Summary
Este protocolo apresenta um conjunto de ensaios funcionais de neutrófilos para ser usado como um método de triagem para cobrir funções de diferentes vias de sinalização. O protocolo inclui uma avaliação inicial e simples da viabilidade celular, pureza, produção de espécies reativas de oxigênio, migração em tempo real, fagocitose e uma sugestão preliminar de armadilhas extracelulares para neutrófilos.
Abstract
Os neutrófilos são conhecidos como uma das primeiras linhas de defesa da resposta imune inata e podem desempenhar muitas funções celulares particulares, como quimiotaxia, migração reversa, fagocitose, degranulação de enzimas e metabólitos citotóxicos e liberação de DNA como armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs). Os neutrófilos não só têm sinalização fortemente regulada, mas também participam da regulação de outros componentes do sistema imunológico. Como os neutrófilos frescos são terminalmente diferenciados, de curta duração e altamente variáveis entre os indivíduos, é importante aproveitar ao máximo as amostras coletadas. Os pesquisadores muitas vezes precisam realizar ensaios de triagem para avaliar uma visão geral das muitas funções dos neutrófilos que podem ser afetadas por condições específicas sob avaliação. Um conjunto de testes seguindo um único processo de isolamento de neutrófilos de densidade normal foi desenvolvido para atender a essa necessidade, buscando um equilíbrio entre rapidez, abrangência, custo e acurácia. Os resultados podem ser usados para fundamentar e orientar estudos de seguimento aprofundados. Este procedimento pode ser realizado em um tempo médio de 4 h e inclui a avaliação da viabilidade celular, produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), migração em tempo real e fagocitose de leveduras em lâminas de vidro, deixando células suficientes para abordagens mais detalhadas, como estudos ômicos. Além disso, o procedimento inclui uma maneira de observar facilmente uma sugestão preliminar de TNEs após coloração panóptica rápida observada por microscopia de luz, com falta de marcadores específicos, embora suficientes para indicar se esforços adicionais nesse sentido valeriam a pena. A diversidade de funções testadas combina pontos comuns entre os testes, reduzindo o tempo e os gastos da análise. O procedimento foi denominado NeutroFun Screen e, apesar de apresentar limitações, equilibra os fatores supracitados. Além disso, o objetivo deste trabalho não é um conjunto de testes definido, mas sim uma diretriz que possa ser facilmente ajustada aos recursos e demandas de cada laboratório.
Introduction
Os neutrófilos são as células imunes inatas mais abundantes no sangue humano e são conhecidos por desempenhar um papel importante na infecção e inflamação, sendo os primeiros respondedores a chegar ao local do dano tecidual1. Nos últimos anos, tem havido um crescente reconhecimento do papel crucial que os neutrófilos desempenham em uma variedade de doenças e no suporte da homeostase2. Os neutrófilos não só têm sinalização fortemente regulada, mas também participam da regulação de outros componentes do sistema imune 3,4,5. Portanto, investigar os neutrófilos e suas diversas funções celulares incomuns, como quimiotaxia, migraçãoreversa6, fagocitose7, burst respiratório8 e liberação de armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs)7, é imperativo em inúmeros contextos de pesquisa onde é necessário avaliar as potenciais alterações funcionais, morfológicas ou moleculares dos neutrófilos desencadeadas por condições específicas em análise.
Os neutrófilos recém-isolados são terminalmente diferenciados, de curta duração, altamente dinâmicos e facilmente ativados9. No entanto, um método de armazenamento eficiente que não afete as respostas dos neutrófilos ainda não foi alcançado, tornando desafiadora a realização de múltiplos ensaios que devem ser ininterruptos. Além disso, análises funcionais previamentedescritas10,11, baseadas em ensaios que requerem citometria e/ou coloração fluorescente, podem não ser uma escolha viável quando uma avaliação ampla e inicial dos neutrófilos é necessária.
Para resolver essas questões, este protocolo descreve um conjunto de testes que podem ser realizados após um único processo de isolamento, incluindo a avaliação da viabilidade celular, produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), migração em tempo real e fagocitose de Saccharomyces cerevisiae, cujos resultados podem ser usados para fundamentar estudos de seguimento aprofundados. Este procedimento, denominado NeutroFun Screen, foi projetado para abranger as principais atividades efetoras, exceto a degranulação, e pode ser concluído em um tempo médio de 4 h, incluindo 1 h de ativação. Além disso, as células remanescentes podem ser usadas para abordagens mais detalhadas, como estudos ômicos. A vantagem desse método está no equilíbrio entre rapidez, abrangência, custo e precisão.
Além disso, há uma maneira de observar facilmente uma sugestão preliminar de NETs, sem marcadores específicos, mas o suficiente para indicar se mais esforços nessa direção valeriam a pena. A diversidade de funções testadas visa combinar pontos comuns entre os testes, reduzindo o tempo de análise e os gastos. O principal objetivo deste método é fornecer uma análise funcional equilibrada em relação à velocidade, abrangência, custo e acurácia que permita uma visão geral da resposta dos neutrófilos, tornando-se um passo inicial útil na investigação dos efeitos de novos estímulos sobre os neutrófilos de densidade normal.
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Protocol
Todos os experimentos seguiram rigorosamente as diretrizes éticas estabelecidas pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade de Brasília (processo 13364819.0.0000.5558), e as amostras foram identificadas por códigos para garantir o anonimato dos doadores. As células foram obtidas de doadores normais do sexo masculino, saudáveis, com idade entre 18 e 35 anos, que assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido e preencheram os seguintes critérios de elegibilidade: não fumantes/vapers, sem condições crônicas de saúde e sem história de condições inflamatórias nos últimos 14 dias.
1. Coleta de sangue
- Coloque assepticamente 0,3 mL de 5.000 UI/mL de heparina (ver Tabela de Materiais) em uma seringa estéril de 20 mL para heparinizá-la.
- Aplicar um torniquete venoso cerca de 4 pontos acima do local da punção e identificar a veia cubital ou cefálica mediana para punção venosa.
NOTA: Certifique-se de que o tempo total de torniquete não exceda 1 min. - Limpar o local da punção com álcool a 70% e realizar a punção venosa.
- Inverta suavemente a seringa três ou quatro vezes depois de coletar o sangue para misturar o sangue e a heparina corretamente.
2. Isolamento de neutrófilos
NOTA: Leucócitos polimorfonucleares (PMNs) são isolados por centrifugação por gradiente de densidade seguido de lise hipotônica das hemácias remanescentes (RBC), como descritoanteriormente11 com algumas alterações. Este método não é obrigatório para a realização dos ensaios de triagem, podendo ser substituído desde que o método escolhido resulte em uma viabilidade de >97%, priming ou ativação de <3% dos PMNs, e produza células suficientes para todos os ensaios, réplicas e condições. A realização dessas etapas em condições assépticas e o uso de soluções livres de endotoxinas são mandatórios para evitar a ativação celular.
- Fazer diluições de 12 mL de meios de separação de 60% e 70% (comercialmente disponíveis; ver Tabela de Materiais) em tubos cônicos de 50 mL.
- Prepare o gradiente de baixo para cima adicionando 4 mL de cada vez a diluição de 60% sobre a diluição de 70%, usando uma pipeta de 5 mL. Faça isso suavemente para evitar misturar a interface.
- Colocar cuidadosamente 12 mL de sangue heparinizado sobre o gradiente de densidade. Centrifugar a 200 x g durante 15 min à temperatura ambiente.
OBS: A partir desta etapa, até a ativação do PMN, todos os reagentes e tubos utilizados devem ser mantidos em um resfriador cheio de gelo. - Descarte a camada de plasma/células mononucleares e, em seguida, transfira suavemente a camada acima da pastilha de eritrócitos para dois tubos cônicos de 15 mL com aproximadamente 7,5 mL em cada. Completar o volume do tubo com solução salina balanceada de Hank (HBSS; ver Tabela de Materiais).
- Centrifugar a 300 x g durante 5 min a 19 °C.
- Lave o pellet de célula com HBSS.
- Descarte o sobrenadante despejando o tubo e ressuspenda suavemente o pellet em 7 mL de HBSS.
- Centrifugar a 300 x g durante 5 minutos a 19 °C para remover todos os meios de separação.
- Realizar lise hipotônica das hemácias remanescentes.
- Descarte o sobrenadante e combine os pellets em um único tubo.
- Ressuspender a pastilha de CH/PMN em 3 mL de H2O estéril e adicionar 3 mL de HBSS (2x) dentro de 25 s para restaurar a osmolaridade. Em seguida, centrifugar a 300 x g por 5 min a 19 °C.
- Repita os passos 2.8.1 e 2.8.2 para uma pastilha branca e sem eritrócitos.
NOTA: O sobrenadante deve ser removido o mais rapidamente possível para minimizar o contacto dos neutrófilos com os produtos de degradação das hemácias. Alternativamente, a segunda lise hipotônica pode ser substituída ressuspendendo suavemente a camada residual de hemácias e removendo todo o sobrenadante, pois as hemácias restantes sedimentarão acima da pelota de PMN.
- Descarte o sobrenadante despejando o tubo, ressuspenda suavemente os PMNs no buffer restante e transfira-os para um microtubo gelado.
NOTA: Certifique-se de anotar o volume durante a transferência das células ressuspensas com uma micropipeta. - Transferir 3 x 1 μL da suspensão celular para uma lâmina de vidro limpa (três poços de 1 μL cada) e corar com panóptica rápida (ver Tabela de Materiais) para avaliação da morfologia e pureza12.
- Para coloração com panóptica rápida, imergir a lâmina cinco vezes no fixador panóptico n° 1, seis vezes em eosina n° 2 e duas vezes em hematoxilina n° 3, com duração de 1 s cada imersão.
- Lave suavemente a lâmina de vidro com água destilada.
- Deixe escorrer e secar ao ar.
- Observar ao microscópio e contar 300 células aleatórias em cada poço, diferenciando os neutrófilos dos demais granulócitos.
- Transferir 1 μL da suspensão celular para 49 μL do corante azul de tripano a 0,2%13 e contar as células usando uma câmara de Neubauer, distinguindo entre células mortas e viáveis.
- Ajustar a concentração celular para 6.667 células/μL utilizando uma solução de plasma autólogo a 50% e HBSS a 50% suplementada com cálcio e magnésio. Dividir uniformemente a suspensão de 6.667 células/μL entre os microtubos correspondentes às condições a serem testadas, incluindo o controle negativo.
NOTA: Qualquer concentração celular semelhante aos neutrófilos circulantes no organismo modelo pode ser usada, mas é importante usar a mesma concentração celular em todos os experimentos para reprodutibilidade.
Figura 1: Protocolo de isolamento de neutrófilos. Duas concentrações do meio de separação (percoll) (A) são empilhadas (B), então o sangue é colocado em camadas no topo do gradiente de separação (C). Após a centrifugação, o PMN fica na camada central (D), que é dividida em dois tubos de 15 mL (E). A suspensão celular é lavada duas vezes em HBSS e centrifugada (G-I) para remover o meio, em seguida, as células são ressuspensas e as hemácias residuais são submetidas a duas rodadas de lise hipotônica (J-M). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
3. Preparação para ativação de neutrófilos
- Em microtubos de 1,5 mL, preparar um sistema de ativação para cada condição de modo que a concentração celular final seja de 6.600 células/μL. Por exemplo, para testar os efeitos de 100 nM fMLP (N-formil-metionil-leucil-fenilalanina; ver Tabela de Materiais), adicione 5 μL de 10 μM fMLP a 495 μL da suspensão de 6.667 células/μL. Para o controle negativo (não estimulado), adicionar HBSS contendo Ca2+ e Mg2+.
NOTA: Para demonstrar esta metodologia, foram utilizadas as seguintes concentrações finais dos estímulos: 100 nM fMLP, 16 μM de falaxin, um peptídeo antimicrobiano de ocorrência natural14, e 100 nM PMA (phorbol 12-miristato 13-acetato) (ver Tabela de Materiais). - Incubar a 37 °C sem rotação.
NOTA: Todas as alíquotas para ensaios funcionais são retiradas desta suspensão celular, doravante denominada sistema de ativação.
4. Ensaio de cloreto de azul de nitrotetrazólio (NBT) para avaliação da produção de ROS
- Preparação da solução de trabalho NBT: Para cada condição experimental, prepare uma solução de trabalho NBT (ver Tabela de Materiais) de 6 mM usando as seguintes etapas:
- Dissolver 0,0005 g de NBT em 10 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) e vórtice por pelo menos 15 min.
- Adicionar 90 μL de HBSS Ca2+Mg2+ e vórtice até 2 min.
OBS: Todas as etapas que envolvem o NBT devem ser realizadas no escuro.
- Realizar teste de lâminas NBT.
- Após 20 minutos de ativação celular, misture suavemente a suspensão celular e transfira cuidadosamente 2 μL de PMN para uma lâmina de vidro limpa. Incubar durante 20 min numa câmara humidificada a 37 °C.
OBS: Não espalhe muito a suspensão da célula sobre a lâmina; caso contrário, pode secar antes da incubação. - Adicionar 1 μL da solução de trabalho NBT sobre as células e incubar durante 20 minutos protegido da luz.
- Seque a lâmina com ar quente e fixe-a com uma gota de metanol em cada poço por 1 min. Coloração com 0,03% de safranina (ver Tabela de Materiais) por 1 min.
- Lave suavemente a lâmina de vidro com água destilada.
- Deixe a lâmina secar ao ar e observe ao microscópio.
- Contar 100 células aleatórias em cada poço, diferenciando neutrófilos com e sem depósitos de formazana.
- Após 20 minutos de ativação celular, misture suavemente a suspensão celular e transfira cuidadosamente 2 μL de PMN para uma lâmina de vidro limpa. Incubar durante 20 min numa câmara humidificada a 37 °C.
- Realizar ensaio de espectrofotometria NBT.
- Após 40 min de ativação celular, misture suavemente a suspensão celular e transfira 90 μL de PMNs do sistema de ativação para um microtubo limpo. Em seguida, adicione cuidadosamente 20 μL da solução NBT 6 mM. Incubar no escuro durante 20 minutos a 37 °C.
- Adicionar 100 μL de dodecil sulfato de sódio a 10% (SDS; ver Tabela de Materiais) e vórtice.
- Sonicate usando um sonicator de ponta a uma amplitude de 60%, cinco ciclos de 15 s cada com intervalos de 15 s. Centrifugar a 12.000 x g por 5 min.
- Transferir 60 μL do sobrenadante para uma placa de fundo claro de 96 poços e medir a absorbância do produto formazan a 570 nm.
5. Ensaio de fagocitose
- Prepare uma suspensão de 33.000 leveduras/μL para cada condição, conforme descrito abaixo:
- Adicionar aproximadamente 0,75 mg de levedura seca (Saccharomyces cerevisiae; ver Tabela de Materiais) a 200 μL de HBSS Ca2+Mg2+ e incubar num termomisturador a 100 °C com 500 rpm durante, pelo menos, 15 min.
- Homogeneizar a mistura por vórtice e transferir 5 μL de suspensão de levedura para 45 μL de corante azul de tripano a 0,2%. Conte as leveduras usando uma câmara de Neubauer.
- Ajustar a concentração da suspensão inicial para 33.000 células de levedura/μL utilizando HBSS Ca2+Mg2+. Mantenha a suspensão no gelo até o uso.
- Após 20 min de ativação celular, misturar suavemente a suspensão celular e transferir 5 μL do sistema de ativação para 5 μL da suspensão de 33.000 leveduras/μL de Saccharomyces cerevisiae em um novo microtubo estéril.
NOTA: A relação neutrófilo/levedura é de 1:5 (PMN:levedura). - Transferir imediatamente 6 μL da suspensão PMN/levedura para três poços de uma lâmina de vidro limpa (2 μL cada) e incubar a lâmina em uma câmara umidificada por 40 min.
OBS: Não espalhe muito a suspensão da célula sobre a lâmina; caso contrário, pode secar antes da incubação. - Secar a lâmina sob ar quente e manchar com panóptica rápida, conforme descrito no passo 2.9 acima.
NOTA: O terceiro passo da coloração panóptica rápida é fundamental para a análise microscópica da lâmina. A coloração da lâmina por ≥3 s nesta etapa pode torná-la imprópria para análise, uma vez que será difícil diferenciar leveduras de lobos nucleares de neutrófilos. - Observar as lâminas ao microscópio, contando 100 neutrófilos aleatórios de cada poço e discriminando entre PMNs positivos e negativos para fagocitose.
NOTA: Pelo menos uma partícula de levedura dentro ou em contato direto com a membrana celular PMN indica um PMN positivo para fagocitose. Se estiver interessado na relação levedura/neutrófilo, conte também o número de partículas de levedura engolfadas.
6. Ensaio de quimiotaxia PMN em tempo real
OBS: O ensaio de migração é realizado de forma semelhante ao protocolo descrito anteriormente15, com as seguintes adaptações:
- Prepare o gradiente quimiotático adicionando 160 μL de quimioatrativo (por exemplo, fMLP, IL-8, C5 ou LTB4; ver Tabela de Materiais) à câmara inferior de uma placa de análise de células em tempo real (RTCA) baseada em impedância. Para controles negativos e brancos, adicionar 160 μL de HBSS Ca2+Mg2+.
- Fixar a câmara superior e adicionar 25 μL de HBSS Ca2+Mg2+. Incubar à temperatura ambiente durante pelo menos 1 h para formar o gradiente quimiotático.
- Após 60 min de ativação celular, misturar suavemente a suspensão celular e colocar 60 μL de suspensão celular na câmara superior. Adicionar 60 μL de HBSS Ca2+Mg2+ ao branco.
- Coloque a placa RTCA e programe o software RTCA para medir o índice celular (IC) a cada 60 s por 2 h.
NOTA: As placas de ATR podem ser lavadas para reutilização conforme descrito anteriormente16. Em resumo, lave as câmaras e eletrodos de ATR com solução salina buferred de fosfato (PBS) três vezes, depois com água ultrapura tipo I duas vezes. Incubar a câmara inferior e superior com tripsina 0,25% 0,53 mM ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) por 40 min. Lave com água ultrapura três vezes.
7. Ensaio sugestivo de NET
- Após 10 min de ativação celular, misturar suavemente a suspensão celular e transferir 4 μL dos PMNs de cada sistema de ativação sob avaliação, divididos em dois poços de uma lâmina de vidro limpa. Incubar numa câmara humidificada a 37 °C durante 30 min.
- Adicionar 1 μL de DNAse I a um dos poços e incubar durante 20 min a 37 °C (numa câmara húmida).
- Secar a lâmina e corar com panóptica rápida, conforme descrito anteriormente no passo 2.9 da seção "isolamento de neutrófilos".
- Avalie as lâminas ao microscópio.
Observação : procure qualquer indicação de versão NET, caracterizada pela presença de estruturas semelhantes à Web. Uma vez identificado, confirme se o tratamento com DNAse I foi capaz de remover tais estruturas. Este ensaio é sugestivo de formação de NET, uma vez que testes adicionais são necessários para confirmar sua presença.
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Representative Results
O método de isolamento baseado em densidade utilizado neste estudo (Figura 1) atendeu aos critérios para os experimentos propostos. Os parâmetros neutrófilos obtidos por esse método incluíram viabilidade ≥98%, pureza ≥94% e rendimento celular ≥1,5 x 107, sem ativação detectável pelos testes de triagem. Duas etapas relevantes no isolamento dos PMNs são a anticoagulação e a remoção das hemácias. Manter o tubo de sangue anticoagulado ou a seringa em um balanço suave antes de sobrepor o gradiente de densidade e escolher um método de remoção de hemácias para evitar tanto a ativação quanto a contaminação podem influenciar o rendimento e a reprodutibilidade do experimento.
Para avaliar a visão funcional da função dos neutrófilos, foi desenvolvido um fluxo de trabalho que permitiu que os ensaios de triagem propostos fossem realizados com pelo menos dois pesquisadores em um tempo médio de 4 h, com 1 h de ativação e 2 h de monitoramento da migração em tempo real, como mostra a Figura 2.
Figura 2: O fluxo de trabalho do NeutroFun Screen. Para avaliar o painel de respostas funcionais desencadeadas por condições específicas sob avaliação, o fluxo de trabalho do NeutroFun Screen conta com a participação de pelo menos dois pesquisadores. O pesquisador 1 (R1) inicia o processo de isolamento do PMN, seguido do ajuste da concentração celular e incubação do sistema de ativação, enquanto que, paralelamente, o pesquisador 2 (R2) prepara os materiais para realizar os próximos ensaios, que são divididos entre os dois: R1 realiza ensaios de fagocitose, NET e espectrofotométricos NBT; O R2 realiza migração em tempo real e testes de slides NBT. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
O ensaio clássico do NBT17 foi otimizado para avaliação das lâminas e espectrofotométrica da formação de formazana resultante da reação do NBT com as ROS geradas pelos PMNs. O ensaio espectrofotométrico permitiu quantificação relativa entre as condições, enquanto o ensaio de microscopia foi útil para análise descritiva e semiquantitativa, avaliando a regularidade da distribuição cristalina, morfologia e número de células contendo formazana. Os resultados do ensaio espectrofotométrico são mostrados na Figura 3A, indicando que 100 nM de PMA induziram elevada produção de ERO (em uma proporção média de 3:2:1) em comparação com os grupos fMLP e controle. Os resultados do teste de lâminas do NBT (Figura 3B) corroboraram os resultados espectrofotométricos, mostrando também a PMA como o estímulo indutor da produção de ERO mais intenso em relação à fMLP (Figura 3C), como demonstrado anteriormente pela medida direta das ROS por citometria18. Em relação à contagem celular, o número de neutrófilos contendo cristais de formazana mostrou uma relação de 7:4:1 nas condições PMA:fMLP:controle, revelando também diferentes padrões de distribuição de formazana entre PMMf e PMNs ativados por PMA; O tratamento com fMLP resultou em células individuais intensamente ativadas, enquanto o PMA induziu a formação de cristais de formazana espalhados por todo o citoplasma na maioria dos PMNs. Além disso, algumas características morfológicas que diferenciaram as condições foram observadas, como expressiva agregação celular após tratamento com PMA. A ausência dessas características típicas de ativação e baixos níveis de formazana no grupo controle indicaram que o estado de repouso não foi significativamente perturbado. Portanto, o ensaio NBT provou ser um teste simples, barato e confiável para a produção de ROS de neutrófilos, que pode ser usado para visualizar a capacidade e a intensidade de um dado estímulo para induzir a produção de EROs.
Figura 3: Teste NBT. (A) Avaliação espectrofotométrica da explosão respiratória de neutrófilos para diferentes condições (controle negativo: fMLP 100 nM e PMA 100 nM) pela absorbância de formazana (490-630 nm). Os dados de quatro doadores são apresentados como média ± desvio padrão (DP). * = todos os grupos são diferentes entre si (p≤ 0,05); £ = As comparações CTRL versus PMA e fMLP versus PMA mostram diferenças significativas (p≤ 0,05). (B) O teste de lâminas pode ser analisado qualitativamente, caracterizando a intensidade dos depósitos de formazana, sua localização dentro da célula e a agregação celular. Setas pretas apontam para cristais de formazana. Barras de escala: 20 μm. (C) Número de PMNs contendo formazana, contado por microscopia óptica. Os dados de oito doadores apresentaram média ± DP.*** p < 0,0001, teste t de Student. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
As lâminas de fagocitose foram utilizadas para determinar a taxa de fagocitose em porcentagem de neutrófilos que realizaram fagocitose, como mostra a Figura 4. Embora tanto o fMLP de 100 nM quanto o peptídeo antimicrobiano de 16 μM tenham induzido um aparente aumento do engolfamento de leveduras, a diferença não foi estatisticamente significativa até a dupla estimulação, o que aumentou significativamente a fagocitose em comparação com o grupo controle e pode sugerir uma resposta à dupla estimulação.
Figura 4: Teste de fagocitose. Os neutrófilos foram avaliados pela capacidade de fagocitose (contagem de neutrófilos contendo levedura). Embora a exposição a 100 nM fMLP ou a um peptídeo antimicrobiano de 16 μM antes da incubação da levedura tenha aumentado a fagocitose em comparação com o grupo controle, (A) o aumento não foi estatisticamente significativo. Curiosamente, uma incubação inicial com fMLP, seguida pela adição do peptídeo antimicrobiano, resultou em fagocitose significativamente aumentada em neutrófilos humanos (asterisco entre CTRL e o peptídeo antimicrobiano fMLP+). (B) As setas pretas mostram células leveduriformes, as setas verdes mostram apenas neutrófilos e as setas vermelhas apontam para neutrófilos fagocitantes. Os dados de cinco doadores apresentaram média ± DP. Barras de escala: 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Um exemplo de resultados de migração celular em tempo real é mostrado na Figura 5, exibindo o conhecido efeito quimiotático de 100 nM fMLP sobre neutrófilos. A cinética de migração celular foi ajustada ao modelo de Gompertz, possibilitando a comparação de seus parâmetros.
Figura 5: Migração de células em tempo real. O índice celular reflete a impedância elétrica resultante da migração celular. Neste ensaio, fMLP foi usado como um controle positivo da migração de neutrófilos adicionando 100 nM fMLP à câmara inferior. Um controle negativo (CTRL) continha apenas HBSS na câmara inferior. As curvas superpostas representam o ajuste da curva ao modelo de Gompertz, modificado para melhor se ajustar às inclinações ascendente e descendente. Os dados de três doadores, apresentados como média ± DP.* p < 0,05, teste t de Student. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Finalmente, um teste de microscopia óptica simples sugestivo da presença de NET, no qual os PMNs são corados com panóptica rápida. É possível observar que para alguns estímulos específicos indutores de NET, como PMA ou alguns peptídeos antimicrobianos, mesmo após um curto tempo de ativação (1 h) é possível observar estruturas filamentosas semelhantes a teias próximas às células, o que não é possível em outras condições como o controle negativo e fMLP (Figura 6). Para melhor sustentar essa afirmação, DNase I foi adicionada após 40 min de ativação celular com PMA de 100 nm ou um peptídeo antimicrobiano, removendo as estruturas NET-like (Figura 6). Embora esse método não seja adequado para a caracterização de NETs e possa ser influenciado por artefatos, é um ponto de partida barato, simples e interessante para justificar novos investimentos na análise de NETs, especialmente em contextos em que os efeitos dos estímulos são desconhecidos ou mal descritos.
Figura 6: Ensaio sugestivo de formação de NET. Uma análise qualitativa de neutrófilos corados com panóptico após 1 h de ativação sobre uma lâmina de vidro pode indicar liberação de NET. Os grupos CTRL (A,B) e fMLP (C,D) não apresentaram qualquer indicação de liberação de NET, enquanto a ativação com PMA (E-H) induziu a formação de estruturas semelhantes a NETs que foram degradadas pelo tratamento com DNase I (I-L). A investigação dos efeitos de um peptídeo antimicrobiano sobre os neutrófilos mostrou que tal estímulo pode ser capaz de eliciar a liberação de NET, uma vez que as lâminas apresentavam estruturas net-like (M-P) que foram degradadas pela DNase I (Q-T). As setas vermelhas apontam para estruturas semelhantes à NET. Barras de escala: 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Os neutrófilos são células altamente dinâmicas e responsivas, de curta duração e ainda não podem ser criopreservados19, o que torna as investigações sobre sua biologia desafiadoras. Portanto, é essencial seguir passos cuidadosos para obter neutrófilos viáveis, enriquecidos e em repouso11,20. Este estudo empregou uma técnica de isolamento baseada em densidade que enfatiza a manipulação suave e mínima, bem como o uso de baixas temperaturas até a etapa de ativação. Além disso, o processamento do sangue deve ocorrer dentro de 30 minutos após a punção venosa e ser armazenado à temperatura ambiente. O presente trabalho apresenta uma opção para diminuir o estresse de manipulação e o tempo de experimento. Para simplificar ainda mais o processo, introduzimos uma nova etapa (como opção) no protocolo, que envolve a remoção de hemácias por ressuspensão suave e aspiração da camada de hemácias após um único procedimento de hemólise. Essa etapa reduz o estresse de manipulação e o tempo de experimento, pois remove a maioria das hemácias com apenas uma etapa de hemólise hipotônica. No entanto, deve-se notar que as habilidades do operador afetam muito a eficácia dessa etapa, e nem sempre pode remover totalmente as hemácias. Além disso, a aspiração de hemácias pode levar à perda de neutrófilos, mas isso não afeta o rendimento, pois mais neutrófilos foram inicialmente recuperados do gradiente ao coletar mais perto da camada de hemácias. Portanto, a aspiração de hemácias é recomendada se os ensaios não exigirem a maior pureza possível, ou se o operador tiver tido resultados consistentemente bons. Para os testes de triagem aqui apresentados, uma pequena quantidade de hemácias contaminantes (<3%) não interferiria nos resultados.
Para garantir que todos os procedimentos sejam realizados em tempo hábil, incluindo a preparação dos reagentes, é apresentado um fluxo de trabalho (Figura 2) que detalha o cronograma e a divisão de tarefas entre dois pesquisadores. Após o término de todos os ensaios funcionais, as células remanescentes podem ser preparadas para investigações moleculares posteriores, como estudos ômicos por lise celular com tampão de lise e armazenamento adequados.
Produção de ROS
O burst respiratório é uma característica do priming e ativação de neutrófilos18,21, e a avaliação da produção de ERO é um método comum usado para estimar o estado de ativação de neutrófilos. Este estudo avaliou a produção de ERO utilizando duas abordagens: microscopia óptica e espectrofotometria.
O teste NBT é uma abordagem bem conhecida para avaliar o burst respiratório em neutrófilos 22,23. Dois métodos comumente utilizados são os ensaios baseados em microscopia óptica (ou teste de lâmina) e espectrofotometria 24,25,26. Embora a microscopia óptica permita a visualização de detalhes no nível celular, ela é propensa a viés do usuário. Portanto, o teste de lâminas do NBT serve como um complemento qualitativo ao ensaio espectrofotométrico em relação às características fenotípicas, tais como padrões de formação de formazana, intensidade e agregação celular.
As etapas críticas para os ensaios de lâmina e espectrofotometria do NBT são a solubilização completa do NBT e do formazan. Ao contrário das recomendações do fabricante, o NBT não se dissolve bem em água. No entanto, homogeneizar o NBT em DMSO por pelo menos 15 min e, em seguida, adicionar água/HBSS e vórtice por 2 min fornece solubilização completa. Além disso, para analisar a absorbância de formazan, duas etapas críticas devem ser alcançadas: (1) liberação de cristais de formazana das células por lise de PMN e (2) solubilização completa de cristais de formazana. Ambas as etapas foram alcançadas com o tratamento do pellet celular com SDS a 10%, como recentemente sugerido27, seguido de análise de sonicação e absorbância do sobrenadante a 570 nm.
Além disso, os resultados do NBT dos grupos controle negativo e positivo são o primeiro passo da triagem a ser avaliada. Esta etapa deve mostrar uma diferença notável, uma vez que a avaliação da produção de ERO através do formazan indica se o processo de isolamento pode ter sido responsável por mudanças indesejadas no estado de repouso das células, seja por estimulação ou inibição.
Outros métodos, como a análise de citocromo credução28 ou citometria defluxo29, são frequentemente utilizados para detecção de EROs; no entanto, considerando uma abordagem de triagem, sua aplicação requer maior tempo de experimento, uso de marcadores específicos e instrumentos caros. A quimioluminescência do luminol/isoluminol é um método rápido e econômico para a detecção de EROs, além de permitir a diferenciação de ERO intra e extracelular. No entanto, um luminômetro é necessário para este método 30,31. Embora o custo do instrumento pudesse ser contornado pelo uso de uma instalação, ele ainda seria inadequado para uma análise de triagem realizada simultaneamente com outros ensaios.
Fagocitose
A incubação PMN/levedura fornece uma visão geral da capacidade e eficácia da fagocitose de neutrófilos, contando o número de neutrófilos que realizam fagocitose e o número de leveduras engolidas por neutrófilo. No entanto, como a própria partícula de levedura é um sinal de ativação, a comparação do grupo controle com o PMN pré-tratado constitui um sistema de estimulação dupla, que pode não apresentar alterações significativas, como mostrado no CTRL versus PMN tratado com fMLP (Figura 4). No entanto, este ensaio é útil para indicar se um modulador potencial geraria algum impacto na fagocitose. Um novo peptídeo antimicrobiano foi testado usando este ensaio, e os resultados indicam uma resposta potencial interessante a essa combinação de estímulos, que tem sido recentemente discutida como necessária para uma ativação eficiente32.
O passo crítico para este ensaio é a coloração, pois a análise torna-se pouco confiável se a lâmina for mantida na panóptica nº 3 (hematoxilina) por ≥3 s. Isso ocorre porque as células de levedura e os lobos nucleares de neutrófilos não podem ser distinguidos uns dos outros. Além disso, esta abordagem permite a análise morfológica dos neutrófilos após exposição a moduladores. A citometria de fluxo é outra técnica eficiente para analisar a fagocitose33, embora apresente limitações pela dificuldade em discriminar entre partículas ligadas à membrana e engolidas e outros fatores relacionados ao conjunto de triagem proposto, como discutido no tópico anterior. A mesma limitação é observada no método aqui descrito, embora deva ser considerado como uma triagem inicial para orientar estudos de seguimento.
Migração em tempo real
O protocolo de triagem em tempo real foi otimizado para avaliar a capacidade de migração de PMNs. Embora um estudo anterior tenha sugerido que o revestimento da face inferior da placa de ATR era necessário para o ensaio de migração para mostrar uma diferença entre o controle negativo e o tratamento com IL-815, este estudo mostrou altos valores de intervalo de confiança (IC) para células tratadas com fMLP sem a adição de agentes de revestimento. Os resultados apresentaram alta reprodutibilidade, com migração significativa a partir de 12 min. Além disso, a análise de ajuste de curvas dos dados de migração obtidos pode revelar parâmetros, tais como índice máximo de células, bem como aumento e diminuição da inclinação, que são úteis para entender a dinâmica da migração, podendo depender da concentração ou diferir entre as condições. O melhor ajuste para as curvas de migração de neutrófilos (Figura 5) foi para a função de Gompertz ajustada34, mostrando que a fMLP aumenta o índice celular máximo e aumenta a inclinação.
Atenção especial é necessária para evitar bolhas no sistema RTCA, pois elas podem bloquear a passagem das células pelos eletrodos, comprometendo o experimento. Um fator limitante é o alto custo das placas. Embora técnicas mais baratas analisem a migração celular, elas carecem de boa reprodutibilidade ou são difíceis e demoradas, como a câmara de Boyden35. Portanto, a ATR é uma análise de migração confiável e compatível com os outros testes de triagem aqui apresentados.
Redes
Finalmente, um ensaio promissor, fácil e de baixo custo para uma avaliação preliminar da formação de NET foi desenvolvido usando microscopia óptica. Ela foi derivada da observação de lâminas de fagocitose, nas quais a PMA, um estímulo específico indutor de NET, testado quanto ao seu efeito na capacidade de fagocitose, também induziu a formação de uma estrutura semelhante a uma teia em comparação com os grupos CTRL e fMLP. Este trabalho levantou a hipótese de que essas estruturas poderiam indicar a versão NET. Tal hipótese foi testada pelo tratamento das amostras com DNase I após a ativação, onde não foram encontradas estruturas filamentosas nos neutrófilos ativados por PMA. A suposição de que tais estruturas são prováveis de serem NETs baseia-se no fato de que a PMA é citada como um indutor bem conhecido da formação de NETs36,37, no achado de estruturas semelhantes por microscopia de fluorescência usando marcadores específicos para NETs38,39 e na degradação de NETs catalisada por DNase I40,41. É importante enfatizar que este não é um método para a confirmação da formação de NETs, mas apenas uma triagem preliminar que sugere a presença de NETs. Embora este teste tenha limitações, uma vez que os TNEs podem ser confundidos com artefatos de coloração, ele serve a um propósito relevante ao sugerir a formação de NETs em uma triagem rápida e de baixo custo que pode ser realizada em conjunto com outros testes funcionais. Uma vez detectados como possivelmente relevantes para o estudo em triagem, os TNEs podem ser posteriormente avaliados por microscopia confocal ou eletrônica42, como discutido mais adiante.
Em nosso laboratório, novos peptídeos antimicrobianos, também com probabilidade de ter atividades imunomoduladoras, são frequentemente avaliados por esse conjunto de ensaios de triagem para melhor orientar uma análise mais aprofundada dos efeitos de alguns peptídeos em neutrófilos humanos, já que alguns mostram interessantes propriedades moduladoras de ROS43, fagocitose, migração e/ou NET.
Em conclusão, o NeutroFun Screen oferece uma ferramenta valiosa para identificar potenciais moduladores da atividade de neutrófilos de densidade normal a partir de um grande número de compostos não testados. No entanto, é importante notar que este método serve apenas como uma triagem preliminar. Após essa triagem inicial, metodologias mais caras, avançadas e demoradas podem ser direcionadas para funções ou caminhos específicos sugeridos por esses primeiros resultados para validação dos dados. Para a produção de EROs, fagocitose e formação de NET, existem métodos alternativos para validação dos dados e obtenção de resultados quantitativos adicionais. A visualização e quantificação do NET podem ser realizadas por meio da análise por microscopia de imunofluorescência, que determina a presença e sobreposição de DNA extracelular e proteínas dos grânulos, como a mieloperoxidase e a elastase neutrofílica, como descrito em detalhes recentemente42. As ROS desempenham diferentes papéis cruciais em muitos processos biológicos e, portanto, seu estudo é altamente difundido e diversificado. Entre as metodologias mais estabelecidas estão aquelas que fazem uso de anticorpos, como o ensaio imunoenzimático (ELISA) e o immunoblotting de luminescência, ou a detecção de fluorescência, como citometria de fluxo de células sob diferentes marcações, por meio de DCFDA, espectroscopia de RPE e medidas de atividade enzimática44. Da mesma forma, a avaliação robusta da fagocitose também é feita de várias maneiras; Os métodos alternativos incluem citometria de fluxo isolada45,46 ou combinada com microscopia de fluorescência47. A migração celular em tempo real descrita é um ensaio robusto e suficiente que não requer validação adicional e apresenta parâmetros que outras metodologias não conseguem contemplar. Outras combinações de tais métodos podem se adequar melhor a cenários específicos, mas, em resumo, isso representa uma combinação rápida e acessível que engloba muitas atividades de neutrófilos.
Em resumo, este estudo visa fornecer um conjunto de ensaios consistindo de metodologias simples, rápidas e de baixo custo para avaliar múltiplas respostas de neutrófilos a novas moléculas e condições como forma de melhor direcionar esforços para metodologias avançadas. Como principais limitações, os resultados dos ensaios de ROS, NET e fagocitose devem ser considerados preliminares e precisam de validação adicional por ensaios mais específicos e elaborados, e aqueles que dependem da contagem de células de microscopia não automatizada são propensos a viés inconsciente.
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Disclosures
Os autores declaram a inexistência de conflitos de interesse.
Acknowledgments
As agências de fomento FAPDF, CNPq, CAPES, UnB, FINEP e FINATEC são reconhecidas pelos autores.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CIM-Plate 16 | Agilent | 5665825001 | |
| CLARIOstar Plate Reader | BMG LABTECH | US Patent Number 9,733,124 Product details: MARS Data Analysis Software |
|
| Dimethyl sulfoxide | Dinâmica | 1582 | |
| DNAse I | Sigma - Aldrich | DN 25 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma - Aldrich | E5134 | |
| Fast panoptic stain | Laborclin | 620529 | |
| Glass slide | Exacta | 7102 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution with calcium, with magnesium, without phenol red. | Sigma - Aldrich | 55037C | |
| Hank’s Balanced Salt Solution without calcium chloride, magnesium sulfate and sodium bicarbonate. | Sigma - Aldrich | H4641 | |
| Heparin | Blau | 7896014655229 | |
| Laminar flow cabinet | Veco | VLFS-12 | |
| Microscope | Zeiss | 415501-0101-002 | Product details: Primostar 1 |
| Mixing Block | BIOER | MB-102 | |
| Neubauer improved bright-lined | New Optik | 1110000 | |
| N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine | Sigma - Aldrich | F3506 | |
| Nitroblue tetrazolium | Neon | CAS 298-83-9 | |
| Percoll | Cytiva | 17089101 | separation media |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma - Aldrich | P8139 | |
| Phosphate buffered saline tablet | Sigma - Aldrich | P4417 | |
| ROTOFIX 32 A | Hettich | 1206 | |
| Saccharomyces cerevisiae | Fleischmann | ||
| Safranin | Sigma - Aldrich | 50240 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Cytiva | 17-1313-01 | |
| Sonicator | Qsonica | Q125 | |
| Trypan blue solution | Vetec | C.I. 23850 | |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries, Inc. | 0K-0500-902 | |
| xCELLigence Real-Time Cell Analysis (RTCA) DP (dual purpose) | Agilent | 380601050 | Product details: RTCA system composed of detection hardware, cell plates and software |
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