Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

הכנת דגימה ללכידת תרחיף חלבונים עבור פרוטאומיקה של דמעות על ידי כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה טנדם

Published: December 1, 2023 doi: 10.3791/64617
Automatic Translation
*1, *1,2, 1,2, 1, 1,2,3,4
1Centre for Myopia Research, School of Optometry, The Hong Kong Polytechnic University, 2Centre for Eye and Vision Research (CEVR), 3Research Centre for SHARP Vision (RCSV), The Hong Kong Polytechnic University, 4Research Centre for Chinese Medicine Innovation (RCMI), The Hong Kong Polytechnic University
* These authors contributed equally

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה לאיסוף דגימות דמעות באמצעות רצועות Schirmer ותהליך עבודה כמותי משולב לגילוי סמנים ביולוגיים לא פולשניים של חלבון דמעות. תהליך העבודה של הכנת דגימת לכידת מתלים מאפשר הכנת דגימת דמעות מהירה וחזקה וניתוח ספקטרומטרי מסה, וכתוצאה מכך תפוקות שחזור פפטידים וזיהוי חלבונים גבוהים יותר מאשר הליכים סטנדרטיים בתמיסה.

Abstract

נוזל דמעות הוא אחד הנוזלים הביולוגיים הנגישים בקלות שניתן לאסוף באופן לא פולשני. לפרוטאומיקה של דמעות יש פוטנציאל לגלות סמנים ביולוגיים למספר מחלות ומצבים עיניים. עמודת לכידת המתלים דווחה כזרימת עבודה יעילה וידידותית להכנת דגימות ליישום רחב של אנליזה פרוטאומית במורד הזרם. עם זאת, אסטרטגיה זו לא נחקרה היטב בניתוח של פרוטאום דמעות אנושי. הפרוטוקול הנוכחי מתאר זרימת עבודה משולבת מדגימות דמעות אנושיות קליניות לפפטידים מטוהרים למחקר סמנים ביולוגיים לא פולשניים של חלבון דמעות באמצעות ספקטרומטריית מסות, המספקת תובנות לגבי סמנים ביולוגיים של מחלות וניטור בשילוב עם ניתוח ביואינפורמטיקה. הכנת דגימת לכידת תרחיף חלבונים יושמה והדגימה את גילוי פרוטאום הדמעות בהליכים מהירים, ניתנים לשחזור וידידותיים למשתמש, כהכנת דגימה אוניברסלית ואופטימלית לניתוח נוזל דמעות אנושי. בפרט, הליך לכידת התרחיף השיג ביצועים טובים יותר מהכנת הדגימה בתמיסה במונחים של התאוששות פפטידים, זיהוי חלבונים וזמן הכנת דגימה קצר יותר.

Introduction

פרוטאומיקה של דמעות קיבלה תשומת לב לחקור סמנים ביולוגיים פוטנציאליים למחלות עיניים ומצבים 1,2,3,4,5,6, כדי לגשת לפתוגנזה של המצב העיני והמערכתי, כמו גם לנצל את היתרון של איסוף דגימות דמעות לא פולשניות באמצעות רצועות שירמר. ההתקדמות הטכנולוגית של ספקטרומטריית המסות של הדור הבא אפשרה לכמת חלבונים בדמעות בקנה מידה מיקרוליטרי בדיוק ובדיוק שלא היו אפשריים בעבר. שיטות הכנה לדוגמה עדיין אינן סטנדרטיות. תהליך עבודה חזק וסטנדרטי להכנת דגימות חיוני להצלחת היישום הקליני במחקר סמנים ביולוגיים של חלבון דמעות. תהליך הכנת הדגימה של לכידת המתלים (S-Trap) דווח לאחרונה כשיטת הכנת דגימה יעילה ורגישה לניתוח פרוטאומי רחב במורד הזרם 7,8. עם זאת, אסטרטגיה זו לא דווחה היטב בניתוח של פרוטאום דמעות אנושי, ביצועים טובים יותר מהכנת דגימות בעזרת מסנן (FASP) ועיכול בתמיסה במונחים של יעילות עיכול אנזימטית והמספר הגדול יותר של זיהוי חלבונים על ידי ניתוח ספקטרומטרי מסה9. הגישה מבוססת מלכודת ה-S הודגמה בהכנת רקמת רשתית 10, רקמה קבועה פורמלין, משובצת פרפין (FFPE) 11, תאים 12, מיקרואורגניזם 13 וביופסיות נוזליות14,15.

פרוטוקול זה מתאר זרימת עבודה כמותית משולבת מדגימות קליניות לחלבון מעוכל אנזימטי לגילוי פאנל סמנים ביולוגיים של חלבון דמעות לא פולשני עם אסטרטגיה טכנית מהירה, ניתנת לשחזור וחזקה. בקצרה, נוזל הדמעות נאסף באמצעות רצועת שירמר סטנדרטית ומיד יובש עם מחמם מסגרת עיניים כדי למנוע אוטוליזה של חלבון בטמפרטורת החדר. סך החלבונים המשובצים חולצו באמצעות חיץ ליזיס של 5% נתרן דודציל סולפט (SDS) על פי הצעת היצרן, ולאחר מכן מדידת בדיקת חלבונים. לאחר מכן עבר הליזט המופק הפחתה סטנדרטית עם dithiothreitol (DTT) ואלקילציה עם iodoacetamide (IAA).

לאחר החמצה עם חומצה זרחתית, חיץ משקעים של חלבון עמוד לוכד תרחיף המכיל 90% מתנול ו-100 מילימטר טריאתילמוניום ביקרבונט (TEAB) נוסף לחלבונים מצטברים. לאחר מכן הועברה הדגימה לעמודת מיקרו חדשה ללכידת מתלים. עיכול אנזימטי עם טריפסין בדרגת ריצוף ביחס של 1:25 (w/w, טריפסין: חלבון) ב-47°C למשך שעה אחת. הפפטידים שהתקבלו סולקו באמצעות צנטריפוגה, ברצף עם 50 מילימטר TEAB, 0.2% חומצה פורמית מימית (FA) ו-50% אצטוניטריל (ACN) שהכילו 0.2% FA. הפפטידים המדוללים יובשו בוואקום והורכבו מחדש ב-0.1% FA. ריכוז הפפטיד נמדד והותאם ל-0.5 מק"ג/מיקרוליטר לצורך אנליזה ספקטרומטרית של מסות.

Protocol

הנבדקים סיפקו הסכמה מדעת בכתב לפני השתתפותם במחקר. המחקר אושר על ידי ועדת האתיקה האנושית של האוניברסיטה הפוליטכנית של הונג קונג ודבק בעקרונות הצהרת הלסינקי.

1. איסוף נוזל דמעות אנושי עם רצועת שירמר

  1. יש ללבוש כפפות ולחטא כדי למנוע זיהום דגימה.
  2. בדקו שהאריזה הפנימית שלמה, סטרילית ולא פג תוקפה.
  3. כופפו מעט את החלק העליון של רצועת שירמר פנימה בסימן 0 מ"מ, כפי שמצוין ליד קצה חצי העיגול של הרצועה (איור 1).
  4. הסר את הרצועה מהחבילה הפנימית על ידי החזקת קצה הרצועה, והימנע ממגע ישיר עם אזור איסוף הדגימה מ- 0 עד 25 מ"מ.
  5. בקש מהנבדק להסיט את מבטו ממיקום הרצועה שיש למקם.
  6. משכו מטה את העפעף התחתון בעדינות וחברו את קצה הרצועה בפורניקס התחתון ליד אזור הקנטוס הצידי (איור 2). חזור על אותו הליך בעין השנייה.
  7. בקשו מהנבדק לסגור בעדינות את העפעפיים כדי למזער גירוי.
  8. יש לאסוף נוזל דמעות למשך כ-5 דקות או רצוי דגימת דמעות בקוטר 15-20 מ"מ.
  9. בקשו מהנבדק לפקוח את שתי העיניים, משכו מטה את העפעף התחתון בעדינות והסירו את הרצועות מהנושא.
  10. בדוק את אורך הלחות ברצועת שירמר ורשום את הכמות שנאספה במ"מ.
  11. יבשו את הרצועה עם מחמם מסגרת אחיד ונקי עד שהנוזל יבש לחלוטין.
    הערה: יש להימנע מחימום עודף שעלול לחרוך את נייר הפילטר.
  12. הכניסו כל רצועת שירמר מיובשת לצינור קריו-צינור מסומן ואחסנו אותה במקום קריר ויבש בחושך עד לעיבוד נוסף.

2. הכנת כימיקלים וריאגנטים

  1. חיץ ליזיס (5% SDS, 50 mM TEAB, pH 7.5), 20 מ"ל
    1. פיפטה 1 מ"ל של 1 M TEAB ו 80 μL של 12% חומצה זרחתית. מערבלים וסוניק לזמן קצר כדי להסיר בועות. למעלה עד 20 מ"ל עם מים deionized.
    2. שוקלים 1 גרם SDS ומוסיפים לתמיסה עם תנודה עד להמסה.
  2. מאגר משקעים חלבוני (90% מתנול, 100 mM TEAB, pH 7.1), 10 מ"ל
    1. הוסף 893 μL של 1 M TEAB ו 92 μL של מים deionized.
    2. הוסף 15 μL של 85 wt. % חומצה זרחתית ו 9 מ"ל של מתנול לתמיסה מערבולת לזמן קצר.
  3. חיץ עיכול (50 מ"מ TEAB), 1 מ"ל
    1. הוסף 50 μL של 1 M TEAB וממלא עד 1 מ"ל עם מים נטולי יונים.
  4. 200 mM dithiothreitol (DTT) פתרון, 500 μL
    1. שוקלים 15 מ"ג של DTT ומתמוססים ב 500 μL של מים deionized; מערבולת בקצרה.
      הערה: יש להכין לפני השימוש.
  5. תמיסת יודואצטמיד (IAA) 400 mM, 200 מיקרוליטר
    1. שוקלים 15 מ"ג של IAA ומתמוססים ב 200 מיקרוליטר של מים נטולי יונים; מערבולת בקצרה. הערה: יש להכין לפני השימוש ולהימנע מאור.
  6. 0.2% חומצה פורמית, 50% אצטוניטריל, 10 מ"ל
    1. להכין 10 מ"ל של 50% acetonitrile במים deionized.
    2. מוסיפים 20 μL של חומצה פורמית ומערבולת לזמן קצר.
  7. 0.2% תמיסת חומצה פורמית, 10 מ"ל
    1. הוסף 20 μL של חומצה פורמית ל 10 מ"ל של מים deionized מערבולת לזמן קצר.
  8. 0.1% תמיסת חומצה פורמית, 10 מ"ל
    1. הוסף 10 μL של חומצה פורמית ל 10 מ"ל של מים deionized; מערבולת בקצרה.

3. מיצוי חלבון ברצועת שירמר

  1. גזור והשלך את הקצה הקדמי מעבר לסימן 0 מ"מ של הרצועה כדי להסיר זיהום פוטנציאלי עקב מגע של רקמות הלחמית עם מספריים נקיים מנירוסטה.
  2. חתכו את הרצועה במרווחים של 1 מ"מ לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל (איור 3).
  3. הוסיפו 100 מיקרוליטר של חיץ ליזיס לצינור המיקרוצנטריפוגה, ומערבלים ב-1,000 סל"ד, טמפרטורת החדר למשך שעה בתרמומיקסר.
  4. צנטריפוגה לזמן קצר ולהעביר את supernatant לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש 1.5 מ"ל.
  5. מעבירים את הרצועות לקצוות פיפטה של 200 μL בעזרת מלקחיים נקיים. הכניסו את הקצוות לאותו צינור משלב 3.4 עם מחזיק וצנטריפוגה בטמפרטורת החדר ב-4,000 × גרם למשך דקה אחת נוספת להתאוששות מרבית של הדגימה הנותרת ברצועה.
  6. יש למדוד את ריכוז החלבון באמצעות חומצה ביכומונית (BCA) או בדיקת חלבון תואם.

4. הכנת דגימת לכידת מתלים

  1. נרמל דגימות ל 50 מיקרוגרם של חלבון בהתבסס על תוצאת בדיקת החלבון.
  2. הוסף DTT של 200 mM ביחס של 1:10 (v/v, DTT: sample) לריכוז סופי של 20 mM DTT ודגור ב- 95 ° C למשך 10 דקות.
  3. מצננים את תמיסת החלבון לטמפרטורת החדר.
  4. הוסף 400 mM IAA ביחס של 1:10 (v/v, IAA: מדגם) לריכוז סופי של 40 mM IAA ודגור בחושך בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
  5. הוסף 12% חומצה זרחתית מימית ביחס של 1:10 (v/v, חומצה: דגימה) לריכוז סופי של 1.2% חומצה זרחתית ומערבולת לזמן קצר.
  6. הוסף חיץ קשירת חלבון ביחס של 1:6 (v/v, מדגם: חוצץ) ומערבולות לזמן קצר.
    הערה: בשלב זה יש ליצור חלקיקי חלבון קולואידיים, והתמיסה תיראה שקופה אם כמות החלבון מספקת.
  7. פתח את מכסה עמוד המיקרו ספין של לכידת המתלים והרכיב את עמוד הספין על צינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 2 מ"ל כדי לאסוף זרימה.
  8. הוסף עד 200 μL של תערובת חלבון ליזט חומצי לתוך העמודה.
  9. צנטריפוגה את העמוד ב 4,000 × גרם במשך 20 שניות. חלקיקי חלבון נלכדו; חזור על הפעולה עד לטעינת הדגימות לעמודה.
  10. הוסף 150 μL של חיץ קשירת חלבון וצנטריפוגה ב 4,000 × גרם במשך 20 שניות כדי לשטוף את החלבון מרחף. חזור על הפעולה 3x.
  11. הרכיבו את עמוד המיקרו לכידת המתלים על צינור מיקרוצנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מ"ל.
  12. הוסף 20 μL של 50mM מאגר עיכול TEAB המכיל פרוטאז ביחס של 1:25 (w/w, טריפסין: חלבון) למסנן בתוך עמוד הסחרור, ובכך הימנע מבועות ומרווח אוויר בין המסנן לתמיסת העיכול.
  13. כבשו את עמוד המיקרו-ספין של לכידת המתלים כדי למנוע אידוי. לדגור ב 47 ° C במשך 1 שעה ב thermomixer; אין לרעוד או לערבל במהלך העיכול.
  14. פפטידים Elute עם 40 μL של 50 mM TEAB על ידי כוח צנטריפוגלי ב 4,000 × גרם במשך 20 שניות.
  15. הוסף 40 μL של 0.2% FA וצנטריפוגה ב 4,000 × גרם במשך 20 שניות.
  16. הוסף 35 μL של 0.2% FA, 50% acetonitrile, וצנטריפוגה ב 4,000 × גרם במשך 20 שניות.
  17. בריכה שלוש פולטת ומיובשת עם צנטריפוגת ואקום.
  18. יש לאחסן במקפיא בטמפרטורה אולטרה-נמוכה של -80°C עד לניתוח נוסף. הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.

5. שחזור פפטידים לניתוח ספקטרומטריית מסות

  1. הרכיבו מחדש את הדגימה עם 12 μL של 0.1% FA, מערבולת וצנטריפוגה לזמן קצר.
  2. מדוד ריכוז פפטיד באמצעות ערכת בדיקת פפטידים.
  3. נרמל את ריכוז הפפטיד ל-0.5 מיקרוגרם/מיקרוליטר ב-0.1% FA.
  4. מעבירים את תערובת הפפטיד לבקבוקון אוטודוגר ומוכנים לניתוח ספקטרומטריית מסות.

6. רכישת דגימה על ידי כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה טנדם

  1. טען 3 מיקרוגרם של הפפטיד עם מאגר העמסה איזוקרטית (0.1% FA, 5% ACN) לעמוד מלכודת (C18, 5 מיקרומטר, 100 מיקרומטר, 20 מ"מ) בקצב זרימה של 2 מיקרוליטר/דקה למשך 15 דקות.
  2. שבר את הפפטידים באמצעות טור ננו-אנליטי הפוך (C18, 5 מיקרומטר, 100 מיקרומטר, 300 מ"מ) בקצב זרימה של 350 nL/min בשיפוע הפרדה של 155 דקות. השתמש בפאזה A ניידת הכוללת תערובת של 0.1% חומצה פורמית (v/v), 5% ACN (v/v) במים ושלב B נייד המכיל 0.1% FA (v/v), 98% ACN (v/v) במים. השתמש במעבר הצבע הבא: 0-0.5 דקות: 5% B, 0.5-90 דקות: 10% B, 90-120 דקות: 20% B, 120-130 דקות: 28% B, 130-135 דקות: 45% B, 135-141 דקות: 80% B, 141-155 דקות: 5% B.
  3. בצע רכישה תלוית נתונים (DDA) עם טווח סריקת TOF-MS בין 350 ל- 1800 m/z עם זמן הצטברות של 250 ms וזמן אי-הכללת יעד דינמי של 18 שניות. לאחר מכן, בצע סריקת MS/MS במהירות של 100 עד 1,800 m/z במצב רגישות גבוהה עם זמן הצטברות של 50 ms עבור 50 המבשרים המובילים בכל מחזור עם סף של 125 cps עבור אות MS/MS עם מצב טעינה מ- +2 עד +4.
  4. נתח נתונים גולמיים באמצעות התוכנה שבוצעה אליה הפניה או מנועים תואמים אחרים עם מסד נתונים סימוכין ב- FASTA ממסד הנתונים UniProt הנגיש לציבור.

Representative Results

פרוטוקול זה מאפשר איסוף דגימות דמעות עם רצועות Schirmer המאוחסנות יבשות בטמפרטורת החדר לפני הכנת הדגימה הבאה לניתוח ספקטרומטריית מסות. זרימת עבודה של הכנת דגימות בעזרת מסנן (FASP) עם מיקרו-עמודה עם לכידת מתלים אפשרה הכנת דגימה מהירה תוך שעות, בהשוואה לנוהלי עיכול נפוצים המקובלים בתמיסה בימים הדורשים דגירה בלילה. תפוקת ההתאוששות של הפפטיד הייתה גבוהה משמעותית (p < 0.001) מאשר פרוטוקול העיכול הסטנדרטי בתמיסה ועם יכולת שחזור טובה במקדם שונות (%CV) < 7%. שלולית של דגימות דמעות חזרה על עצמה בשישה עותקים טכניים עם 74.2 ± 5.0% התאוששות פפטיד ו-52.8 ± שחזור פפטיד של 1.6% בדגימות שהוכנו עם הליכים בתמיסה. דגימת דמעות מאוגמת עם כמות חלבון של 36.3 מיקרוגרם הוקפצה לרצועת שירמר וחולצה כפי שתואר קודם לכן, יעילות המיצוי של חלבון הייתה 81% (29.5 ± 6.8 מיקרוגרם, ממוצע ± SD).

שני תהליכי העבודה העמיסו 3 מיקרוגרם של פפטידים על הטרשת הנפוצה, וחיפוש ה-DDA הניב סך של 1,183 ±-118 חלבונים (5,757 ±-537 פפטידים שונים) ו-874 ±-70 חלבונים (4,400 ±-328 פפטידים) ב-1% FDR בקבוצת לכידת התרחיף ובקבוצת התמיסה, בהתאמה. ניתוח של אונטולוגיה גנטית (GO) באמצעות מערכת סיווג PANTHER גילה פרוטאומים דומים מאוד עבור שתי הגישות, כאשר קשירה, פעילות קטליטית וויסות תפקוד מולקולרי הם הפונקציות המולקולריות העיקריות שלהם (איור 4).

Figure 1
איור 1: כופפו את החלק העליון של רצועת Schirmer בסימן 0 מ"מ לפני היישום. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: מיקום רצועת שירמר במהלך איסוף הדמעות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: איור של טיפול ברצועת Schirmer לפני מיצוי חלבונים. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: תרשים עוגה שמדגים את ניתוח האונטולוגיה הגנטית עבור הפרוטאומים שזוהו באמצעות זרימת העבודה בתוך הפתרון וזרימת העבודה של לכידת מתלים, באמצעות מערכת הסיווג PANTHER. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

כדי להשיג תוצאות מדויקות בשיטה זו, יש ללבוש כפפות חד פעמיות ללא חשמל בכל ההליכים מאיסוף דגימת הדמעות כדי למנוע זיהום דגימה. חשוב להימנע מבועות ומרווחי אוויר בין המסנן לתמיסת הדגימה בכל שלב על ידי שימוש בעמודים מסתובבים זעירים. אם נפח הדגימה גדול מקיבולת העמודות, מומלץ לחזור על התהליך. פרוטוקול זה הוכח כיעיל יותר מהפרוטוקול המסורתי בתמיסה במונחים של זמן הכנה, התאוששות חלבון וזיהוי חלבון כולל. הסיבה העיקרית לכך היא שהדגימות עוברות את רוב הפרוצדורות הנדרשות על אותה עמודה, בניגוד לשיטת התמיסה הכוללת שלבי העברה מרובים כגון משקעים אצטון, עיכול וניקוי (התפלה), מה שמגדיל את הסבירות לשינויים בנתונים המתקבלים.

בנוסף לדגימות הדמעות שנאספו בשיטת מיקרו-נימים16,17, תהליך עבודה זה של FASP עם מיקרו-עמוד לכידת מתלים מספק שיטת הכנת דגימות חלופית המאפשרת הכנת דגימת דמעות מהירה וחזקה שנאספה באמצעות רצועות Schirmer, עם הכנת חומר מינימלית וצעדים ידידותיים למשתמש לביצוע. זה מאפשר הכנת דגימת דמעות הניתנת לשחזור עבור מחקרי עוקבה גדולים על פני מחלות עיניים מרובות או מצבים עם התאוששות פפטיד משופרת וזיהוי חלבון על ידי טרשת נפוצה על פני הליכים בתמיסה. תהליך אמין זה יכול לשמש באופן קבוע להכנת דגימות סמנים ביולוגיים של דמעות למחקר ולמטרות קליניות אחרות. והכי חשוב, זה דורש הכשרה מינימלית של הצוות לאיסוף באתר ושולל את הצורך באחסון דגימות במקפיא. הדגימות מיובשות במקום כדי למזער אוטוליזה של חלבון והתפרקותו. לפיכך, זה מאפשר משלוח נוח בדואר כדי להקל על ניתוח במורד הזרם, בניגוד לשימוש בצינורות מיקרו-נימיים.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי יוזמת InnoHK וממשלת האזור המנהלי המיוחד של הונג קונג; מרכז המחקר לראייה חדה; ומרכז המחקר לחדשנות ברפואה סינית (RCMI) באוניברסיטה הפוליטכנית של הונג קונג.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
9 mm Plastic Screw Thread Vials Thermo Scientific C4000-11
Acetonitrile, LCMS Grade Anaqua AC-1026
Centrifuge MiniSpin plus Eppendorf 5453000097
DL-dithiothreitol (DTT), BioUltra Sigma-Aldrich 43815
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL Eppendorf 30120086
Formic acid, ACS reagent, ≥96% Sigma-Aldrich 695076
Frame Heater OPTIMONSUN Electronic Breitfeld & Schliekert GmbH 1203166
Iodoacetamide (IAA), BioUltra Sigma-Aldrich I1149
Methanol, HPLC Grade Anaqua MA-1292
Nunc Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes, 2 mL Thermo Fisher Scientific 368632
Phosphoric acid, 85 wt.% in H2O Sigma-Aldrich 345245
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay Thermo Fisher Scientific 23275
Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific A53225
Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry Sciex TripleTOF 6600
Schirmer Ophthalmic Strips Entod Research Cell UK Ltd I-DEW Tearstrips
S-Trap Micro Column Protifi C02-micro-80
SureSTART 9 mm Screw Caps Thermo Scientific CHSC9-40
Triethylammonium bicarbonate (TEAB), 1 M Sigma-Aldrich 18597
Ultra-performance Liquid Chromatography Eksigent NanoLC 400 
UltraPure Sodium dodecyl sulfate (SDS) Thermo Fisher Scientific 15525017

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ma, J. Y. W., Sze, Y. H., Bian, J. F., Lam, T. C. Critical role of mass spectrometry proteomics in tear biomarker discovery for multifactorial ocular diseases (Review). International Journal of Molecular Medicine. 47 (5), 83 (2021).
  2. Tse, J. S. H., et al. Integrating clinical data and tear proteomics to assess efficacy, ocular surface status, and biomarker response after orthokeratology lens wear. Translational Vision Science & Technology. 10 (11), 18 (2021).
  3. Cheung, J. K., et al. Human tear proteome dataset in response to daily wear of water gradient contact lens using SWATH-MS approach. Data in Brief. 36, 107120 (2021).
  4. Tse, J. S., et al. Data on assessment of safety and tear proteome change in response to orthokeratology lens - Insight from integrating clinical data and next generation proteomics. Data in Brief. 29, 105186 (2020).
  5. Zhan, X., Li, J., Guo, Y., Golubnitschaja, O. Mass spectrometry analysis of human tear fluid biomarkers specific for ocular and systemic diseases in the context of 3P medicine. The EPMA Journal. 12 (4), 449-475 (2021).
  6. Ponzini, E., et al. Mass spectrometry-based tear proteomics for noninvasive biomarker discovery. Mass Spectrometry Reviews. 41 (5), 842-860 (2022).
  7. HaileMariam, M., et al. S-Trap, an ultrafast sample-preparation approach for shotgun proteomics. Journal of Proteome Research. 17 (9), 2917-2924 (2018).
  8. Ding, H., et al. Urine proteomics: evaluation of different sample preparation workflows for quantitative, reproducible, and improved depth of analysis. Journal of Proteome Research. 19 (4), 1857-1862 (2020).
  9. Ludwig, K. R., Schroll, M. M., Hummon, A. B. Comparison of in-solution, FASP, and S-Trap based digestion methods for bottom-up proteomic studies. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2480-2490 (2018).
  10. Sze, Y. H., et al. High-pH reversed-phase fractionated neural retina proteome of normal growing C57BL/6 mouse. Scientific Data. 8 (1), 27 (2021).
  11. Marchione, D. M., et al. HYPERsol: High-quality data from archival FFPE tissue for clinical proteomics. Journal of Proteome Research. 19 (2), 973-983 (2020).
  12. Chhuon, C., et al. A sensitive S-Trap-based approach to the analysis of T cell lipid raft proteome. Journal of Lipid Research. 61 (11), 1512-1523 (2020).
  13. Hayoun, K., et al. Evaluation of sample preparation methods for fast proteotyping of microorganisms by tandem mass spectrometry. Frontiers in Microbiology. 10, 1985 (2019).
  14. Templeton, E. M., et al. Comparison of SPEED, S-Trap, and in-solution-based sample preparation methods for mass spectrometry in kidney tissue and plasma. International Journal of Molecular Sciences. 24 (7), 6290 (2023).
  15. Ding, Z., Wang, N., Ji, N., Chen, Z. S. Proteomics technologies for cancer liquid biopsies. Molecular Cancer. 21 (1), 53 (2022).
  16. Nättinen, J., Aapola, U., Jylhä, A., Vaajanen, A., Uusitalo, H. Comparison of capillary and Schirmer strip tear fluid sampling methods using SWATH-MS proteomics approach. Translational Vision Science & Technology. 9 (3), 16 (2020).
  17. Bachhuber, F., Huss, A., Senel, M., Tumani, H. Diagnostic biomarkers in tear fluid: from sampling to preanalytical processing. Scientific Reports. 11 (1), 10064 (2021).

Tags

רפואה גיליון 202 נוזל דמעות רצועת שירמר פרוטאומיקה ספקטרומטריית מסות
הכנת דגימה ללכידת תרחיף חלבונים עבור פרוטאומיקה של דמעות על ידי כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה טנדם
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tse, J. S. H., Sze, Y. H., Ka-Wai… More

Tse, J. S. H., Sze, Y. H., Ka-Wai Cheung, J., Li, K. K., Lam, T. C. A Protein Suspension-Trapping Sample Preparation for Tear Proteomics by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (202), e64617, doi:10.3791/64617 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter