Summary
Dit protocol bevat een reeks neutrofiele functionele assays die kunnen worden gebruikt als screeningsmethode om functies van verschillende signaalroutes te dekken. Het protocol omvat een eerste en eenvoudige evaluatie van de levensvatbaarheid van cellen, zuiverheid, productie van reactieve zuurstofsoorten, real-time migratie, fagocytose en een voorlopige suggestie van extracellulaire neutrofiele vallen.
Abstract
Neutrofielen staan bekend als een van de eerste verdedigingslinies in de aangeboren immuunrespons en kunnen veel specifieke cellulaire functies uitvoeren, zoals chemotaxis, omgekeerde migratie, fagocytose, degranulatie van cytotoxische enzymen en metabolieten en afgifte van DNA als neutrofiele extracellulaire vallen (NET's). Neutrofielen hebben niet alleen zelf een strak gereguleerde signalering, maar nemen ook deel aan de regulatie van andere componenten van het immuunsysteem. Aangezien verse neutrofielen terminaal gedifferentieerd zijn, van korte duur zijn en zeer variabel zijn tussen individuen, is het belangrijk om het meeste uit de verzamelde monsters te halen. Onderzoekers moeten vaak screeningstests uitvoeren om een overzicht te krijgen van de vele neutrofiele functies die kunnen worden beïnvloed door specifieke omstandigheden die worden geëvalueerd. Om aan deze behoefte te voldoen, werd een reeks tests ontwikkeld na een enkel isolatieproces van neutrofielen met normale dichtheid, waarbij werd gezocht naar een evenwicht tussen snelheid, volledigheid, kosten en nauwkeurigheid. De resultaten kunnen worden gebruikt om diepgaande vervolgstudies te beredeneren en te begeleiden. Deze procedure kan worden uitgevoerd in een gemiddelde tijd van 4 uur en omvat de evaluatie van de levensvatbaarheid van cellen, de productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS), real-time migratie en fagocytose van gist op glasplaatjes, waardoor er voldoende cellen overblijven voor meer gedetailleerde benaderingen zoals omics-studies. Bovendien omvat de procedure een manier om gemakkelijk een voorlopige suggestie van NET waar te nemen na snelle panoptische kleuring waargenomen door lichtmicroscopie, met een gebrek aan specifieke markers, zij het voldoende om aan te geven of verdere inspanningen op die manier de moeite waard zouden zijn. De diversiteit aan geteste functies combineert gemeenschappelijke punten tussen tests, waardoor de analysetijd en -kosten worden verminderd. De procedure kreeg de naam NeutroFun Screen, en hoewel het beperkingen heeft, brengt het de bovengenoemde factoren in evenwicht. Bovendien is het doel van dit werk niet een definitieve testset, maar eerder een richtlijn die gemakkelijk kan worden aangepast aan de middelen en eisen van elk lab.
Introduction
Neutrofielen zijn de meest voorkomende aangeboren immuuncellen in menselijk bloed en het is bekend dat ze een belangrijke rol spelen bij infectie en ontsteking, omdat ze de eerste responders zijn die op de plaats van weefselbeschadiging aankomen1. In de afgelopen jaren is er een groeiende erkenning van de cruciale rol die neutrofielen spelen bij een verscheidenheid aan ziekten en bij het ondersteunen van homeostase2. Neutrofielen hebben niet alleen zelf een strak gereguleerde signalering, maar nemen ook deel aan de regulatie van andere componenten van het immuunsysteem 3,4,5. Daarom is het onderzoeken van neutrofielen en hun vele ongebruikelijke cellulaire functies, zoals chemotaxis, omgekeerde migratie6, fagocytose7, respiratoire uitbarsting8 en het vrijkomen van neutrofiele extracellulaire vallen (NET's)7, absoluut noodzakelijk in tal van onderzoekscontexten waar het noodzakelijk is om de potentiële neutrofiele functionele, morfologische of moleculaire veranderingen te beoordelen die worden veroorzaakt door specifieke omstandigheden die worden geanalyseerd.
Pas geïsoleerde neutrofielen zijn terminaal gedifferentieerd, kortlevend, zeer dynamisch en gemakkelijk te activeren9. Een efficiënte opslagmethode die geen invloed heeft op de neutrofielenresponsen is echter nog niet bereikt, waardoor het een uitdaging is om meerdere tests uit te voeren die ononderbroken moeten zijn. Bovendien zijn eerder beschreven functionele analyses 10,11, gebaseerd op tests die cytometrie en/of fluorescerende kleuring vereisen, mogelijk geen haalbare keuze wanneer een brede en eerste evaluatie van de neutrofielen nodig is.
Om deze problemen aan te pakken, beschrijft dit protocol een reeks tests die kunnen worden uitgevoerd na een enkel isolatieproces, waaronder de evaluatie van de levensvatbaarheid van cellen, de productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS), real-time migratie en fagocytose van Saccharomyces cerevisiae, waarvan de resultaten kunnen worden gebruikt om diepgaande vervolgstudies te redeneren. Deze procedure, NeutroFun Screen genaamd, is ontworpen om de belangrijkste effectoractiviteiten te omvatten, behalve degranulatie, en kan worden voltooid in een gemiddelde tijd van 4 uur, inclusief 1 uur activering. Bovendien kunnen de resterende cellen worden gebruikt voor meer gedetailleerde benaderingen zoals omics-studies. Het voordeel van deze methode ligt in de balans tussen snelheid, volledigheid, kosten en nauwkeurigheid.
Bovendien is er een manier om gemakkelijk een voorlopige suggestie van NET waar te nemen, zonder specifieke markers, maar voldoende om aan te geven of verdere inspanningen in die richting de moeite waard zouden zijn. De diversiteit aan geteste functies is bedoeld om gemeenschappelijke punten tussen tests te combineren, waardoor de analysetijd en -kosten worden verminderd. Het belangrijkste doel van deze methode is om een evenwichtige, functionele analyse te bieden met betrekking tot snelheid, volledigheid, kosten en nauwkeurigheid die een overzicht mogelijk maakt van de respons van de neutrofielen, waardoor het een nuttige eerste stap is in het onderzoeken van de effecten van nieuwe stimuli op neutrofielen met normale dichtheid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten volgden strikt de ethische richtlijnen die zijn opgesteld door de institutionele beoordelingsraad van de Universiteit van Brasilia (proces 13364819.0.0000.5558), en monsters werden geïdentificeerd door codes om de anonimiteit van de donor te waarborgen. De cellen werden verkregen van normale gezonde mannelijke donoren in de leeftijd van 18-35 jaar, die de geïnformeerde toestemming ondertekenden en voldeden aan de volgende geschiktheidscriteria: niet-rokers/vapers, geen chronische gezondheidsproblemen en geen voorgeschiedenis van ontstekingsaandoeningen in de afgelopen 14 dagen.
1. Bloedafname
- Plaats aseptisch 0,3 ml heparine van 5.000 IE/ml (zie materiaaltabel) in een steriele spuit van 20 ml om het te hepariniseren.
- Breng een veneuze tourniquet ongeveer 4 inch boven de prikplaats aan en identificeer de mediane cubitale of cephalische ader voor venapunctie.
NOTITIE: Zorg ervoor dat de totale tourniquettijd niet langer is dan 1 minuut. - Reinig de prikplaats met 70% alcohol en voer de venapunctie uit.
- Keer de spuit drie of vier keer voorzichtig om nadat u het bloed hebt verzameld om het bloed en de heparine goed te mengen.
2. Isolatie van neutrofielen
OPMERKING: Polymorfonucleaire leukocyten (PMN's) worden geïsoleerd door middel van dichtheidsgradiëntcentrifugatie gevolgd door hypotone lysis van de resterende rode bloedcellen (RBC), zoals eerder beschreven11 met enkele veranderingen. Deze methode is niet verplicht om de screeningstests uit te voeren en kan worden vervangen zolang de gekozen methode resulteert in een levensvatbaarheid van >97%, priming of activering van <3% van de PMN's en voldoende cellen oplevert voor alle tests, replicaten en omstandigheden. Het uitvoeren van deze stappen onder aseptische omstandigheden en het gebruik van endotoxinevrije oplossingen zijn verplicht om celactivering te voorkomen.
- Maak verdunningen van 12 ml van 60% en 70% scheidingsmedia (in de handel verkrijgbaar; zie Materiaaltabel) in conische buisjes van 50 ml.
- Bereid de gradiënt van onder naar boven voor door 4 ml per keer de 60% verdunning over de 70% verdunning toe te voegen met behulp van een pipet van 5 ml. Doe dit voorzichtig om te voorkomen dat de interface wordt verwisseld.
- Leg voorzichtig 12 ml gehepariniseerd bloed bovenop de dichtheidsgradiënt. Centrifugeer op 200 x g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Vanaf deze stap, tot aan de activering van PMN, moeten alle gebruikte reagentia en buizen in een koeler gevuld met ijs worden bewaard. - Gooi de plasma-/mononucleaire cellaag weg en breng de laag boven de erytrocytenpellet voorzichtig over in twee conische buisjes van 15 ml met elk ongeveer 7,5 ml. Vul het buisvolume aan met Hank's uitgebalanceerde zoutoplossing (HBSS; zie Tabel met materialen).
- Centrifugeer op 300 x g gedurende 5 minuten bij 19 °C.
- Was de celkorrel met HBSS.
- Gooi het supernatans weg door de buis te gieten en resuspendeer de pellet voorzichtig in 7 ml HBSS.
- Centrifugeer op 300 x g gedurende 5 minuten bij 19 °C om alle scheidingsmedia te verwijderen.
- Voer hypotone lysis uit van de resterende rode bloedcellen.
- Gooi het supernatans weg en combineer de pellets in een enkele buis.
- Resuspendeer de RBC/PMN-pellet in 3 ml steriele H2O en voeg binnen 25 s 3 ml HBSS (2x) toe om de osmolariteit te herstellen. Centrifugeer vervolgens gedurende 5 minuten bij 300 x g bij 19 °C.
- Herhaal stap 2.8.1 en 2.8.2 voor een witte, erytrocytenvrije pellet.
OPMERKING: Het supernatans moet zo snel mogelijk worden verwijderd om het contact van neutrofielen met RBC-afbraakproducten tot een minimum te beperken. Als alternatief kan de tweede hypotone lysis worden vervangen door de resterende RBC-laag voorzichtig te resuspenderen en al het supernatant te verwijderen, aangezien de resterende RBC's boven de PMN-pellet zullen bezinken.
- Gooi het supernatans weg door de buis te gieten, resuspendeer de PMN's voorzichtig in de resterende buffer en breng ze over naar een ijskoude microbuis.
NOTITIE: Zorg ervoor dat u het volume annoteert terwijl u de geresuspendeerde cellen overbrengt met een micropipet. - Breng 3 x 1 μl van de celsuspensie over op een schoon glasplaatje (drie putjes van elk 1 μl) en kleur met snelle panoptiek (zie materiaaltabel) voor morfologie en zuiverheidsevaluatie12.
- Om te kleuren met snelle panoptiek, dompelt u het objectglaasje vijf keer onder in panoptisch fixatiemiddel nr. 1, zes keer in eosine nr. 2 en tweemaal in hematoxyline nr. 3, waarbij elke onderdompeling 1 s duurt.
- Was het objectglaasje voorzichtig met gedestilleerd water.
- Laat uitlekken en aan de lucht laten drogen.
- Observeer onder een microscoop en tel 300 willekeurige cellen in elk putje, waardoor de neutrofielen worden onderscheiden van andere granulocyten.
- Breng 1 μL van de celsuspensie over naar 49 μL 0,2% trypanblauwe kleurstof13 en tel de cellen met behulp van een Neubauer-kamer, waarbij onderscheid wordt gemaakt tussen dode en levensvatbare cellen.
- Pas de celconcentratie aan tot 6.667 cellen/μL met behulp van een oplossing van 50% autoloog plasma en 50% HBSS aangevuld met calcium en magnesium. Verdeel de suspensie van 6,667 cellen/μl gelijkmatig over de microbuisjes die overeenkomen met de te testen omstandigheden, inclusief de negatieve controle.
OPMERKING: Elke celconcentratie die vergelijkbaar is met de circulerende neutrofielen in het modelorganisme kan worden gebruikt, maar het is belangrijk om in alle experimenten dezelfde celconcentratie te gebruiken voor reproduceerbaarheid.
Figuur 1: Het neutrofielenisolatieprotocol. Twee concentraties van het scheidingsmedium (percoll) (A) worden gestapeld (B), waarna het bloed bovenop de scheidingsgradiënt (C) wordt gelegd. Na het centrifugeren bevindt de PMN zich in de centrale laag (D), die is verdeeld in twee buisjes van 15 ml (E). De celsuspensie wordt tweemaal gewassen in HBSS en gecentrifugeerd (G-I) om de media te verwijderen, vervolgens worden de cellen opnieuw gesuspendeerd en worden resterende RBC's onderworpen aan twee rondes van hypotone lysis (J-M). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. Voorbereiding voor activering van neutrofielen
- Bereid in microbuisjes van 1,5 ml een activeringssysteem voor elke aandoening voor, zodat de uiteindelijke celconcentratie 6.600 cellen/μL is. Om bijvoorbeeld de effecten van 100 nM fMLP (N-formyl-methionyl-leucyl-fenylalanine; zie Materiaaltabel) te testen, voegt u 5 μL 10 μM fMLP toe aan 495 μL van de 6,667 cel/μL suspensie. Voeg voor de negatieve (niet-gestimuleerde) controle HBSS toe metCa 2+ en Mg2+.
OPMERKING: Om deze methodologie te demonstreren, werden de volgende eindconcentraties van de stimuli gebruikt: 100 nM fMLP, 16 μM fallaxine, een natuurlijk voorkomend antimicrobieel peptide14 en 100 nM PMA (phorbol 12-myristaat 13-acetaat) (zie Tabel met materialen). - Incubeer bij 37 °C zonder rotatie.
OPMERKING: Alle aliquots voor functionele assays zijn afkomstig van deze celsuspensie, hierna het activeringssysteem genoemd.
4. Nitrotetrazoliumblauwchloride (NBT)-test voor het evalueren van de ROS-productie
- Bereiding van de NBT-werkoplossing: Bereid voor elke experimentele omstandigheid een NBT-werkoplossing (zie Materiaaltabel) van 6 mM met behulp van de volgende stappen:
- Los 0,0005 g NBT op in 10 μL dimethylsulfoxide (DMSO) en draai gedurende ten minste 15 minuten.
- Voeg 90 μL HBSS Ca2+Mg2+ toe en draai tot 2 min.
NOTITIE: Alle stappen met betrekking tot NBT moeten in het donker worden uitgevoerd.
- Voer de NBT-objectglaasjestest uit.
- Na 20 minuten celactivatie mengt u de celsuspensie voorzichtig en brengt u voorzichtig 2 μL PMN over op een schoon objectglaasje. Incubeer gedurende 20 minuten in een bevochtigde kamer bij 37 °C.
NOTITIE: Spreid de celophanging niet te veel over de slede; anders kan het vóór de incubatie uitdrogen. - Voeg 1 μL van de NBT-werkoplossing toe aan de cellen en incubeer verder gedurende 20 minuten beschermd tegen licht.
- Droog het glaasje af met hete lucht en fixeer het met een druppel methanol in elk putje gedurende 1 minuut. Kleuring met 0,03% safranine (zie Materiaaltabel) gedurende 1 min.
- Was het objectglaasje voorzichtig met gedestilleerd water.
- Laat het objectglaasje aan de lucht drogen en observeer het onder een microscoop.
- Tel 100 willekeurige cellen in elk putje en onderscheid neutrofielen met en zonder formazaanse afzettingen.
- Na 20 minuten celactivatie mengt u de celsuspensie voorzichtig en brengt u voorzichtig 2 μL PMN over op een schoon objectglaasje. Incubeer gedurende 20 minuten in een bevochtigde kamer bij 37 °C.
- Voer een NBT-spectrofotometrietest uit.
- Na 40 minuten celactivatie mengt u de celsuspensie voorzichtig en brengt u 90 μL PMN's over van het activeringssysteem naar een schone microbuis. Voeg vervolgens voorzichtig 20 μL van de 6 mM NBT-oplossing toe. Incubeer in het donker gedurende 20 minuten bij 37 °C.
- Voeg 100 μL 10% natriumdodecylsulfaat (SDS; zie materiaaltabel) en vortex toe.
- Sonicaat met behulp van een tip-sonicator met een amplitude van 60%, vijf cycli van elk 15 s met intervallen van 15 s. Centrifugeer op 12.000 x g gedurende 5 min.
- Breng 60 μl van het supernatans over naar een plaat met 96 putjes met heldere bodem en meet de absorptie van het formazanproduct bij 570 nm.
5. Fagocytose-test
- Bereid een suspensie van 33.000 gisten/μL voor elke toestand, zoals hieronder beschreven:
- Voeg ongeveer 0,75 mg droge gist (Saccharomyces cerevisiae; zie materiaaltabel) toe aan 200 μl HBSS Ca2+Mg2+ en incubeer in een thermomixer bij 100 °C met 500 tpm gedurende ten minste 15 min.
- Homogeniseer het mengsel door vortexen en breng 5 μL gistsuspensie over op 45 μL 0,2% trypanblauwe kleurstof. Tel de gisten met behulp van een Neubauer-kamer.
- Pas de concentratie van de initiële suspensie aan tot 33.000 gistcellen/μL met HBSS Ca2+Mg2+. Bewaar de suspensie op ijs tot gebruik.
- Na 20 minuten celactivatie mengt u de celsuspensie voorzichtig en brengt u 5 μL van het activeringssysteem over naar 5 μL van de 33.000 gist/μL Saccharomyces cerevisiae-suspensie in een nieuwe steriele microbuis.
OPMERKING: De verhouding tussen neutrofielen en gist is 1:5 (PMN:gist). - Breng onmiddellijk 6 μL van de PMN/gistsuspensie over in drie putjes van een schoon objectglaasje (elk 2 μL) en incubeer het objectglaasje gedurende 40 minuten in een bevochtigde kamer.
NOTITIE: Spreid de celophanging niet te veel over de slede; anders kan het uitdrogen voordat het wordt uitgebroed. - Droog het glaasje onder hete lucht en beits het met snelle panoptiek, zoals beschreven in stap 2.9 hierboven.
OPMERKING: De derde stap van de snelle panoptische kleuring is van cruciaal belang voor de microscopie-analyse van het objectglaasje. Het kleuren van het objectglaasje gedurende ≥3 s in deze stap kan het ongeschikt maken voor analyse, omdat het moeilijk zal zijn gist te onderscheiden van neutrofiele kernkwabben. - Bekijk de objectglaasjes onder de microscoop, tel 100 willekeurige neutrofielen van elk putje en maak onderscheid tussen PMN's positief en negatief voor fagocytose.
OPMERKING: Ten minste één gistdeeltje in of in direct contact met het PMN-celmembraan duidt op een PMN-positief voor fagocytose. Als je geïnteresseerd bent in de gist/neutrofielenverhouding, tel dan ook het aantal gistdeeltjes dat wordt verzwolgen.
6. PMN-chemotaxis-test in real time
OPMERKING: De migratietest wordt op dezelfde manier uitgevoerd als het eerder beschreven protocol15, met de volgende aanpassingen:
- Bereid de chemotactische gradiënt voor door 160 μL chemolokstof (bijv. fMLP, IL-8, C5 of LTB4; zie Materiaaltabel) toe te voegen aan de onderste kamer van een op impedantie gebaseerde real-time cell analyzer (RTCA)-plaat. Voeg voor negatieve controles en blanco's 160 μL HBSS Ca2+Mg2+ toe.
- Bevestig de bovenste kamer en voeg 25 μL HBSS Ca2+Mg2+ toe. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende ten minste 1 uur om de chemotactische gradiënt te vormen.
- Na 60 minuten celactivatie mengt u de celsuspensie voorzichtig en plaatst u 60 μL celsuspensie in de bovenste kamer. Voeg 60 μL HBSS Ca2+Mg2+ toe aan de blanco.
- Plaats de RTCA-plaat en programmeer de RTCA-software om gedurende 2 uur elke 60 s de celindex (CI) te meten.
OPMERKING: De RTCA-platen kunnen worden gewassen voor hergebruik zoals eerder beschreven16. Samenvattend, was de RTCA-kamers en elektroden drie keer met fosfaat-buferred saline (PBS) en vervolgens twee keer met type I ultrapuur water. Incubeer de onderste en bovenste kamer met 0,25% trypsine 0,53 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) gedurende 40 minuten. Driemaal wassen met ultrapuur water.
7. NETTO suggestieve test
- Meng na 10 minuten celactivering voorzichtig de celsuspensie en breng 4 μL PMN's over van elk te evalueren activeringssysteem, verdeeld over twee putjes van een schoon glasplaatje. Incubeer in een bevochtigde kamer bij 37 °C gedurende 30 min.
- Voeg 1 μL DNAse I toe aan een van de putjes en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 °C (in een natte kamer).
- Droog het glaasje en de vlek af met snelle panoptiek, zoals eerder beschreven in stap 2.9 van het hoofdstuk "neutrofielenisolatie".
- Evalueer de objectglaasjes onder een microscoop.
OPMERKING: Zoek naar enige indicatie van NET-release, gekenmerkt door de aanwezigheid van webachtige structuren. Eenmaal geïdentificeerd, bevestigen of de DNAse I-behandeling in staat was om dergelijke structuren te verwijderen. Deze test wijst op NET-vorming, aangezien aanvullende tests nodig zijn om hun aanwezigheid te bevestigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De op dichtheid gebaseerde isolatiemethode die in deze studie werd gebruikt (figuur 1) voldeed aan de criteria voor de voorgestelde experimenten. Neutrofielenparameters die met deze methode werden verkregen, waren onder meer levensvatbaarheid ≥98%, zuiverheid ≥94% en celopbrengst ≥1,5 x 107, zonder activering die door de screeningstests kon worden gedetecteerd. Twee relevante stappen in de isolatie van PMN's zijn antistolling en verwijdering van rode bloedcellen. Door de antigecoaguleerde bloedbuis of spuit zachtjes te laten schommelen voordat u een laag over de dichtheidsgradiënt aanbrengt en een RBC-verwijderingsmethode te kiezen om zowel activering als besmetting te voorkomen, kan dit de opbrengst en reproduceerbaarheid van het experiment beïnvloeden.
Om het functionele overzicht van de neutrofielenfunctie te beoordelen, werd een workflow ontwikkeld die het mogelijk maakte om de voorgestelde screeningstests uit te voeren met ten minste twee onderzoekers in een gemiddelde tijd van 4 uur, met 1 uur activering en 2 uur real-time migratiemonitoring, zoals weergegeven in figuur 2.
Figuur 2: De NeutroFun Screen workflow. Om het panel van functionele reacties te beoordelen die worden veroorzaakt door specifieke omstandigheden die worden geëvalueerd, omvat de NeutroFun Screen-workflow de deelname van ten minste twee onderzoekers. Onderzoeker 1 (R1) start het PMN-isolatieproces, gevolgd door aanpassing van de celconcentratie en incubatie van het activeringssysteem, terwijl tegelijkertijd onderzoeker 2 (R2) de materialen voorbereidt om de volgende tests uit te voeren, die over de twee zijn verdeeld: R1 voert fagocytose-, NET- en spectrofotometrische NBT-tests uit; R2 voert real-time migratie- en NBT-objectglaasjestests uit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De klassieke NBT-test17 werd geoptimaliseerd voor zowel objectglaas- als spectrofotometrische beoordeling van de formazanformatie als gevolg van de reactie van NBT met de ROS gegenereerd door PMN's. De spectrofotometrische test maakte relatieve kwantificering tussen omstandigheden mogelijk, terwijl de microscopietest nuttig was voor beschrijvende en semi-kwantitatieve analyse, waarbij de regelmaat van kristalverdeling, morfologie en aantal cellen met formazan werd geëvalueerd. De resultaten van de spectrofotometrische test zijn weergegeven in figuur 3A, wat aangeeft dat 100 nM PMA een verhoogde ROS-productie induceerde (in een gemiddelde verhouding van 3:2:1) in vergelijking met fMLP en controlegroepen. De resultaten van de NBT-objectglaasjestest (Figuur 3B) bevestigden de spectrofotometrische resultaten en toonden ook aan dat PMA de meest intense ROS-productie-inducerende stimulus was in vergelijking met fMLP (Figuur 3C), zoals eerder aangetoond door de directe meting van ROS door cytometrie18. Wat het tellen van cellen betreft, vertoonde het aantal neutrofielen dat formazankristallen bevatte een verhouding van 7:4:1 in de PMA:fMLP:controleomstandigheden, wat ook verschillende formazan-distributiepatronen tussen fMLP en PMA-geactiveerde PMN's aan het licht bracht; fMLP-behandeling resulteerde in intensief geactiveerde individuele cellen, terwijl PMA de vorming van formazankristallen induceerde die verspreid waren over het cytoplasma in de meeste PMN's. Verder werden enkele morfologische kenmerken waargenomen die de aandoeningen differentieerden, zoals expressieve celaggregatie na PMA-behandeling. De afwezigheid van dergelijke typische activeringskenmerken en lage niveaus van formazan in de controlegroep gaven aan dat de rusttoestand niet significant verstoord was. Daarom bleek de NBT-test een eenvoudige, goedkope en betrouwbare test te zijn voor de productie van neutrofiele ROS die kan worden gebruikt om de capaciteit en intensiteit van een bepaalde stimulus om ROS-productie te induceren te overzien.
Figuur 3: NBT-test. (A) De spectrofotometrische beoordeling van neutrofiele respiratoire bursts onder verschillende omstandigheden (negatieve controle: 100 nM fMLP en 100 nM PMA) door middel van formazan-extinctie (490-630 nm). Gegevens van vier donoren worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). * = alle groepen verschillen van elkaar (p≤ 0,05); £ = De vergelijkingen CTRL versus PMA en fMLP versus PMA laten significante verschillen zien (p≤ 0,05). (B) De objectglaasjestest kan kwalitatief worden geanalyseerd, waarbij de intensiteit van formazanafzettingen, de locatie in de cel en de celaggregatie worden gekarakteriseerd. Zwarte pijlen wijzen naar formazan kristallen. Schaalbalken: 20 μm. (C) Aantal PMN's dat formazan bevat, geteld met optische microscopie. Gegevens van acht donoren gepresenteerd als gemiddelde ± SD. *** p < 0,0001, Student's t-toets. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De fagocytoseglaasjes werden gebruikt om de fagocytosesnelheid te bepalen als percentage neutrofielen die fagocytose uitvoeren, zoals weergegeven in figuur 4. Hoewel zowel 100 nM fMLP als 16 μM antimicrobieel peptide een ogenschijnlijk verhoogde gistverzwelging induceerden, was het verschil niet statistisch significant tot de dubbele stimulatie, die de fagocytose significant verbeterde in vergelijking met de controlegroep en een respons op dubbele stimulatie zou kunnen suggereren.
Figuur 4: Fagocytosetest. Neutrofielen werden beoordeeld op basis van hun fagocytosecapaciteit (tellen van neutrofielen die gist bevatten). Hoewel de blootstelling aan 100 nM fMLP of een 16 μM antimicrobieel peptide voorafgaand aan de incubatie van gist de fagocytose versterkte in vergelijking met de controlegroep, (A) was de toename niet statistisch significant. Interessant is dat een eerste incubatie met fMLP, gevolgd door toevoeging van het antimicrobiële peptide, resulteerde in een significant verbeterde fagocytose bij menselijke neutrofielen (asterisk tussen CTRL en het fMLP+ antimicrobiële peptide). (B) Zwarte pijlen tonen gistcellen, groene pijlen tonen alleen neutrofielen en rode pijlen wijzen op fagocytoserende neutrofielen. Gegevens van vijf donoren gepresenteerd als gemiddelde ± SD. Schaalbalken: 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Een voorbeeld van real-time celmigratieresultaten is weergegeven in figuur 5, die het bekende chemotactische effect van 100 nM fMLP op neutrofielen laat zien. De kinetiek van de celmigratie werd aangepast aan het Gompertz-model, waardoor de parameters konden worden vergeleken.
Figuur 5: Real-time celmigratie. De celindex geeft de elektrische impedantie weer die het gevolg is van celmigratie. In deze test werd fMLP gebruikt als een positieve controle van neutrofielenmigratie door 100 nM fMLP toe te voegen aan de onderste kamer. Een negatieve controle (CTRL) bevatte alleen HBSS in de onderste kamer. De boven elkaar geplaatste curven vertegenwoordigen de curve die past bij het Gompertz-model, aangepast om het beste te passen bij stijgende en dalende hellingen. Gegevens van drie donoren, gepresenteerd als gemiddelde ± SD.* p < 0,05, Student's t-toets. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Ten slotte wordt een eenvoudige optische microscopietest gepresenteerd die de aanwezigheid van NET suggereert, waarbij de PMN's worden gekleurd met snelle panoptische kleuren. Het is mogelijk om waar te nemen dat het voor sommige specifieke NET-inducerende stimuli, zoals PMA of sommige antimicrobiële peptiden, zelfs na een korte activeringstijd (1 uur) mogelijk is om filamenteuze webachtige structuren in de buurt van de cellen waar te nemen, terwijl dit niet mogelijk is in andere omstandigheden zoals de negatieve controle en fMLP (Figuur 6). Om deze bewering beter te ondersteunen, werd DNase I toegevoegd na 40 minuten celactivatie met 100 nm PMA of een antimicrobieel peptide, waarbij de NET-achtige structuren werden verwijderd (Figuur 6). Hoewel deze methode niet geschikt is voor NET-karakterisering en kan worden beïnvloed door artefacten, is het een goedkoop, eenvoudig en interessant startpunt om verdere investeringen in het analyseren van NET's te rechtvaardigen, vooral in contexten waarin de effecten van de stimuli onbekend of slecht beschreven zijn.
Figuur 6: NET-formatie suggestieve test. Een kwalitatieve analyse van panoptische neutrofielen na 1 uur activering op een glasplaatje kan wijzen op NET-afgifte. CTRL (A,B) en fMLP (C,D) groepen vertoonden geen enkele indicatie van NET-afgifte, terwijl activering met PMA (E-H) de vorming van NET-achtige structuren induceerde die werden afgebroken door DNase I-behandeling (I-L). Onderzoek naar de effecten van een antimicrobieel peptide op de neutrofielen toonde aan dat een dergelijke stimulus in staat zou kunnen zijn om NET-afgifte uit te lokken, aangezien de objectglaasjes de NET-achtige structuren (M-P) vertoonden die werden afgebroken door DNase I (Q-T). Rode pijlen wijzen naar NET-achtige structuren. Schaalbalken: 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Neutrofielen zijn zeer dynamische en responsieve cellen die van korte duur zijn en nog niet kunnen worden gecryopreserveerd19, waardoor onderzoek naar hun biologie een uitdaging is. Daarom is het essentieel om zorgvuldige stappen te volgen om levensvatbare, verrijkte en rustende neutrofielen te verkrijgen 11,20. Deze studie maakte gebruik van een op dichtheid gebaseerde isolatietechniek die de nadruk legt op zachte en minimale manipulatie, evenals het gebruik van lage temperaturen tot de activeringsstap. Bovendien moet de bloedverwerking binnen 30 minuten na de venapunctie plaatsvinden en bij kamertemperatuur worden bewaard. Het huidige werk biedt een optie om manipulatiestress en experimenteertijd te verminderen. Om het proces verder te vereenvoudigen, hebben we een nieuwe stap (als optie) in het protocol geïntroduceerd, waarbij RBC's worden verwijderd door zachte resuspensie en aspiratie van de RBC-laag na een enkele hemolyseprocedure. Deze stap vermindert de manipulatiestress en experimenteertijd, omdat het de meeste rode bloedcellen verwijdert met slechts één hypotone hemolysestap. Er moet echter worden opgemerkt dat de vaardigheden van de operator van grote invloed zijn op de effectiviteit van deze stap en dat RBC's niet altijd volledig worden verwijderd. Bovendien kan RBC-aspiratie leiden tot een verlies van neutrofielen, maar dit heeft geen invloed op de opbrengst, omdat er aanvankelijk meer neutrofielen uit de gradiënt werden teruggewonnen wanneer ze dichter bij de RBC-laag werden verzameld. Daarom wordt RBC-aspiratie aanbevolen als de tests niet de hoogst mogelijke zuiverheid vereisen, of als de operator consistent goede resultaten heeft behaald. Voor de hier gepresenteerde screeningstests zou een kleine hoeveelheid verontreinigende RBC's (<3%) de resultaten niet verstoren.
Om ervoor te zorgen dat alle procedures tijdig worden uitgevoerd, inclusief de bereiding van reagens, wordt een workflow gepresenteerd (figuur 2) waarin de tijdlijn en taakverdeling tussen twee onderzoekers worden beschreven. Nadat alle functionele tests zijn voltooid, kunnen de resterende cellen worden voorbereid voor verder moleculair onderzoek, zoals omics-studies door cellyse met de juiste lysisbuffer en opslag.
ROS productie
Respiratoire burst is een kenmerk van neutrofiele priming en activering18,21, en het evalueren van ROS-productie is een veelgebruikte methode die wordt gebruikt om de activeringsstatus van neutrofielen te schatten. Deze studie evalueerde de ROS-productie met behulp van twee benaderingen: optische microscopie en spectrofotometrie.
De NBT-test is een bekende benadering om de respiratoire uitbarsting in neutrofielente beoordelen 22,23. Twee veelgebruikte methoden zijn de op optische microscopie gebaseerde (of diatest) en spectrofotometrie gebaseerde assays 24,25,26. Hoewel optische microscopie de visualisatie van details op celniveau mogelijk maakt, is het vatbaar voor gebruikersvooringenomenheid. Daarom dient de NBT-objectglaasjestest als een kwalitatieve aanvulling op de spectrofotometrische test met betrekking tot fenotypische kenmerken, zoals formazanvormingspatronen, intensiteit en celaggregatie.
De kritieke stappen voor zowel de NBT-objectglaasjes- als spectrofotometrische tests zijn de volledige oplosbaarheid van NBT en formazan. In tegenstelling tot de aanbevelingen van de fabrikant lost NBT niet goed op in water. Het homogeniseren van NBT in DMSO gedurende ten minste 15 minuten en vervolgens het toevoegen van water/HBSS en vortexing gedurende 2 minuten zorgt echter voor volledige oplosbaarheid. Om de absorptie van formazan te analyseren, moeten bovendien twee kritieke stappen worden bereikt: (1) afgifte van formazankristallen uit cellen door PMN-lysis en (2) volledige oplosbaarheid van formazan-kristallen. Beide stappen werden bereikt door de celpellet te behandelen met 10% SDS, zoals onlangs werd gesuggereerd27, gevolgd door sonicatie- en absorptieanalyse van het supernatans bij 570 nm.
Bovendien zijn de NBT-resultaten van de negatieve en positieve controlegroepen de eerste stap van de te beoordelen screening. Deze stap moet een opmerkelijk verschil laten zien, aangezien ROS-productie-evaluatie door middel van formazan aangeeft of het isolatieproces verantwoordelijk kan zijn geweest voor ongewenste veranderingen in de ruststatus van de cellen, hetzij door stimulatie of remming.
Andere methoden, zoals cytochroom c-reductie28 of flowcytometrie29-analyse, worden vaak gebruikt voor ROS-detectie; Bij het overwegen van een screeningsaanpak vereist de toepassing ervan echter een langere experimenteertijd, het gebruik van specifieke markers en dure instrumenten. Chemiluminescentie van luminol/isoluminol is een snelle en kosteneffectieve methode voor het detecteren van ROS, terwijl ook de differentiatie van intra- en extracellulaire ROS mogelijk is. Voor deze methode is echter een luminometer nodig30,31. Hoewel de kosten van het instrument kunnen worden omzeild door het gebruik van een faciliteit, zou het nog steeds ongeschikt zijn voor een screeningsanalyse die gelijktijdig met andere tests wordt uitgevoerd.
Fagocytose
De PMN/gistincubatie geeft een overzicht van de capaciteit en werkzaamheid van neutrofiele fagocytose door het aantal neutrofielen te tellen dat fagocytose uitvoert en het aantal gisten dat per neutrofielen wordt verzwolgen. Aangezien het gistdeeltje zelf echter een activeringssignaal is, vormt het vergelijken van de controlegroep met voorbehandeld PMN een dubbel stimulatiesysteem, dat mogelijk geen significante veranderingen vertoont, zoals weergegeven in de CTRL versus fMLP-behandelde PMN (Figuur 4). Niettemin is deze test nuttig om aan te geven of een potentiële modulator enige invloed zou hebben op fagocytose. Met behulp van deze test werd een nieuw antimicrobieel peptide getest en de resultaten wijzen op een interessante potentiële respons op deze combinatie van stimuli, die onlangs is besproken als nodig voor efficiënte activering32.
De cruciale stap voor deze test is de kleuring, omdat de analyse onbetrouwbaar wordt als het objectglaasje gedurende ≥3 s op panoptiek nr. 3 (hematoxyline) wordt gehouden. Dit komt omdat de gistcellen en de neutrofiele kernkwabben niet van elkaar te onderscheiden zijn. Bovendien maakt deze benadering de morfologische analyse van neutrofielen na blootstelling aan modulatoren mogelijk. Flowcytometrie is een andere efficiënte techniek om fagocytose33 te analyseren, hoewel het beperkingen heeft door de moeilijkheid om onderscheid te maken tussen membraangebonden en verzwolgen deeltjes en andere factoren die verband houden met de voorgestelde screeningset, zoals besproken in het vorige onderwerp. Dezelfde beperking wordt waargenomen in de hierin beschreven methode, hoewel dit moet worden beschouwd als een eerste screening om vervolgstudies te begeleiden.
Real-time migratie
Het real-time screeningsprotocol is geoptimaliseerd om de migratiecapaciteit van PMN's te evalueren. Hoewel een eerdere studie suggereerde dat het coaten van de onderkant van de RTCA-plaat nodig was om de migratietest een verschil te laten zien tussen de negatieve controle en IL-8-behandeling15, toonde deze studie hoge betrouwbaarheidsinterval (CI)-waarden voor met fMLP behandelde cellen zonder toevoeging van coatingmiddelen. De resultaten vertoonden een hoge reproduceerbaarheid met een significante migratie vanaf 12 minuten. Bovendien kan curve fitting analyse van de verkregen migratiegegevens parameters aan het licht brengen, zoals het maximum van de celindex en de toename en afname van de helling, die nuttig zijn voor het begrijpen van de dynamiek van de migratie, en die afhankelijk kunnen zijn van concentratie of kunnen verschillen tussen omstandigheden. De beste aanpassing voor neutrofielenmigratiecurven (Figuur 5) was de aangepaste Gompertz-functie34, waaruit blijkt dat fMLP de maximale celindex en de grotere helling verhoogt.
Speciale aandacht is vereist om bellen in het RTCA-systeem te voorkomen, omdat deze de cellen die door de elektroden gaan kunnen blokkeren, waardoor het experiment in gevaar komt. Een beperkende factor zijn de hoge kosten van de platen. Hoewel goedkopere technieken celmigratie analyseren, missen ze een goede reproduceerbaarheid of zijn ze moeilijk en tijdrovend, zoals de Boyden-kamer35. Daarom is RTCA een betrouwbare migratieanalyse die compatibel is met de andere screeningstests die hier worden gepresenteerd.
Netten
Ten slotte werd een veelbelovende, eenvoudige en goedkope test ontwikkeld voor een voorlopige evaluatie van NET-vorming met behulp van optische microscopie. Het werd afgeleid van de observatie van fagocytoseglaasjes, waarin PMA, een specifieke NET-inducerende stimulus die werd getest op zijn effect op de fagocytosecapaciteit, ook een webachtige structuurvorming induceerde in vergelijking met de CTRL- en fMLP-groepen. Dit werk veronderstelde dat die structuren zouden kunnen duiden op NET-afgifte. Een dergelijke hypothese werd getest door de monsters na activering te behandelen met DNase I, waarbij geen filamenteuze structuren werden gevonden in PMA-geactiveerde neutrofielen. De veronderstelling dat dergelijke structuren waarschijnlijk NET's zijn, is gebaseerd op het feit dat PMA wordt genoemd als een bekende inductor van NET-vorming36,37, de bevinding van vergelijkbare structuren door fluorescentiemicroscopie met behulp van specifieke markers voor NET's38,39 en de afbraak van NET's gekatalyseerd door DNase I40,41. Het is belangrijk om te benadrukken dat dit geen methode is voor de bevestiging van NET-vorming, maar slechts een voorlopige screening die de aanwezigheid van NET suggereert. Hoewel deze test beperkingen heeft, aangezien NET's kunnen worden verward met kleuringsartefacten, dient het een relevant doel bij het suggereren van NET-vorming in een snelle en goedkope screening die samen met andere functionele tests kan worden uitgevoerd. Eenmaal gedetecteerd als mogelijk relevant voor het onderzoek dat wordt gescreend, kunnen NET's verder worden geëvalueerd door confocale of elektronenmicroscopie42, zoals later wordt besproken.
In ons laboratorium worden nieuwe antimicrobiële peptiden, die waarschijnlijk ook immunomodulerende activiteiten hebben, vaak geëvalueerd door deze reeks screeningstests om verdere analyse van de effecten van sommige peptiden op menselijke neutrofielen beter te begeleiden, aangezien sommige interessante ROS43-, fagocytose-, migratie- en/of NET-modulerende eigenschappen vertonen.
Concluderend biedt de NeutroFun Screen een waardevol hulpmiddel voor het identificeren van potentiële modulatoren van de neutrofielenactiviteit met normale dichtheid uit een groot aantal niet-geteste verbindingen. Het is echter belangrijk op te merken dat deze methode slechts dient als een voorlopige screening. Na deze eerste screening kunnen duurdere, geavanceerde en tijdrovende methodologieën worden gericht op specifieke functies of paden die door deze eerste resultaten worden voorgesteld voor gegevensvalidatie. Voor ROS-productie, fagocytose en NET-vorming zijn er alternatieve methoden voor gegevensvalidatie en om verdere kwantitatieve resultaten te verkrijgen. NET-visualisatie en -kwantificering kunnen worden uitgevoerd door middel van immunofluorescentiemicroscopie-analyse, die de aanwezigheid en overlap van extracellulair DNA en granule-eiwitten, zoals myeloperoxidase en neutrofiele elastase, bepaalt, zoals onlangs in detail beschreven42. ROS spelen verschillende cruciale rollen in veel biologische processen, en daarom is hun studie zeer wijdverbreid en divers. Een van de meest gevestigde methodologieën zijn die welke gebruik maken van antilichamen, zoals de enzymgekoppelde immunosorbenttest (ELISA) en immunoblotting van luminescentie, of fluorescentiedetectie - zoals flowcytometrie van cellen onder verschillende etikettering - door middel van DCFDA, EPR-spectroscopie en enzymatische activiteitsmetingen44. Evenzo wordt robuuste fagocytose-evaluatie ook op verschillende manieren gedaan; De alternatieve methoden omvatten flowcytometrie alleen45,46 of gecombineerd met fluorescentiemicroscopie47. De beschreven real-time celmigratie is een robuuste en toereikende test die geen verdere validatie vereist en parameters presenteert die andere methodologieën niet kunnen overwegen. Andere combinaties van dergelijke methoden passen misschien beter bij specifieke scenario's, maar samengevat is dit een snelle en betaalbare combinatie die veel neutrofiele activiteiten omvat.
Samenvattend heeft deze studie tot doel een reeks tests te bieden die bestaan uit eenvoudige, snelle en goedkope methodologieën om meerdere neutrofielenreacties op nieuwe moleculen en aandoeningen te evalueren als een manier om de inspanningen beter te richten op geavanceerde methodologieën. Als belangrijke beperkingen moeten de resultaten van ROS-, NET- en fagocytose-assays als voorlopig worden beschouwd en moeten ze verder worden gevalideerd door meer specifieke en uitgebreide assays, en degenen die afhankelijk zijn van niet-geautomatiseerde microscopieceltelling zijn vatbaar voor onbewuste vooringenomenheid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.
Acknowledgments
De auteurs erkennen de volgende financieringsinstanties: FAPDF, CNPq, CAPES, UnB, FINEP en FINATEC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CIM-Plate 16 | Agilent | 5665825001 | |
| CLARIOstar Plate Reader | BMG LABTECH | US Patent Number 9,733,124 Product details: MARS Data Analysis Software |
|
| Dimethyl sulfoxide | Dinâmica | 1582 | |
| DNAse I | Sigma - Aldrich | DN 25 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma - Aldrich | E5134 | |
| Fast panoptic stain | Laborclin | 620529 | |
| Glass slide | Exacta | 7102 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution with calcium, with magnesium, without phenol red. | Sigma - Aldrich | 55037C | |
| Hank’s Balanced Salt Solution without calcium chloride, magnesium sulfate and sodium bicarbonate. | Sigma - Aldrich | H4641 | |
| Heparin | Blau | 7896014655229 | |
| Laminar flow cabinet | Veco | VLFS-12 | |
| Microscope | Zeiss | 415501-0101-002 | Product details: Primostar 1 |
| Mixing Block | BIOER | MB-102 | |
| Neubauer improved bright-lined | New Optik | 1110000 | |
| N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine | Sigma - Aldrich | F3506 | |
| Nitroblue tetrazolium | Neon | CAS 298-83-9 | |
| Percoll | Cytiva | 17089101 | separation media |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma - Aldrich | P8139 | |
| Phosphate buffered saline tablet | Sigma - Aldrich | P4417 | |
| ROTOFIX 32 A | Hettich | 1206 | |
| Saccharomyces cerevisiae | Fleischmann | ||
| Safranin | Sigma - Aldrich | 50240 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Cytiva | 17-1313-01 | |
| Sonicator | Qsonica | Q125 | |
| Trypan blue solution | Vetec | C.I. 23850 | |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries, Inc. | 0K-0500-902 | |
| xCELLigence Real-Time Cell Analysis (RTCA) DP (dual purpose) | Agilent | 380601050 | Product details: RTCA system composed of detection hardware, cell plates and software |
References
- Nauseef, W. M., Borregaard, N.
- Groeneweg, L., Hidalgo, A. Emerging roles of infiltrating granulocytes and monocytes in homeostasis. Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (19), 3823-3830 (2020).
- Rosales, C., Lowell, C. A., Schnoor, M., Uribe-Querol, E. Neutrophils: their role in innate and adaptive immunity 2017. Journal of Immunology Research. 2017, 9748345 (2017).
- Castro, M., et al. Proteome analysis of resting human neutrophils. Protein & Peptide Letters. 13 (5), 481-487 (2006).
- Li, Y., et al. The regulatory roles of neutrophils in adaptive immunity. Cell Communication and Signaling. 17, 147 (2019).
- de Oliveira, S., Rosowski, E. E., Huttenlocher, A. Neutrophil migration in infection and wound repair: going forward in reverse. Nature Reviews Immunology. 16 (6), 378-391 (2016).
- Burn, G. L., Foti, A., Marsman, G., Patel, D. F., Zychlinsky, A.
- El-Benna, J., et al. Priming of the neutrophil respiratory burst: role in host defense and inflammation. Immunological Reviews. 273 (1), 180-193 (2016).
- Castro, M. S., Cilli, E. M., Fontes, W. Combinatorial synthesis and directed evolution applied to the production of alpha-helix forming antimicrobial peptides analogues. Current Protein & Peptide Science. 7 (6), 473-478 (2006).
- Mihaila, A. C., et al. Transcriptional profiling and functional analysis of N1/N2 neutrophils reveal an immunomodulatory effect of S100A9-blockade on the pro-inflammatory N1 subpopulation. Frontiers in Immunology. 12, 708770 (2021).
- Kuhns, D. B., Priel, D. A. L., Chu, J., Zarember, K. A. Isolation and functional analysis of human neutrophils. Current Protocols in Immunology. 111 (1), 7-23 (2015).
- Paulíková, E., Kociková, A., Sabol, M. Modification of a panoptic method of staining isolated cells. Bratislavske Lekarske Listy. 94 (12), 638-640 (1993).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111 (1), 1-3 (2015).
- Libério, M. S., et al. Anti-proliferative and cytotoxic activity of pentadactylin isolated from Leptodactylus labyrinthicus on melanoma cells. Amino Acids. 40 (1), 51-59 (2011).
- Cano, P. M., Vargas, A., Lavoie, J. P. A real-time assay for neutrophil chemotaxis. BioTechniques. 60 (5), 245-251 (2016).
- Stefanowicz-Hajduk, J., Adamska, A., Bartoszewski, R., Ochocka, J. R. Reuse of E-plate cell sensor arrays in the xCELLigence Real-Time Cell Analyzer. BioTechniques. 61 (3), 117-122 (2016).
- Björkstén, B., Nyström, K., Lindqvist, B. The nitroblue tetrazolium (NBT) test in endemic benign (epidemic) nephropathy. Acta Medica Scandinavica. 199 (1-6), 147-150 (1976).
- Aquino, E., et al. Proteomic analysis of neutrophil priming by PAF. Protein & Peptide Letters. 23 (2), 142-151 (2016).
- Blanter, M., Gouwy, M., Struyf, S. Studying neutrophil function in vitro: cell models and environmental factors. Journal of Inflammation Research. 14, 141-162 (2021).
- Hsu, A. Y., Peng, Z., Luo, H., Loison, F. Isolation of human neutrophils from whole blood and buffy coats. Journal of Visualized Experiments. (175), e62837 (2021).
- Moghadam, Z. M., Henneke, P., Kolter, J. From flies to men: ROS and the NADPH oxidase in phagocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 628991 (2021).
- Pattan, S. S., Bhat, K. G., Pattar, G. D., Kuntagi, M. Comparison of three different techniques for isolation of neutrophils from blood and their utility in performing nitroblue tetrazolium test. International Journal of Basic and Applied Physiology. 8 (1), 41 (2019).
- Gooty, J. R., Shashirekha, A., Guntakala, V. R., Palaparthi, R. Estimation of phagocytic activity of polymorphonuclear leukocytes in chronic and aggressive periodontitis patients with nitroblue tetrazolium test. Journal of Indian Society of Periodontology. 23 (4), 316 (2019).
- Langer, S., et al. Clinical and laboratory profiles of 17 cases of chronic granulomatous disease in north India. Indian Journal of Hematology and Blood Transfusion. 37 (1), 45-51 (2021).
- Oualha, R., et al. Infection of human neutrophils with Leishmania infantum or Leishmania major strains triggers activation and differential cytokines release. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 9, 153 (2019).
- Zilinskas, J., Zekonis, J., Zekonis, G., Valantiejiene, A., Periokaite, R. The reduction of nitroblue tetrazolium by total blood in periodontitis patients and the aged. Stomatologijal. 9 (4), 105-108 (2007).
- Benov, L. Improved formazan dissolution for bacterial MTT assay. Microbiology Spectrum. 9 (3), e01637 (2021).
- Chen, Y., Junger, W. G.
- Richardson, M. P., Ayliffe, M. J., Helbert, M., Davies, E. G. A simple flow cytometry assay using dihydrorhodamine for the measurement of the neutrophil respiratory burst in whole blood: comparison with the quantitative nitrobluetetrazolium test. Journal of Immunological Methods. 219 (1-2), 187-193 (1998).
- Jancinová, V., et al. The combined luminol/isoluminol chemiluminescence method for differentiating between extracellular and intracellular oxidant production by neutrophils. Redox Report. 11 (3), 110-116 (2006).
- Nosál, R., et al. Pharmacological intervention with oxidative burst in human neutrophils. Interdisciplinary Toxicology. 10 (2), 56-60 (2017).
- Mol, S., et al. Efficient neutrophil activation requires two simultaneous activating stimuli. International Journal of Molecular Sciences. 22 (18), 10106 (2021).
- Schneider, L., et al. Flow cytometry evaluation of CD14/CD16 monocyte subpopulations in systemic sclerosis patients: a cross sectional controlled study. Advances in Rheumatology. 61 (1), 27 (2021).
- Akin, E., Pelen, N. N., Tiryaki, I. U., Yalcin, F. Parameter identification for gompertz and logistic dynamic equations. PLoS One. 15 (4), e0230582 (2020).
- Guy, J. B., et al. Evaluation of the cell invasion and migration process: A comparison of the video microscope-based scratch wound assay and the boyden chamber assay. Journal of Visualized Experiments. (129), e56337 (2017).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- de Bont, C. M., Koopman, W. J. H., Boelens, W. C., Pruijn, G. J. M. Stimulus-dependent chromatin dynamics, citrullination, calcium signalling and ROS production during NET formation. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1865, 1621-1629 (2018).
- Masuda, S., et al. Measurement of NET formation in vitro and in vivo by flow cytometry. Cytometry Part A. 91 (8), 822-829 (2017).
- Zharkova, O., et al. A flow cytometry-based assay for high-throughput detection and quantification of neutrophil extracellular traps in mixed cell populations. Cytometry Part A. 95 (3), 268-278 (2019).
- Hosseinnejad, A., et al. DNase I functional microgels for neutrophil extracellular trap disruption. Biomaterials Science. 10 (1), 85-99 (2022).
- Chrysanthopoulou, A., et al. Neutrophil extracellular traps promote differentiation and function of fibroblasts. The Journal of Pathology. 233 (3), 294-307 (2014).
- Tong, M., Abrahams, V. M. Visualization and quantification of neutrophil extracellular traps. Methods in Molecular Biology. 2255, 87-95 (2021).
- Santana, C. J. C., et al. Biological properties of a novel multifunctional host defense peptide from the skin secretion of the chaco tree frog, boana raniceps. Biomolecules. 10 (5), 790 (2020).
- Murphy, M. P., et al. Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo. Nature Metabolism. 4 (6), 651-662 (2022).
- Boero, E., et al. Use of flow cytometry to evaluate phagocytosis of staphylococcus aureus by human neutrophils. Frontiers in Immunology. 12, 635825 (2021).
- Karsten, C. B., et al. A versatile high-throughput assay to characterize antibody-mediated neutrophil phagocytosis. Journal of Immunological Methods. 471, 46-56 (2019).
- Smirnov, A., Solga, M. D., Lannigan, J., Criss, A. K. Using imaging flow cytometry to quantify neutrophil phagocytosis. Methods in Molecular Biology. 2087, 127-140 (2020).
