Summary
Dieses Protokoll umfasst eine Reihe von funktionellen Neutrophilen-Assays, die als Screening-Methode verwendet werden, um Funktionen aus verschiedenen Signalwegen abzudecken. Das Protokoll beinhaltet eine erste und einfache Bewertung der Zelllebensfähigkeit, Reinheit, Produktion reaktiver Sauerstoffspezies, Echtzeitmigration, Phagozytose und einen vorläufigen Vorschlag für neutrophile extrazelluläre Fallen.
Abstract
Neutrophile Granulozyten sind als eine der ersten Verteidigungslinien in der angeborenen Immunantwort bekannt und können viele bestimmte zelluläre Funktionen ausführen, wie z. B. Chemotaxis, Rückwanderung, Phagozytose, Degranulation von zytotoxischen Enzymen und Metaboliten und Freisetzung von DNA als neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs). Neutrophile Granulozyten haben nicht nur selbst eine streng regulierte Signalübertragung, sondern sind auch an der Regulation anderer Komponenten des Immunsystems beteiligt. Da frische Neutrophile unheilbar differenziert, kurzlebig und sehr variabel zwischen den Individuen sind, ist es wichtig, das Beste aus den gesammelten Proben zu machen. Forscher müssen häufig Screening-Assays durchführen, um einen Überblick über die vielen Funktionen von Neutrophilen zu erhalten, die von bestimmten zu untersuchenden Bedingungen beeinflusst werden können. Um diesem Bedarf gerecht zu werden, wurde eine Reihe von Tests entwickelt, die einem einzigen Isolierungsprozess von Neutrophilen normaler Dichte folgen und ein Gleichgewicht zwischen Geschwindigkeit, Vollständigkeit, Kosten und Genauigkeit anstreben. Die Ergebnisse können als Begründung und Leitfaden für eingehende Folgestudien verwendet werden. Dieses Verfahren kann in einer durchschnittlichen Zeit von 4 Stunden durchgeführt werden und umfasst die Bewertung der Zelllebensfähigkeit, der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), der Echtzeitmigration und der Phagozytose von Hefe auf Glasobjektträgern, so dass genügend Zellen für detailliertere Ansätze wie Omics-Studien übrig bleiben. Darüber hinaus bietet das Verfahren eine Möglichkeit, nach einer schnellen panoptischen Färbung, die durch Lichtmikroskopie beobachtet wurde, auf einfache Weise eine vorläufige Vermutung von NETs zu beobachten, wobei es an spezifischen Markern mangelt, die jedoch ausreichen, um anzuzeigen, ob sich weitere Bemühungen auf diese Weise lohnen würden. Die Vielfalt der getesteten Funktionen kombiniert Gemeinsamkeiten zwischen den Tests und reduziert so den Zeit- und Kostenaufwand für die Analyse. Das Verfahren wurde NeutroFun Screen genannt, und obwohl es Einschränkungen hat, gleicht es die oben genannten Faktoren aus. Darüber hinaus ist das Ziel dieser Arbeit kein eindeutiges Testset, sondern vielmehr ein Leitfaden, der leicht an die Ressourcen und Anforderungen jedes Labors angepasst werden kann.
Introduction
Neutrophile Granulozyten sind die am häufigsten vorkommenden Zellen des angeborenen Immunsystems im menschlichen Blut und es ist bekannt, dass sie eine wichtige Rolle bei Infektionen und Entzündungen spielen, da sie die ersten Helfer sind, die an der Stelle der Gewebeschädigung eintreffen1. In den letzten Jahren hat sich die Erkenntnis durchgesetzt, dass Neutrophile eine entscheidende Rolle bei einer Vielzahl von Krankheiten und bei der Unterstützung der Homöostase spielen2. Neutrophile Granulozyten haben nicht nur selbst eine streng regulierte Signalübertragung, sondern sind auch an der Regulation anderer Komponenten des Immunsystems beteiligt 3,4,5. Daher ist die Untersuchung von Neutrophilen und ihren vielen ungewöhnlichen zellulären Funktionen, wie Chemotaxis, Rückwanderung6, Phagozytose7, respiratorischer Ausbruch8 und die Freisetzung von neutrophilen extrazellulären Fallen (NETs)7, in zahlreichen Forschungskontexten unerlässlich, in denen es notwendig ist, die potenziellen funktionellen, morphologischen oder molekularen Veränderungen von Neutrophilen zu bewerten, die durch bestimmte zu analysierende Bedingungen ausgelöst werden.
Frisch isolierte Neutrophile sind terminal, kurzlebig, hochdynamisch und leicht zu aktivieren9. Eine effiziente Lagerungsmethode, die die Reaktionen der Neutrophilen nicht beeinflusst, wurde jedoch noch nicht erreicht, was es schwierig macht, mehrere Assays durchzuführen, die ununterbrochen sein müssen. Darüber hinaus sind zuvor beschriebene funktionelle Analysen10,11, die auf Assays basieren, die Zytometrie und/oder Fluoreszenzfärbung erfordern, möglicherweise keine praktikable Wahl, wenn eine breite und erste Bewertung der Neutrophilen erforderlich ist.
Um diese Probleme anzugehen, beschreibt dieses Protokoll eine Reihe von Tests, die nach einem einzigen Isolierungsprozess durchgeführt werden können, einschließlich der Bewertung der Zelllebensfähigkeit, der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), der Echtzeitmigration und der Phagozytose von Saccharomyces cerevisiae, deren Ergebnisse zur Begründung eingehender Folgestudien verwendet werden können. Dieses Verfahren mit dem Namen NeutroFun Screen wurde entwickelt, um die wichtigsten Effektoraktivitäten mit Ausnahme der Degranulation zu umfassen, und kann in einer durchschnittlichen Zeit von 4 Stunden abgeschlossen werden, einschließlich 1 Stunde Aktivierung. Darüber hinaus können die verbleibenden Zellen für detailliertere Ansätze wie Omics-Studien verwendet werden. Der Vorteil dieser Methode liegt in der Balance zwischen Geschwindigkeit, Komplexität, Kosten und Genauigkeit.
Darüber hinaus gibt es eine Möglichkeit, einen vorläufigen Vorschlag von NETs leicht zu beobachten, ohne spezifische Marker, aber genug, um anzuzeigen, ob sich weitere Bemühungen in dieser Richtung lohnen würden. Die Vielfalt der getesteten Funktionen zielt darauf ab, Gemeinsamkeiten zwischen den Tests zu kombinieren und so den Zeit- und Kostenaufwand für die Analyse zu reduzieren. Das Hauptziel dieser Methode ist es, eine ausgewogene, funktionelle Analyse in Bezug auf Geschwindigkeit, Vollständigkeit, Kosten und Genauigkeit zu liefern, die einen Überblick über die Reaktion der Neutrophilen ermöglicht, was sie zu einem nützlichen ersten Schritt bei der Untersuchung der Auswirkungen neuer Stimuli auf Neutrophile normaler Dichte macht.
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Protocol
Alle Experimente folgten strikt den ethischen Richtlinien, die vom institutionellen Prüfungsausschuss der Universität Brasilia festgelegt wurden (Prozess 13364819.0.0000.5558), und die Proben wurden durch Codes identifiziert, um die Anonymität der Spender zu gewährleisten. Die Zellen wurden von normalen, gesunden männlichen Spendern im Alter von 18 bis 35 Jahren gewonnen, die die Einverständniserklärung unterschrieben und die folgenden Zulassungskriterien erfüllten: Nichtraucher/Dampfer, keine chronischen Erkrankungen und keine entzündlichen Erkrankungen in der Vorgeschichte in den letzten 14 Tagen.
1. Blutabnahme
- Geben Sie aseptisch 0,3 ml 5.000 I.E./ml Heparin (siehe Materialtabelle) in eine sterile 20-ml-Spritze, um es zu heparinisieren.
- Legen Sie ein venöses Tourniquet etwa 4 Zoll über der Einstichstelle an und identifizieren Sie die mediane Kubital- oder Kopfvene für die Venenpunktion.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Gesamtdauer des Tourniquets 1 Minute nicht überschreitet. - Reinigen Sie die Einstichstelle mit 70%igem Alkohol und führen Sie die Venenpunktion durch.
- Drehen Sie die Spritze nach der Blutentnahme drei- oder viermal vorsichtig um, um das Blut und das Heparin richtig zu mischen.
2. Isolierung von Neutrophilen
HINWEIS: Polymorphkernige Leukozyten (PMNs) werden durch Dichtegradientenzentrifugation isoliert, gefolgt von hypotoner Lyse der verbleibenden roten Blutkörperchen (RBC), wie zuvor beschrieben11 mit einigen Änderungen. Diese Methode ist für die Durchführung der Screening-Assays nicht zwingend erforderlich und kann ersetzt werden, solange die gewählte Methode zu einer Viabilität von >97 %, Priming oder Aktivierung von <3 % der PMNs führt und genügend Zellen für alle Assays, Replikate und Bedingungen liefert. Die Durchführung dieser Schritte unter aseptischen Bedingungen und die Verwendung endotoxinfreier Lösungen sind zwingend erforderlich, um eine Zellaktivierung zu vermeiden.
- 12-ml-Verdünnungen von 60%igen und 70%igen Trennmedien (im Handel erhältlich; siehe Materialtabelle) in konischen 50-ml-Röhrchen herstellen.
- Bereiten Sie den Gradienten von unten nach oben vor, indem Sie mit einer 5-ml-Pipette jeweils 4 ml der 60%igen Verdünnung über die 70%ige Verdünnung hinzufügen. Tun Sie dies vorsichtig, um eine Vermischung der Schnittstelle zu vermeiden.
- Schichten Sie vorsichtig 12 ml heparinisiertes Blut auf den Dichtegradienten. Bei 200 x g 15 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.
HINWEIS: Von diesem Schritt an bis zur PMN-Aktivierung müssen alle verwendeten Reagenzien und Röhrchen in einem mit Eis gefüllten Kühler aufbewahrt werden. - Die Plasma-/mononukleäre Zellschicht wird verworfen und dann die Schicht über dem Erythrozytenpellet vorsichtig in zwei konische 15-ml-Röhrchen mit jeweils ca. 7,5 ml übertragen. Füllen Sie das Volumen des Röhrchens mit Hank's Balanced Salt Solution (HBSS; siehe Materialtabelle) auf.
- Bei 300 x g 5 min bei 19 °C zentrifugieren.
- Waschen Sie das Zellpellet mit HBSS.
- Verwerfen Sie den Überstand, indem Sie das Röhrchen gießen, und resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig in 7 ml HBSS.
- Bei 300 x g für 5 min bei 19 °C zentrifugieren, um alle Trennmedien zu entfernen.
- Führen Sie eine hypotone Lyse der verbleibenden Erythrozyten durch.
- Entsorgen Sie den Überstand und mischen Sie die Pellets in einem einzigen Röhrchen.
- Resuspendieren Sie das RBC/PMN-Pellet in 3 ml sterilemH2Ound fügen Sie innerhalb von 25 s 3 ml HBSS (2x) hinzu, um die Osmolarität wiederherzustellen. Anschließend bei 300 x g für 5 min bei 19 °C zentrifugieren.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.8.1 und 2.8.2 für ein weißes, erythrozytenfreies Pellet.
HINWEIS: Der Überstand muss so schnell wie möglich entfernt werden, um den Kontakt von Neutrophilen mit Erythrozytenabbauprodukten zu minimieren. Alternativ kann die zweite hypotone Lyse ersetzt werden, indem die verbleibende Erythrozytenschicht sanft resuspendiert und der gesamte Überstand entfernt wird, da die verbleibenden Erythrozyten über dem PMN-Pellet sedimentieren.
- Entsorgen Sie den Überstand, indem Sie das Röhrchen gießen, resuspendieren Sie die PMNs vorsichtig in den verbleibenden Puffer und geben Sie sie in ein eiskaltes Mikroröhrchen.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie das Volumen mit Anmerkungen versehen, während Sie die resuspendierten Zellen mit einer Mikropipette übertragen. - Übertragen Sie 3 x 1 μl der Zellsuspension auf einen sauberen Objektträger (drei Vertiefungen mit je 1 μl) und färben Sie sie mit einer schnellen Panoptik (siehe Materialtabelle) zur Beurteilung der Morphologie und Reinheit12.
- Um mit schneller Panoptik zu färben, tauchen Sie den Objektträger fünfmal in das panoptische Fixiermittel Nr. 1, sechsmal in Eosin Nr. 2 und zweimal in Hämatoxylin Nr. 3, wobei jedes Eintauchen 1 s dauert.
- Waschen Sie den Objektträger vorsichtig mit destilliertem Wasser.
- Abtropfen lassen und an der Luft trocknen lassen.
- Beobachten Sie unter dem Mikroskop und zählen Sie 300 zufällige Zellen in jeder Vertiefung, um die Neutrophilen von anderen Granulozyten zu unterscheiden.
- Man überträgt 1 μl der Zellsuspension auf 49 μl 0,2%igen Trypanblaufarbstoff13 und zählt die Zellen mit einer Neubauer-Kammer, wobei zwischen toten und lebensfähigen Zellen unterschieden wird.
- Stellen Sie die Zellkonzentration auf 6.667 Zellen/μl ein, indem Sie eine Lösung aus 50 % autologem Plasma und 50 % HBSS verwenden, die mit Kalzium und Magnesium ergänzt wird. Die 6.667 Zellen/μl Suspension wird gleichmäßig auf die Mikroröhrchen verteilt, die den zu testenden Bedingungen, einschließlich der Negativkontrolle, entsprechen.
HINWEIS: Jede Zellkonzentration, die den zirkulierenden Neutrophilen im Modellorganismus ähnlich ist, kann verwendet werden, aber es ist wichtig, in allen Experimenten die gleiche Zellkonzentration zu verwenden, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.
Abbildung 1: Das Protokoll zur Isolierung von Neutrophilen. Zwei Konzentrationen des Trennmediums (Percoll) (A) werden gestapelt (B), dann wird das Blut auf den Trenngradienten (C) geschichtet. Nach der Zentrifugation befindet sich das PMN in der zentralen Schicht (D), die in zwei 15-ml-Röhrchen (E) unterteilt ist. Die Zellsuspension wird zweimal in HBSS gewaschen und zentrifugiert (G-I), um das Medium zu entfernen, dann werden die Zellen resuspendiert und die verbleibenden Erythrozyten werden zwei Runden der hypotonen Lyse (J-M) unterzogen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
3. Vorbereitung auf die Neutrophilenaktivierung
- Bereiten Sie in 1,5-ml-Mikroröhrchen ein Aktivierungssystem für jede Bedingung vor, so dass die endgültige Zellkonzentration 6.600 Zellen/μl beträgt. Um beispielsweise die Wirkung von 100 nM fMLP (N-Formyl-Methionyl-Leucyl-Phenylalanin; siehe Materialtabelle) zu testen, fügen Sie 5 μl 10 μM fMLP zu 495 μl der 6.667 Zellen/μl-Suspension hinzu. Für die negative (unstimulierte) Kontrolle wird HBSS mit Ca2+ und Mg2+ zugegeben.
ANMERKUNG: Um diese Methodik zu demonstrieren, wurden die folgenden Endkonzentrationen der Stimuli verwendet: 100 nM fMLP, 16 μM Fallaxin, ein natürlich vorkommendes antimikrobielles Peptid14, und 100 nM PMA (Phorbol-12-myristat-13-acetat) (siehe Materialtabelle). - Bei 37 °C ohne Rotation inkubieren.
ANMERKUNG: Alle Aliquots für funktionelle Assays werden aus dieser Zellsuspension entnommen, die im Folgenden als Aktivierungssystem bezeichnet wird.
4. Nitrotetrazoliumblauchlorid (NBT)-Assay zur Bewertung der ROS-Produktion
- Herstellung der NBT-Arbeitslösung: Für jede Versuchsbedingung ist eine NBT-Arbeitslösung (siehe Materialtabelle) von 6 mM mit den folgenden Schritten herzustellen:
- 0,0005 g NBT in 10 μl Dimethylsulfoxid (DMSO) lösen und mindestens 15 Minuten lang vortexen.
- 90 μl HBSS Ca2+Mg2+ zugeben und bis zu 2 min vortexen.
HINWEIS: Alle Schritte, bei denen NBT zum Einsatz kommt, müssen im Dunkeln durchgeführt werden.
- Führen Sie einen NBT-Schiebertest durch.
- Nach 20 Minuten Zellaktivierung wird die Zellsuspension vorsichtig gemischt und vorsichtig 2 μl PMN auf einen sauberen Objektträger gegeben. 20 Minuten in einer befeuchteten Kammer bei 37 °C inkubieren.
HINWEIS: Verteilen Sie die Zellenaufhängung nicht zu stark auf dem Objektträger. Andernfalls kann es vor der Inkubation austrocknen. - Geben Sie 1 μl der NBT-Arbeitslösung über die Zellen und inkubieren Sie 20 Minuten lang lichtgeschützt weiter.
- Trocknen Sie den Objektträger mit heißer Luft und fixieren Sie ihn mit einem Tropfen Methanol in jeder Vertiefung für 1 min. Mit 0,03% Safranin (siehe Materialtabelle) 1 Min. beizen.
- Waschen Sie den Objektträger vorsichtig mit destilliertem Wasser.
- Lassen Sie den Objektträger an der Luft trocknen und beobachten Sie ihn unter dem Mikroskop.
- Zählen Sie 100 zufällige Zellen in jeder Vertiefung und differenzieren Sie Neutrophile mit und ohne Formazan-Ablagerungen.
- Nach 20 Minuten Zellaktivierung wird die Zellsuspension vorsichtig gemischt und vorsichtig 2 μl PMN auf einen sauberen Objektträger gegeben. 20 Minuten in einer befeuchteten Kammer bei 37 °C inkubieren.
- Führen Sie einen NBT-Spektrophotometrie-Assay durch.
- Nach 40 Minuten Zellaktivierung wird die Zellsuspension vorsichtig gemischt und 90 μl PMNs aus dem Aktivierungssystem in ein sauberes Mikroröhrchen überführt. Geben Sie dann vorsichtig 20 μl der 6 mM NBT-Lösung hinzu. 20 min im Dunkeln bei 37 °C inkubieren.
- 100 μl 10%iges Natriumdodecylsulfat (SDS; siehe Materialtabelle) zugeben und vortexen.
- Beschallung mit einem Tip-Sonicator mit einer Amplitude von 60 %, fünf Zyklen von je 15 s mit 15 s Intervallen. Bei 12.000 x g für 5 min zentrifugieren.
- 60 μl des Überstandes werden auf eine 96-Well-Platte mit klarem Boden überführt und die Absorption des Formazanprodukts bei 570 nm gemessen.
5. Phagozytose-Assay
- Bereiten Sie eine Suspension von 33.000 Hefen/μl für jede Bedingung vor, wie unten beschrieben:
- Etwa 0,75 mg Trockenhefe (Saccharomyces cerevisiae; siehe Materialtabelle) zu 200 μl HBSS Ca2+Mg2+ geben und in einem Thermomixer bei 100 °C mit 500 U/min für mindestens 15 min inkubieren.
- Die Mischung wird durch Vortexen homogenisiert und 5 μl Hefesuspension in 45 μl 0,2%igen Trypanblaufarbstoff überführt. Die Hefen mit einer Neubauer-Kammer abzählen.
- Stellen Sie die Konzentration der Ausgangssuspension auf 33.000 Hefezellen/μl unter Verwendung von HBSS Ca2+Mg2+ ein. Bewahren Sie die Suspension bis zur Verwendung auf Eis auf.
- Nach 20 Minuten Zellaktivierung wird die Zellsuspension vorsichtig gemischt und 5 μl des Aktivierungssystems in 5 μl der 33.000 Hefe/μl Saccharomyces cerevisiae-Suspension in einem neuen sterilen Mikroröhrchen überführt.
HINWEIS: Das Verhältnis von Neutrophilen zu Hefe beträgt 1:5 (PMN:Hefe). - Sofort werden 6 μl der PMN/Hefesuspension in drei Vertiefungen eines sauberen Objektträgers (je 2 μl) überführt und der Objektträger 40 Minuten lang in einer befeuchteten Kammer inkubiert.
HINWEIS: Verteilen Sie die Zellenaufhängung nicht zu stark auf dem Objektträger. Andernfalls kann es vor der Inkubation austrocknen. - Trocknen Sie den Objektträger unter heißer Luft und färben Sie ihn mit schneller Panoptik, wie in Schritt 2.9 oben beschrieben.
HINWEIS: Der dritte Schritt der schnellen panoptischen Färbung ist entscheidend für die mikroskopische Analyse des Objektträgers. Die Färbung des Objektträgers für ≥3 s in diesem Schritt kann ihn für die Analyse ungeeignet machen, da es schwierig sein wird, Hefe von neutrophilen Kernlappen zu unterscheiden. - Betrachten Sie die Objektträger unter dem Mikroskop, zählen Sie 100 zufällige Neutrophile jeder Vertiefung und unterscheiden Sie zwischen PMNs, die für Phagozytose positiv und negativ sind.
HINWEIS: Mindestens ein Hefepartikel innerhalb oder in direktem Kontakt mit der PMN-Zellmembran weist auf eine PMN hin, die für Phagozytose positiv ist. Wenn Sie sich für das Verhältnis von Hefe zu Neutrophilen interessieren, zählen Sie auch die Anzahl der verschlungenen Hefepartikel.
6. Echtzeit-PMN-Chemotaxis-Assay
HINWEIS: Der Migrationsassay wird ähnlich wie das zuvorbeschriebene Protokoll 15 durchgeführt, mit den folgenden Anpassungen:
- Bereiten Sie den chemotaktischen Gradienten vor, indem Sie 160 μl Chemolockstoff (z. B. fMLP, IL-8, C5 oder LTB4; siehe Materialtabelle) in die untere Kammer einer impedanzbasierten RTCA-Platte (Real Time Cell Analyzer) geben. Für Negativkontrollen und Blindproben 160 μl HBSS Ca2+Mg2+ zugeben.
- Befestigen Sie die obere Kammer und fügen Sie 25 μl HBSS Ca2+Mg2+ hinzu. Mindestens 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubieren, um den chemotaktischen Gradienten zu bilden.
- Nach 60 Minuten Zellaktivierung wird die Zellsuspension vorsichtig gemischt und 60 μl Zellsuspension in die obere Kammer gegeben. 60 μl HBSS Ca2+Mg2+ zum Rohling geben.
- Platzieren Sie die RTCA-Platte und programmieren Sie die RTCA-Software so, dass der Zellindex (CI) 2 Stunden lang alle 60 s gemessen wird.
HINWEIS: Die RTCA-Platten können zur Wiederverwendung gewaschen werden, wie zuvor beschrieben16. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die RTCA-Kammern und Elektroden dreimal mit phosphathaltiger Kochsalzlösung (PBS) und dann zweimal mit Reinstwasser Typ I gewaschen werden. Die untere und obere Kammer werden 40 Minuten lang mit 0,25 % Trypsin und 0,53 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) inkubiert. Dreimal mit Reinstwasser waschen.
7. NET-suggestiver Assay
- Nach 10 Minuten Zellaktivierung wird die Zellsuspension vorsichtig gemischt und 4 μl der PMNs von jedem zu bewertenden Aktivierungssystem übertragen, aufgeteilt in zwei Vertiefungen eines sauberen Objektträgers. In einer befeuchteten Kammer bei 37 °C für 30 min inkubieren.
- Geben Sie 1 μl DNAse I in eine der Vertiefungen und inkubieren Sie 20 Minuten lang bei 37 °C (in einer Feuchtkammer).
- Trocknen Sie den Objektträger und färben Sie ihn mit einer schnellen Panoptik, wie zuvor in Schritt 2.9 des Abschnitts "Neutrophile Isolierung" beschrieben.
- Werten Sie die Objektträger unter dem Mikroskop aus.
HINWEIS: Suchen Sie nach Hinweisen auf eine NET-Freigabe, die durch das Vorhandensein von netzartigen Strukturen gekennzeichnet ist. Bestätigen Sie nach der Identifizierung, ob die DNAse I-Behandlung in der Lage war, solche Strukturen zu entfernen. Dieser Assay deutet auf eine NET-Bildung hin, da zusätzliche Tests erforderlich sind, um ihr Vorhandensein zu bestätigen.
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Representative Results
Die in dieser Studie verwendete dichtebasierte Isolationsmethode (Abbildung 1) erfüllte die Kriterien für die vorgeschlagenen Experimente. Zu den mit dieser Methode ermittelten neutrophilen Parametern gehörten die Lebensfähigkeit ≥98 %, die Reinheit ≥94 % und die Zellausbeute ≥1,5 x 107, wobei in den Screening-Tests keine Aktivierung nachweisbar war. Zwei relevante Schritte bei der Isolierung von PMNs sind die Antikoagulation und die Entfernung von Erythrozyten. Das Halten des antikoagulierten Blutröhrchens oder der Spritze auf einem sanften Schaukeln, bevor es über den Dichtegradienten aufgetragen wird, und die Wahl einer Erythrozytenentfernungsmethode, um sowohl eine Aktivierung als auch eine Kontamination zu verhindern, kann die Ausbeute und Reproduzierbarkeit des Experiments beeinflussen.
Um den funktionellen Überblick über die Funktion der Neutrophilen zu bewerten, wurde ein Workflow entwickelt, der es ermöglichte, die vorgeschlagenen Screening-Assays mit mindestens zwei Forschern in einer durchschnittlichen Zeit von 4 Stunden durchzuführen, mit 1 Stunde Aktivierung und 2 Stunden Echtzeit-Migrationsüberwachung, wie in Abbildung 2 dargestellt.
Abbildung 2: Der NeutroFun Screen Workflow. Um das Panel der funktionellen Reaktionen zu bewerten, die durch bestimmte Bedingungen ausgelöst werden, umfasst der NeutroFun Screen-Workflow die Teilnahme von mindestens zwei Forschern. Forscher 1 (R1) startet den PMN-Isolierungsprozess, gefolgt von der Anpassung der Zellkonzentration und der Inkubation des Aktivierungssystems, während parallel dazu Forscher 2 (R2) die Materialien für die Durchführung der nächsten Assays vorbereitet, die zwischen den beiden aufgeteilt sind: R1 führt Phagozytose-, NET- und spektrophotometrische NBT-Assays durch; R2 führt Echtzeit-Migrations- und NBT-Slide-Tests durch. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Der klassische NBT-Assay17 wurde sowohl für die Objektträger- als auch für die spektrophotometrische Beurteilung der Formazanbildung optimiert, die sich aus der Reaktion von NBT mit den von PMNs erzeugten ROS ergibt. Der spektrophotometrische Assay ermöglichte eine relative Quantifizierung zwischen den Bedingungen, während der Mikroskopie-Assay für die deskriptive und semiquantitative Analyse nützlich war, um die Regelmäßigkeit der Kristallverteilung, der Morphologie und der Anzahl der formazanhaltigen Zellen zu bewerten. Die Ergebnisse des spektrophotometrischen Assays sind in Abbildung 3A dargestellt, was darauf hindeutet, dass 100 nM PMA im Vergleich zu fMLP- und Kontrollgruppen eine erhöhte ROS-Produktion (in einem durchschnittlichen Verhältnis von 3:2:1) induzierten. Die Ergebnisse des NBT-Objektträgertests (Abbildung 3B) bestätigten die spektrophotometrischen Ergebnisse und zeigten auch, dass PMA im Vergleich zu fMLP der intensivste ROS-Produktions-induzierende Stimulus ist (Abbildung 3C), wie zuvor durch die direkte Messung von ROS mittels Zytometriegezeigt wurde 18. In Bezug auf die Zellzählung zeigte die Anzahl der Neutrophilen, die Formazankristalle enthielten, ein Verhältnis von 7:4:1 unter den PMA:fMLP:Kontrollbedingungen, was auch unterschiedliche Formazan-Verteilungsmuster zwischen fMLP und PMA-aktivierten PMNs zeigte; Die fMLP-Behandlung führte zu einer intensiven Aktivierung einzelner Zellen, während PMA bei den meisten PMNs die Bildung von Formazan-Kristallen induzierte, die über das gesamte Zytoplasma verstreut waren. Darüber hinaus wurden einige morphologische Merkmale beobachtet, die die Bedingungen differenzierten, wie z.B. die expressive Zellaggregation nach PMA-Behandlung. Das Fehlen solcher typischen Aktivierungsmerkmale und die niedrigen Formazan-Spiegel in der Kontrollgruppe deuteten darauf hin, dass der Ruhezustand nicht signifikant gestört war. Daher erwies sich der NBT-Assay als einfacher, kostengünstiger und zuverlässiger Test für die Produktion von neutrophilen ROS, der verwendet werden kann, um die Kapazität und Intensität eines bestimmten Stimulus zur Induktion der ROS-Produktion zu überblicken.
Abbildung 3: NBT-Test. (A) Die spektrophotometrische Beurteilung des respiratorischen Bursts von Neutrophilen unter verschiedenen Bedingungen (Negativkontrolle: 100 nM fMLP und 100 nM PMA) durch Formazan-Absorption (490-630 nm). Die Daten von vier Spendern werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt. * = alle Gruppen unterscheiden sich voneinander (p≤ 0,05); £ = Die Vergleiche CTRL versus PMA und fMLP versus PMA zeigen signifikante Unterschiede (p≤ 0,05). (B) Der Objektträgertest kann qualitativ analysiert werden, indem die Intensität der Formazan-Ablagerungen, ihre Lage innerhalb der Zelle und die Zellaggregation charakterisiert werden. Schwarze Pfeile zeigen auf Formazan-Kristalle. Maßstabsbalken: 20 μm. (C) Anzahl der formazanhaltigen PMNs, gezählt durch optische Mikroskopie. Die Daten von acht Spendern wurden als Mittelwert ± SD dargestellt. *** p < 0,0001, Student's t-Test. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Die Phagozytose-Objektträger wurden verwendet, um die Phagozytoserate als Prozentsatz der Neutrophilen zu bestimmen, die eine Phagozytose durchführen, wie in Abbildung 4 dargestellt. Obwohl sowohl 100 nM fMLP als auch 16 μM antimikrobielles Peptid eine anscheinend erhöhte Hefeverschlingung induzierten, war der Unterschied bis zur dualen Stimulation statistisch nicht signifikant, was die Phagozytose im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant verstärkte und auf eine Reaktion auf duale Stimulation hindeuten könnte.
Abbildung 4: Phagozytose-Test. Neutrophile Granulozyten wurden nach ihrer Phagozytosekapazität (Zählung von neutrophilen Granulozyten, die Hefe enthalten) bewertet. Obwohl die Exposition bei 100 nM fMLP oder einem 16 μM antimikrobiellen Peptid vor der Hefeinkubation die Phagozytose im Vergleich zur Kontrollgruppe erhöhte, (A) war der Anstieg statistisch nicht signifikant. Interessanterweise führte eine initiale Inkubation mit fMLP, gefolgt von der Zugabe des antimikrobiellen Peptids, zu einer signifikant verbesserten Phagozytose in humanen Neutrophilen (Sternchen zwischen CTRL und dem antimikrobiellen Peptid fMLP+). (B) Schwarze Pfeile zeigen Hefezellen, grüne Pfeile zeigen nur Neutrophile und rote Pfeile zeigen phagozytenbildende Neutrophile. Die Daten von fünf Spendern wurden als Mittelwert ± SD dargestellt. Maßstabsbalken: 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ein Beispiel für Echtzeit-Zellmigrationsergebnisse ist in Abbildung 5 dargestellt, das die bekannte chemotaktische Wirkung von 100 nM fMLP auf Neutrophile zeigt. Die Zellmigrationskinetik wurde an das Gompertz-Modell angepasst, um den Vergleich seiner Parameter zu ermöglichen.
Abbildung 5: Zellmigration in Echtzeit. Der Zellindex spiegelt die elektrische Impedanz wider, die sich aus der Zellmigration ergibt. In diesem Assay wurde fMLP als Positivkontrolle der Neutrophilenmigration verwendet, indem 100 nM fMLP in die untere Kammer gegeben wurden. Eine Negativkontrolle (CTRL) enthielt nur HBSS in der unteren Kammer. Die überlagerten Kurven stellen die Kurvenanpassung des Gompertz-Modells dar, die so modifiziert wurde, dass sie am besten zu aufsteigenden und abfallenden Hängen passt. Daten von drei Spendern, dargestellt als Mittelwert ± SD.* p < 0,05, Student's t-Test. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abschließend wird ein einfacher optischer Mikroskopietest vorgestellt, der auf das Vorhandensein von NET hindeutet, bei dem die PMNs mit schneller Panoptik gefärbt werden. Es ist möglich zu beobachten, dass es für einige spezifische NET-induzierende Stimuli, wie PMA oder einige antimikrobielle Peptide, selbst nach einer kurzen Aktivierungszeit (1 h) möglich ist, filamentöse, netzartige Strukturen in der Nähe der Zellen zu beobachten, während dies unter anderen Bedingungen wie der Negativkontrolle und fMLP nicht möglich ist (Abbildung 6). Um diese Behauptung besser zu untermauern, wurde DNase I nach 40 Minuten Zellaktivierung mit 100 nm PMA oder einem antimikrobiellen Peptid hinzugefügt, wobei die NET-ähnlichen Strukturen entfernt wurden (Abbildung 6). Obwohl diese Methode nicht für die NET-Charakterisierung geeignet ist und durch Artefakte beeinflusst werden kann, ist sie ein kostengünstiger, einfacher und interessanter Ausgangspunkt, um weitere Investitionen in die Analyse von NETs zu rechtfertigen, insbesondere in Kontexten, in denen die Auswirkungen der Stimuli unbekannt oder schlecht beschrieben sind.
Abbildung 6: Suggestiver Assay zur NET-Bildung. Eine qualitative Analyse von panoptisch gefärbten Neutrophilen nach 1 h Aktivierung über einem Objektträger kann auf eine NET-Freisetzung hinweisen. CTRL (A,B) und fMLP (C,D) Gruppen zeigten keinen Hinweis auf eine NET-Freisetzung, während die Aktivierung mit PMA (E-H) die Bildung von NET-ähnlichen Strukturen induzierte, die durch DNase I-Behandlung (I-L) abgebaut wurden. Die Untersuchung der Wirkung eines antimikrobiellen Peptids auf die Neutrophilen zeigte, dass ein solcher Stimulus in der Lage sein könnte, eine NET-Freisetzung hervorzurufen, da die Objektträger die NET-ähnlichen Strukturen (M-P) präsentierten, die durch DNase I (Q-T) abgebaut wurden. Rote Pfeile zeigen auf NET-ähnliche Strukturen. Maßstabsleisten: 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Neutrophile Granulozyten sind hochdynamische und reaktionsfähige Zellen, die kurzlebig sind und noch nicht kryokonserviert werden können19, was die Untersuchung ihrer Biologie zu einer Herausforderung macht. Daher ist es wichtig, sorgfältige Schritte zu befolgen, um lebensfähige, angereicherte und ruhende Neutrophile zu erhalten11,20. In dieser Studie wurde eine dichtebasierte Isolationstechnik verwendet, die den Schwerpunkt auf eine sanfte und minimale Manipulation sowie die Verwendung niedriger Temperaturen bis zum Aktivierungsschritt legt. Darüber hinaus muss die Blutaufbereitung innerhalb von 30 Minuten nach der Venenpunktion erfolgen und bei Raumtemperatur gelagert werden. Die vorliegende Arbeit stellt eine Option dar, um den Manipulationsstress und die Experimentierzeit zu verringern. Um den Prozess weiter zu vereinfachen, haben wir einen neuen Schritt (als Option) in das Protokoll aufgenommen, bei dem die Erythrozyten durch sanfte Resuspension und Aspiration der Erythrozytenschicht nach einem einzigen Hämolyseverfahren entfernt werden. Dieser Schritt reduziert den Manipulationsstress und die Versuchszeit, da er die Mehrheit der Erythrozyten mit nur einem hypotonen Hämolyseschritt entfernt. Es sollte jedoch beachtet werden, dass die Fähigkeiten des Bedieners die Effektivität dieses Schritts stark beeinflussen und Erythrozyten nicht immer vollständig entfernt werden. Darüber hinaus kann die Aspiration von Erythrozyten zu einem Verlust von Neutrophilen führen, was jedoch keinen Einfluss auf die Ausbeute hat, da bei der Ansammlung näher an der Erythrozytenschicht zunächst mehr Neutrophile aus dem Gradienten gewonnen wurden. Daher wird die Erythrozytenaspiration empfohlen, wenn die Assays nicht die höchstmögliche Reinheit erfordern oder wenn der Bediener konstant gute Ergebnisse erzielt hat. Bei den hier vorgestellten Screening-Tests würde eine geringe Menge an kontaminierenden Erythrozyten (<3 %) die Ergebnisse nicht beeinträchtigen.
Um sicherzustellen, dass alle Verfahren, einschließlich der Reagenzienvorbereitung, rechtzeitig durchgeführt werden, wird ein Workflow vorgestellt (Abbildung 2), der den Zeitplan und die Aufgabenteilung zwischen zwei Forschern detailliert beschreibt. Nachdem alle funktionellen Assays abgeschlossen sind, können die verbleibenden Zellen für weitere molekulare Untersuchungen, wie z.B. Omics-Studien durch Zelllyse mit geeignetem Lysepuffer und Lagerung, vorbereitet werden.
ROS-Produktion
Der respiratorische Ausbruch ist ein Kennzeichen des neutrophilen Primings und der Aktivierung18,21, und die Bewertung der ROS-Produktion ist eine gängige Methode zur Abschätzung des Aktivierungsstatus von Neutrophilen. In dieser Studie wurde die ROS-Produktion mit zwei Ansätzen untersucht: optische Mikroskopie und Spektrophotometrie.
Der NBT-Test ist ein bekannter Ansatz zur Beurteilung des respiratorischen Bursts bei Neutrophilen22,23. Zwei häufig verwendete Methoden sind die auf optischer Mikroskopie basierenden (oder Objektträgertest) und die auf Spektrophotometrie basierenden Assays 24,25,26. Obwohl die optische Mikroskopie die Visualisierung von Details auf Zellebene ermöglicht, ist sie anfällig für Benutzerverzerrungen. Daher dient der NBT-Objektträgertest als qualitative Ergänzung zum spektrophotometrischen Assay in Bezug auf phänotypische Merkmale wie Formazan-Bildungsmuster, Intensität und Zellaggregation.
Die kritischen Schritte sowohl für den NBT-Objektträger- als auch für den spektralphotometrischen Test sind die vollständige Solubilisierung von NBT und Formazan. Entgegen den Empfehlungen des Herstellers löst sich NBT nicht gut in Wasser auf. Das Homogenisieren von NBT in DMSO für mindestens 15 Minuten und die anschließende Zugabe von Wasser/HBSS und das Vortexen für 2 Minuten sorgen jedoch für eine vollständige Solubilisierung. Um die Absorption von Formazan zu analysieren, müssen außerdem zwei kritische Schritte erreicht werden: (1) Freisetzung von Formazankristallen aus Zellen durch PMN-Lyse und (2) vollständige Solubilisierung von Formazankristallen. Beide Schritte wurden erreicht, indem das Zellpellet mit 10% SDS behandelt wurde, wie kürzlich vorgeschlagen27, gefolgt von einer Beschallungs- und Absorptionsanalyse des Überstandes bei 570 nm.
Darüber hinaus sind die NBT-Ergebnisse der negativen und positiven Kontrollgruppen der erste Schritt des zu bewertenden Screenings. Dieser Schritt muss einen bemerkenswerten Unterschied aufweisen, da die Bewertung der ROS-Produktion durch Formazan Aufschluss darüber gibt, ob der Isolierungsprozess für unerwünschte Veränderungen des Ruhezustands der Zellen entweder durch Stimulation oder Hemmung verantwortlich gewesen sein könnte.
Andere Methoden, wie z. B. die Cytochrom-c-Reduktion28 oder die Durchflusszytometrie-29-Analyse, werden häufig für den ROS-Nachweis verwendet; Wenn man jedoch einen Screening-Ansatz in Betracht zieht, erfordert ihre Anwendung eine längere Experimentierzeit, die Verwendung spezifischer Marker und teure Instrumente. Die Chemilumineszenz von Luminol/Isoluminol ist eine schnelle und kostengünstige Methode zum Nachweis von ROS und ermöglicht gleichzeitig die Differenzierung von intra- und extrazellulären ROS. Für dieses Verfahren ist jedoch ein Luminometer erforderlich30,31. Obwohl die Gerätekosten durch den Einsatz einer Einrichtung umgangen werden könnten, wäre sie immer noch nicht für eine Screening-Analyse geeignet, die gleichzeitig mit anderen Assays durchgeführt wird.
Phagozytose
Die PMN/Hefe-Inkubation gibt einen Überblick über die Phagozytosekapazität und -wirksamkeit von Neutrophilen, indem die Anzahl der Neutrophilen, die eine Phagozytose durchführen, und die Anzahl der Hefen, die pro Neutrophilen verschlungen werden, gezählt werden. Da es sich bei dem Hefepartikel selbst jedoch um ein Aktivierungssignal handelt, stellt der Vergleich der Kontrollgruppe mit vorbehandeltem PMN ein duales Stimulationssystem dar, das möglicherweise keine signifikanten Veränderungen aufweist, wie in der CTRL im Vergleich zu fMLP-behandeltem PMN gezeigt wird (Abbildung 4). Nichtsdestotrotz ist dieser Assay nützlich, um anzuzeigen, ob ein potenzieller Modulator einen Einfluss auf die Phagozytose haben würde. Ein neuartiges antimikrobielles Peptid wurde mit diesem Assay getestet, und die Ergebnisse deuten auf eine interessante potenzielle Reaktion auf diese Kombination von Stimuli hin, die kürzlich als notwendig für eine effiziente Aktivierung diskutiert wurde32.
Der kritische Schritt für diesen Assay ist die Färbung, da die Analyse unzuverlässig wird, wenn der Objektträger für ≥3 s auf Panoptikum Nr. 3 (Hämatoxylin) gehalten wird. Das liegt daran, dass die Hefezellen und die neutrophilen Kernlappen nicht voneinander unterschieden werden können. Darüber hinaus ermöglicht dieser Ansatz die morphologische Analyse von Neutrophilen nach Exposition gegenüber Modulatoren. Die Durchflusszytometrie ist eine weitere effiziente Technik zur Analyse der Phagozytose33, obwohl sie Einschränkungen durch die Schwierigkeit hat, zwischen membrangebundenen und verschlungenen Partikeln und anderen Faktoren im Zusammenhang mit dem vorgeschlagenen Screening-Set zu unterscheiden, wie im vorherigen Thema diskutiert. Die gleiche Einschränkung wird bei dem hier beschriebenen Verfahren beobachtet, obwohl dies als ein erstes Screening zur Steuerung von Folgestudien zu betrachten ist.
Migration in Echtzeit
Das Echtzeit-Screening-Protokoll wurde optimiert, um die Migrationskapazität von PMNs zu bewerten. Obwohl eine frühere Studie darauf hindeutete, dass eine Beschichtung der Unterseite der RTCA-Platte erforderlich war, damit der Migrationsassay einen Unterschied zwischen der Negativkontrolle und der IL-8-Behandlung zeigte15, zeigte diese Studie hohe Konfidenzintervallwerte (CI) für fMLP-behandelte Zellen ohne Zusatz von Beschichtungsmitteln. Die Ergebnisse zeigten eine hohe Reproduzierbarkeit mit signifikanter Migration ab 12 Minuten. Darüber hinaus kann die Kurvenanpassungsanalyse der erhaltenen Migrationsdaten Parameter wie das Zellindexmaximum sowie die Zunahme und Abnahme der Steigung aufdecken, die für das Verständnis der Dynamik der Migration nützlich sind und von der Konzentration abhängen oder sich zwischen den Bedingungen unterscheiden können. Die beste Anpassung für die Migrationskurven der Neutrophilen (Abbildung 5) war die angepasste Gompertz-Funktion34, die zeigte, dass fMLP den maximalen Zellindex und die erhöhte Steigung erhöht.
Besondere Aufmerksamkeit ist erforderlich, um Blasen im RTCA-System zu vermeiden, da sie die Zellen, die durch die Elektroden gelangen, blockieren und das Experiment beeinträchtigen können. Ein limitierender Faktor sind die hohen Kosten für die Platten. Obwohl billigere Techniken die Zellmigration analysieren, fehlt es ihnen an guter Reproduzierbarkeit oder sie sind schwierig und zeitaufwändig, wie z. B. die Boyden-Kammer35. Daher ist RTCA eine zuverlässige Migrationsanalyse, die mit den anderen hier vorgestellten Screening-Tests kompatibel ist.
Netze
Schließlich wurde ein vielversprechender, einfacher und kostengünstiger Assay für eine vorläufige Bewertung der NET-Bildung mit Hilfe der optischen Mikroskopie entwickelt. Sie wurde aus der Beobachtung von Phagozytose-Objektträgern abgeleitet, bei denen PMA, ein spezifischer NET-induzierender Stimulus, der auf seine Wirkung auf die Phagozytosekapazität getestet wurde, im Vergleich zu den CTRL- und fMLP-Gruppen ebenfalls eine netzartige Strukturbildung induzierte. In dieser Arbeit wurde die Hypothese aufgestellt, dass diese Strukturen auf eine NET-Freisetzung hinweisen könnten. Eine solche Hypothese wurde getestet, indem die Proben nach der Aktivierung mit DNase I behandelt wurden, wobei keine filamentösen Strukturen in PMA-aktivierten Neutrophilen gefunden wurden. Die Annahme, dass es sich bei solchen Strukturen wahrscheinlich um NETs handelt, beruht auf der Tatsache, dass PMA als bekannter Induktor der NET-Bildung36,37 genannt wird, dem Nachweis ähnlicher Strukturen durch Fluoreszenzmikroskopie unter Verwendung spezifischer Marker für NETs38,39 und dem Abbau von NETs, die durch DNase I katalysiert werden40,41. Es ist wichtig zu betonen, dass es sich hierbei nicht um eine Methode zur Bestätigung der NET-Bildung handelt, sondern nur um ein vorläufiges Screening, das auf das Vorhandensein von NETs hindeutet. Obwohl dieser Test Einschränkungen hat, da NETs mit Färbeartefakten verwechselt werden können, erfüllt er einen relevanten Zweck, indem er die NET-Bildung in einem schnellen und kostengünstigen Screening vorschlägt, das zusammen mit anderen Funktionstests durchgeführt werden kann. Sobald NETs als möglicherweise relevant für die zu screenende Studie detektiert wurden, können sie durch konfokale oder Elektronenmikroskopie42 weiter ausgewertet werden, wie später erörtert wird.
In unserem Labor werden neuartige antimikrobielle Peptide, die wahrscheinlich auch immunmodulatorische Aktivitäten haben, häufig durch diese Reihe von Screening-Assays bewertet, um die weitere Analyse der Auswirkungen einiger Peptide auf menschliche Neutrophile zu verbessern, da einige interessante ROS43-, Phagozytose-, Migrations- und/oder NET-modulierende Eigenschaften aufweisen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der NeutroFun Screen ein wertvolles Werkzeug zur Identifizierung potenzieller Modulatoren der Neutrophilenaktivität normaler Dichte aus einer großen Anzahl ungetesteter Verbindungen bietet. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass diese Methode nur als Vorab-Screening dient. Nach diesem ersten Screening können teurere, fortschrittlichere und zeitaufwändigere Methoden auf bestimmte Funktionen oder Pfade gelenkt werden, die durch diese ersten Ergebnisse für die Datenvalidierung vorgeschlagen werden. Für die ROS-Produktion, Phagozytose und NET-Bildung gibt es alternative Methoden zur Datenvalidierung und zur Gewinnung weiterer quantitativer Ergebnisse. NET-Visualisierung und -Quantifizierung kann durch immunfluoreszenzmikroskopische Analysen durchgeführt werden, die das Vorhandensein und die Überlappung von extrazellulärer DNA und Körnerproteinen wie Myeloperoxidase und neutrophiler Elastase bestimmen, wie kürzlich ausführlich beschrieben42. ROS spielen in vielen biologischen Prozessen eine entscheidende Rolle, und daher ist ihre Untersuchung sehr weit verbreitet und vielfältig. Zu den etabliertesten Methoden gehören solche, die Antikörper verwenden, wie z. B. der Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) und das Immunoblotting von Lumineszenz oder die Fluoreszenzdetektion - wie die Durchflusszytometrie von Zellen unter unterschiedlicher Markierung - durch DCFDA, EPR-Spektroskopie und enzymatische Aktivitätsmessungen44. In ähnlicher Weise wird eine robuste Phagozytose-Bewertung auch auf verschiedene Weise durchgeführt. Zu den alternativen Methoden gehören die alleinige Durchflusszytometrie45,46 oder die Kombination mit Fluoreszenzmikroskopie47. Die beschriebene Echtzeit-Zellmigration ist ein robuster und ausreichender Assay, der keiner weiteren Validierung bedarf und Parameter aufweist, die andere Methoden nicht berücksichtigen können. Andere Kombinationen solcher Methoden könnten für bestimmte Szenarien besser geeignet sein, aber zusammenfassend stellt dies eine schnelle und erschwingliche Kombination dar, die viele neutrophile Aktivitäten umfasst.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Studie darauf abzielt, eine Reihe von Assays bereitzustellen, die aus einfachen, schnellen und kostengünstigen Methoden bestehen, um mehrere neutrophile Reaktionen auf neue Moleküle und Bedingungen zu bewerten, um die Bemühungen besser auf fortschrittliche Methoden auszurichten. Als wesentliche Einschränkungen sollten die Ergebnisse von ROS-, NET- und Phagozytose-Assays als vorläufig betrachtet werden und müssen durch spezifischere und aufwändigere Assays weiter validiert werden, und diejenigen, die sich auf die nicht-automatisierte Mikroskopie-Zellzählung stützen, sind anfällig für unbewusste Verzerrungen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.
Acknowledgments
Die Autoren nennen die folgenden Förderorganisationen: FAPDF, CNPq, CAPES, UnB, FINEP und FINATEC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CIM-Plate 16 | Agilent | 5665825001 | |
| CLARIOstar Plate Reader | BMG LABTECH | US Patent Number 9,733,124 Product details: MARS Data Analysis Software |
|
| Dimethyl sulfoxide | Dinâmica | 1582 | |
| DNAse I | Sigma - Aldrich | DN 25 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma - Aldrich | E5134 | |
| Fast panoptic stain | Laborclin | 620529 | |
| Glass slide | Exacta | 7102 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution with calcium, with magnesium, without phenol red. | Sigma - Aldrich | 55037C | |
| Hank’s Balanced Salt Solution without calcium chloride, magnesium sulfate and sodium bicarbonate. | Sigma - Aldrich | H4641 | |
| Heparin | Blau | 7896014655229 | |
| Laminar flow cabinet | Veco | VLFS-12 | |
| Microscope | Zeiss | 415501-0101-002 | Product details: Primostar 1 |
| Mixing Block | BIOER | MB-102 | |
| Neubauer improved bright-lined | New Optik | 1110000 | |
| N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine | Sigma - Aldrich | F3506 | |
| Nitroblue tetrazolium | Neon | CAS 298-83-9 | |
| Percoll | Cytiva | 17089101 | separation media |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma - Aldrich | P8139 | |
| Phosphate buffered saline tablet | Sigma - Aldrich | P4417 | |
| ROTOFIX 32 A | Hettich | 1206 | |
| Saccharomyces cerevisiae | Fleischmann | ||
| Safranin | Sigma - Aldrich | 50240 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Cytiva | 17-1313-01 | |
| Sonicator | Qsonica | Q125 | |
| Trypan blue solution | Vetec | C.I. 23850 | |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries, Inc. | 0K-0500-902 | |
| xCELLigence Real-Time Cell Analysis (RTCA) DP (dual purpose) | Agilent | 380601050 | Product details: RTCA system composed of detection hardware, cell plates and software |
References
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