Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

مجموعة من تقنيات الفحص للحصول على نظرة عامة سريعة على وظيفة العدلات

Published: February 9, 2024 doi: 10.3791/65329
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1, 1
1Laboratory of Protein Chemistry and Biochemistry, Department of Cell Biology, University of Brasilia, 2Institute of Physics, University of Brasilia

Summary

يتميز هذا البروتوكول بمجموعة من المقايسات الوظيفية للعدلات لاستخدامها كطريقة فحص لتغطية الوظائف من مسارات الإشارات المختلفة. يتضمن البروتوكول تقييما أوليا وبسيطا لصلاحية الخلية ، والنقاء ، وإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية ، والهجرة في الوقت الفعلي ، والبلعمة ، واقتراح أولي لمصائد العدلات خارج الخلية.

Abstract

تعرف العدلات بأنها واحدة من خطوط الدفاع الأولى في الاستجابة المناعية الفطرية ويمكن أن تؤدي العديد من الوظائف الخلوية الخاصة ، مثل الانجذاب الكيميائي ، والهجرة العكسية ، والبلعمة ، وتحلل الإنزيمات السامة للخلايا والمستقلبات ، وإطلاق الحمض النووي كمصائد خارج الخلية للعدلات (NETs). لا تقوم العدلات بتنظيم الإشارات بإحكام فحسب ، بل تشارك أيضا في تنظيم المكونات الأخرى للجهاز المناعي. نظرا لأن العدلات الطازجة متباينة بشكل نهائي وقصيرة العمر ومتغيرة للغاية بين الأفراد ، فمن المهم تحقيق أقصى استفادة من العينات التي تم جمعها. غالبا ما يحتاج الباحثون إلى إجراء فحوصات الفحص لتقييم نظرة عامة على العديد من وظائف العدلات التي قد تتأثر بظروف معينة قيد التقييم. تم تطوير مجموعة من الاختبارات بعد عملية عزل واحدة للعدلات ذات الكثافة الطبيعية لتلبية هذه الحاجة ، سعيا لتحقيق التوازن بين السرعة والشمولية والتكلفة والدقة. يمكن استخدام النتائج لتبرير وتوجيه دراسات المتابعة المتعمقة. يمكن تنفيذ هذا الإجراء في متوسط وقت 4 ساعات ويتضمن تقييم صلاحية الخلية ، وإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، والهجرة في الوقت الفعلي ، والبلعمة من الخميرة على الشرائح الزجاجية ، وترك خلايا كافية لنهج أكثر تفصيلا مثل دراسات omics. علاوة على ذلك ، يتضمن الإجراء طريقة لمراقبة اقتراح أولي للشبكات بسهولة بعد تلطيخ بانوبتيكي سريع لوحظ بواسطة المجهر الضوئي ، مع عدم وجود علامات محددة ، وإن كانت كافية للإشارة إلى ما إذا كان من المفيد بذل المزيد من الجهود بهذه الطريقة. يجمع تنوع الوظائف التي تم اختبارها بين النقاط المشتركة بين الاختبارات ، مما يقلل من وقت التحليل والنفقات. تم تسمية الإجراء باسم NeutroFun Screen ، وعلى الرغم من وجود قيود ، إلا أنه يوازن بين العوامل المذكورة أعلاه. علاوة على ذلك ، فإن الهدف من هذا العمل ليس مجموعة اختبار محددة ، بل هو مبدأ توجيهي يمكن تعديله بسهولة وفقا لموارد ومتطلبات كل مختبر.

Introduction

العدلات هي الخلايا المناعية الفطرية الأكثر وفرة في دم الإنسان ومن المعروف أنها تلعب دورا رئيسيا في العدوى والالتهابات ، كونها أول المستجيبين الذين يصلون إلى موقع تلف الأنسجة1. في السنوات الأخيرة ، كان هناك اعتراف متزايد بالدور الحاسم الذي تلعبه العدلات في مجموعة متنوعة من الأمراض وفي دعم التوازن2. لا تقوم العدلات بتنظيم الإشارات بإحكام فحسب ، بل تشارك أيضا في تنظيم المكونات الأخرى للجهاز المناعي3،4،5. لذلك ، فإن التحقيق في العدلات والعديد من وظائفها الخلوية غير العادية ، مثل الانجذاب الكيميائي ، والهجرة العكسية6 ، والبلعمة7 ، والانفجار التنفسي8 ، وإطلاق مصائد العدلات خارج الخلية (NETs) 7 ، أمر حتمي في العديد من سياقات البحث حيث يكون من الضروري تقييم التغيرات الوظيفية أو المورفولوجية أو الجزيئية المحتملة التي تسببها ظروف محددة قيد التحليل.

العدلات المعزولة حديثا متباينة بشكل نهائي ، وقصيرة العمر ، وديناميكية للغاية ، ويمكن تنشيطهابسهولة 9. ومع ذلك ، لم يتم بعد تحقيق طريقة تخزين فعالة لا تؤثر على استجابات العدلات ، مما يجعل من الصعب إجراء فحوصات متعددة يجب أن تكون دون انقطاع. علاوة على ذلك ، قد لا تكون التحليلات الوظيفية الموصوفةسابقا 10،11 ، بناء على المقايسات التي تتطلب قياس الخلايا و / أو تلطيخ الفلورسنت ، خيارا قابلا للتطبيق عند الحاجة إلى تقييم واسع وأولي للعدلات.

لمعالجة هذه المشكلات ، يصف هذا البروتوكول مجموعة من الاختبارات التي يمكن إجراؤها بعد عملية عزل واحدة ، بما في ذلك تقييم صلاحية الخلية ، وإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، والهجرة في الوقت الفعلي ، والبلعمة في Saccharomyces cerevisiae ، والتي يمكن استخدام نتائجها لتبرير دراسات المتابعة المتعمقة. تم تصميم هذا الإجراء ، المسمى NeutroFun Screen ، ليشمل أنشطة المستجيب الرئيسية ، باستثناء التحبب ، ويمكن إكماله في متوسط وقت قدره 4 ساعات ، بما في ذلك 1 ساعة من التنشيط. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام الخلايا المتبقية لنهج أكثر تفصيلا مثل دراسات omics. تكمن ميزة هذه الطريقة في توازنها بين السرعة والشمولية والتكلفة والدقة.

وعلاوة على ذلك، هناك طريقة للمراقبة بسهولة لاقتراح أولي بشأن شبكات شبكية، دون علامات محددة، ولكنها تكفي لبيان ما إذا كان من المفيد بذل مزيد من الجهود في هذا الاتجاه. يهدف تنوع الوظائف التي تم اختبارها إلى الجمع بين النقاط المشتركة بين الاختبارات ، مما يقلل من وقت التحليل والنفقات. الهدف الرئيسي من هذه الطريقة هو توفير تحليل وظيفي متوازن فيما يتعلق بالسرعة والشمولية والتكلفة والدقة التي تسمح بإلقاء نظرة عامة على استجابة العدلات ، مما يجعلها خطوة أولية مفيدة في التحقيق في آثار المحفزات الجديدة على العدلات ذات الكثافة الطبيعية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

اتبعت جميع التجارب بدقة المبادئ التوجيهية الأخلاقية التي وضعها مجلس المراجعة المؤسسية في جامعة برازيليا (العملية 13364819.0.0000.5558) ، وتم تحديد العينات بواسطة الرموز لضمان عدم الكشف عن هوية المانح. تم الحصول على الخلايا من متبرعين ذكور أصحاء طبيعيين تتراوح أعمارهم بين 18 و 35 عاما ، والذين وقعوا على الموافقة المستنيرة واستوفوا معايير الأهلية التالية: غير المدخنين / vapers ، ولا توجد حالات صحية مزمنة ، ولا يوجد تاريخ من الحالات الالتهابية في آخر 14 يوما.

1. جمع الدم

  1. ضع 0.3 مل من 5000 وحدة دولية / مل من الهيبارين (انظر جدول المواد) في حقنة معقمة سعة 20 مل لتهقيمها.
  2. ضع عاصبة وريدية حوالي 4 بوصات فوق موقع البزل وحدد الوريد المرفقي أو الرأسي المتوسط لبزل الوريد.
    ملاحظة: تأكد من أن إجمالي وقت العاصبة لا يتجاوز 1 دقيقة.
  3. تنظيف موقع ثقب مع الكحول 70 ٪ وإجراء بزل الوريد.
  4. اقلب المحقنة برفق ثلاث أو أربع مرات بعد جمع الدم لخلط الدم والهيبارين بشكل صحيح.

2. عزل العدلات

ملاحظة: يتم عزل الكريات البيض متعددة الأشكال النووية (PMNs) من خلال الطرد المركزي المتدرج الكثافة يليه تحلل منخفض التوتر لخلايا الدم الحمراء المتبقية (RBC) ، كما هو موضح سابقا11 مع بعض التغييرات. هذه الطريقة ليست إلزامية لإجراء فحوصات الفحص ، ويمكن استبدالها طالما أن الطريقة المختارة تؤدي إلى صلاحية >97٪ ، أو تحضير أو تنشيط <3٪ من PMNs ، وتنتج خلايا كافية لجميع المقايسات والنسخ المتماثلة والظروف. يعد تنفيذ هذه الخطوات في ظل ظروف معقمة واستخدام محاليل خالية من السموم الداخلية أمرا إلزاميا لتجنب تنشيط الخلية.

  1. اصنع تخفيفات 12 مل من وسائط فصل 60٪ و 70٪ (متوفرة تجاريا ؛ انظر جدول المواد) في أنابيب مخروطية سعة 50 مل.
  2. قم بإعداد التدرج من الأسفل إلى الأعلى بإضافة 4 مل في وقت التخفيف بنسبة 60٪ على التخفيف بنسبة 70٪ ، باستخدام ماصة 5 مل. افعل ذلك برفق لمنع خلط الواجهة.
  3. ضع طبقة 12 مل من الدم الهيبارين بعناية فوق تدرج الكثافة. أجهزة الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: من هذه الخطوة فصاعدا ، حتى تنشيط PMN ، يجب حفظ جميع الكواشف والأنابيب المستخدمة في مبرد مملوء بالثلج.
  4. تخلص من طبقة الخلايا البلازمية / أحادية النواة ، ثم انقل الطبقة برفق فوق حبيبات كرات الدم الحمراء إلى أنبوبين مخروطيين سعة 15 مل مع حوالي 7.5 مل في كل منهما. قم بتكوين حجم الأنبوب باستخدام محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS ؛ انظر جدول المواد).
  5. أجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 19 درجة مئوية.
  6. اغسل بيليه الخلية باستخدام HBSS.
    1. تخلص من المادة الطافية عن طريق صب الأنبوب وإعادة تعليق الحبيبات برفق في 7 مل من HBSS.
    2. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 19 درجة مئوية لإزالة جميع وسائط الفصل.
  7. أداء تحلل منخفض التوتر من كرات الدم الحمراء المتبقية.
    1. تخلص من المادة الطافية وادمج الكريات في أنبوب واحد.
    2. أعد تعليق حبيبات RBC / PMN في 3 مل من H2O المعقم وأضف 3 مل من HBSS (2x) في غضون 25 ثانية لاستعادة الأسمولية. ثم ، أجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 19 درجة مئوية.
    3. كرر الخطوتين 2.8.1 و2.8.2 للحصول على حبيبات بيضاء خالية من كريات الدم الحمراء.
      ملاحظة: يجب إزالة المادة الطافية في أسرع وقت ممكن لتقليل ملامسة العدلات لمنتجات انهيار كرات الدم الحمراء. بدلا من ذلك ، يمكن استبدال التحلل الثاني منخفض التوتر عن طريق تعليق طبقة كرات الدم الحمراء المتبقية برفق وإزالة كل المواد الطافية ، حيث أن كرات الدم الحمراء المتبقية سوف تترسب فوق حبيبات PMN.
  8. تخلص من المادة الطافية عن طريق سكب الأنبوب ، وأعد تعليق PMNs برفق في المخزن المؤقت المتبقي ، وانقلها إلى أنبوب دقيق بارد مثلج.
    ملاحظة: تأكد من إضافة تعليق توضيحي إلى وحدة التخزين أثناء نقل الخلايا المعاد تعليقها باستخدام ماصة دقيقة.
  9. انقل 3 × 1 ميكرولتر من معلق الخلية إلى شريحة زجاجية نظيفة (ثلاثة آبار سعة كل منها 1 ميكرولتر) وصبغها ببانوبتيك سريع (انظر جدول المواد) لتقييم التشكل والنقاء12.
    1. للتلوين باستخدام بانوبتيك سريع ، اغمر الشريحة خمس مرات في المثبت الشامل رقم 1 ، وست مرات في eosin رقم 2 ، ومرتين في الهيماتوكسيلين رقم 3 ، مع كل غمر يدوم 1 ثانية.
    2. اغسل الشريحة الزجاجية برفق بالماء المقطر.
    3. السماح لاستنزاف والهواء الجاف.
  10. راقب تحت المجهر وعد 300 خلية عشوائية في كل بئر ، وبالتالي تمييز العدلات عن الخلايا المحببة الأخرى.
  11. نقل 1 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى 49 ميكرولتر من 0.2٪ صبغة تريبانالزرقاء 13 وعد الخلايا باستخدام غرفة نيوباور ، والتمييز بين الخلايا الميتة والقابلة للحياة.
  12. اضبط تركيز الخلية على 6,667 خلية / ميكرولتر باستخدام محلول من 50٪ بلازما ذاتية و 50٪ HBSS مكملة بالكالسيوم والمغنيسيوم. قسم 6667 خلية / ميكرولتر بالتساوي بين الأنابيب الدقيقة المقابلة للظروف المراد اختبارها ، بما في ذلك التحكم السلبي.
    ملاحظة: يمكن استخدام أي تركيز خلية مشابه للعدلات المنتشرة في الكائن الحي النموذجي ، ولكن من المهم استخدام نفس تركيز الخلية في جميع التجارب من أجل التكاثر.

Figure 1
الشكل 1: بروتوكول عزل العدلات. يتم تكديس تركيزين من وسط الفصل (percoll) (A) (B) ، ثم يتم وضع طبقات الدم فوق تدرج الفصل (C). بعد الطرد المركزي ، يكون PMN في الطبقة المركزية (D) ، والتي تنقسم إلى أنبوبين سعة 15 مل (E). يتم غسل تعليق الخلية مرتين في HBSS والطرد المركزي (G-I) لإزالة الوسائط ، ثم يتم إعادة الخلايا ، ويتم تقديم كرات الدم الحمراء المتبقية إلى جولتين من تحلل منخفض التوتر (J-M). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

3. التحضير لتنشيط العدلات

  1. في الأنابيب الدقيقة سعة 1.5 مل ، قم بإعداد نظام تنشيط لكل حالة بحيث يكون تركيز الخلية النهائي 6600 خلية / ميكرولتر. على سبيل المثال ، لاختبار تأثيرات 100 نانومتر fMLP (N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine ؛ انظر جدول المواد) ، أضف 5 ميكرولتر من 10 ميكرومتر fMLP إلى 495 ميكرولتر من 6,667 خلية / ميكرولتر معلق. بالنسبة للتحكم السلبي (غير المحفز) ، أضف HBSS الذي يحتوي على Ca2+ و Mg2+.
    ملاحظة: لإثبات هذه المنهجية ، تم استخدام التركيزات النهائية التالية للمحفزات: 100 نانومتر fMLP ، 16 ميكرومتر من fallaxin ، ببتيد مضاد للميكروباتطبيعي 14 ، و 100 نانومتر PMA (phorbol 12-myristate 13-acetate) (انظر جدول المواد).
  2. احتضان في 37 درجة مئوية دون دوران.
    ملاحظة: يتم أخذ جميع الحصصات للمقايسات الوظيفية من تعليق الخلية هذا ، ويشار إليه فيما يلي باسم نظام التنشيط.

4. مقايسة كلوريد النيتروتيترازوليوم الأزرق (NBT) لتقييم إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية

  1. إعداد حل عمل NBT: لكل حالة تجريبية ، قم بإعداد حل عمل NBT (انظر جدول المواد) من 6 mM باستخدام الخطوات التالية:
    1. قم بإذابة 0.0005 جم من NBT في 10 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) والدوامة لمدة 15 دقيقة على الأقل.
    2. أضف 90 ميكرولتر من HBSS Ca2 + Mg2+ ودوامة تصل إلى دقيقتين.
      ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الخطوات التي تتضمن NBT في الظلام.
  2. قم بإجراء اختبار شرائح NBT.
    1. بعد 20 دقيقة من تنشيط الخلية ، امزج تعليق الخلية برفق وانقل بعناية 2 ميكرولتر من PMN إلى شريحة زجاجية نظيفة. احتضان لمدة 20 دقيقة في غرفة رطبة على حرارة 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: لا تنشر تعليق الخلية كثيرا على الشريحة ؛ وإلا فقد يجف قبل الحضانة.
    2. أضف 1 ميكرولتر من محلول عمل NBT فوق الخلايا واحتضانها لمدة 20 دقيقة محمية من الضوء.
    3. تجفيف الشريحة بالهواء الساخن وإصلاحه مع قطرة من الميثانول في كل بئر لمدة 1 دقيقة. بقعة مع 0.03٪ سافرانين (انظر جدول المواد) لمدة 1 دقيقة.
    4. اغسل الشريحة الزجاجية برفق بالماء المقطر.
    5. اترك الشريحة تجف في الهواء وراقبها تحت المجهر.
    6. عد 100 خلية عشوائية في كل بئر ، مع التمييز بين العدلات مع وبدون رواسب الفورمازان.
  3. إجراء مقايسة قياس الطيف الضوئي NBT.
    1. بعد 40 دقيقة من تنشيط الخلية ، امزج تعليق الخلية برفق وانقل 90 ميكرولتر من PMNs من نظام التنشيط إلى أنبوب دقيق نظيف. ثم أضف بعناية 20 ميكرولتر من محلول 6 mM NBT. احتضان في الظلام لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    2. أضف 100 ميكرولتر من 10٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS ؛ انظر جدول المواد) والدوامة.
    3. Sonicate باستخدام tip-sonicator بسعة 60 ٪ ، خمس دورات من 15 ثانية لكل منها مع فترات 15 ثانية. جهاز طرد مركزي عند 12000 × جرام لمدة 5 دقائق.
    4. انقل 60 ميكرولتر من المادة الطافية إلى صفيحة 96 بئرا صافية القاع وقم بقياس امتصاص منتج الفورمازان عند 570 نانومتر.

5. مقايسة البلعمة

  1. قم بإعداد معلق 33000 خميرة / ميكرولتر لكل حالة ، كما هو موضح أدناه:
    1. أضف ما يقرب من 0.75 مجم من الخميرة الجافة (Saccharomyces cerevisiae ؛ انظر جدول المواد) إلى 200 ميكرولتر من HBSS Ca2 + Mg2+ واحتضانها في خلاط حراري عند 100 درجة مئوية مع 500 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة على الأقل.
    2. تجانس الخليط عن طريق الدوامة ونقل 5 ميكرولتر من تعليق الخميرة إلى 45 ميكرولتر من صبغة تريبان الزرقاء 0.2٪. عد الخمائر باستخدام غرفة نيوباور.
    3. اضبط تركيز المعلق الأولي على 33000 خلية خميرة / ميكرولتر باستخدام HBSS Ca2 + Mg2+. الحفاظ على تعليق على الجليد حتى الاستخدام.
  2. بعد 20 دقيقة من تنشيط الخلية ، امزج تعليق الخلية برفق وانقل 5 ميكرولتر من نظام التنشيط إلى 5 ميكرولتر من 33000 خميرة / ميكرولتر معلق Saccharomyces cerevisiae في أنبوب دقيق معقم جديد.
    ملاحظة: نسبة العدلات إلى الخميرة هي 1: 5 (PMN: الخميرة).
  3. انقل على الفور 6 ميكرولتر من تعليق PMN / الخميرة إلى ثلاثة آبار من شريحة زجاجية نظيفة (2 ميكرولتر لكل منها) واحتضان الشريحة في غرفة مرطبة لمدة 40 دقيقة.
    ملاحظة: لا تنشر تعليق الخلية كثيرا على الشريحة ؛ خلاف ذلك ، قد يجف قبل الحضانة.
  4. جفف الشريحة تحت الهواء الساخن وصمة عار باستخدام بانوبتيك سريع ، كما هو موضح في الخطوة 2.9 أعلاه.
    ملاحظة: الخطوة الثالثة من تلطيخ بانوبتيك سريع أمر بالغ الأهمية للتحليل المجهري للشريحة. يمكن أن يؤدي تلطيخ الشريحة لمدة ≥3 ثوان في هذه الخطوة إلى جعلها غير صالحة للتحليل ، حيث سيكون من الصعب التمييز بين الخميرة والفصوص النووية العدلة.
  5. راقب الشرائح تحت المجهر ، عد 100 عدلة عشوائية لكل بئر والتمييز بين PMNs الإيجابية والسلبية للبلعمة.
    ملاحظة: يشير جسيم خميرة واحد على الأقل داخل الغشاء الخلوي PMN أو في اتصال مباشر معه إلى وجود PMN إيجابي للبلعمة. إذا كنت مهتما بنسبة الخميرة / العدلات ، فاحسب عدد جزيئات الخميرة المبتلعة أيضا.

6. الفحص الكيميائي PMN في الوقت الحقيقي

ملاحظة: يتم إجراء اختبار الترحيل بشكل مشابه للبروتوكول الموضح سابقا15 ، مع التعديلات التالية:

  1. قم بإعداد التدرج الكيميائي عن طريق إضافة 160 ميكرولتر من الجاذب الكيميائي (على سبيل المثال ، fMLP أو IL-8 أو C5 أو LTB4 ؛ انظر جدول المواد) إلى الغرفة السفلية للوحة محلل الخلايا في الوقت الحقيقي (RTCA) القائمة على المعاوقة. بالنسبة للضوابط السلبية والفراغات ، أضف 160 ميكرولتر من HBSS Ca2 + Mg2+.
  2. نعلق الغرفة العلوية وإضافة 25 ميكرولتر من HBSS Ca2 + Mg2+. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة على الأقل لتشكيل التدرج الكيميائي.
  3. بعد 60 دقيقة من تنشيط الخلية ، امزج تعليق الخلية برفق وضع 60 ميكرولتر من تعليق الخلية في الغرفة العلوية. أضف 60 ميكرولتر من HBSS Ca2 + Mg2+ إلى الفراغ.
  4. ضع لوحة RTCA وبرمج برنامج RTCA لقياس مؤشر الخلية (CI) كل 60 ثانية لمدة 2 ساعة.
    ملاحظة: يمكن غسل لوحات RTCA لإعادة استخدامها كما هو موضح سابقا16. باختصار ، اغسل غرف RTCA والأقطاب الكهربائية بمحلول ملحي من الفوسفات (PBS) ثلاث مرات ، ثم بمياه فائقة النقاء من النوع الأول مرتين. احتضان الحجرة السفلية والعلوية بنسبة 0.25٪ تربسين 0.53 مللي متر حمض الإيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA) لمدة 40 دقيقة. تغسل بالماء النقي ثلاث مرات.

7. صافي مقايسة موحية

  1. بعد 10 دقائق من تنشيط الخلية ، امزج تعليق الخلية برفق وانقل 4 ميكرولتر من PMNs من كل نظام تنشيط قيد التقييم ، مقسما إلى بئرين من شريحة زجاجية نظيفة. احتضان في غرفة رطبة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  2. أضف 1 ميكرولتر من DNAse I إلى أحد الآبار واحتضانها لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية (في غرفة رطبة).
  3. قم بتجفيف الشريحة والبقع باستخدام بانوبتيك سريع ، كما هو موضح سابقا في الخطوة 2.9 من قسم "عزل العدلات".
  4. تقييم الشرائح تحت المجهر.
    ملاحظة: ابحث عن أي إشارة إلى إصدار NET ، تتميز بوجود هياكل تشبه الويب. بمجرد تحديده ، تأكد مما إذا كان علاج DNA I قادرا على إزالة مثل هذه الهياكل. يشير هذا الفحص إلى تكوين NET ، حيث يلزم إجراء اختبارات إضافية لتأكيد وجودها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

استوفت طريقة العزل القائمة على الكثافة المستخدمة في هذه الدراسة (الشكل 1) معايير التجارب المقترحة. تضمنت معلمات العدلات التي تم الحصول عليها من هذه الطريقة الصلاحية ≥98٪ ، والنقاء ≥94٪ ، وإنتاجية الخلية ≥1.5 × 107 ، مع عدم وجود تنشيط يمكن اكتشافه بواسطة اختبارات الفحص. خطوتان ذات صلة في عزل PMNs هما منع التخثر وإزالة كرات الدم الحمراء. يمكن أن يؤثر الحفاظ على أنبوب الدم أو المحقنة المضادة للتخثر في حالة هزاز لطيف قبل وضع طبقات فوق تدرج الكثافة واختيار طريقة إزالة كرات الدم الحمراء لمنع كل من التنشيط والتلوث على إنتاجية التجربة وقابليتها للتكاثر.

لتقييم النظرة العامة الوظيفية لوظيفة العدلات ، تم تطوير سير عمل سمح بإجراء فحوصات الفحص المقترحة مع باحثين اثنين على الأقل في متوسط وقت 4 ساعات ، مع 1 ساعة من التنشيط و 2 ساعة من مراقبة الهجرة في الوقت الفعلي ، كما هو موضح في الشكل 2.

Figure 2
الشكل 2: سير عمل شاشة NeutroFun. لتقييم لوحة الاستجابات الوظيفية الناتجة عن ظروف محددة قيد التقييم ، يتضمن سير عمل NeutroFun Screen مشاركة باحثين على الأقل. يبدأ الباحث 1 (R1) عملية عزل PMN ، تليها تعديل تركيز الخلية وحضانة نظام التنشيط ، بينما في موازاة ذلك ، يقوم الباحث 2 (R2) بإعداد المواد لتنفيذ المقايسات التالية ، والتي تنقسم بين الاثنين: R1 يقوم بإجراء البلعمة ، NET ، ومقايسات NBT الطيفية ؛ يقوم R2 بإجراء اختبارات الترحيل في الوقت الفعلي واختبارات شرائح NBT. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تم تحسين اختبار NBT الكلاسيكي17 لكل من التقييم الشريطي والطيفي لتشكيل الفورمازان الناتج عن تفاعل NBT مع ROS الناتج عن PMNs. سمح الفحص الطيفي بالقياس الكمي النسبي بين الظروف ، في حين كان الفحص المجهري مفيدا للتحليل الوصفي وشبه الكمي ، وتقييم انتظام التوزيع البلوري ، والتشكل ، وعدد الخلايا التي تحتوي على الفورمازان. تظهر نتائج الفحص الطيفي في الشكل 3 أ ، مما يشير إلى أن 100 نانومتر PMA تسبب في ارتفاع إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (بمتوسط نسبة 3: 2: 1) مقارنة ب fMLP ومجموعات التحكم. أكدت نتائج اختبار شرائح NBT (الشكل 3B) نتائج القياس الطيفي ، وأظهرت أيضا أن PMA هو التحفيز الأكثر كثافة لإنتاج ROS مقارنة ب fMLP (الشكل 3C) ، كما هو موضح سابقا من خلال القياس المباشر ل ROS بواسطة القياس الخلوي18. فيما يتعلق بعدد الخلايا ، أظهر عدد العدلات التي تحتوي على بلورات الفورمازان نسبة 7: 4: 1 في PMA: fMLP: ظروف التحكم ، مما يكشف أيضا عن أنماط توزيع الفورمازان المختلفة بين fMLP و PMAs المنشطة PMA. أدى علاج fMLP إلى تنشيط الخلايا الفردية بشكل مكثف ، بينما تسبب PMA في تكوين بلورات الفورمازان المنتشرة في جميع أنحاء السيتوبلازم في غالبية PMNs. علاوة على ذلك ، لوحظت بعض الخصائص المورفولوجية التي ميزت الظروف ، مثل تجميع الخلايا التعبيرية بعد علاج PMA. يشير عدم وجود خصائص التنشيط النموذجية هذه والمستويات المنخفضة من الفورمازان في المجموعة الضابطة إلى أن حالة الراحة لم تكن مضطربة بشكل كبير. لذلك ، أثبت اختبار NBT أنه اختبار بسيط وغير مكلف وموثوق به لإنتاج ROS العدلات التي يمكن استخدامها لإلقاء نظرة عامة على قدرة وشدة حافز معين للحث على إنتاج ROS.

Figure 3
الشكل 3: اختبار NBT. (أ) التقييم الطيفي لانفجار الجهاز التنفسي للعدلات في ظروف مختلفة (التحكم السلبي: 100 نانومتر fMLP و 100 نانومتر PMA) عن طريق امتصاص الفورمازان (490-630 نانومتر). يتم عرض البيانات من أربعة مانحين كمتوسط ± الانحراف المعياري (SD). * = تختلف جميع المجموعات عن بعضها البعض (ص ≤ 0.05) ؛ £ = تظهر المقارنات CTRL مقابل PMA و fMLP مقابل PMA اختلافات كبيرة (p≤ 0.05). (ب) يمكن تحليل اختبار الشرائح نوعيا ، مع توصيف شدة رواسب الفورمازان ، وموقعها داخل الخلية ، وتجميع الخلايا. تشير الأسهم السوداء إلى بلورات الفورمازان. قضبان المقياس: 20 ميكرومتر. (ج) عدد PMNs التي تحتوي على الفورمازان ، محسوبة بواسطة المجهر الضوئي. تم تقديم البيانات من ثمانية مانحين كمتوسط ± SD. *** p < 0.0001 ، اختبار t للطالب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

استخدمت شرائح البلعمة لتحديد معدل البلعمة كنسبة مئوية من العدلات التي تؤدي البلعمة، كما هو موضح في الشكل 4. على الرغم من أن كلا من 100 نانومتر fMLP و 16 ميكرومتر من الببتيد المضاد للميكروبات تسبب في زيادة ابتلاع الخميرة على ما يبدو ، إلا أن الفرق لم يكن ذا دلالة إحصائية حتى التحفيز المزدوج ، مما عزز بشكل كبير البلعمة مقارنة بالمجموعة الضابطة وقد يشير إلى استجابة عند التحفيز المزدوج.

Figure 4
الشكل 4: اختبار البلعمة. تم تقييم العدلات من خلال قدرتها البلعمة (عد العدلات التي تحتوي على الخميرة). على الرغم من أن التعرض ل 100 نانومتر fMLP أو 16 ميكرومتر من الببتيد المضاد للميكروبات قبل حضانة الخميرة عزز البلعمة مقارنة بالمجموعة الضابطة ، (أ) لم تكن الزيادة ذات دلالة إحصائية. ومن المثير للاهتمام ، أن الحضانة الأولية مع fMLP ، تليها إضافة الببتيد المضاد للميكروبات ، أدت إلى زيادة كبيرة في البلعمة في العدلات البشرية (العلامة النجمية بين CTRL والببتيد المضاد للميكروبات fMLP +). (ب) تظهر الأسهم السوداء خلايا فطر الخميرة، وتظهر الأسهم الخضراء العدلات وحدها، وتشير الأسهم الحمراء إلى العدلات البلعمية. وقدمت البيانات الواردة من خمسة مانحين على أنها متوسط ± SD. قضبان المقياس: 20 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

يظهر مثال على نتائج هجرة الخلايا في الوقت الفعلي في الشكل 5 ، حيث يوضح التأثير الكيميائي المعروف ل 100 nM fMLP على العدلات. تم تعديل حركية هجرة الخلية وفقا لنموذج Gompertz ، مما يتيح مقارنة معلماته.

Figure 5
الشكل 5: ترحيل الخلايا في الوقت الفعلي. يعكس مؤشر الخلية المعاوقة الكهربائية الناتجة عن هجرة الخلايا. في هذا الفحص ، تم استخدام fMLP كعنصر تحكم إيجابي في هجرة العدلات عن طريق إضافة 100 نانومتر fMLP إلى الغرفة السفلية. احتوى عنصر التحكم السلبي (CTRL) على HBSS فقط في الغرفة السفلية. تمثل المنحنيات المتراكبة المنحنى المناسب لنموذج Gompertz ، وتم تعديلها لتناسب المنحدرات الصاعدة والتنازلية بشكل أفضل. بيانات من ثلاثة مانحين ، معروضة كمتوسط ± SD. * p < 0.05 ، اختبار t للطالب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

أخيرا ، يتم تقديم اختبار مجهري بصري بسيط يوحي بوجود NET ، حيث يتم تلطيخ PMNs ببانوبتيك سريع. من الممكن ملاحظة أنه بالنسبة لبعض المحفزات المحددة التي تحفز NET ، مثل PMA أو بعض الببتيدات المضادة للميكروبات ، حتى بعد وقت تنشيط قصير (1 ساعة) ، من الممكن ملاحظة الهياكل الخيطية الشبيهة بالشبكة بالقرب من الخلايا ، في حين أن هذا غير ممكن في ظروف أخرى مثل التحكم السلبي و fMLP (الشكل 6). لدعم هذا الادعاء بشكل أفضل ، تمت إضافة DNase I بعد 40 دقيقة من تنشيط الخلية باستخدام 100 نانومتر PMA أو ببتيد مضاد للميكروبات ، مما أدى إلى إزالة الهياكل الشبيهة بالشبكة (الشكل 6). على الرغم من أن هذه الطريقة غير مناسبة لتوصيف NET ويمكن أن تتأثر بالقطع الأثرية ، إلا أنها نقطة انطلاق رخيصة وبسيطة ومثيرة للاهتمام لتبرير المزيد من الاستثمارات في تحليل الشبكات ، خاصة في السياقات التي تكون فيها تأثيرات المحفزات غير معروفة أو موصوفة بشكل سيئ.

Figure 6
الشكل 6: مقايسة موحية لتشكيل الشبكة. قد يشير التحليل النوعي للعدلات الملطخة بالبانوبتيك بعد 1 ساعة من التنشيط على شريحة زجاجية إلى إطلاق صافي. لم تظهر مجموعات CTRL (A ، B) و fMLP (C ، D) أي مؤشر على إطلاق NET ، بينما أدى التنشيط باستخدام PMA (E-H) إلى تكوين هياكل شبيهة ب NET تدهورت بواسطة معالجة DNase I (I-L). أظهر التحقيق في آثار الببتيد المضاد للميكروبات على العدلات أن مثل هذا التحفيز قد يكون قادرا على استنباط إطلاق NET ، لأن الشرائح قدمت الهياكل الشبيهة ب NET (M-P) التي تدهورت بواسطة DNase I (Q-T). تشير الأسهم الحمراء إلى هياكل تشبه NET. قضبان المقياس: 10 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

العدلات هي خلايا ديناميكية للغاية وسريعة الاستجابة وقصيرة العمر ولا يمكن حفظها بالتبريدحتى الآن 19 ، مما يجعل التحقيقات في بيولوجيتها صعبة. لذلك ، من الضروري اتباع خطوات دقيقة للحصول على العدلات القابلة للحياة والمخصبة والراحة11,20. استخدمت هذه الدراسة تقنية عزل قائمة على الكثافة تؤكد على التلاعب اللطيف والحد الأدنى ، بالإضافة إلى استخدام درجات حرارة منخفضة حتى خطوة التنشيط. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن تتم معالجة الدم في غضون 30 دقيقة بعد بزل الوريد وأن يتم تخزينها في درجة حرارة الغرفة. يقدم العمل الحالي خيارا لتقليل إجهاد التلاعب ووقت التجربة. لتبسيط العملية بشكل أكبر ، قدمنا خطوة جديدة (كخيار) في البروتوكول ، والتي تتضمن إزالة كرات الدم الحمراء عن طريق إعادة التعليق اللطيف وشفط طبقة كرات الدم الحمراء بعد إجراء انحلال الدم واحد. تقلل هذه الخطوة من إجهاد التلاعب ووقت التجربة ، لأنها تزيل غالبية كرات الدم الحمراء بخطوة واحدة فقط من انحلال الدم منخفض التوتر. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن مهارات المشغل تؤثر بشكل كبير على فعالية هذه الخطوة ، وقد لا تزيل دائما كرات الدم الحمراء بالكامل. علاوة على ذلك ، يمكن أن يؤدي شفط كرات الدم الحمراء إلى فقدان العدلات ، لكن هذا لا يؤثر على المحصول ، حيث تم استرداد المزيد من العدلات في البداية من التدرج عند التجميع بالقرب من طبقة كرات الدم الحمراء. لذلك ، يوصى بشفط كرات الدم الحمراء إذا كانت المقايسات لا تتطلب أعلى نقاء ممكن ، أو إذا كان المشغل قد حقق نتائج جيدة باستمرار. بالنسبة لاختبارات الفحص المعروضة هنا ، فإن كمية صغيرة من كرات الدم الحمراء الملوثة (<3٪) لن تتداخل مع النتائج.

لضمان تنفيذ جميع الإجراءات في الوقت المناسب ، بما في ذلك إعداد الكاشف ، يتم تقديم سير عمل (الشكل 2) يوضح بالتفصيل الجدول الزمني وتقسيم المهام بين باحثين. بعد الانتهاء من جميع المقايسات الوظيفية ، يمكن تحضير الخلايا المتبقية لمزيد من التحقيقات الجزيئية ، مثل دراسات omics عن طريق تحلل الخلية مع المخزن المؤقت والتخزين المناسبين.

إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية
انفجار الجهاز التنفسي هو السمة المميزة لفتيلة العدلات وتنشيطها18،21 ، وتقييم إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية هو طريقة شائعة تستخدم لتقدير حالة تنشيط العدلات. قيمت هذه الدراسة إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية باستخدام نهجين: الفحص المجهري الضوئي والقياس الطيفي.

اختبار NBT هو نهج معروف لتقييم انفجار الجهاز التنفسي في العدلات22,23. طريقتان شائعتان الاستخدام هما الفحص المجهري الضوئي (أو اختبار الشرائح) والمقايسات القائمة على القياس الطيفي24،25،26. على الرغم من أن الفحص المجهري الضوئي يسمح بتصور التفاصيل على مستوى الخلية ، إلا أنه عرضة لتحيز المستخدم. لذلك ، يعمل اختبار شرائح NBT كمكمل نوعي للمقايسة الطيفية فيما يتعلق بميزات النمط الظاهري ، مثل أنماط تكوين الفورمازان وشدته وتجميع الخلايا.

الخطوات الحاسمة لكل من الشريحة NBT والاختبارات الطيفية هي NBT والذوبان الكامل للفورمازان. على عكس توصيات الشركة المصنعة ، لا يذوب NBT جيدا في الماء. ومع ذلك ، فإن تجانس NBT في DMSO لمدة 15 دقيقة على الأقل ثم إضافة الماء / HBSS والدوامة لمدة 2 دقيقة يوفر الذوبان الكامل. بالإضافة إلى ذلك ، لتحليل امتصاص الفورمازان ، يجب تحقيق خطوتين حاسمتين: (1) إطلاق بلورات الفورمازان من الخلايا عن طريق تحلل PMN و (2) الذوبان الكامل لبلورات الفورمازان. تم تحقيق كلتا الخطوتين من خلال معالجة حبيبات الخلية بنسبة 10٪ SDS ، كما اقترح مؤخرا27 ، تليها تحليل صوتنة وامتصاص المادة الطافية عند 570 نانومتر.

علاوة على ذلك ، فإن نتائج NBT للمجموعات الضابطة السلبية والإيجابية هي الخطوة الأولى للفحص الذي يجب تقييمه. يجب أن تظهر هذه الخطوة فرقا ملحوظا ، حيث يشير تقييم إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية من خلال الفورمازان إلى ما إذا كانت عملية العزل مسؤولة عن التغييرات غير المرغوب فيها في حالة الراحة للخلايا إما عن طريق التحفيز أو التثبيط.

غالبا ما تستخدم طرق أخرى ، مثل تقليل السيتوكرومج 28 أو تحليل قياس التدفق الخلوي29 ، للكشف عن أنواع الأكسجين التفاعلية ؛ ومع ذلك ، بالنظر إلى نهج الفحص ، يتطلب تطبيقها وقتا أطول للتجربة ، واستخدام علامات محددة ، وأدوات باهظة الثمن. يعد التلألؤ الكيميائي للمينول / الأيزولومينول طريقة سريعة وفعالة من حيث التكلفة للكشف عن أنواع الأكسجين التفاعلية مع السماح أيضا بالتمايز بين أنواع الأكسجين التفاعلية داخل وخارج الخلية. ومع ذلك ، مطلوب مقياس الإنارة لهذه الطريقة30,31. على الرغم من أنه يمكن التحايل على تكلفة الأداة باستخدام مرفق ، إلا أنه سيظل غير صالح لتحليل الفرز الذي يتم إجراؤه في وقت واحد مع المقايسات الأخرى.

البلعمه
يوفر حضانة PMN / الخميرة نظرة عامة على قدرة البلعمة العدلة وفعاليتها من خلال حساب عدد العدلات التي تؤدي البلعمة وعدد الخمائر التي يتم ابتلاعها لكل عدلات. ومع ذلك ، نظرا لأن جسيم الخميرة نفسه هو إشارة تنشيط ، فإن مقارنة المجموعة الضابطة مع PMN المعالج مسبقا يشكل نظام تحفيز مزدوج ، والذي قد لا يعرض تغييرات كبيرة ، كما هو موضح في CTRL مقابل PMN المعالج ب fMLP (الشكل 4). ومع ذلك ، فإن هذا الاختبار مفيد في الإشارة إلى ما إذا كان المغير المحتمل سيولد أي تأثير على البلعمة. تم اختبار ببتيد جديد مضاد للميكروبات باستخدام هذا الفحص ، وتشير النتائج إلى استجابة محتملة مثيرة للاهتمام لهذا المزيج من المحفزات ، والتي تمت مناقشتها مؤخرا حسب الحاجة للتنشيطالفعال 32.

الخطوة الحاسمة لهذا الفحص هي التلوين ، حيث يصبح التحليل غير موثوق به إذا تم الاحتفاظ بالشريحة على panoptic رقم 3 (الهيماتوكسيلين) لمدة ≥3 ثوان. وذلك لأنه لا يمكن تمييز خلايا فطر الخميرة والفصوص النووية المتعادلة بعضها عن بعض. علاوة على ذلك ، يسمح هذا النهج بتحليل مورفولوجيا العدلات بعد التعرض للمعدلات. قياس التدفق الخلوي هو تقنية فعالة أخرى لتحليل البلعمة33 ، على الرغم من أن لها قيودا من خلال صعوبة التمييز بين الجسيمات المرتبطة بالغشاء والغارقة والعوامل الأخرى المتعلقة بمجموعة الفحص المقترحة ، كما تمت مناقشته في الموضوع السابق. ويلاحظ نفس القيد في الطريقة الموصوفة هنا، على الرغم من أن هذا يعتبر بمثابة فحص أولي لتوجيه دراسات المتابعة.

الترحيل في الوقت الحقيقي
تم تحسين بروتوكول الفحص في الوقت الفعلي لتقييم قدرة ترحيل PMNs. على الرغم من أن دراسة سابقة أشارت إلى أن طلاء الجانب السفلي من لوحة RTCA كان ضروريا لمقايسة الهجرة لإظهار الفرق بين التحكم السلبي ومعالجة IL-815 ، أظهرت هذه الدراسة قيم فاصل ثقة عالية (CI) للخلايا المعالجة ب fMLP دون إضافة عوامل طلاء. قدمت النتائج قابلية عالية للتكاثر مع هجرة كبيرة من 12 دقيقة فصاعدا. علاوة على ذلك ، يمكن أن يكشف تحليل ملاءمة المنحنى لبيانات الهجرة التي تم الحصول عليها عن معلمات ، مثل الحد الأقصى لمؤشر الخلية وكذلك زيادة ونقصان المنحدر ، والتي تكون مفيدة لفهم ديناميكيات الهجرة ، وقد تعتمد على التركيز أو تختلف بين الظروف. كان أفضل ملاءمة لمنحنيات هجرة العدلات (الشكل 5) هو دالة Gompertz المعدلة34 ، مما يدل على أن fMLP يزيد من الحد الأقصى لمؤشر الخلية وزيادة الميل.

مطلوب اهتمام خاص لتجنب الفقاعات في نظام RTCA لأنها يمكن أن تمنع الخلايا التي تمر عبر الأقطاب الكهربائية ، مما يعرض التجربة للخطر. العامل المحدد هو التكلفة العالية للوحات. على الرغم من أن التقنيات الأرخص تحلل هجرة الخلايا ، إلا أنها تفتقر إلى قابلية التكاثر الجيدة أو صعبة وتستغرق وقتا طويلا ، مثل غرفة Boyden35. لذلك ، RTCA هو تحليل ترحيل موثوق به متوافق مع اختبارات الفحص الأخرى المعروضة هنا.

شباك
أخيرا ، تم تطوير اختبار واعد وسهل ومنخفض التكلفة لإجراء تقييم أولي لتشكيل NET باستخدام المجهر الضوئي. تم اشتقاقه من ملاحظة شرائح البلعمة ، حيث تسبب PMA ، وهو حافز محدد يحفز NET تم اختباره لتأثيره على قدرة البلعمة ، في تكوين بنية تشبه الويب مقارنة بمجموعات CTRL و fMLP. افترض هذا العمل أن هذه الهياكل يمكن أن تشير إلى الإصدار الصافي. تم اختبار هذه الفرضية عن طريق معالجة العينات باستخدام DNase I بعد التنشيط ، حيث لم يتم العثور على هياكل خيطية في العدلات المنشطة PMA. يعتمد الافتراض بأن مثل هذه الهياكل من المحتمل أن تكون شبكات NETs على حقيقة أن PMA يتم الاستشهاد به كمحفز معروف لتشكيل NET 36,37 ، والعثور على هياكل مماثلة بواسطة المجهر الفلوري باستخدام علامات محددة ل NETs38,39 وتدهور NETs التي يحفزها DNase I40,41. من المهم التأكيد على أن هذه ليست طريقة لتأكيد تكوين NET ، ولكنها مجرد فحص أولي يشير إلى وجود NETs. على الرغم من أن هذا الاختبار له قيود ، حيث يمكن الخلط بين NETs والتحف الملطخة ، إلا أنه يخدم غرضا ذا صلة في اقتراح تكوين NET في فحص سريع ومنخفض التكلفة يمكن إجراؤه مع اختبارات وظيفية أخرى. بمجرد اكتشافها على أنها ذات صلة بالدراسة التي يتم فحصها ، يمكن تقييم الشبكات بشكل أكبر بواسطة المجهر البؤري أو المجهريالإلكتروني 42 ، كما تمت مناقشته لاحقا.

في مختبرنا ، يتم تقييم الببتيدات الجديدة المضادة للميكروبات ، والتي من المحتمل أيضا أن يكون لها أنشطة مناعية ، بشكل متكرر من خلال هذه المجموعة من فحوصات الفحص لتوجيه المزيد من التحليل بشكل أفضل لتأثيرات بعض الببتيدات على العدلات البشرية ، حيث يظهر البعض خصائص ROS43 المثيرة للاهتمام ، البلعمة ، الهجرة و / أو خصائص تعديل الشبكة.

في الختام ، توفر شاشة NeutroFun أداة قيمة لتحديد المعدلات المحتملة لنشاط العدلات ذات الكثافة الطبيعية من عدد كبير من المركبات غير المختبرة. ومع ذلك ، من المهم ملاحظة أن هذه الطريقة تعمل فقط كفحص أولي. بعد هذا الفحص الأولي ، يمكن توجيه منهجيات أكثر تكلفة ومتقدمة وتستغرق وقتا طويلا إلى وظائف أو مسارات محددة تقترحها هذه النتائج الأولية للتحقق من صحة البيانات. لإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية ، والبلعمة ، وتكوين NET ، هناك طرق بديلة للتحقق من صحة البيانات والحصول على مزيد من النتائج الكمية. يمكن إجراء التصور الصافي والقياس الكمي من خلال التحليل المجهري المناعي ، والذي يحدد وجود وتداخل الحمض النووي خارج الخلية والبروتينات الحبيبية ، مثل الميلوبيروكسيديز والإيلاستاز العدلات ، كما هو موضح بالتفصيلمؤخرا 42. تلعب أنواع الأكسجين التفاعلية أدوارا حاسمة مختلفة في العديد من العمليات البيولوجية ، وبالتالي فإن دراستها واسعة الانتشار ومتنوعة. من بين المنهجيات الأكثر رسوخا تلك التي تستخدم الأجسام المضادة ، مثل مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) والنشاف المناعي للتلألؤ ، أو الكشف عن التألق - مثل قياس التدفق الخلوي للخلايا تحت علامات مختلفة - من خلال DCFDA ، التحليل الطيفي EPR ، وقياسات النشاط الأنزيمي44. وبالمثل ، يتم إجراء تقييم قوي للبلعمة بعدة طرق. تشمل الطرق البديلة قياس التدفق الخلوي وحده45,46 أو جنبا إلى جنب مع المجهر الفلوري47. إن ترحيل الخلايا في الوقت الفعلي الموصوف هو اختبار قوي وكاف لا يتطلب مزيدا من التحقق من الصحة ويقدم معلمات لا يمكن للمنهجيات الأخرى التفكير فيها. قد تتناسب مجموعات أخرى من هذه الأساليب بشكل أفضل مع سيناريوهات محددة ، ولكن باختصار ، يمثل هذا مزيجا سريعا وبأسعار معقولة يشمل العديد من أنشطة العدلات.

باختصار ، تهدف هذه الدراسة إلى توفير مجموعة من المقايسات التي تتكون من منهجيات بسيطة وسريعة ومنخفضة التكلفة لتقييم استجابات العدلات المتعددة للجزيئات والظروف الجديدة كوسيلة لتوجيه الجهود بشكل أفضل نحو المنهجيات المتقدمة. كقيود رئيسية ، يجب اعتبار النتائج من فحوصات ROS و NET والبلعمة أولية وتحتاج إلى مزيد من التحقق من الصحة من خلال فحوصات أكثر تحديدا وتفصيلا ، وتلك التي تعتمد على عدد خلايا الفحص المجهري غير الآلي عرضة للتحيز اللاواعي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgments

يعترف المؤلفون بوكالات التمويل التالية: FAPDF و CNPq و CAPES و UnB و FINEP و FINATEC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CIM-Plate 16 Agilent  5665825001
CLARIOstar Plate Reader  BMG LABTECH US Patent Number 9,733,124
Product details: MARS Data Analysis Software
Dimethyl sulfoxide Dinâmica 1582
DNAse I Sigma - Aldrich DN 25
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate Sigma - Aldrich E5134
Fast panoptic stain Laborclin 620529
Glass slide Exacta 7102
Hank’s Balanced Salt Solution with calcium, with magnesium, without phenol red. Sigma - Aldrich 55037C
Hank’s Balanced Salt Solution without calcium chloride, magnesium sulfate and sodium bicarbonate. Sigma - Aldrich H4641
Heparin Blau  7896014655229
Laminar flow cabinet Veco VLFS-12
Microscope Zeiss 415501-0101-002 Product details: Primostar 1
Mixing Block BIOER MB-102
Neubauer improved bright-lined New Optik 1110000
N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine Sigma - Aldrich F3506
Nitroblue tetrazolium Neon CAS 298-83-9
Percoll Cytiva 17089101 separation media
Phorbol 12-myristate 13-acetate Sigma - Aldrich P8139
Phosphate buffered saline tablet Sigma - Aldrich P4417
ROTOFIX 32 A Hettich 1206
Saccharomyces cerevisiae Fleischmann
Safranin Sigma - Aldrich 50240
Sodium dodecyl sulfate Cytiva 17-1313-01
Sonicator Qsonica Q125
Trypan blue solution Vetec C.I. 23850
Vortex Genie 2 Scientific Industries, Inc. 0K-0500-902
xCELLigence Real-Time Cell Analysis (RTCA) DP (dual purpose) Agilent  380601050 Product details: RTCA system composed of detection hardware, cell plates and software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nature Immunology. 15 (7), 602-611 (2014).
  2. Groeneweg, L., Hidalgo, A. Emerging roles of infiltrating granulocytes and monocytes in homeostasis. Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (19), 3823-3830 (2020).
  3. Rosales, C., Lowell, C. A., Schnoor, M., Uribe-Querol, E. Neutrophils: their role in innate and adaptive immunity 2017. Journal of Immunology Research. 2017, 9748345 (2017).
  4. Castro, M., et al. Proteome analysis of resting human neutrophils. Protein & Peptide Letters. 13 (5), 481-487 (2006).
  5. Li, Y., et al. The regulatory roles of neutrophils in adaptive immunity. Cell Communication and Signaling. 17, 147 (2019).
  6. de Oliveira, S., Rosowski, E. E., Huttenlocher, A. Neutrophil migration in infection and wound repair: going forward in reverse. Nature Reviews Immunology. 16 (6), 378-391 (2016).
  7. Burn, G. L., Foti, A., Marsman, G., Patel, D. F., Zychlinsky, A. The neutrophil. Immunity. 54 (7), 1377-1391 (2021).
  8. El-Benna, J., et al. Priming of the neutrophil respiratory burst: role in host defense and inflammation. Immunological Reviews. 273 (1), 180-193 (2016).
  9. Castro, M. S., Cilli, E. M., Fontes, W. Combinatorial synthesis and directed evolution applied to the production of alpha-helix forming antimicrobial peptides analogues. Current Protein & Peptide Science. 7 (6), 473-478 (2006).
  10. Mihaila, A. C., et al. Transcriptional profiling and functional analysis of N1/N2 neutrophils reveal an immunomodulatory effect of S100A9-blockade on the pro-inflammatory N1 subpopulation. Frontiers in Immunology. 12, 708770 (2021).
  11. Kuhns, D. B., Priel, D. A. L., Chu, J., Zarember, K. A. Isolation and functional analysis of human neutrophils. Current Protocols in Immunology. 111 (1), 7-23 (2015).
  12. Paulíková, E., Kociková, A., Sabol, M. Modification of a panoptic method of staining isolated cells. Bratislavske Lekarske Listy. 94 (12), 638-640 (1993).
  13. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111 (1), 1-3 (2015).
  14. Libério, M. S., et al. Anti-proliferative and cytotoxic activity of pentadactylin isolated from Leptodactylus labyrinthicus on melanoma cells. Amino Acids. 40 (1), 51-59 (2011).
  15. Cano, P. M., Vargas, A., Lavoie, J. P. A real-time assay for neutrophil chemotaxis. BioTechniques. 60 (5), 245-251 (2016).
  16. Stefanowicz-Hajduk, J., Adamska, A., Bartoszewski, R., Ochocka, J. R. Reuse of E-plate cell sensor arrays in the xCELLigence Real-Time Cell Analyzer. BioTechniques. 61 (3), 117-122 (2016).
  17. Björkstén, B., Nyström, K., Lindqvist, B. The nitroblue tetrazolium (NBT) test in endemic benign (epidemic) nephropathy. Acta Medica Scandinavica. 199 (1-6), 147-150 (1976).
  18. Aquino, E., et al. Proteomic analysis of neutrophil priming by PAF. Protein & Peptide Letters. 23 (2), 142-151 (2016).
  19. Blanter, M., Gouwy, M., Struyf, S. Studying neutrophil function in vitro: cell models and environmental factors. Journal of Inflammation Research. 14, 141-162 (2021).
  20. Hsu, A. Y., Peng, Z., Luo, H., Loison, F. Isolation of human neutrophils from whole blood and buffy coats. Journal of Visualized Experiments. (175), e62837 (2021).
  21. Moghadam, Z. M., Henneke, P., Kolter, J. From flies to men: ROS and the NADPH oxidase in phagocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 628991 (2021).
  22. Pattan, S. S., Bhat, K. G., Pattar, G. D., Kuntagi, M. Comparison of three different techniques for isolation of neutrophils from blood and their utility in performing nitroblue tetrazolium test. International Journal of Basic and Applied Physiology. 8 (1), 41 (2019).
  23. Gooty, J. R., Shashirekha, A., Guntakala, V. R., Palaparthi, R. Estimation of phagocytic activity of polymorphonuclear leukocytes in chronic and aggressive periodontitis patients with nitroblue tetrazolium test. Journal of Indian Society of Periodontology. 23 (4), 316 (2019).
  24. Langer, S., et al. Clinical and laboratory profiles of 17 cases of chronic granulomatous disease in north India. Indian Journal of Hematology and Blood Transfusion. 37 (1), 45-51 (2021).
  25. Oualha, R., et al. Infection of human neutrophils with Leishmania infantum or Leishmania major strains triggers activation and differential cytokines release. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 9, 153 (2019).
  26. Zilinskas, J., Zekonis, J., Zekonis, G., Valantiejiene, A., Periokaite, R. The reduction of nitroblue tetrazolium by total blood in periodontitis patients and the aged. Stomatologijal. 9 (4), 105-108 (2007).
  27. Benov, L. Improved formazan dissolution for bacterial MTT assay. Microbiology Spectrum. 9 (3), e01637 (2021).
  28. Chen, Y., Junger, W. G. Measurement of oxidative burst in neutrophils. Methods in Molecular Biology. 844, 115-124 (2012).
  29. Richardson, M. P., Ayliffe, M. J., Helbert, M., Davies, E. G. A simple flow cytometry assay using dihydrorhodamine for the measurement of the neutrophil respiratory burst in whole blood: comparison with the quantitative nitrobluetetrazolium test. Journal of Immunological Methods. 219 (1-2), 187-193 (1998).
  30. Jancinová, V., et al. The combined luminol/isoluminol chemiluminescence method for differentiating between extracellular and intracellular oxidant production by neutrophils. Redox Report. 11 (3), 110-116 (2006).
  31. Nosál, R., et al. Pharmacological intervention with oxidative burst in human neutrophils. Interdisciplinary Toxicology. 10 (2), 56-60 (2017).
  32. Mol, S., et al. Efficient neutrophil activation requires two simultaneous activating stimuli. International Journal of Molecular Sciences. 22 (18), 10106 (2021).
  33. Schneider, L., et al. Flow cytometry evaluation of CD14/CD16 monocyte subpopulations in systemic sclerosis patients: a cross sectional controlled study. Advances in Rheumatology. 61 (1), 27 (2021).
  34. Akin, E., Pelen, N. N., Tiryaki, I. U., Yalcin, F. Parameter identification for gompertz and logistic dynamic equations. PLoS One. 15 (4), e0230582 (2020).
  35. Guy, J. B., et al. Evaluation of the cell invasion and migration process: A comparison of the video microscope-based scratch wound assay and the boyden chamber assay. Journal of Visualized Experiments. (129), e56337 (2017).
  36. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  37. de Bont, C. M., Koopman, W. J. H., Boelens, W. C., Pruijn, G. J. M. Stimulus-dependent chromatin dynamics, citrullination, calcium signalling and ROS production during NET formation. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1865, 1621-1629 (2018).
  38. Masuda, S., et al. Measurement of NET formation in vitro and in vivo by flow cytometry. Cytometry Part A. 91 (8), 822-829 (2017).
  39. Zharkova, O., et al. A flow cytometry-based assay for high-throughput detection and quantification of neutrophil extracellular traps in mixed cell populations. Cytometry Part A. 95 (3), 268-278 (2019).
  40. Hosseinnejad, A., et al. DNase I functional microgels for neutrophil extracellular trap disruption. Biomaterials Science. 10 (1), 85-99 (2022).
  41. Chrysanthopoulou, A., et al. Neutrophil extracellular traps promote differentiation and function of fibroblasts. The Journal of Pathology. 233 (3), 294-307 (2014).
  42. Tong, M., Abrahams, V. M. Visualization and quantification of neutrophil extracellular traps. Methods in Molecular Biology. 2255, 87-95 (2021).
  43. Santana, C. J. C., et al. Biological properties of a novel multifunctional host defense peptide from the skin secretion of the chaco tree frog, boana raniceps. Biomolecules. 10 (5), 790 (2020).
  44. Murphy, M. P., et al. Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo. Nature Metabolism. 4 (6), 651-662 (2022).
  45. Boero, E., et al. Use of flow cytometry to evaluate phagocytosis of staphylococcus aureus by human neutrophils. Frontiers in Immunology. 12, 635825 (2021).
  46. Karsten, C. B., et al. A versatile high-throughput assay to characterize antibody-mediated neutrophil phagocytosis. Journal of Immunological Methods. 471, 46-56 (2019).
  47. Smirnov, A., Solga, M. D., Lannigan, J., Criss, A. K. Using imaging flow cytometry to quantify neutrophil phagocytosis. Methods in Molecular Biology. 2087, 127-140 (2020).

Tags

هذا الشهر في JoVE ، العدد 204 ،
مجموعة من تقنيات الفحص للحصول على نظرة عامة سريعة على وظيفة العدلات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Souza Luz, I., Takaya, R., Gonzaga… More

Souza Luz, I., Takaya, R., Gonzaga Ribeiro, D., Sales Silva, N., Fontes, L., Castro, M. S., Fontes, W. A Set of Screening Techniques for a Quick Overview of the Neutrophil Function. J. Vis. Exp. (204), e65329, doi:10.3791/65329 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter