Summary
Denne protokollen inneholder et sett med nøytrofile funksjonsanalyser som skal brukes som en screeningsmetode for å dekke funksjoner fra forskjellige signalveier. Protokollen inkluderer en innledende og enkel evaluering av cellelevedyktighet, renhet, reaktiv oksygenartsproduksjon, sanntidsmigrasjon, fagocytose og et foreløpig forslag om nøytrofile ekstracellulære feller.
Abstract
Neutrofiler er kjent som en av de første forsvarslinjene i den medfødte immunresponsen og kan utføre mange spesielle cellulære funksjoner, som kjemotaksis, omvendt migrasjon, fagocytose, degranulering av cytotoksiske enzymer og metabolitter og frigjøring av DNA som nøytrofile ekstracellulære feller (NET). Neutrofiler har ikke bare tett regulert signalering selv, men deltar også i reguleringen av andre komponenter i immunsystemet. Siden ferske nøytrofiler er terminalt differensierte, kortvarige og svært variable blant individer, er det viktig å få mest mulig ut av de innsamlede prøvene. Forskere må ofte utføre screeninganalyser for å vurdere en oversikt over de mange nøytrofile funksjonene som kan påvirkes av spesifikke forhold som vurderes. Et sett med tester etter en enkelt isolasjonsprosess av nøytrofiler med normal tetthet ble utviklet for å imøtekomme dette behovet, og søkte en balanse mellom hastighet, omfattende, kostnad og nøyaktighet. Resultatene kan brukes til å resonnere og veilede grundige oppfølgingsstudier. Denne prosedyren kan utføres på en gjennomsnittlig tid på 4 timer og inkluderer evaluering av cellelevedyktighet, produksjon av reaktive oksygenarter (ROS), sanntidsmigrasjon og fagocytose av gjær på glassglass, og etterlater nok celler til mer detaljerte tilnærminger som omics-studier. Videre inkluderer prosedyren en måte å enkelt observere et foreløpig forslag til NET etter rask panoptisk farging observert ved lysmikroskopi, med mangel på spesifikke markører, om enn nok til å indikere om ytterligere innsats på den måten ville være verdt. Mangfoldet av testede funksjoner kombinerer vanlige punkter blant testene, noe som reduserer analysetiden og utgiftene. Prosedyren ble kalt NeutroFun Screen, og selv om den har begrensninger, balanserer den de nevnte faktorene. Videre er målet med dette arbeidet ikke et bestemt testsett, men snarere en retningslinje som enkelt kan justeres til hvert laboratoriums ressurser og krav.
Introduction
Neutrofiler er de mest tallrike medfødte immuncellene i humant blod og er kjent for å spille en viktig rolle i infeksjon og betennelse, og er de første respondentene som kommer til stedetfor vevskader. I de senere år har det vært en økende anerkjennelse av den avgjørende rollen som nøytrofiler spiller i en rekke sykdommer og i å støtte homeostase2. Neutrofiler har ikke bare tett regulert signalering selv, men deltar også i reguleringen av andre komponenter i immunsystemet 3,4,5. Derfor er undersøkelse av nøytrofiler og deres mange uvanlige cellulære funksjoner, som kjemotaksis, omvendt migrasjon6, fagocytose7, respiratorisk utbrudd8 og frigjøring av nøytrofile ekstracellulære feller (NET)7, avgjørende i mange forskningssammenhenger der det er nødvendig å vurdere potensielle nøytrofile funksjonelle, morfologiske, eller molekylære endringer utløst av spesifikke forhold som analyseres.
Ferskt isolerte nøytrofiler er terminalt differensierte, kortvarige, svært dynamiske og lett aktiverte9. Imidlertid er en effektiv lagringsmetode som ikke påvirker nøytrofilresponsene ennå ikke oppnådd, noe som gjør det utfordrende å utføre flere analyser som må være uavbrutt. Videre kan tidligere beskrevne funksjonelle analyser10,11, basert på analyser som krever cytometri og/eller fluorescerende farging, ikke være et levedyktig valg når en bred og innledende evaluering av nøytrofilen er nødvendig.
For å løse disse problemene beskriver denne protokollen et sett med tester som kan utføres etter en enkelt isolasjonsprosess, inkludert evaluering av cellelevedyktighet, produksjon av reaktive oksygenarter (ROS), sanntidsmigrasjon og fagocytose av Saccharomyces cerevisiae, hvis resultater kan brukes til å resonnere grundige oppfølgingsstudier. Denne prosedyren, kalt NeutroFun Screen, ble designet for å omfatte de ledende effektoraktivitetene, unntatt degranulering, og kan fullføres på en gjennomsnittlig tid på 4 timer, inkludert 1 time aktivering. I tillegg kan de gjenværende cellene brukes til mer detaljerte tilnærminger som omics-studier. Fordelen med denne metoden ligger i balansen mellom hastighet, omfattende, kostnad og nøyaktighet.
Videre er det en måte å enkelt observere et foreløpig forslag til NET, uten spesifikke markører, men nok til å indikere om ytterligere innsats i den retningen ville være verdt. Mangfoldet av testede funksjoner tar sikte på å kombinere felles poeng blant tester, redusere analysetiden og utgiftene. Hovedmålet med denne metoden er å gi en balansert, funksjonell analyse med hensyn til hastighet, omfattende, kostnad og nøyaktighet som gir en oversikt over nøytrofilens respons, noe som gjør det til et nyttig første skritt i å undersøke effekten av nye stimuli på nøytrofiler med normal tetthet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter fulgte strengt de etiske retningslinjene fastsatt av det institusjonelle gjennomgangsstyret ved Universitetet i Brasilia (prosess 13364819.0.0000.5558), og prøver ble identifisert med koder for å sikre donoranonymitet. Cellene ble hentet fra normale friske mannlige donorer i alderen 18-35 år, som signerte det informerte samtykket og oppfylte følgende valgbarhetskriterier: ikke-røykere / dampere, ingen kroniske helsemessige forhold og ingen historie med inflammatoriske tilstander de siste 14 dagene.
1. Blodsamling
- Plasser aseptisk 0,3 ml 5000 IE/ml heparin (se materialfortegnelsen) i en steril sprøyte på 20 ml for å heparinisere den.
- Påfør en venøs turniquet ca 4 i over stikkstedet og identifiser median cubital eller cephalic vene for venepunktur.
MERK: Sørg for at den totale turnétiden ikke overstiger 1 min. - Rengjør stikkstedet med 70% alkohol og utfør venepunkturen.
- Snu sprøyten forsiktig tre eller fire ganger etter at du har samlet blodet for å blande blodet og heparinet riktig.
2. Nøytrofil isolasjon
MERK: Polymorfonukleære leukocytter (PMN) isoleres gjennom sentrifugering av tetthetsgradient etterfulgt av hypoton lyse av de gjenværende røde blodcellene (RBC), som tidligere beskrevet11 med noen endringer. Denne metoden er ikke obligatorisk for å utføre screeninganalysene, og kan erstattes så lenge den valgte metoden resulterer i en levedyktighet på >97%, priming eller aktivering av <3% av PMNene, og gir nok celler for alle analyser, replikater og forhold. Å utføre disse trinnene under aseptiske forhold og bruke endotoksinfrie løsninger er obligatorisk for å unngå celleaktivering.
- Lag 12 ml fortynninger av 60 % og 70 % separasjonsmedier (kommersielt tilgjengelig; se materialfortegnelse) i 50 ml koniske rør.
- Klargjør gradienten fra bunn til topp ved å tilsette 4 ml om gangen med 60 % fortynning over 70 % fortynning ved bruk av en 5 ml pipette. Gjør dette forsiktig for å forhindre blanding av grensesnittet.
- Legg forsiktig 12 ml heparinisert blod på toppen av tetthetsgradienten. Sentrifuge ved 200 x g i 15 min ved romtemperatur.
MERK: Fra dette trinnet og fremover, til PMN-aktivering, må alle reagenser og rør som brukes oppbevares i en kjøler fylt med is. - Kast plasma/mononukleære cellelag, og overfør deretter laget over erytrocyttpelleten forsiktig til to 15 ml koniske rør med ca. 7,5 ml i hver. Gjør opp rørvolumet med Hanks balanserte saltløsning (HBSS; se materialfortegnelse).
- Sentrifuge ved 300 x g i 5 minutter ved 19 °C.
- Vask cellepelleten med HBSS.
- Kast supernatanten ved å helle på slangen og forsiktig resuspendere pelleten i 7 ml HBSS.
- Sentrifuge ved 300 x g i 5 minutter ved 19 °C for å fjerne alle separasjonsmediene.
- Utfør hypotonisk lyse av de resterende RBC.
- Kast supernatanten og kombiner pellets i et enkelt rør.
- Resuspender RBC/PMN-pelleten i 3 ml steril H2O og tilsett 3 ml HBSS (2x) innen 25 s for å gjenopprette osmolariteten. Deretter sentrifuger ved 300 x g i 5 min ved 19 °C.
- Gjenta trinn 2.8.1 og 2.8.2 for en hvit, erytrocyttfri pellet.
MERK: Supernatanten må fjernes så snart som mulig for å minimere kontakten mellom nøytrofile granulocytter og RBC-nedbrytningsprodukter. Alternativt kan den andre hypotoniske lysen erstattes ved forsiktig å resuspendere det gjenværende RBC-laget og fjerne all supernatanten, da de gjenværende RBC-ene vil sedimentere over PMN-pelleten.
- Kast supernatanten ved å helle røret, resuspender PMN-ene forsiktig i den gjenværende bufferen og overfør dem til et iskaldt mikrorør.
MERK: Sørg for å kommentere volumet mens du overfører de resuspenderte cellene med en mikropipette. - Overfør 3 x 1 μL av celleopphenget til et rent glassglass (tre brønner på 1 μL hver) og beis med rask panoptisk (se materialfortegnelse) for morfologi og renhetsevaluering12.
- For å beise med rask panoptikk, senk lysbildet fem ganger i panoptisk fiksativ n ° 1, seks ganger i eosin n ° 2 og to ganger i hematoksylin n ° 3, med hver nedsenkning som varer 1 s.
- Vask glasslysbildet forsiktig med destillert vann.
- La renne av og lufttørke.
- Observer under et mikroskop og telle 300 tilfeldige celler i hver brønn, og dermed skille nøytrofilene fra andre granulocytter.
- Overfør 1 μL av cellesuspensjonen til 49 μL med 0,2% trypanblått fargestoff13 og tell cellene ved hjelp av et Neubauer-kammer, skille mellom døde og levedyktige celler.
- Juster cellekonsentrasjonen til 6 667 celler / μL ved bruk av en løsning av 50% autologt plasma og 50% HBSS supplert med kalsium og magnesium. Del 6 667 celler/μL-suspensjonen jevnt mellom mikrorørene som tilsvarer betingelsene som skal testes, inkludert den negative kontrollen.
MERK: Enhver cellekonsentrasjon som ligner de sirkulerende nøytrofilene i modellorganismen kan brukes, men det er viktig å bruke samme cellekonsentrasjon i alle eksperimenter for reproduserbarhet.
Figur 1: Den nøytrofile isolasjonsprotokollen. To konsentrasjoner av separasjonsmediet (percoll) (A) er stablet (B), deretter blir blodet lagdelt på toppen av separasjonsgradienten (C). Etter sentrifugering er PMN i det sentrale laget (D), som er delt inn i to 15 ml rør (E). Cellesuspensjonen vaskes to ganger i HBSS og sentrifugeres (G-I) for å fjerne mediet, deretter resuspenderes cellene og gjenværende RBC sendes til to runder hypotonisk lyse (J-M). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
3. Forberedelse for nøytrofil aktivering
- I 1,5 ml mikrorør, forberede et aktiveringssystem for hver tilstand slik at den endelige cellekonsentrasjonen er 6,600 celler / μL. For eksempel, for å teste effekten av 100 nM fMLP (N-formyl-metionyl-leucyl-fenylalanin; se materialfortegnelse), tilsett 5 μL av 10 μM fMLP til 495 μL av 6,667 celle / μL-suspensjonen. For negativ (ustimulert) kontroll, tilsett HBSS som inneholder Ca2+ og Mg2+.
MERK: For å demonstrere denne metoden ble følgende endelige konsentrasjoner av stimuli brukt: 100 nM fMLP, 16 μM fallaksin, et naturlig forekommende antimikrobielt peptid14 og 100 nM PMA (phorbol 12-myristat 13-acetat) (se materialfortegnelse). - Inkuber ved 37 °C uten rotasjon.
MERK: Alle alikoter for funksjonelle analyser er hentet fra denne cellesuspensjonen, heretter kalt aktiveringssystemet.
4. Nitrotetrazoliumblåklorid (NBT) analyse for evaluering av ROS-produksjon
- Forberedelse av NBT-arbeidsløsning: For hver eksperimentell tilstand, lag en NBT (se materialtabell) arbeidsløsning på 6 mM ved å bruke følgende trinn:
- Løs opp 0,0005 g NBT i 10 μL dimetylsulfoksid (DMSO) og virvel i minst 15 minutter.
- Tilsett 90 μL HBSS Ca2+Mg2+ og vortex opptil 2 min.
MERK: Alle trinn som involverer NBT må utføres i mørket.
- Utfør NBT-lysbildetest.
- Etter 20 minutter med celleaktivering, bland forsiktig cellesuspensjonen og overfør forsiktig 2 μL PMN til et rent glassglass. Inkuber i 20 minutter i et fuktet kammer ved 37 °C.
MERK: Ikke spre cellesuspensjonen for mye over lysbildet; Ellers kan det tørke ut før inkubering. - Legg 1 μL av NBT-arbeidsløsningen over cellene og inkuber videre i 20 minutter beskyttet mot lys.
- Tørk lysbildet med varmluft og fest det med en dråpe metanol i hver brønn i 1 min. Beis med 0,03% safranin (se materialfortegnelse) i 1 min.
- Vask glasslysbildet forsiktig med destillert vann.
- La lysbildet lufttørke og observere under et mikroskop.
- Telle 100 tilfeldige celler i hver brønn, differensiere nøytrofiler med og uten formazan innskudd.
- Etter 20 minutter med celleaktivering, bland forsiktig cellesuspensjonen og overfør forsiktig 2 μL PMN til et rent glassglass. Inkuber i 20 minutter i et fuktet kammer ved 37 °C.
- Utføre NBT-spektrofotometrianalyse.
- Etter 40 minutter med celleaktivering, bland cellesuspensjonen forsiktig og overfør 90 μL PMN fra aktiveringssystemet til et rent mikrorør. Deretter tilsettes du forsiktig 20 μL av 6 mM NBT-løsningen. Rug i mørket i 20 minutter ved 37 °C.
- Tilsett 100 μL 10 % natriumdodecylsulfat (SDS; se materialfortegnelse) og virvel.
- Sonikere ved hjelp av en spiss-sonikator med en amplitude på 60%, fem sykluser på 15 s hver med 15 s intervaller. Sentrifuge ved 12 000 x g i 5 min.
- Overfør 60 μL av supernatanten til en klar bunnplate med 96 brønner og mål absorbansen til formazan-produktet ved 570 nm.
5. Fagocytose analyse
- Forbered en 33 000 gjær / μL suspensjon for hver tilstand, som beskrevet nedenfor:
- Tilsett ca. 0,75 mg tørrgjær (Saccharomyces cerevisiae; se materialfortegnelse) til 200 μl HBSS Ca2+Mg2+ og inkuber i en thermomixer ved 100 °C med 500 rpm i minst 15 minutter.
- Homogeniser blandingen ved vortexing og overfør 5 μL gjærsuspensjon til 45 μL av 0,2% trypanblått fargestoff. Tell gjærene ved hjelp av et Neubauer-kammer.
- Juster konsentrasjonen av den opprinnelige suspensjonen til 33 000 gjærceller/μL ved bruk av HBSS Ca2+Mg2+. Oppbevar suspensjonen på is til bruk.
- Etter 20 minutter med celleaktivering, bland cellesuspensjonen forsiktig og overfør 5 μL av aktiveringssystemet til 5 μL av 33 000 gjær/μL Saccharomyces cerevisiae-suspensjonen i et nytt sterilt mikrorør.
MERK: Forholdet mellom nøytrofil og gjær er 1:5 (PMN:gjær). - Overfør umiddelbart 6 μL av PMN/gjærsuspensjonen til tre brønner med et rent glassglass (2 μL hver) og inkuber lysbildet i et fuktet kammer i 40 minutter.
MERK: Ikke spre cellesuspensjonen for mye over lysbildet; Ellers kan det tørke ut før inkubasjon. - Tørk lysbildet under varm luft og beis med rask panoptikk, som beskrevet i trinn 2.9 ovenfor.
MERK: Det tredje trinnet i den raske panoptiske fargingen er avgjørende for mikroskopianalysen av lysbildet. Farging av lysbildet i ≥3 s på dette trinnet kan gjøre det uegnet til analyse, siden det vil være vanskelig å skille gjær fra nøytrofile nukleære lober. - Observer lysbildene under mikroskopet, telle 100 tilfeldige nøytrofiler av hver brønn og diskriminere mellom PMNs positive og negative for fagocytose.
MERK: Minst en gjærpartikkel i eller i direkte kontakt med PMN-cellemembranen indikerer en PMN-positiv for fagocytose. Hvis du er interessert i gjær / nøytrofilforholdet, teller antall gjærpartikler oppslukt også.
6. Analyse av PMN-kjemotaksis i sanntid
MERK: Migrasjonsanalysen utføres på samme måte som protokollen beskrevet tidligere15, med følgende tilpasninger:
- Forbered den kjemotaktiske gradienten ved å legge til 160 μL kjemoattraktant (f.eks. fMLP, IL-8, C5 eller LTB4; se materialfortegnelse) til det nedre kammeret i en impedansbasert sanntidscelleanalysator (RTCA) plate. For negative kontroller og tomme verdier, tilsett 160 μL HBSS Ca2+Mg2+.
- Fest det øvre kammeret og tilsett 25 μL HBSS Ca2+Mg2+. Inkuber ved romtemperatur i minst 1 time for å danne den kjemotaktiske gradienten.
- Etter 60 minutter med celleaktivering, bland cellesuspensjonen forsiktig og plasser 60 μL cellesuspensjon i det øvre kammeret. Tilsett 60 μL HBSS Ca2+Mg2+ til blankt.
- Plasser RTCA-platen og programmer RTCA-programvaren til å måle celleindeksen (CI) hver 60. s i 2 timer.
MERK: RTCA-platene kan vaskes for gjenbruk som tidligere beskrevet16. Oppsummert, vask RTCA-kamrene og elektrodene med fosfat-buferred saltvann (PBS) tre ganger, deretter med type I ultrarent vann to ganger. Inkuber nedre og øvre kammer med 0,25% trypsin 0,53 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) i 40 minutter. Vask med ultrarent vann tre ganger.
7. NET suggestiv analyse
- Etter 10 minutter med celleaktivering, bland forsiktig cellesuspensjonen og overfør 4 μL av PMNene fra hvert aktiveringssystem under evaluering, delt inn i to brønner med et rent glassglass. Inkuber i et fuktet kammer ved 37 °C i 30 minutter.
- Tilsett 1 μL DNAse I til en av brønnene og inkuber i 20 minutter ved 37 °C (i et vått kammer).
- Tørk lysbildet og flekken med rask panoptikk, som tidligere beskrevet i trinn 2.9 i avsnittet "Nøytrofil isolasjon".
- Evaluer lysbildene under et mikroskop.
MERK: Se etter en indikasjon på NET-utgivelse, preget av tilstedeværelsen av weblignende strukturer. Når det er identifisert, bekreft om DNAse I-behandlingen var i stand til å fjerne slike strukturer. Denne analysen tyder på NET-dannelse, da det kreves ytterligere tester for å bekrefte deres tilstedeværelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den tetthetsbaserte isolasjonsmetoden som ble brukt i denne studien (figur 1) oppfylte kriteriene for de foreslåtte forsøkene. Nøytrofile parametere oppnådd fra denne metoden inkluderte levedyktighet ≥98%, renhet ≥94% og celleutbytte ≥1,5 x 107, uten aktivering detekterbar ved screeningtestene. To relevante trinn i isolering av PMN er antikoagulasjon og fjerning av RBC. Å holde det antikoagulerte blodrøret eller sprøyten ved en mild gynging før lagdeling over tetthetsgradienten og velge en RBC-fjerningsmetode for å forhindre både aktivering og forurensning, kan påvirke eksperimentets utbytte og reproduserbarhet.
For å vurdere den funksjonelle oversikten over nøytrofilfunksjonen ble det utviklet en arbeidsflyt som gjorde det mulig å utføre de foreslåtte screeninganalysene med minst to forskere på en gjennomsnittlig tid på 4 timer, med 1 time aktivering og 2 timer sanntids migrasjonsovervåking, som vist i figur 2.
Figur 2: Arbeidsflyten for NeutroFun Screen. For å vurdere panelet av funksjonelle responser utløst av spesifikke forhold under evaluering, inkluderer NeutroFun Screen-arbeidsflyten deltakelse av minst to forskere. Forsker 1 (R1) starter PMN-isolasjonsprosessen, etterfulgt av cellekonsentrasjonsjustering og inkubasjon av aktiveringssystemet, mens parallelt forbereder forsker 2 (R2) materialene for å utføre de neste analysene, som er delt mellom de to: R1 utfører fagocytose, NET og spektrofotometriske NBT-analyser; R2 utfører sanntidsmigrasjon og NBT-lysbildetester. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Den klassiske NBT-analysen17 ble optimalisert for både lysbilde- og spektrofotometrisk vurdering av formazanformasjonen som følge av reaksjonen av NBT med ROS generert av PMN. Den spektrofotometriske analysen tillot relativ kvantifisering mellom forhold, mens mikroskopianalysen var nyttig for beskrivende og semi-kvantitativ analyse, evaluering av regelmessigheten av krystallfordeling, morfologi og antall celler som inneholder formazan. Resultatene av den spektrofotometriske analysen er vist i figur 3A, noe som indikerer at 100 nM PMA induserte forhøyet ROS-produksjon (i et gjennomsnittlig forhold på 3:2:1) sammenlignet med fMLP og kontrollgruppen. NBT-lysbildetestresultatene (figur 3B) bekreftet de spektrofotometriske resultatene, og viste også PMA som den mest intense ROS-produksjonsinduserende stimulansen sammenlignet med fMLP (figur 3C), som tidligere demonstrert ved direkte måling av ROS ved cytometri18. Når det gjelder celletelling, viste antall nøytrofiler som inneholdt formazankrystaller et forhold på 7: 4: 1 i PMA: fMLP: kontrollforholdene, og avslørte også forskjellige formazan-distribusjonsmønstre mellom fMLP og PMA-aktiverte PMN; fMLP-behandling resulterte i intensivt aktiverte individuelle celler, mens PMA induserte dannelsen av formazankrystaller spredt over cytoplasma i de fleste PMN. Videre ble det observert noen morfologiske karakteristika som differensierte tilstandene, som ekspressiv celleaggregering etter PMA-behandling. Fraværet av slike typiske aktiveringsegenskaper og lave nivåer av formazan på kontrollgruppen indikerte at hviletilstanden ikke var signifikant forstyrret. Derfor viste NBT-analysen seg å være en enkel, billig og pålitelig test for nøytrofil ROS-produksjon som kan brukes til å kontrollere kapasiteten og intensiteten til en gitt stimulus for å indusere ROS-produksjon.
Figur 3: NBT-test. (A) Den spektrofotometriske vurderingen av nøytrofilt respirasjonsbrudd til forskjellige forhold (negativ kontroll: 100 nM fMLP og 100 nM PMA) ved formazanabsorbans (490-630 nm). Data fra fire donorer er presentert som gjennomsnitt ± standardavvik (SD). * = alle grupper er forskjellige fra hverandre (s≤ 0,05); £ = Sammenligningene CTRL versus PMA og fMLP versus PMA viser signifikante forskjeller (s≤ 0,05). (B) Lysbildetesten kan analyseres kvalitativt, karakteriserer intensiteten av formazan-innskudd, dens plassering i cellen og celleaggregeringen. Svarte piler peker på formazankrystaller. Skalasøyler: 20 μm. (C) Antall PMN-er som inneholder formazan, regnet ved optisk mikroskopi. Data fra åtte donorer presentert som gjennomsnitt ± SD. *** p < 0,0001, Student t-test. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Fagocytosebildene ble brukt til å bestemme fagocytoseraten i prosent av nøytrofile som utførte fagocytose, som vist i figur 4. Selv om både 100 nM fMLP og 16 μM antimikrobielt peptid induserte en tilsynelatende økt gjæroppslukning, var forskjellen ikke statistisk signifikant før den doble stimuleringen, noe som signifikant forbedret fagocytosen sammenlignet med kontrollgruppen og kan tyde på en respons ved dobbel stimulering.
Figur 4 Fagocytosetest. Nøytrofile granulocytter ble evaluert etter deres fagocytosekapasitet (telling av nøytrofiler som inneholder gjær). Selv om eksponeringen for 100 nM fMLP eller et 16 μM antimikrobielt peptid før gjærinkubasjon økte fagocytosen sammenlignet med kontrollgruppen, (A) var økningen ikke statistisk signifikant. Interessant nok resulterte en innledende inkubasjon med fMLP, etterfulgt av tilsetning av det antimikrobielle peptidet, i signifikant forbedret fagocytose hos humane nøytrofiler (stjerne mellom CTRL og fMLP+ antimikrobielt peptid). (B) Svarte piler viser gjærceller, grønne piler viser nøytrofiler alene, og røde piler peker på fagocytoserende nøytrofiler. Data fra fem givere presentert som gjennomsnitt ± SD. Skala barer: 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Et eksempel på sanntids cellemigrasjonsresultater er vist i figur 5, som viser den velkjente kjemotaktiske effekten av 100 nM fMLP på nøytrofiler. Cellemigrasjonskinetikken ble justert til Gompertz-modellen, noe som gjorde det mulig å sammenligne parametrene.
Figur 5: Cellemigrasjon i sanntid. Celleindeksen reflekterer den elektriske impedansen som følge av cellemigrasjon. I denne analysen ble fMLP brukt som en positiv kontroll av nøytrofil migrasjon ved å legge til 100 nM fMLP til det nedre kammeret. Negativ kontroll (CTRL) inneholdt kun HBSS i nedre kammer. De overlagrede kurvene representerer kurven som passer til Gompertz-modellen, modifisert for å passe best mulig til stigende og synkende bakker. Data fra tre donorer, presentert som gjennomsnitt ± SD.* p < 0,05, Student t-test. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Til slutt presenteres en enkel optisk mikroskopitest som tyder på tilstedeværelsen av NET, hvor PMNene er farget med rask panoptikk. Det er mulig å observere at for noen spesifikke NET-induserende stimuli, som PMA eller noen antimikrobielle peptider, selv etter kort aktiveringstid (1 time) er det mulig å observere trådformede nettlignende strukturer nær cellene, mens dette ikke er mulig under andre forhold som negativ kontroll og fMLP (figur 6). For bedre å støtte denne påstanden ble DNase I lagt til etter 40 minutters celleaktivering med 100 nm PMA eller et antimikrobielt peptid, og fjernet de NET-lignende strukturene (figur 6). Selv om denne metoden ikke er egnet for NET-karakterisering og kan påvirkes av artefakter, er det et billig, enkelt og interessant utgangspunkt for å rettferdiggjøre ytterligere investeringer i å analysere NET, spesielt i sammenhenger der effekten av stimuli er ukjent eller dårlig beskrevet.
Figur 6: NET-formasjon suggestiv analyse. En kvalitativ analyse av panoptisk-farget nøytrofiler etter 1 time med aktivering over et glassglass kan indikere NET-frigjøring. CTRL (A,B) og fMLP (C,D)-gruppene viste ingen indikasjon på NET-frigjøring, mens aktivering med PMA (E-H) induserte dannelse av NET-lignende strukturer som ble degradert av DNase I-behandling (I-L). Undersøkelse av effekten av et antimikrobielt peptid på nøytrofilene viste at en slik stimulus kunne fremkalle NET-frigjøring, siden lysbildene presenterte NET-lignende strukturer (M-P) som ble nedbrutt av DNase I (Q-T). Røde piler peker på NET-lignende strukturer. Skala barer: 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nøytrofiler er svært dynamiske og responsive celler som er kortvarige og ennå ikke kan kryopreserveres19, noe som gjør undersøkelser av deres biologi utfordrende. Derfor er det viktig å følge nøye skritt for å oppnå levedyktige, berikede og hvilende nøytrofiler11,20. Denne studien benyttet en tetthetsbasert isolasjonsteknikk som legger vekt på mild og minimal manipulasjon, samt bruk av lave temperaturer frem til aktiveringstrinnet. I tillegg må blodbehandling skje innen 30 minutter etter venepunktur og oppbevares ved romtemperatur. Det nåværende arbeidet presenterer et alternativ for å redusere manipulasjonsstress og eksperimenttid. For å forenkle prosessen ytterligere, introduserte vi et nytt trinn (som et alternativ) i protokollen, som innebærer å fjerne RBC ved forsiktig resuspensjon og aspirasjon av RBC-laget etter en enkelt hemolyseprosedyre. Dette trinnet reduserer manipulasjonsstress og eksperimenttid, da det fjerner flertallet av RBC med bare ett hypotonisk hemolysetrinn. Det skal imidlertid bemerkes at operatørferdigheter i stor grad påvirker effektiviteten til dette trinnet, og det kan ikke alltid helt fjerne RBC. Videre kan RBC-aspirasjon føre til tap av nøytrofiler, men dette påvirker ikke utbyttet, da flere nøytrofiler opprinnelig ble gjenvunnet fra gradienten når de samlet seg nærmere RBC-laget. Derfor anbefales RBC-aspirasjon hvis analysene ikke krever høyest mulig renhet, eller hvis operatøren har hatt konsekvent gode resultater. For screeningtestene som presenteres her, vil en liten mengde forurensnings-RBC (<3%) ikke forstyrre resultatene.
For å sikre at alle prosedyrene utføres i rett tid, inkludert reagensklargjøring, presenteres en arbeidsflyt (figur 2) som beskriver tidslinjen og oppgavefordelingen mellom to forskere. Etter at alle funksjonelle analyser er ferdige, kan de gjenværende cellene fremstilles for videre molekylære undersøkelser, som omics-studier ved cellelyse med riktig lysisbuffer og lagring.
ROS-produksjon
Respiratorisk utbrudd er et kjennetegn på nøytrofil priming og aktivering 18,21, og evaluering av ROS-produksjon er en vanlig metode som brukes til å estimere aktiveringsstatusen til nøytrofiler. Denne studien evaluerte ROS-produksjon ved hjelp av to tilnærminger: optisk mikroskopi og spektrofotometri.
NBT-testen er en velkjent tilnærming for å vurdere respiratorisk utbrudd i nøytrofiler22,23. To vanlige metoder er den optiske mikroskopibaserte (eller lysbildetest) og spektrofotometribaserte analyser 24,25,26. Selv om optisk mikroskopi tillater visualisering av detaljer på cellenivå, er det utsatt for brukerskjevhet. Derfor fungerer NBT-lysbildetesten som et kvalitativt supplement til den spektrofotometriske analysen angående fenotypiske egenskaper, for eksempel formazanformasjonsmønstre, intensitet og celleaggregering.
De kritiske trinnene for både NBT-lysbildet og spektrofotometriske tester er NBT og formazan fullstendig oppløselighet. I motsetning til produsentens anbefalinger, oppløses NBT ikke godt i vann. Imidlertid gir homogenisering av NBT i DMSO i minst 15 min og deretter tilsetning av vann / HBSS og vortexing i 2 min fullstendig oppløseliggjøring. I tillegg, for å analysere absorbansen av formazan, må to kritiske trinn oppnås: (1) frigjøring av formazankrystaller fra celler ved PMN-lyse og (2) fullstendig oppløseliggjøring av formazankrystaller. Begge trinnene ble oppnådd ved å behandle cellepelleten med 10% SDS, som nylig foreslått27, etterfulgt av sonikering og absorbansanalyse av supernatanten ved 570 nm.
Videre er NBT-resultatene fra de negative og positive kontrollgruppene det første trinnet i screeningen som skal vurderes. Dette trinnet må vise en bemerkelsesverdig forskjell, siden ROS-produksjonsevaluering gjennom formazan indikerer om isolasjonsprosessen kan ha vært ansvarlig for uønskede endringer i hvilestatusen til cellene enten ved stimulering eller inhibering.
Andre metoder, som cytokrom c-reduksjon28 eller flowcytometri29-analyse, brukes ofte til ROS-deteksjon; Men vurderer en screening-tilnærming, krever søknaden deres en lengre eksperimenttid, bruk av spesifikke markører og dyre instrumenter. Kjemiluminescens av luminol / isoluminol er en rask og kostnadseffektiv metode for å oppdage ROS samtidig som det tillater differensiering av intra- og ekstracellulær ROS. Imidlertid kreves et luminometer for denne metoden30,31. Selv om instrumentkostnaden kunne omgås ved bruk av en innretning, ville den likevel være uegnet for en screeninganalyse utført samtidig med andre analyser.
Fagocytose
PMN / gjærinkubasjonen gir en oversikt over nøytrofil fagocytosekapasitet og effekt ved å telle antall nøytrofiler som utfører fagocytose og antall gjær oppslukt per nøytrofil. Men siden gjærpartikkelen i seg selv er et aktiveringssignal, utgjør sammenligning av kontrollgruppen med forbehandlet PMN et dobbelt stimuleringssystem, som kanskje ikke viser signifikante endringer, som vist i CTRL versus fMLP-behandlet PMN (figur 4). Likevel er denne analysen nyttig for å indikere om en potensiell modulator vil generere noen innvirkning på fagocytose. Et nytt antimikrobielt peptid ble testet ved hjelp av denne analysen, og resultatene indikerer en interessant potensiell respons på denne kombinasjonen av stimuli, som nylig har blitt diskutert som nødvendig for effektiv aktivering32.
Det kritiske trinnet for denne analysen er fargingen, da analysen blir upålitelig hvis lysbildet holdes på panoptisk nr. 3 (hematoksylin) i ≥3 s. Dette skyldes at gjærcellene og de nøytrofile nukleære lobene ikke kan skilles fra hverandre. Videre tillater denne tilnærmingen morfologianalysen av nøytrofiler etter eksponering for modulatorer. Flowcytometri er en annen effektiv teknikk for å analysere fagocytose33, selv om den har begrensninger gjennom vanskeligheten med å diskriminere mellom membranbundne og oppslukte partikler og andre faktorer relatert til det foreslåtte screeningsettet, som diskutert i forrige emne. Den samme begrensningen er observert i metoden beskrevet her, selv om dette skal betraktes som en innledende screening for å veilede oppfølgingsstudier.
Migrering i sanntid
Screeningprotokollen i sanntid ble optimalisert for å evaluere migrasjonskapasiteten til PMN-er. Selv om en tidligere studie antydet at belegg på undersiden av RTCA-platen var nødvendig for at migrasjonsanalysen skulle vise en forskjell mellom den negative kontrollen og IL-8-behandling15, viste denne studien høye konfidensintervallverdier (CI) for fMLP-behandlede celler uten tilsetning av beleggmidler. Resultatene ga høy reproduserbarhet med betydelig migrasjon fra 12 minutter og oppover. Videre kan kurvetilpasningsanalyse av de oppnådde migrasjonsdataene avsløre parametere, for eksempel celleindeksmaksimum samt økning og reduksjon av helning, som er nyttige for å forstå migrasjonsdynamikken, og kan avhenge av konsentrasjon eller avvike mellom forhold. Den beste tilpasningen for nøytrofile migrasjonskurver (figur 5) var den justerte Gompertz-funksjonen34, som viste at fMLP øker maksimal celleindeks og økt helning.
Spesiell oppmerksomhet er nødvendig for å unngå bobler i RTCA-systemet, da de kan blokkere cellene som passerer gjennom elektrodene, noe som kompromitterer eksperimentet. En begrensende faktor er den høye prisen på platene. Selv om billigere teknikker analyserer cellemigrasjon, mangler de god reproduserbarhet eller er vanskelige og tidkrevende, for eksempel Boyden-kammeret35. Derfor er RTCA en pålitelig migrasjonsanalyse som er kompatibel med de andre screeningtestene som presenteres her.
Garn
Til slutt ble en lovende, enkel og rimelig analyse for en foreløpig evaluering av NET-dannelse utviklet ved hjelp av optisk mikroskopi. Det ble avledet fra observasjon av fagocytose-lysbilder, hvor PMA, en spesifikk NET-induserende stimulus testet for sin effekt på fagocytosekapasitet, også induserte en nettlignende strukturdannelse sammenlignet med CTRL- og fMLP-gruppene. Dette arbeidet antydet at disse strukturene kunne indikere NET-utgivelse. En slik hypotese ble testet ved å behandle prøvene med DNase I etter aktivering, hvor det ikke ble funnet filamentøse strukturer i PMA-aktiverte nøytrofiler. Antagelsen om at slike strukturer sannsynligvis er NET er basert på det faktum at PMA er sitert som en velkjent induktor av NET-dannelse36,37, funn av lignende strukturer ved fluorescensmikroskopi ved bruk av spesifikke markører for NET38,39 og nedbrytning av NET katalysert av DNase I40,41. Det er viktig å understreke at dette ikke er en metode for bekreftelse av NET-dannelse, men bare en foreløpig screening som antyder tilstedeværelse av NET. Selv om denne testen har begrensninger, da NET kan forveksles med fargeartefakter, tjener den et relevant formål ved å foreslå NET-dannelse i en rask og rimelig screening som kan utføres sammen med andre funksjonstester. Når det er oppdaget som mulig relevant for studien som screenes, kan NET evalueres videre ved konfokal- eller elektronmikroskopi42, som diskutert senere.
I vårt laboratorium blir nye antimikrobielle peptider, som også sannsynligvis har immunmodulerende aktiviteter, ofte evaluert av dette settet med screeningsanalyser for bedre å veilede videre analyse av effekten av noen peptider på humane nøytrofiler, da noen viser interessante ROS43, fagocytose, migrasjon og / eller NET-modulerende egenskaper.
Avslutningsvis tilbyr NeutroFun Screen et verdifullt verktøy for å identifisere potensielle modulatorer av nøytrofil aktivitet med normal tetthet fra et stort antall uprøvde forbindelser. Det er imidlertid viktig å merke seg at denne metoden bare fungerer som en foreløpig screening. Etter denne innledende screeningen kan dyrere, avanserte og tidkrevende metoder rettes til spesifikke funksjoner eller veier foreslått av disse første resultatene for datavalidering. For ROS-produksjon, fagocytose og NET-dannelse finnes det alternative metoder for datavalidering og for å oppnå ytterligere kvantitative resultater. NET-visualisering og kvantifisering kan utføres gjennom immunfluorescensmikroskopianalyse, som bestemmer tilstedeværelsen og overlappingen av ekstracellulære DNA- og granulatproteiner, som myeloperoksidase og nøytrofil elastase, som beskrevet i detalj nylig42. ROS spiller forskjellige avgjørende roller i mange biologiske prosesser, og derfor er studien svært utbredt og mangfoldig. Blant de mest etablerte metodene er de som benytter antistoffer, for eksempel enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) og immunoblotting av luminescens, eller fluorescensdeteksjon - som flowcytometri av celler under forskjellig merking - gjennom DCFDA, EPR-spektroskopi og enzymatiske aktivitetsmålinger44. På samme måte gjøres robust fagocytoseevaluering også på flere måter; De alternative metodene er flowcytometri alene45,46 eller kombinert med fluorescensmikroskopi47. Den beskrevne sanntidscellemigrasjonen er en robust og tilstrekkelig analyse som ikke krever ytterligere validering og presenterer parametere som andre metoder ikke kan tenke på. Andre kombinasjoner av slike metoder kan passe bedre til spesifikke scenarier, men oppsummert representerer dette en rask og rimelig kombinasjon som omfatter mange nøytrofile aktiviteter.
Oppsummert har denne studien som mål å gi et sett med analyser bestående av enkle, raske og rimelige metoder for å evaluere flere nøytrofile responser på nye molekyler og forhold som en måte å bedre rette innsatsen mot avanserte metoder. Som store begrensninger bør resultatene fra ROS-, NET- og fagocytoseanalyser betraktes som foreløpige og trenger ytterligere validering ved mer spesifikke og forseggjorte analyser, og de som er avhengige av ikke-automatisert mikroskopicelletall er utsatt for ubevisst skjevhet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Forfatterne anerkjenner følgende finansieringsorganer: FAPDF, CNPq, CAPES, UnB, FINEP og FINATEC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CIM-Plate 16 | Agilent | 5665825001 | |
| CLARIOstar Plate Reader | BMG LABTECH | US Patent Number 9,733,124 Product details: MARS Data Analysis Software |
|
| Dimethyl sulfoxide | Dinâmica | 1582 | |
| DNAse I | Sigma - Aldrich | DN 25 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma - Aldrich | E5134 | |
| Fast panoptic stain | Laborclin | 620529 | |
| Glass slide | Exacta | 7102 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution with calcium, with magnesium, without phenol red. | Sigma - Aldrich | 55037C | |
| Hank’s Balanced Salt Solution without calcium chloride, magnesium sulfate and sodium bicarbonate. | Sigma - Aldrich | H4641 | |
| Heparin | Blau | 7896014655229 | |
| Laminar flow cabinet | Veco | VLFS-12 | |
| Microscope | Zeiss | 415501-0101-002 | Product details: Primostar 1 |
| Mixing Block | BIOER | MB-102 | |
| Neubauer improved bright-lined | New Optik | 1110000 | |
| N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine | Sigma - Aldrich | F3506 | |
| Nitroblue tetrazolium | Neon | CAS 298-83-9 | |
| Percoll | Cytiva | 17089101 | separation media |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma - Aldrich | P8139 | |
| Phosphate buffered saline tablet | Sigma - Aldrich | P4417 | |
| ROTOFIX 32 A | Hettich | 1206 | |
| Saccharomyces cerevisiae | Fleischmann | ||
| Safranin | Sigma - Aldrich | 50240 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Cytiva | 17-1313-01 | |
| Sonicator | Qsonica | Q125 | |
| Trypan blue solution | Vetec | C.I. 23850 | |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries, Inc. | 0K-0500-902 | |
| xCELLigence Real-Time Cell Analysis (RTCA) DP (dual purpose) | Agilent | 380601050 | Product details: RTCA system composed of detection hardware, cell plates and software |
References
- Nauseef, W. M., Borregaard, N.
- Groeneweg, L., Hidalgo, A. Emerging roles of infiltrating granulocytes and monocytes in homeostasis. Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (19), 3823-3830 (2020).
- Rosales, C., Lowell, C. A., Schnoor, M., Uribe-Querol, E. Neutrophils: their role in innate and adaptive immunity 2017. Journal of Immunology Research. 2017, 9748345 (2017).
- Castro, M., et al. Proteome analysis of resting human neutrophils. Protein & Peptide Letters. 13 (5), 481-487 (2006).
- Li, Y., et al. The regulatory roles of neutrophils in adaptive immunity. Cell Communication and Signaling. 17, 147 (2019).
- de Oliveira, S., Rosowski, E. E., Huttenlocher, A. Neutrophil migration in infection and wound repair: going forward in reverse. Nature Reviews Immunology. 16 (6), 378-391 (2016).
- Burn, G. L., Foti, A., Marsman, G., Patel, D. F., Zychlinsky, A.
- El-Benna, J., et al. Priming of the neutrophil respiratory burst: role in host defense and inflammation. Immunological Reviews. 273 (1), 180-193 (2016).
- Castro, M. S., Cilli, E. M., Fontes, W. Combinatorial synthesis and directed evolution applied to the production of alpha-helix forming antimicrobial peptides analogues. Current Protein & Peptide Science. 7 (6), 473-478 (2006).
- Mihaila, A. C., et al. Transcriptional profiling and functional analysis of N1/N2 neutrophils reveal an immunomodulatory effect of S100A9-blockade on the pro-inflammatory N1 subpopulation. Frontiers in Immunology. 12, 708770 (2021).
- Kuhns, D. B., Priel, D. A. L., Chu, J., Zarember, K. A. Isolation and functional analysis of human neutrophils. Current Protocols in Immunology. 111 (1), 7-23 (2015).
- Paulíková, E., Kociková, A., Sabol, M. Modification of a panoptic method of staining isolated cells. Bratislavske Lekarske Listy. 94 (12), 638-640 (1993).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111 (1), 1-3 (2015).
- Libério, M. S., et al. Anti-proliferative and cytotoxic activity of pentadactylin isolated from Leptodactylus labyrinthicus on melanoma cells. Amino Acids. 40 (1), 51-59 (2011).
- Cano, P. M., Vargas, A., Lavoie, J. P. A real-time assay for neutrophil chemotaxis. BioTechniques. 60 (5), 245-251 (2016).
- Stefanowicz-Hajduk, J., Adamska, A., Bartoszewski, R., Ochocka, J. R. Reuse of E-plate cell sensor arrays in the xCELLigence Real-Time Cell Analyzer. BioTechniques. 61 (3), 117-122 (2016).
- Björkstén, B., Nyström, K., Lindqvist, B. The nitroblue tetrazolium (NBT) test in endemic benign (epidemic) nephropathy. Acta Medica Scandinavica. 199 (1-6), 147-150 (1976).
- Aquino, E., et al. Proteomic analysis of neutrophil priming by PAF. Protein & Peptide Letters. 23 (2), 142-151 (2016).
- Blanter, M., Gouwy, M., Struyf, S. Studying neutrophil function in vitro: cell models and environmental factors. Journal of Inflammation Research. 14, 141-162 (2021).
- Hsu, A. Y., Peng, Z., Luo, H., Loison, F. Isolation of human neutrophils from whole blood and buffy coats. Journal of Visualized Experiments. (175), e62837 (2021).
- Moghadam, Z. M., Henneke, P., Kolter, J. From flies to men: ROS and the NADPH oxidase in phagocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 628991 (2021).
- Pattan, S. S., Bhat, K. G., Pattar, G. D., Kuntagi, M. Comparison of three different techniques for isolation of neutrophils from blood and their utility in performing nitroblue tetrazolium test. International Journal of Basic and Applied Physiology. 8 (1), 41 (2019).
- Gooty, J. R., Shashirekha, A., Guntakala, V. R., Palaparthi, R. Estimation of phagocytic activity of polymorphonuclear leukocytes in chronic and aggressive periodontitis patients with nitroblue tetrazolium test. Journal of Indian Society of Periodontology. 23 (4), 316 (2019).
- Langer, S., et al. Clinical and laboratory profiles of 17 cases of chronic granulomatous disease in north India. Indian Journal of Hematology and Blood Transfusion. 37 (1), 45-51 (2021).
- Oualha, R., et al. Infection of human neutrophils with Leishmania infantum or Leishmania major strains triggers activation and differential cytokines release. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 9, 153 (2019).
- Zilinskas, J., Zekonis, J., Zekonis, G., Valantiejiene, A., Periokaite, R. The reduction of nitroblue tetrazolium by total blood in periodontitis patients and the aged. Stomatologijal. 9 (4), 105-108 (2007).
- Benov, L. Improved formazan dissolution for bacterial MTT assay. Microbiology Spectrum. 9 (3), e01637 (2021).
- Chen, Y., Junger, W. G.
- Richardson, M. P., Ayliffe, M. J., Helbert, M., Davies, E. G. A simple flow cytometry assay using dihydrorhodamine for the measurement of the neutrophil respiratory burst in whole blood: comparison with the quantitative nitrobluetetrazolium test. Journal of Immunological Methods. 219 (1-2), 187-193 (1998).
- Jancinová, V., et al. The combined luminol/isoluminol chemiluminescence method for differentiating between extracellular and intracellular oxidant production by neutrophils. Redox Report. 11 (3), 110-116 (2006).
- Nosál, R., et al. Pharmacological intervention with oxidative burst in human neutrophils. Interdisciplinary Toxicology. 10 (2), 56-60 (2017).
- Mol, S., et al. Efficient neutrophil activation requires two simultaneous activating stimuli. International Journal of Molecular Sciences. 22 (18), 10106 (2021).
- Schneider, L., et al. Flow cytometry evaluation of CD14/CD16 monocyte subpopulations in systemic sclerosis patients: a cross sectional controlled study. Advances in Rheumatology. 61 (1), 27 (2021).
- Akin, E., Pelen, N. N., Tiryaki, I. U., Yalcin, F. Parameter identification for gompertz and logistic dynamic equations. PLoS One. 15 (4), e0230582 (2020).
- Guy, J. B., et al. Evaluation of the cell invasion and migration process: A comparison of the video microscope-based scratch wound assay and the boyden chamber assay. Journal of Visualized Experiments. (129), e56337 (2017).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- de Bont, C. M., Koopman, W. J. H., Boelens, W. C., Pruijn, G. J. M. Stimulus-dependent chromatin dynamics, citrullination, calcium signalling and ROS production during NET formation. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1865, 1621-1629 (2018).
- Masuda, S., et al. Measurement of NET formation in vitro and in vivo by flow cytometry. Cytometry Part A. 91 (8), 822-829 (2017).
- Zharkova, O., et al. A flow cytometry-based assay for high-throughput detection and quantification of neutrophil extracellular traps in mixed cell populations. Cytometry Part A. 95 (3), 268-278 (2019).
- Hosseinnejad, A., et al. DNase I functional microgels for neutrophil extracellular trap disruption. Biomaterials Science. 10 (1), 85-99 (2022).
- Chrysanthopoulou, A., et al. Neutrophil extracellular traps promote differentiation and function of fibroblasts. The Journal of Pathology. 233 (3), 294-307 (2014).
- Tong, M., Abrahams, V. M. Visualization and quantification of neutrophil extracellular traps. Methods in Molecular Biology. 2255, 87-95 (2021).
- Santana, C. J. C., et al. Biological properties of a novel multifunctional host defense peptide from the skin secretion of the chaco tree frog, boana raniceps. Biomolecules. 10 (5), 790 (2020).
- Murphy, M. P., et al. Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo. Nature Metabolism. 4 (6), 651-662 (2022).
- Boero, E., et al. Use of flow cytometry to evaluate phagocytosis of staphylococcus aureus by human neutrophils. Frontiers in Immunology. 12, 635825 (2021).
- Karsten, C. B., et al. A versatile high-throughput assay to characterize antibody-mediated neutrophil phagocytosis. Journal of Immunological Methods. 471, 46-56 (2019).
- Smirnov, A., Solga, M. D., Lannigan, J., Criss, A. K. Using imaging flow cytometry to quantify neutrophil phagocytosis. Methods in Molecular Biology. 2087, 127-140 (2020).
