| Phosphate buffered saline tablet | Sigma - Aldrich | P4417 | |
| ROTOFIX 32 A | Hettich | 1206 | |
| Saccharomyces cerevisiae | Fleischmann | ||
| Safranin | Sigma - Aldrich | 50240 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Cytiva | 17-1313-01 | |
| Sonicator | Qsonica | Q125 | |
| Trypan blue solution | Vetec | C.I. 23850 | |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries, Inc. | 0K-0500-902 | |
| xCELLigence Real-Time Cell Analysis (RTCA) DP (dual purpose) | Agilent | 380601050 | Product details: RTCA system composed of detection hardware, cell plates and software |
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