Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

En uppsättning screeningtekniker för en snabb överblick över neutrofilfunktionen

Published: February 9, 2024 doi: 10.3791/65329
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1, 1
1Laboratory of Protein Chemistry and Biochemistry, Department of Cell Biology, University of Brasilia, 2Institute of Physics, University of Brasilia

Summary

Detta protokoll innehåller en uppsättning neutrofila funktionella analyser som ska användas som en screeningmetod för att täcka funktioner från olika signalvägar. Protokollet innehåller en inledande och enkel utvärdering av cellviabilitet, renhet, produktion av reaktiva syreradikaler, realtidsmigration, fagocytos och ett preliminärt förslag på neutrofila extracellulära fällor.

Abstract

Neutrofiler är kända som en av de första försvarslinjerna i det medfödda immunsvaret och kan utföra många speciella cellulära funktioner, såsom kemotaxi, omvänd migration, fagocytos, degranulering av cytotoxiska enzymer och metaboliter och frisättning av DNA som neutrofila extracellulära fällor (NET). Neutrofiler har inte bara en hårt reglerad signalering själva, utan deltar också i regleringen av andra komponenter i immunsystemet. Eftersom färska neutrofiler är terminalt differentierade, kortlivade och mycket varierande mellan individer är det viktigt att få ut det mesta av de insamlade proverna. Forskare behöver ofta utföra screeninganalyser för att bedöma en översikt över de många neutrofila funktioner som kan påverkas av specifika tillstånd som utvärderas. En uppsättning tester efter en enda isoleringsprocess av neutrofiler med normal densitet utvecklades för att tillgodose detta behov, och sökte en balans mellan hastighet, omfattning, kostnad och noggrannhet. Resultaten kan användas för att resonera och vägleda fördjupade uppföljningsstudier. Denna procedur kan utföras på en genomsnittlig tid av 4 timmar och inkluderar utvärdering av cellviabilitet, produktion av reaktiva syreradikaler (ROS), realtidsmigration och fagocytos av jäst på glasskivor, vilket lämnar tillräckligt med celler för mer detaljerade tillvägagångssätt som omics-studier. Dessutom innehåller proceduren ett sätt att enkelt observera ett preliminärt förslag på NET efter snabb panoptisk färgning observerad med ljusmikroskopi, med brist på specifika markörer, om än tillräckligt för att indikera om ytterligare ansträngningar på det sättet skulle vara värda besväret. Mångfalden av testade funktioner kombinerar gemensamma punkter bland testerna, vilket minskar analystiden och kostnaderna. Proceduren fick namnet NeutroFun Screen, och även om den har begränsningar, balanserar den de ovan nämnda faktorerna. Dessutom är syftet med detta arbete inte en definitiv testuppsättning, utan snarare en riktlinje som enkelt kan anpassas till varje labbs resurser och krav.

Introduction

Neutrofiler är de vanligaste medfödda immuncellerna i mänskligt blod och är kända för att spela en viktig roll i infektion och inflammation, eftersom de är de första som kommer till platsen för vävnadsskadan1. Under de senaste åren har det funnits ett växande erkännande av den avgörande roll som neutrofiler spelar i en mängd olika sjukdomar och för att stödja homeostas2. Neutrofiler har inte bara en hårt reglerad signalering själva, utan deltar också i regleringen av andra komponenter i immunsystemet 3,4,5. Därför är det absolut nödvändigt att undersöka neutrofiler och deras många ovanliga cellulära funktioner, såsom kemotaxis, omvänd migration6, fagocytos7, andningsutbrott8 och frisättning av neutrofila extracellulära fällor (NET)7, i många forskningssammanhang där det är nödvändigt att bedöma de potentiella neutrofila funktionella, morfologiska eller molekylära förändringar som utlöses av specifika förhållanden som analyseras.

Nyligen isolerade neutrofiler är terminalt differentierade, kortlivade, mycket dynamiska och lättaktiverade. En effektiv lagringsmetod som inte påverkar neutrofilsvaren har dock ännu inte uppnåtts, vilket gör det utmanande att utföra flera analyser som måste vara oavbrutna. Dessutom kan tidigare beskrivna funktionella analyser10,11, baserade på analyser som kräver cytometri och/eller fluorescerande färgning, inte vara ett genomförbart val när en bred och initial utvärdering av neutrofilen behövs.

För att ta itu med dessa problem beskriver detta protokoll en uppsättning tester som kan utföras efter en enda isoleringsprocess, inklusive utvärdering av cellviabilitet, produktion av reaktiva syreradikaler (ROS), realtidsmigration och fagocytos av Saccharomyces cerevisiae, vars resultat kan användas för att resonera om djupgående uppföljningsstudier. Denna procedur, som kallas NeutroFun Screen, utformades för att omfatta de ledande effektoraktiviteterna, förutom degranulering, och kan slutföras på en genomsnittlig tid av 4 timmar, inklusive 1 timmes aktivering. Dessutom kan de återstående cellerna användas för mer detaljerade metoder som omics-studier. Fördelen med denna metod ligger i dess balans mellan hastighet, omfattning, kostnad och noggrannhet.

Dessutom finns det ett sätt att enkelt observera ett preliminärt förslag på NET, utan specifika markörer, men tillräckligt för att indikera om ytterligare ansträngningar i den riktningen skulle vara värda besväret. Mångfalden av testade funktioner syftar till att kombinera gemensamma punkter mellan testerna, vilket minskar analystiden och kostnaderna. Huvudmålet med denna metod är att tillhandahålla en balanserad, funktionell analys avseende hastighet, omfattning, kostnad och noggrannhet som möjliggör en översikt över neutrofilens svar, vilket gör det till ett användbart första steg för att undersöka effekterna av nya stimuli på neutrofiler med normal densitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla experiment följde strikt de etiska riktlinjer som fastställts av den institutionella granskningsnämnden vid universitetet i Brasilia (process 13364819.0.0000.5558), och proverna identifierades med koder för att säkerställa donatorns anonymitet. Cellerna erhölls från normala friska manliga donatorer i åldern 18-35 år, som undertecknade det informerade samtycket och uppfyllde följande behörighetskriterier: icke-rökare/vejpare, inga kroniska hälsotillstånd och ingen historia av inflammatoriska tillstånd under de senaste 14 dagarna.

1. Insamling av blod

  1. Placera aseptiskt 0,3 ml 5 000 IE/ml heparin (se Materialförteckning) i en steril 20 ml spruta för att heparinisera den.
  2. Applicera ett venöst tryckförband cirka 4 tum ovanför punktionsstället och identifiera mediankubital- eller cefalvenen för venpunktion.
    OBS: Se till att den totala tourniquettiden inte överstiger 1 min.
  3. Rengör stickstället med 70 % alkohol och utför venpunktionen.
  4. Vänd försiktigt sprutan upp och ner tre eller fyra gånger efter att du har samlat upp blodet för att blanda blodet och heparinet ordentligt.

2. Isolering av neutrofila granulocyter

OBS: Polymorfonukleära leukocyter (PMN) isoleras genom densitetsgradientcentrifugering följt av hypoton lys av de återstående röda blodkropparna (RBC), som tidigare beskrivits11 med vissa förändringar. Denna metod är inte obligatorisk för att utföra screeninganalyserna och kan ersättas så länge den valda metoden resulterar i en viabilitet på >97 %, priming eller aktivering av <3 % av PMN:erna och ger tillräckligt med celler för alla analyser, replikat och förhållanden. Att utföra dessa steg under aseptiska förhållanden och använda endotoxinfria lösningar är obligatoriskt för att undvika cellaktivering.

  1. Gör 12 ml spädningar av 60 % och 70 % separationsmedia (finns i handeln, se materialtabell) i 50 ml koniska rör.
  2. Förbered gradienten nedifrån och upp genom att tillsätta 4 ml i taget av 60 % spädning över 70 % utspädning med hjälp av en 5 ml pipett. Gör detta försiktigt för att förhindra att gränssnittet blandas.
  3. Lägg försiktigt 12 ml hepariniserat blod ovanpå densitetsgradienten. Centrifugera vid 200 x g i 15 minuter i rumstemperatur.
    OBS: Från detta steg och framåt, tills PMN-aktivering, måste alla reagenser och rör som används förvaras i en kylare fylld med is.
  4. Kassera plasma-/mononukleära cellskiktet och överför sedan försiktigt skiktet ovanför erytrocytpelleten till två 15 ml koniska rör med cirka 7,5 ml i varje. Fyll rörvolymen med Hanks balanserade saltlösning (HBSS; se materialförteckning).
  5. Centrifugera vid 300 x g i 5 minuter vid 19 °C.
  6. Tvätta cellpelleten med HBSS.
    1. Kassera supernatanten genom att hälla tuben och försiktigt återsuspendera pelleten i 7 ml HBSS.
    2. Centrifugera vid 300 x g i 5 minuter vid 19 °C för att avlägsna alla separationsmedier.
  7. Utför hypoton lys av de återstående röda blodkropparna.
    1. Kassera supernatanten och kombinera pelletsen i ett enda rör.
    2. Återsuspendera RBC/PMN-pelleten i 3 ml steril H2O och tillsätt 3 ml HBSS (2x) inom 25 s för att återställa osmolariteten. Centrifugera sedan vid 300 x g i 5 minuter vid 19 °C.
    3. Upprepa steg 2.8.1 och 2.8.2 för en vit, erytrocytfri pellet.
      OBS: Supernatanten måste avlägsnas så snart som möjligt för att minimera kontakten mellan neutrofiler och RBC-nedbrytningsprodukter. Alternativt kan den andra hypotona lysen ersättas genom att försiktigt resuspendera det kvarvarande RBC-skiktet och ta bort all supernatant, eftersom de återstående RBC:erna kommer att sedimentera ovanför PMN-pelleten.
  8. Kassera supernatanten genom att hälla röret, återsuspendera försiktigt PMN:erna i den återstående bufferten och överför dem till ett iskallt mikrorör.
    OBS: Se till att kommentera volymen medan du överför de omsuspenderade cellerna med en mikropipett.
  9. Överför 3 x 1 μl av cellsuspensionen till ett rent glasglas (tre brunnar på 1 μL vardera) och färga med snabb panoptik (se materialtabell) för morfologi och renhetsbedömning12.
    1. För att färga med snabb panoptik, sänk ner objektglaset fem gånger i panoptiskt fixativ nr 1, sex gånger i eosin nr 2 och två gånger i hematoxylin nr 3, där varje nedsänkning varar 1 s.
    2. Tvätta försiktigt glasskivan med destillerat vatten.
    3. Låt rinna av och lufttorka.
  10. Observera under ett mikroskop och räkna 300 slumpmässiga celler i varje brunn, vilket skiljer neutrofilerna från andra granulocyter.
  11. Överför 1 μl av cellsuspensionen till 49 μl 0,2 % trypanblått färgämne13 och räkna cellerna med hjälp av en Neubauer-kammare, varvid man skiljer mellan döda och livsdugliga celler.
  12. Justera cellkoncentrationen till 6 667 celler/μl med hjälp av en lösning av 50 % autolog plasma och 50 % HBSS kompletterat med kalcium och magnesium. Fördela suspensionen med 6 667 celler/μl jämnt fördelat mellan de mikrorör som motsvarar de betingelser som ska testas, inklusive den negativa kontrollen.
    OBS: Vilken cellkoncentration som helst som liknar de cirkulerande neutrofilerna i modellorganismen kan användas, men det är viktigt att använda samma cellkoncentration i alla försök för reproducerbarhet.

Figure 1
Figur 1: Isoleringsprotokollet för neutrofila granulocyter. Två koncentrationer av separationsmediet (perkoll) (A) staplas (B), sedan skiktas blodet ovanpå separationsgradienten (C). Efter centrifugering finns PMN i det centrala skiktet (D), som är uppdelat i två 15 ml rör (E). Cellsuspensionen tvättas två gånger i HBSS och centrifugeras (G-I) för att avlägsna mediet, sedan återupplivas cellerna och kvarvarande röda blodkroppar utsätts för två omgångar av hypoton lys (JM). Klicka här för att se en större version av denna figur.

3. Förberedelse för aktivering av neutrofila granulocyter

  1. I 1,5 ml mikrorör bereds ett aktiveringssystem för varje tillstånd så att den slutliga cellkoncentrationen är 6 600 celler/μL. Till exempel, för att testa effekterna av 100 nM fMLP (N-formyl-metionyl-leucyl-fenylalanin; se Materialtabell), tillsätt 5 μL 10 μM fMLP till 495 μL av 6 667 cell/μL-suspensionen. För den negativa (ostimulerade) kontrollen, tillsätt HBSS innehållande Ca2+ och Mg2+.
    OBS: För att demonstrera denna metod användes följande slutliga koncentrationer av stimuli: 100 nM fMLP, 16 μM fallaxin, en naturligt förekommande antimikrobiell peptid14 och 100 nM PMA (forbol 12-myristat 13-acetat) (se materialförteckning).
  2. Inkubera vid 37 °C utan rotation.
    ANMÄRKNING: Alla alikvoter för funktionella analyser tas från denna cellsuspension, nedan kallad aktiveringssystemet.

4. Nitrotetrazoliumblåkloridhalt (NBT) för utvärdering av ROS-produktion

  1. Beredning av NBT-arbetslösning: För varje experimentbetingelse bereds en NBT-arbetslösning (se materialtabell) på 6 mM med hjälp av följande steg:
    1. Lös 0,0005 g NBT i 10 μl dimetylsulfoxid (DMSO) och virvel i minst 15 min.
    2. Tillsätt 90 μL HBSS Ca2+Mg2+ och virvla upp till 2 min.
      OBS: Alla steg som involverar NBT måste utföras i mörker.
  2. Utför NBT-objektglastest.
    1. Efter 20 minuters cellaktivering blandar du försiktigt cellsuspensionen och överför försiktigt 2 μL PMN till ett rent glasglas. Inkubera i 20 minuter i en fuktad kammare vid 37 °C.
      OBS: Sprid inte cellsuspensionen för mycket över objektglaset; annars kan den torka ut före inkubationen.
    2. Tillsätt 1 μl NBT-arbetslösningen över cellerna och inkubera ytterligare i 20 minuter skyddad från ljus.
    3. Torka objektglaset med varmluft och fixera det med en droppe metanol i varje brunn i 1 min. Färga med 0,03 % safranin (se Materialförteckning) i 1 min.
    4. Tvätta försiktigt glasskivan med destillerat vatten.
    5. Låt objektglaset lufttorka och observera under ett mikroskop.
    6. Räkna 100 slumpmässiga celler i varje brunn och differentiera neutrofiler med och utan formazanavlagringar.
  3. Utför NBT-spektrofotometrianalys.
    1. Efter 40 minuters cellaktivering blandar du försiktigt cellsuspensionen och överför 90 μL PMN från aktiveringssystemet till ett rent mikrorör. Tillsätt sedan försiktigt 20 μL av 6 mM NBT-lösningen. Inkubera i mörker i 20 minuter vid 37 °C.
    2. Tillsätt 100 μl 10 % natriumdodecylsulfat (SDS; se materialtabell) och virvel.
    3. Ultraljudsbehandling med hjälp av en tip-ultraljudsbehandling vid en amplitud av 60%, fem cykler på 15 s vardera med 15 s intervall. Centrifugera vid 12 000 x g i 5 minuter.
    4. Överför 60 μl av supernatanten till en platta med klar botten med 96 brunnar och mät formazanproduktens absorbans vid 570 nm.

5. Analys av fagocytos

  1. Bered en 33 000 jäst/μl-suspension för varje tillstånd, enligt beskrivningen nedan:
    1. Tillsätt ca 0,75 mg torrjäst (Saccharomyces cerevisiae; se materialtabell) till 200 μl HBSS Ca2+Mg2+ och inkubera i en termomixer vid 100 °C med 500 rpm i minst 15 min.
    2. Homogenisera blandningen genom vortexing och överför 5 μl jästsuspension till 45 μl 0,2 % trypanblått färgämne. Räkna jästen med hjälp av en Neubauer-kammare.
    3. Justera koncentrationen av den initiala suspensionen till 33 000 jästceller/μl med hjälp av HBSS Ca2+Mg2+. Förvara suspensionen på is fram till användning.
  2. Efter 20 minuters cellaktivering blandas cellsuspensionen försiktigt och 5 μl av aktiveringssystemet överförs till 5 μl av Saccharomyces cerevisiae-suspensionen på 33 000 μl/μl i ett nytt sterilt mikrorör.
    OBS: Förhållandet mellan neutrofiler och jäst är 1:5 (PMN:jäst).
  3. Överför omedelbart 6 μl av PMN/jästsuspensionen till tre brunnar på ett rent glasglas (2 μL vardera) och inkubera glaset i en fuktad kammare i 40 minuter.
    OBS: Sprid inte cellsuspensionen för mycket över objektglaset; Annars kan den torka ut innan den ruvar.
  4. Torka objektglaset under varmluft och fläcka med fast panoptic, enligt beskrivningen i steg 2.9 ovan.
    OBS: Det tredje steget i den snabba panoptiska färgningen är avgörande för mikroskopianalysen av objektglaset. Färgning av objektglaset i ≥3 s i detta steg kan göra det olämpligt för analys, eftersom det blir svårt att skilja jäst från neutrofila kärnlober.
  5. Observera objektglasen under mikroskopet, räkna 100 slumpmässiga neutrofiler från varje brunn och skilja mellan PMN positiva och negativa för fagocytos.
    OBS: Minst en jästpartikel i eller i direkt kontakt med PMN-cellmembranet indikerar en PMN-positiv för fagocytos. Om du är intresserad av förhållandet mellan jäst och neutrofila granulocyter kan du också räkna antalet jästpartiklar som uppslukas.

6. PMN-kemotaxianalys i realtid

OBS: Migreringsanalysen utförs på samma sätt som det protokoll som beskrevs tidigare15, med följande anpassningar:

  1. Bered den kemotaktiska gradienten genom att tillsätta 160 μL kemoattraherande medel (t.ex. fMLP, IL-8, C5 eller LTB4; se materialtabell) till den nedre kammaren på en impedansbaserad RTCA-platta (Real Time Cell Analyzer). För negativa kontroller och blindprov, tillsätt 160 μl HBSS Ca2+Mg2+.
  2. Fäst den övre kammaren och tillsätt 25 μL HBSS Ca2+Mg2+. Inkubera i rumstemperatur i minst 1 timme för att bilda den kemotaktiska gradienten.
  3. Efter 60 minuters cellaktivering blandar du försiktigt cellsuspensionen och placerar 60 μL cellsuspension i den övre kammaren. Tillsätt 60 μl HBSS Ca2+Mg2+ till blindprovet.
  4. Placera RTCA-plattan och programmera RTCA-programvaran för att mäta cellindexet (CI) var 60:e sekund i 2 timmar.
    OBS: RTCA-plattorna kan tvättas för återanvändning enligt tidigare beskrivning16. Sammanfattningsvis, tvätta RTCA-kamrarna och elektroderna med fosfat-buferrerad koksaltlösning (PBS) tre gånger, sedan med ultrarent vatten av typ I två gånger. Inkubera den nedre och övre kammaren med 0,25 % trypsin 0,53 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA) i 40 min. Tvätta med ultrarent vatten tre gånger.

7. Suggestiv analys av NET

  1. Efter 10 minuters cellaktivering blandas cellsuspensionen försiktigt och 4 μL av PMN:erna överförs från varje aktiveringssystem som utvärderas, uppdelat i två brunnar på ett rent glasglas. Inkubera i en fuktad kammare vid 37 °C i 30 min.
  2. Tillsätt 1 μl DNAse I till en av brunnarna och inkubera i 20 minuter vid 37 °C (i våt kammare).
  3. Torka objektglaset och fläcken med snabb panoptik, som tidigare beskrivits i steg 2.9 i avsnittet "neutrofilisolering".
  4. Utvärdera objektglasen i mikroskop.
    Leta efter indikationer på NET-version, som kännetecknas av förekomsten av webbliknande strukturer. När DNAse I-behandlingen har identifierats, bekräfta om den kunde avlägsna sådana strukturer. Denna analys tyder på NET-bildning, eftersom ytterligare tester krävs för att bekräfta deras närvaro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den densitetsbaserade isoleringsmetoden som användes i denna studie (Figur 1) uppfyllde kriterierna för de föreslagna experimenten. De neutrofilparametrar som erhölls med denna metod inkluderade viabilitet ≥98 %, renhet ≥94 % och cellutbyte ≥1,5 x 107, utan att någon aktivering kunde detekteras av screeningtesterna. Två relevanta steg i isoleringen av PMN är antikoagulation och avlägsnande av röda blodkroppar. Att hålla den antikoagulerade blodslangen eller sprutan vid en försiktig gungning innan man lägger den över densitetsgradienten och välja en metod för avlägsnande av röda blodkroppar för att förhindra både aktivering och kontaminering kan påverka experimentets utbyte och reproducerbarhet.

För att bedöma den funktionella översikten av neutrofilfunktionen utvecklades ett arbetsflöde som gjorde det möjligt att utföra de föreslagna screeninganalyserna med minst två forskare på en genomsnittlig tid av 4 timmar, med 1 timmes aktivering och 2 timmars migrationsövervakning i realtid, som visas i figur 2.

Figure 2
Bild 2: Arbetsflödet för NeutroFun Screen. För att bedöma panelen av funktionella svar som utlöses av specifika förhållanden som utvärderas, inkluderar NeutroFun Screen-arbetsflödet deltagande av minst två forskare. Forskare 1 (R1) startar PMN-isoleringsprocessen, följt av justering av cellkoncentration och inkubation av aktiveringssystemet, medan forskare 2 (R2) parallellt förbereder materialen för att utföra nästa analyser, som är uppdelade mellan de två: R1 utför fagocytos, NET och spektrofotometriska NBT-analyser; R2 utför migrering i realtid och NBT-objektglastester. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Den klassiska NBT-analysen17 optimerades för både objektglas och spektrofotometrisk bedömning av formazanbildningen till följd av reaktionen av NBT med ROS som genereras av PMN. Den spektrofotometriska analysen möjliggjorde relativ kvantifiering mellan betingelser, medan mikroskopianalysen var användbar för beskrivande och semikvantitativ analys, för att utvärdera regelbundenheten i kristallfördelningen, morfologin och antalet celler som innehåller formazan. Resultaten av den spektrofotometriska analysen visas i figur 3A, vilket indikerar att 100 nM PMA inducerade förhöjd ROS-produktion (i ett genomsnittligt förhållande på 3:2:1) jämfört med fMLP och kontrollgrupper. Resultaten från NBT-glastestet (figur 3B) bekräftade de spektrofotometriska resultaten och visade också att PMA var den mest intensiva ROS-produktionsinducerande stimulansen jämfört med fMLP (figur 3C), vilket tidigare visats genom direkt mätning av ROS med cytometri18. När det gäller cellräkning visade antalet neutrofiler innehållande formazankristaller ett förhållande på 7:4:1 under PMA:fMLP:kontrollförhållandena, vilket också avslöjade olika formazanfördelningsmönster mellan fMLP och PMA-aktiverade PMN; fMLP-behandling resulterade i intensivt aktiverade enskilda celler, medan PMA inducerade bildandet av formazankristaller utspridda i cytoplasman i majoriteten av PMN. Vidare observerades ett fåtal morfologiska egenskaper som differentierade tillstånden, såsom expressiv cellaggregering efter PMA-behandling. Frånvaron av sådana typiska aktiveringskarakteristika och låga nivåer av formazan i kontrollgruppen tydde på att vilotillståndet inte var signifikant stört. Därför visade sig NBT-analysen vara ett enkelt, billigt och tillförlitligt test för neutrofil ROS-produktion som kan användas för att överblicka kapaciteten och intensiteten hos en given stimulus för att inducera ROS-produktion.

Figure 3
Figur 3: NBT-test. (A) Spektrofotometrisk bedömning av neutrofil andningsburst till olika betingelser (negativ kontroll: 100 nM fMLP och 100 nM PMA) med formazanabsorbans (490-630 nm). Data från fyra donatorer presenteras som medelvärde ± standardavvikelse (SD). * = alla grupper skiljer sig från varandra (p≤ 0,05); £ = Jämförelserna CTRL kontra PMA och fMLP kontra PMA visar signifikanta skillnader (p≤ 0,05). (B) Objektglastestet kan analyseras kvalitativt och karakterisera intensiteten hos formazanavlagringar, dess placering i cellen och cellaggregeringen. Svarta pilar pekar på formazankristaller. Skalstaplar: 20 μm. (C) Antal PMN som innehåller formazan, räknat med optisk mikroskopi. Data från åtta donatorer presenteras som medelvärde ± SD. *** p < 0,0001, Studentens t-test. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Fagocytosglasen användes för att bestämma fagocytosfrekvensen som en procentandel neutrofiler som utför fagocytos, som visas i figur 4. Även om både 100 nM fMLP och 16 μM antimikrobiell peptid inducerade en till synes ökad jästuppslukning, var skillnaden inte statistiskt signifikant förrän den dubbla stimuleringen, vilket signifikant förbättrade fagocytosen jämfört med kontrollgruppen och kan tyda på ett svar vid dubbel stimulering.

Figure 4
Figur 4: Fagocytostest. Neutrofiler utvärderades med hjälp av fagocytoskapacitet (antal neutrofiler som innehåller jäst). Även om exponeringen för 100 nM fMLP eller en 16 μM antimikrobiell peptid före jästinkubation förbättrade fagocytosen jämfört med kontrollgruppen, (A) var ökningen inte statistiskt signifikant. Intressant nog resulterade en initial inkubation med fMLP, följt av tillsats av den antimikrobiella peptiden, i signifikant förbättrad fagocytos hos humana neutrofiler (asterisk mellan CTRL och den antimikrobiella peptiden fMLP+). (B) Svarta pilar visar jästceller, gröna pilar visar enbart neutrofiler och röda pilar pekar på fagocytoserande neutrofiler. Data från fem donatorer presenteras som medelvärde ± SD. Skalstreck: 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Ett exempel på cellmigrationsresultat i realtid visas i figur 5, som visar den välkända kemotaktiska effekten av 100 nM fMLP på neutrofiler. Cellmigrationskinetiken justerades till Gompertz-modellen, vilket gjorde det möjligt att jämföra dess parametrar.

Figure 5
Figur 5: Cellmigrering i realtid. Cellindexet återspeglar den elektriska impedansen till följd av cellmigration. I denna analys användes fMLP som en positiv kontroll av neutrofilmigration genom att tillsätta 100 nM fMLP till den nedre kammaren. En negativ kontroll (CTRL) innehöll endast HBSS i den nedre kammaren. De överlagrade kurvorna representerar kurvanpassningen till Gompertz-modellen, modifierad för att bäst passa stigande och fallande sluttningar. Data från tre donatorer, presenterade som medelvärde ± SD.* p < 0,05, Studentens t-test. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Slutligen presenteras ett enkelt optiskt mikroskopitest som tyder på närvaron av NET, där PMN:erna färgas med snabb panoptik. Det är möjligt att observera att för vissa specifika NET-inducerande stimuli, såsom PMA eller vissa antimikrobiella peptider, är det även efter en kort aktiveringstid (1 timme) möjligt att observera trådliknande nätliknande strukturer nära cellerna, medan detta inte är möjligt under andra förhållanden som negativ kontroll och fMLP (Figur 6). För att bättre stödja detta påstående tillsattes DNas I efter 40 minuters cellaktivering med 100 nm PMA eller en antimikrobiell peptid, vilket avlägsnade de NET-liknande strukturerna (figur 6). Även om denna metod inte är lämplig för NET-karakterisering och kan påverkas av artefakter, är det en billig, enkel och intressant utgångspunkt för att motivera ytterligare investeringar i att analysera NET, särskilt i sammanhang där effekterna av stimuli är okända eller dåligt beskrivna.

Figure 6
Figur 6: Suggestiv analys av NET-bildning. En kvalitativ analys av panoptiskt färgade neutrofiler efter 1 timmes aktivering över ett objektglas kan tyda på NET-frisättning. CTRL (A,B) och fMLP (C,D) grupper visade inga tecken på NET-frisättning, medan aktivering med PMA (E-H) inducerade bildandet av NET-liknande strukturer som bröts ned av DNas I-behandling (I-L). Undersökning av effekterna av en antimikrobiell peptid på neutrofilerna visade att ett sådant stimulus skulle kunna framkalla NET-frisättning, eftersom objektglasen uppvisade de NET-liknande strukturer (M-P) som bröts ned av DNas I (Q-T). Röda pilar pekar på NET-liknande strukturer. Skalstaplar: 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Neutrofiler är mycket dynamiska och responsiva celler som är kortlivade och ännu inte kan kryokonserveras19, vilket gör undersökningar av deras biologi utmanande. Därför är det viktigt att följa noggranna steg för att få livskraftiga, berikade och vilande neutrofiler11,20. Denna studie använde en densitetsbaserad isoleringsteknik som betonar skonsam och minimal manipulation, samt användning av låga temperaturer fram till aktiveringssteget. Dessutom måste blodbehandling ske inom 30 minuter efter venpunktion och förvaras i rumstemperatur. Det aktuella arbetet presenterar ett alternativ för att minska manipulationsstress och experimenttid. För att ytterligare förenkla processen introducerade vi ett nytt steg (som ett alternativ) i protokollet, som innebär att man avlägsnar röda blodkroppar genom försiktig omsuspension och aspiration av RBC-skiktet efter en enda hemolysprocedur. Detta steg minskar manipulationsstressen och experimenttiden, eftersom det tar bort majoriteten av röda blodkroppar med endast ett hypotoniskt hemolyssteg. Det bör dock noteras att operatörens färdigheter i hög grad påverkar effektiviteten i detta steg, och det kanske inte alltid helt tar bort RBC:er. Dessutom kan RBC-aspiration leda till en förlust av neutrofiler, men detta påverkar inte utbytet, eftersom fler neutrofiler initialt återfanns från gradienten när de samlades närmare RBC-skiktet. Därför rekommenderas RBC-aspiration om analyserna inte kräver högsta möjliga renhet, eller om operatören har haft genomgående goda resultat. För de screeningtester som presenteras här skulle en liten mängd kontaminerande röda blodkroppar (<3 %) inte störa resultaten.

För att säkerställa att alla procedurer utförs i rätt tid, inklusive reagensberedning, presenteras ett arbetsflöde (Figur 2) som beskriver tidslinjen och fördelningen av uppgifter mellan två forskare. Efter att alla funktionella analyser är klara kan de återstående cellerna förberedas för ytterligare molekylära undersökningar, som omics-studier genom celllys med korrekt lysbuffert och lagring.

ROS-produktion
Respiratory burst är ett kännetecken för neutrofilpriming och aktivering18,21, och utvärdering av ROS-produktion är en vanlig metod som används för att uppskatta neutrofilers aktiveringsstatus. Denna studie utvärderade ROS-produktion med hjälp av två metoder: optisk mikroskopi och spektrofotometri.

NBT-testet är ett välkänt tillvägagångssätt för att bedöma andningsutbrottet hos neutrofiler22,23. Två vanliga metoder är den optiska mikroskopibaserade (eller objektglastestet) och spektrofotometribaserade analyserna 24,25,26. Även om optisk mikroskopi möjliggör visualisering av detaljer på cellnivå, är den benägen att vara partisk för användaren. Därför fungerar NBT-glastestet som ett kvalitativt komplement till den spektrofotometriska analysen med avseende på fenotypiska egenskaper, såsom formazanbildningsmönster, intensitet och cellaggregering.

De kritiska stegen för både NBT-glaset och spektrofotometriska tester är NBT- och formazan-fullständig solubilisering. I motsats till tillverkarens rekommendationer löser sig NBT inte bra i vatten. Homogenisering av NBT i DMSO i minst 15 minuter och sedan tillsats av vatten/HBSS och vortexing i 2 minuter ger dock fullständig solubilisering. Dessutom, för att analysera absorbansen av formazan, måste två kritiska steg uppnås: (1) frisättning av formazankristaller från celler genom PMN-lys och (2) fullständig solubilisering av formazankristaller. Båda stegen uppnåddes genom att behandla cellpelleten med 10% SDS, som nyligen föreslagits27, följt av ultraljudsbehandling och absorbansanalys av supernatanten vid 570 nm.

Dessutom är NBT-resultaten från de negativa och positiva kontrollgrupperna det första steget i screeningen som ska bedömas. Detta steg måste visa en anmärkningsvärd skillnad, eftersom utvärdering av ROS-produktion genom formazan indikerar om isoleringsprocessen kan ha varit ansvarig för oönskade förändringar i cellernas vilostatus, antingen genom stimulering eller hämning.

Andra metoder, såsom cytokrom c-reduktion28 eller flödescytometri29-analys, används ofta för ROS-detektion; Men med tanke på en screeningmetod kräver deras tillämpning en längre experimenttid, användning av specifika markörer och dyra instrument. Kemiluminescens av luminol/isoluminol är en snabb och kostnadseffektiv metod för att detektera ROS samtidigt som den möjliggör differentiering av intra- och extracellulär ROS. En luminometer krävs dock för denna metod30,31. Även om instrumentkostnaden skulle kunna kringgås genom användning av en anläggning, skulle den fortfarande vara olämplig för en screeninganalys som utförs samtidigt med andra analyser.

Fagocytos
PMN/jäst-inkubationen ger en översikt över neutrofila fagocytosers kapacitet och effekt genom att räkna antalet neutrofiler som utför fagocytos och antalet jästsvampar som uppslukas per neutrofil. Men eftersom jästpartikeln i sig är en aktiveringssignal, utgör jämförelse av kontrollgruppen med förbehandlad PMN ett dubbelt stimuleringssystem, som kanske inte visar signifikanta förändringar, vilket visas i CTRL kontra fMLP-behandlad PMN (figur 4). Icke desto mindre är denna analys användbar för att indikera om en potentiell modulator skulle generera någon inverkan på fagocytos. En ny antimikrobiell peptid testades med hjälp av denna analys, och resultaten indikerar ett intressant potentiellt svar på denna kombination av stimuli, vilket nyligen har diskuterats som nödvändigt för effektiv aktivering32.

Det kritiska steget för denna analys är färgningen, eftersom analysen blir otillförlitlig om objektglaset hålls på panoptiskt nr 3 (hematoxylin) i ≥3 s. Detta beror på att jästcellerna och de neutrofila kärnloberna inte kan skiljas från varandra. Dessutom möjliggör detta tillvägagångssätt morfologianalys av neutrofiler efter exponering för modulatorer. Flödescytometri är en annan effektiv teknik för att analysera fagocytos33, även om den har begränsningar genom svårigheten att skilja mellan membranbundna och uppslukade partiklar och andra faktorer relaterade till den föreslagna screeninguppsättningen, som diskuterats i föregående ämne. Samma begränsning observeras i den metod som beskrivs här, även om detta ska betraktas som en inledande screening för att vägleda uppföljningsstudier.

Migrering i realtid
Screeningprotokollet i realtid optimerades för att utvärdera migreringskapaciteten hos PMN:er. Även om en tidigare studie tydde på att beläggning på undersidan av RTCA-plattan behövdes för att migrationsanalysen skulle visa en skillnad mellan den negativa kontrollen och IL-8-behandling15, visade denna studie höga konfidensintervall (CI) värden för fMLP-behandlade celler utan tillsats av beläggningsmedel. Resultaten visade hög reproducerbarhet med signifikant migration från 12 minuter och framåt. Dessutom kan kurvanpassningsanalys av erhållna migrationsdata avslöja parametrar, såsom cellindex maximalt samt öka och minska lutningen, som är användbara för att förstå migrationens dynamik, och som kan bero på koncentration eller skilja sig åt mellan olika förhållanden. Den bästa anpassningen för neutrofilmigrationskurvor (Figur 5) var den justerade Gompertz-funktionen34, som visar att fMLP ökar det maximala cellindexet och den ökade lutningen.

Särskild uppmärksamhet krävs för att undvika bubblor i RTCA-systemet eftersom de kan blockera cellerna som passerar genom elektroderna, vilket äventyrar experimentet. En begränsande faktor är den höga kostnaden för plattorna. Även om billigare tekniker analyserar cellmigration, saknar de god reproducerbarhet eller är svåra och tidskrävande, såsom Boyden chamber35. RTCA är därför en tillförlitlig migrationsanalys som är kompatibel med de andra screeningtesterna som presenteras här.

Nät
Slutligen utvecklades en lovande, enkel och billig analys för en preliminär utvärdering av NET-bildning med hjälp av optisk mikroskopi. Det härleddes från observationen av fagocytosglas, där PMA, ett specifikt NET-inducerande stimulus som testades för sin effekt på fagocytoskapaciteten, också inducerade en webbliknande strukturbildning jämfört med CTRL- och fMLP-grupperna. Hypotesen i det här arbetet var att dessa strukturer skulle kunna tyda på NET-version. En sådan hypotes testades genom att behandla proverna med DNas I efter aktivering, där inga filamentösa strukturer hittades i PMA-aktiverade neutrofiler. Antagandet att sådana strukturer sannolikt är NET baseras på det faktum att PMA nämns som en välkänd inducerare av NET-bildning36,37, fyndet av liknande strukturer genom fluorescensmikroskopi med hjälp av specifika markörer för NET38,39 och nedbrytningen av NET katalyserade av DNas I 40,41. Det är viktigt att betona att detta inte är en metod för att bekräfta NET-bildning, utan bara en preliminär screening som tyder på närvaron av NET. Även om detta test har begränsningar, eftersom NET kan förväxlas med färgningsartefakter, tjänar det ett relevant syfte genom att föreslå NET-bildning i en snabb och billig screening som kan utföras tillsammans med andra funktionella tester. När NET har upptäckts som möjligen relevant för den studie som screenas kan NET utvärderas ytterligare med konfokal- eller elektronmikroskopi42, vilket diskuteras senare.

I vårt laboratorium utvärderas ofta nya antimikrobiella peptider, som sannolikt också har immunmodulerande aktiviteter, genom denna uppsättning screeninganalyser för att bättre vägleda ytterligare analys av effekterna av vissa peptider på humana neutrofiler, eftersom vissa visar intressanta ROS43, fagocytos, migration och/eller NET-modulerande egenskaper.

Sammanfattningsvis erbjuder NeutroFun Screen ett värdefullt verktyg för att identifiera potentiella modulatorer av den normala densiteten av neutrofilaktivitet från ett stort antal otestade föreningar. Det är dock viktigt att notera att denna metod endast fungerar som en preliminär screening. Efter denna inledande screening kan dyrare, avancerade och tidskrävande metoder riktas mot specifika funktioner eller vägar som föreslås av dessa första resultat för datavalidering. För ROS-produktion, fagocytos och NET-bildning finns alternativa metoder för datavalidering och för att få ytterligare kvantitativa resultat. NET-visualisering och kvantifiering kan utföras genom immunofluorescensmikroskopianalys, som bestämmer närvaron och överlappningen av extracellulärt DNA och granulära proteiner, såsom myeloperoxidas och neutrofil elastas, som beskrivits i detalj nyligen42. ROS spelar olika avgörande roller i många biologiska processer, och därför är deras studier mycket utbredda och mångsidiga. Bland de mest etablerade metoderna finns de som använder sig av antikroppar, såsom enzymkopplad immunadsorberande analys (ELISA) och immunoblotning av luminiscens, eller fluorescensdetektion - såsom flödescytometri av celler under olika märkning - genom DCFDA, EPR-spektroskopi och enzymatiska aktivitetsmätningar44. På samma sätt görs robust fagocytosutvärdering också på flera sätt; De alternativa metoderna inkluderar enbart flödescytometri45,46 eller i kombination med fluorescensmikroskopi47. Den beskrivna cellmigrationen i realtid är en robust och tillräcklig analys som inte kräver ytterligare validering och presenterar parametrar som andra metoder inte kan överväga. Andra kombinationer av sådana metoder kan passa bättre för specifika scenarier, men sammanfattningsvis representerar detta en snabb och prisvärd kombination som omfattar många neutrofila aktiviteter.

Sammanfattningsvis syftar denna studie till att tillhandahålla en uppsättning analyser som består av enkla, snabba och billiga metoder för att utvärdera multipla neutrofila svar på nya molekyler och förhållanden som ett sätt att bättre rikta insatser mot avancerade metoder. Som stora begränsningar bör resultaten från ROS-, NET- och fagocytosanalyser betraktas som preliminära och behöver ytterligare validering av mer specifika och genomarbetade analyser, och de som förlitar sig på icke-automatiserad mikroskopicellräkning är benägna att drabbas av omedveten bias.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna deklarerar att det inte föreligger någon intressekonflikt.

Acknowledgments

Författarna uppmärksammar följande finansiärer: FAPDF, CNPq, CAPES, UnB, FINEP och FINATEC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CIM-Plate 16 Agilent  5665825001
CLARIOstar Plate Reader  BMG LABTECH US Patent Number 9,733,124
Product details: MARS Data Analysis Software
Dimethyl sulfoxide Dinâmica 1582
DNAse I Sigma - Aldrich DN 25
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate Sigma - Aldrich E5134
Fast panoptic stain Laborclin 620529
Glass slide Exacta 7102
Hank’s Balanced Salt Solution with calcium, with magnesium, without phenol red. Sigma - Aldrich 55037C
Hank’s Balanced Salt Solution without calcium chloride, magnesium sulfate and sodium bicarbonate. Sigma - Aldrich H4641
Heparin Blau  7896014655229
Laminar flow cabinet Veco VLFS-12
Microscope Zeiss 415501-0101-002 Product details: Primostar 1
Mixing Block BIOER MB-102
Neubauer improved bright-lined New Optik 1110000
N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine Sigma - Aldrich F3506
Nitroblue tetrazolium Neon CAS 298-83-9
Percoll Cytiva 17089101 separation media
Phorbol 12-myristate 13-acetate Sigma - Aldrich P8139
Phosphate buffered saline tablet Sigma - Aldrich P4417
ROTOFIX 32 A Hettich 1206
Saccharomyces cerevisiae Fleischmann
Safranin Sigma - Aldrich 50240
Sodium dodecyl sulfate Cytiva 17-1313-01
Sonicator Qsonica Q125
Trypan blue solution Vetec C.I. 23850
Vortex Genie 2 Scientific Industries, Inc. 0K-0500-902
xCELLigence Real-Time Cell Analysis (RTCA) DP (dual purpose) Agilent  380601050 Product details: RTCA system composed of detection hardware, cell plates and software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nature Immunology. 15 (7), 602-611 (2014).
  2. Groeneweg, L., Hidalgo, A. Emerging roles of infiltrating granulocytes and monocytes in homeostasis. Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (19), 3823-3830 (2020).
  3. Rosales, C., Lowell, C. A., Schnoor, M., Uribe-Querol, E. Neutrophils: their role in innate and adaptive immunity 2017. Journal of Immunology Research. 2017, 9748345 (2017).
  4. Castro, M., et al. Proteome analysis of resting human neutrophils. Protein & Peptide Letters. 13 (5), 481-487 (2006).
  5. Li, Y., et al. The regulatory roles of neutrophils in adaptive immunity. Cell Communication and Signaling. 17, 147 (2019).
  6. de Oliveira, S., Rosowski, E. E., Huttenlocher, A. Neutrophil migration in infection and wound repair: going forward in reverse. Nature Reviews Immunology. 16 (6), 378-391 (2016).
  7. Burn, G. L., Foti, A., Marsman, G., Patel, D. F., Zychlinsky, A. The neutrophil. Immunity. 54 (7), 1377-1391 (2021).
  8. El-Benna, J., et al. Priming of the neutrophil respiratory burst: role in host defense and inflammation. Immunological Reviews. 273 (1), 180-193 (2016).
  9. Castro, M. S., Cilli, E. M., Fontes, W. Combinatorial synthesis and directed evolution applied to the production of alpha-helix forming antimicrobial peptides analogues. Current Protein & Peptide Science. 7 (6), 473-478 (2006).
  10. Mihaila, A. C., et al. Transcriptional profiling and functional analysis of N1/N2 neutrophils reveal an immunomodulatory effect of S100A9-blockade on the pro-inflammatory N1 subpopulation. Frontiers in Immunology. 12, 708770 (2021).
  11. Kuhns, D. B., Priel, D. A. L., Chu, J., Zarember, K. A. Isolation and functional analysis of human neutrophils. Current Protocols in Immunology. 111 (1), 7-23 (2015).
  12. Paulíková, E., Kociková, A., Sabol, M. Modification of a panoptic method of staining isolated cells. Bratislavske Lekarske Listy. 94 (12), 638-640 (1993).
  13. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111 (1), 1-3 (2015).
  14. Libério, M. S., et al. Anti-proliferative and cytotoxic activity of pentadactylin isolated from Leptodactylus labyrinthicus on melanoma cells. Amino Acids. 40 (1), 51-59 (2011).
  15. Cano, P. M., Vargas, A., Lavoie, J. P. A real-time assay for neutrophil chemotaxis. BioTechniques. 60 (5), 245-251 (2016).
  16. Stefanowicz-Hajduk, J., Adamska, A., Bartoszewski, R., Ochocka, J. R. Reuse of E-plate cell sensor arrays in the xCELLigence Real-Time Cell Analyzer. BioTechniques. 61 (3), 117-122 (2016).
  17. Björkstén, B., Nyström, K., Lindqvist, B. The nitroblue tetrazolium (NBT) test in endemic benign (epidemic) nephropathy. Acta Medica Scandinavica. 199 (1-6), 147-150 (1976).
  18. Aquino, E., et al. Proteomic analysis of neutrophil priming by PAF. Protein & Peptide Letters. 23 (2), 142-151 (2016).
  19. Blanter, M., Gouwy, M., Struyf, S. Studying neutrophil function in vitro: cell models and environmental factors. Journal of Inflammation Research. 14, 141-162 (2021).
  20. Hsu, A. Y., Peng, Z., Luo, H., Loison, F. Isolation of human neutrophils from whole blood and buffy coats. Journal of Visualized Experiments. (175), e62837 (2021).
  21. Moghadam, Z. M., Henneke, P., Kolter, J. From flies to men: ROS and the NADPH oxidase in phagocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 628991 (2021).
  22. Pattan, S. S., Bhat, K. G., Pattar, G. D., Kuntagi, M. Comparison of three different techniques for isolation of neutrophils from blood and their utility in performing nitroblue tetrazolium test. International Journal of Basic and Applied Physiology. 8 (1), 41 (2019).
  23. Gooty, J. R., Shashirekha, A., Guntakala, V. R., Palaparthi, R. Estimation of phagocytic activity of polymorphonuclear leukocytes in chronic and aggressive periodontitis patients with nitroblue tetrazolium test. Journal of Indian Society of Periodontology. 23 (4), 316 (2019).
  24. Langer, S., et al. Clinical and laboratory profiles of 17 cases of chronic granulomatous disease in north India. Indian Journal of Hematology and Blood Transfusion. 37 (1), 45-51 (2021).
  25. Oualha, R., et al. Infection of human neutrophils with Leishmania infantum or Leishmania major strains triggers activation and differential cytokines release. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 9, 153 (2019).
  26. Zilinskas, J., Zekonis, J., Zekonis, G., Valantiejiene, A., Periokaite, R. The reduction of nitroblue tetrazolium by total blood in periodontitis patients and the aged. Stomatologijal. 9 (4), 105-108 (2007).
  27. Benov, L. Improved formazan dissolution for bacterial MTT assay. Microbiology Spectrum. 9 (3), e01637 (2021).
  28. Chen, Y., Junger, W. G. Measurement of oxidative burst in neutrophils. Methods in Molecular Biology. 844, 115-124 (2012).
  29. Richardson, M. P., Ayliffe, M. J., Helbert, M., Davies, E. G. A simple flow cytometry assay using dihydrorhodamine for the measurement of the neutrophil respiratory burst in whole blood: comparison with the quantitative nitrobluetetrazolium test. Journal of Immunological Methods. 219 (1-2), 187-193 (1998).
  30. Jancinová, V., et al. The combined luminol/isoluminol chemiluminescence method for differentiating between extracellular and intracellular oxidant production by neutrophils. Redox Report. 11 (3), 110-116 (2006).
  31. Nosál, R., et al. Pharmacological intervention with oxidative burst in human neutrophils. Interdisciplinary Toxicology. 10 (2), 56-60 (2017).
  32. Mol, S., et al. Efficient neutrophil activation requires two simultaneous activating stimuli. International Journal of Molecular Sciences. 22 (18), 10106 (2021).
  33. Schneider, L., et al. Flow cytometry evaluation of CD14/CD16 monocyte subpopulations in systemic sclerosis patients: a cross sectional controlled study. Advances in Rheumatology. 61 (1), 27 (2021).
  34. Akin, E., Pelen, N. N., Tiryaki, I. U., Yalcin, F. Parameter identification for gompertz and logistic dynamic equations. PLoS One. 15 (4), e0230582 (2020).
  35. Guy, J. B., et al. Evaluation of the cell invasion and migration process: A comparison of the video microscope-based scratch wound assay and the boyden chamber assay. Journal of Visualized Experiments. (129), e56337 (2017).
  36. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  37. de Bont, C. M., Koopman, W. J. H., Boelens, W. C., Pruijn, G. J. M. Stimulus-dependent chromatin dynamics, citrullination, calcium signalling and ROS production during NET formation. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1865, 1621-1629 (2018).
  38. Masuda, S., et al. Measurement of NET formation in vitro and in vivo by flow cytometry. Cytometry Part A. 91 (8), 822-829 (2017).
  39. Zharkova, O., et al. A flow cytometry-based assay for high-throughput detection and quantification of neutrophil extracellular traps in mixed cell populations. Cytometry Part A. 95 (3), 268-278 (2019).
  40. Hosseinnejad, A., et al. DNase I functional microgels for neutrophil extracellular trap disruption. Biomaterials Science. 10 (1), 85-99 (2022).
  41. Chrysanthopoulou, A., et al. Neutrophil extracellular traps promote differentiation and function of fibroblasts. The Journal of Pathology. 233 (3), 294-307 (2014).
  42. Tong, M., Abrahams, V. M. Visualization and quantification of neutrophil extracellular traps. Methods in Molecular Biology. 2255, 87-95 (2021).
  43. Santana, C. J. C., et al. Biological properties of a novel multifunctional host defense peptide from the skin secretion of the chaco tree frog, boana raniceps. Biomolecules. 10 (5), 790 (2020).
  44. Murphy, M. P., et al. Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo. Nature Metabolism. 4 (6), 651-662 (2022).
  45. Boero, E., et al. Use of flow cytometry to evaluate phagocytosis of staphylococcus aureus by human neutrophils. Frontiers in Immunology. 12, 635825 (2021).
  46. Karsten, C. B., et al. A versatile high-throughput assay to characterize antibody-mediated neutrophil phagocytosis. Journal of Immunological Methods. 471, 46-56 (2019).
  47. Smirnov, A., Solga, M. D., Lannigan, J., Criss, A. K. Using imaging flow cytometry to quantify neutrophil phagocytosis. Methods in Molecular Biology. 2087, 127-140 (2020).

Tags

Denna månad i JoVE nummer 204
En uppsättning screeningtekniker för en snabb överblick över neutrofilfunktionen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Souza Luz, I., Takaya, R., Gonzaga… More

Souza Luz, I., Takaya, R., Gonzaga Ribeiro, D., Sales Silva, N., Fontes, L., Castro, M. S., Fontes, W. A Set of Screening Techniques for a Quick Overview of the Neutrophil Function. J. Vis. Exp. (204), e65329, doi:10.3791/65329 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter