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तरल क्रोमैटोग्राफी-टेंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा आंसू प्रोटिओमिक्स के लिए एक प्रोटीन सस्पेंशन-ट्रैपिंग नमूना तैयारी

Published: December 1, 2023 doi: 10.3791/64617
Automatic Translation
*1, *1,2, 1,2, 1, 1,2,3,4
1Centre for Myopia Research, School of Optometry, The Hong Kong Polytechnic University, 2Centre for Eye and Vision Research (CEVR), 3Research Centre for SHARP Vision (RCSV), The Hong Kong Polytechnic University, 4Research Centre for Chinese Medicine Innovation (RCMI), The Hong Kong Polytechnic University
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल शिमर स्ट्रिप्स का उपयोग करके आंसू के नमूने एकत्र करने की एक विधि और गैर-इनवेसिव टियर प्रोटीन बायोमार्कर की खोज के लिए एक एकीकृत मात्रात्मक वर्कफ़्लो का वर्णन करता है। सस्पेंशन ट्रैपिंग नमूना तैयारी वर्कफ़्लो तेज और मजबूत आंसू नमूना तैयारी और मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक विश्लेषण को सक्षम बनाता है, जिसके परिणामस्वरूप मानक इन-सॉल्यूशन प्रक्रियाओं की तुलना में उच्च पेप्टाइड रिकवरी पैदावार और प्रोटीन की पहचान होती है।

Abstract

आंसू द्रव आसानी से सुलभ बायोफ्लुइड्स में से एक है जिसे गैर-आक्रामक रूप से एकत्र किया जा सकता है। आंसू प्रोटिओमिक्स में कई ओकुलर रोगों और स्थितियों के लिए बायोमार्कर की खोज करने की क्षमता है। सस्पेंशन ट्रैपिंग कॉलम को डाउनस्ट्रीम प्रोटिओमिक विश्लेषण के व्यापक अनुप्रयोग के लिए एक कुशल और उपयोगकर्ता के अनुकूल नमूना तैयारी वर्कफ़्लो बताया गया है। फिर भी, मानव आंसू प्रोटिओम के विश्लेषण में इस रणनीति का अच्छी तरह से अध्ययन नहीं किया गया है। वर्तमान प्रोटोकॉल मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करके गैर-इनवेसिव टियर प्रोटीन बायोमार्कर अनुसंधान के लिए नैदानिक मानव आंसू नमूनों से शुद्ध पेप्टाइड्स तक एक एकीकृत वर्कफ़्लो का वर्णन करता है, जो जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण के साथ संयुक्त होने पर रोग बायोमार्कर और निगरानी में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। एक प्रोटीन सस्पेंशन ट्रैपिंग नमूना तैयारी लागू की गई थी और मानव आंसू द्रव विश्लेषण के लिए एक सार्वभौमिक, अनुकूलित नमूना तैयारी के रूप में तेज, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और उपयोगकर्ता के अनुकूल प्रक्रियाओं के साथ आंसू प्रोटिओम की खोज का प्रदर्शन किया गया था। विशेष रूप से, सस्पेंशन ट्रैपिंग प्रक्रिया ने पेप्टाइड रिकवरी, प्रोटीन पहचान और कम नमूना तैयारी समय के मामले में समाधान नमूना तैयारी से बेहतर प्रदर्शन किया।

Introduction

आंसू प्रोटिओमिक्स ने ओकुलर रोगों और स्थितियों 1,2,3,4,5,6 के लिए संभावित बायोमाकर्स का पता लगाने के लिए ध्यान आकर्षित किया है, ओकुलर और प्रणालीगत स्थिति के रोगजनन तक पहुंचने के लिए, साथ ही शिमर स्ट्रिप्स का उपयोग करके गैर-इनवेसिव आंसू नमूना संग्रह के लाभ का फायदा उठाने के लिए। अगली पीढ़ी के मास स्पेक्ट्रोमेट्री की तकनीकी प्रगति ने सटीकता और परिशुद्धता के साथ माइक्रोलिटर-स्केल आंसुओं में प्रोटीन परिमाणीकरण को सक्षम किया है जो अतीत में संभव नहीं था। नमूना तैयार करने के तरीके अभी तक मानकीकृत नहीं हैं। आंसू प्रोटीन बायोमार्कर अनुसंधान में नैदानिक अनुप्रयोग की सफलता के लिए एक मजबूत और मानकीकृत नमूना तैयारी वर्कफ़्लो आवश्यक है। सस्पेंशन ट्रैपिंग (एस-ट्रैप) नमूना तैयारी वर्कफ़्लो को हाल ही में व्यापक डाउनस्ट्रीम प्रोटिओमिक विश्लेषण 7,8 के लिए एक प्रभावी और संवेदनशील नमूना तैयारी विधि के रूप में रिपोर्ट किया गया था। फिर भी, इस रणनीति को मानव आंसू प्रोटिओम के विश्लेषण में अच्छी तरह से रिपोर्ट नहीं किया गया है, एंजाइमेटिक पाचन दक्षता और मास स्पेक्ट्रोमेट्रिकविश्लेषण द्वारा प्रोटीन की पहचान की अधिक संख्या के संदर्भ में फिल्टर-एडेड नमूना तैयारी (एफएएसपी) और इन-सॉल्यूशन पाचन से बेहतर प्रदर्शन किया है। एस-ट्रैप-आधारित दृष्टिकोण रेटिना ऊतक 10, फॉर्मेलिन-फिक्स्ड, पैराफिन-एम्बेडेड (एफएफपीई) ऊतक 11, कोशिका 12, सूक्ष्मजीव 13, और तरल बायोप्सी 14,15 की तैयारी में प्रदर्शित किया गया था।

यह प्रोटोकॉल एक तीव्र, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और मजबूत तकनीकी रणनीति के साथ एक गैर-इनवेसिव आंसू प्रोटीन बायोमार्कर पैनल की खोज के लिए नैदानिक नमूनों से एंजाइमेटिक रूप से पचने वाले प्रोटीन तक एक एकीकृत मात्रात्मक वर्कफ़्लो का वर्णन करता है। संक्षेप में, आंसू द्रव को एक मानक शिमर पट्टी का उपयोग करके एकत्र किया गया था और कमरे के तापमान पर प्रोटीन ऑटोलिसिस को रोकने के लिए तुरंत एक नेत्र फ्रेम हीटर के साथ सुखाया गया था। निर्माता के सुझाव के अनुसार 5% सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) लाइसिस बफर का उपयोग करके एम्बेडेड कुल प्रोटीन निकाले गए थे, इसके बाद प्रोटीन परख माप था। निकाले गए लाइसेट को तब डिथियोथ्रेइटोल (डीटीटी) के साथ मानक कमी और आयोडोसिटामाइड (आईएए) के साथ अल्काइलेशन से गुजरना पड़ा।

फॉस्फोरिक एसिड के साथ अम्लीकरण के बाद, सस्पेंशन ट्रैपिंग कॉलम प्रोटीन वर्षा बफर जिसमें 90% मेथनॉल और 100 एमएम ट्राइथाइलअमोनियम बाइकार्बोनेट (टीईएबी) शामिल थे, को कुल प्रोटीन में जोड़ा गया था। नमूना तब एक नए निलंबन ट्रैपिंग माइक्रो कॉलम में स्थानांतरित किया गया था। एंजाइमेटिक पाचन 1 घंटे के लिए 47 डिग्री सेल्सियस पर 1: 25 अनुपात (डब्ल्यू / डब्ल्यू, ट्रिप्सिन: प्रोटीन) पर अनुक्रमण ग्रेड ट्रिप्सिन के साथ किया जाता है। परिणामी पेप्टाइड्स को तब सेंट्रीफ्यूजेशन के माध्यम से संश्लेषित किया गया था, क्रमिक रूप से 50 एमएम टीईएबी, 0.2% जलीय फॉर्मिक एसिड (एफए), और 50% एसिटोनिट्राइल (एसीएन) जिसमें 0.2% एफए था। इल्यूटेड पेप्टाइड्स को वैक्यूम-सुखाया गया और 0.1% एफए में पुनर्गठित किया गया। मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक विश्लेषण के लिए पेप्टाइड एकाग्रता को मापा गया और 0.5 μg / μL में समायोजित किया गया।

Protocol

अध्ययन में भाग लेने से पहले विषयों ने लिखित सूचित सहमति प्रदान की। अध्ययन को हांगकांग पॉलिटेक्निक विश्वविद्यालय की मानव नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था और हेलसिंकी की घोषणा के सिद्धांतों का पालन किया गया था।

1. शिमर पट्टी के साथ मानव आंसू द्रव का संग्रह

  1. नमूना संदूषण से बचने के लिए दस्ताने पहनें और सैनिटाइज करें।
  2. जांचें कि आंतरिक पैकेजिंग बरकरार, बाँझ है, और समाप्त नहीं हुई है।
  3. शिमर पट्टी के शीर्ष को 0 मिमी के निशान पर थोड़ा अंदर की ओर झुकाएं, जैसा कि पट्टी के अर्धवृत्त सिरे के पास इंगित किया गया है (चित्र 1)।
  4. पट्टी के अंत को पकड़कर आंतरिक पैकेज से पट्टी को हटा दें, और 0 से 25 मिमी तक नमूना संग्रह क्षेत्र के साथ सीधे संपर्क से बचें।
  5. विषय को रखी जाने वाली पट्टी की स्थिति से दूर देखने के लिए कहें।
  6. निचली पलक को धीरे से नीचे खींचें और पार्श्व कैंथस क्षेत्र (चित्रा 2) के पास निचले फोर्निक्स में पट्टी के अंत को हुक करें। दूसरी आंख पर एक ही प्रक्रिया दोहराएं।
  7. जलन को कम करने के लिए विषय को धीरे से पलकें बंद करने के लिए कहें।
  8. लगभग 5 मिनट के लिए आंसू तरल पदार्थ एकत्र करें या अधिमानतः 15-20 मिमी आंसू नमूना एकत्र किया गया था।
  9. विषय को दोनों आंखें खोलने के लिए कहें, निचली पलक को धीरे से नीचे खींचें और विषय से स्ट्रिप्स हटा दें।
  10. शिमर पट्टी पर हाइड्रेटेड लंबाई का निरीक्षण करें और एकत्र की गई मात्रा को मिमी में रिकॉर्ड करें।
  11. पट्टी को एक मानक, साफ फ्रेम हीटर के साथ सुखाएं जब तक कि तरल पदार्थ पूरी तरह से सूख न जाए।
    नोट: अतिरिक्त हीटिंग जो संभावित रूप से फिल्टर पेपर को खराब कर सकती है, से बचा जाना चाहिए।
  12. प्रत्येक सूखे शिमर पट्टी को एक लेबल क्रायोट्यूब में डालें और इसे आगे की प्रक्रिया तक अंधेरे में एक ठंडी, सूखी जगह में अधिमानतः स्टोर करें।

2. रसायनों और अभिकर्मकों की तैयारी

  1. लाइसिस बफर (5% एसडीएस, 50 एमएम टीईएबी, पीएच 7.5), 20 एमएल
    1. 1 एम टीईएबी का 1 एमएल और 12% फॉस्फोरिक एसिड का 80 μL। बुलबुले को हटाने के लिए भंवर और सोनिक संक्षेप में। विआयनीकृत पानी के साथ 20 एमएल तक टॉप।
    2. एसडीएस के 1 ग्राम वजन करें और घुलने तक दोलन के साथ घोल में जोड़ें।
  2. प्रोटीन वर्षा बफर (90% मेथनॉल, 100 एमएम टीईएबी, पीएच 7.1), 10 एमएल
    1. 1 M TEAB के 893 μL और विआयनीकृत पानी के 92 μL जोड़ें।
    2. घोल और भंवर में 15 μL 85 wt. % फॉस्फोरिक एसिड और 9 मिलीलीटर मेथनॉल जोड़ें।
  3. पाचन बफर (50 एमएम टीईएबी), 1 एमएल
    1. 1 एम टीईएबी के 50 μL जोड़ें और विआयनीकृत पानी के साथ 1 एमएल तक शीर्ष करें।
  4. 200 mM dithiothreitol (DTT) समाधान, 500 μL
    1. डीटीटी के 15 मिलीग्राम वजन करें और विआयनीकृत पानी के 500 μL में घुल जाएं; भंवर संक्षेप में।
      नोट: उपयोग करने से पहले तैयार करें।
  5. 400 mM iodoacetamide (IAA) समाधान, 200 μL
    1. 15 मिलीग्राम आईएए वजन करें और विआयनीकृत पानी के 200 μL में घुल जाएं; भंवर संक्षेप में। नोट: उपयोग से पहले तैयारी करें और प्रकाश से बचें।
  6. 0.2% फॉर्मिक एसिड, 50% एसिटोनिट्राइल, 10 एमएल
    1. विआयनीकृत पानी में 50% एसिटोनिट्राइल का 10 एमएल तैयार करें।
    2. फॉर्मिक एसिड और भंवर के 20 μL संक्षेप में जोड़ें।
  7. 0.2% फॉर्मिक एसिड समाधान, 10 एमएल
    1. 10 मिलीलीटर विआयनीकृत पानी और भंवर में 20 μL फॉर्मिक एसिड जोड़ें।
  8. 0.1% फॉर्मिक एसिड समाधान, 10 एमएल
    1. विआयनीकृत पानी के 10 एमएल में 10 μL फॉर्मिक एसिड जोड़ें; भंवर संक्षेप में।

3. शिमर पट्टी में प्रोटीन निष्कर्षण

  1. साफ स्टेनलेस-स्टील कैंची के साथ नेत्रश्लेष्मला ऊतकों के संपर्क के कारण संभावित संदूषण को दूर करने के लिए पट्टी के 0 मिमी निशान से परे सामने के छोर को काटें और फेंक दें।
  2. पट्टी को 1 मिमी अंतराल में 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में काटें (चित्रा 3)।
  3. माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 100 μL लाइसिस बफर जोड़ें, और 1,000 आरपीएम पर भंवर, थर्मोमिक्सर में 1 घंटे के लिए कमरे का तापमान।
  4. सेंट्रीफ्यूज संक्षेप में और सतह पर तैरनेवाला को एक नए 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  5. स्ट्रिप्स को क्लीन फोर्सप्स का उपयोग करके 200 μL पिपेट युक्तियों में ले जाएं। स्ट्रिप पर शेष नमूने की अधिकतम वसूली के लिए 1 मिनट के लिए 4,000 × ग्राम पर कमरे के तापमान पर होल्डर और सेंट्रीफ्यूज के साथ चरण 3.4 से एक ही ट्यूब में टिप्स रखें।
  6. बिसिनकोनिक एसिड (बीसीए) या संगत प्रोटीन परख का उपयोग करके प्रोटीन एकाग्रता को मापें।

4. सस्पेंशन-ट्रैपिंग नमूना तैयारी

  1. प्रोटीन परख परिणाम के आधार पर प्रोटीन के 50 μg प्रोटीन के लिए नमूने सामान्य करें।
  2. 20 mM DTT की अंतिम सांद्रता में 1: 10 (v / v, DTT: नमूना) के अनुपात में 200 mM DTT जोड़ें और 10 मिनट के लिए 95 °C पर इनक्यूबेट करें।
  3. प्रोटीन के घोल को कमरे के तापमान पर ठंडा करें।
  4. 40 mM IAA की अंतिम सांद्रता में 1: 10 (v / v, IAA: नमूना) के अनुपात में 400 mM IAA जोड़ें और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में इनक्यूबेट करें।
  5. 12% जलीय फॉस्फोरिक एसिड को 1: 10 (वी / वी, एसिड: नमूना) के अनुपात में 1.2% फॉस्फोरिक एसिड और भंवर की अंतिम एकाग्रता में संक्षेप में जोड़ें।
  6. प्रोटीन बाइंडिंग बफर को 1: 6 (वी / वी, नमूना: बफर) और भंवर के अनुपात में संक्षेप में जोड़ें।
    नोट: इस चरण में, कोलाइडल प्रोटीन कण का गठन किया जाना चाहिए, और यदि प्रोटीन की मात्रा पर्याप्त है तो समाधान पारभासी दिखाई देगा।
  7. सस्पेंशन ट्रैपिंग माइक्रो स्पिन कॉलम को अनकैप करें और प्रवाह एकत्र करने के लिए स्पिन कॉलम को 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब पर इकट्ठा करें।
  8. कॉलम में अम्लीय प्रोटीन लाइसेट मिश्रण के 200 μL तक जोड़ें।
  9. स्तंभ को 20 सेकंड के लिए 4,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें। प्रोटीन कण फंस गए थे; नमूने कॉलम में लोड होने तक दोहराएं।
  10. निलंबित प्रोटीन को धोने के लिए 20 सेकंड के लिए 4,000 × ग्राम पर 150 μL प्रोटीन बाइंडिंग बफर और सेंट्रीफ्यूज जोड़ें। 3x दोहराएँ।
  11. सस्पेंशन ट्रैपिंग माइक्रो कॉलम को एक नए 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब पर इकट्ठा करें।
  12. स्पिन कॉलम के अंदर फिल्टर पर 1: 25 (डब्ल्यू / डब्ल्यू, ट्रिप्सिन: प्रोटीन) के अनुपात में प्रोटीज युक्त 50 एमएम टीईएबी पाचन बफर के 20 μL जोड़ें, फिल्टर और पाचन समाधान के बीच बुलबुले और हवा के अंतर से बचें।
  13. वाष्पीकरण को रोकने के लिए सस्पेंशन ट्रैपिंग माइक्रो स्पिन कॉलम को कैप करें। थर्मोमिक्सर में 1 घंटे के लिए 47 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें; पाचन के दौरान हिलाएं या भंवर न करें।
  14. 20 सेकंड के लिए 4,000 × ग्राम पर केन्द्रापसारक बल द्वारा 50 एमएम टीईएबी के 40 μL के साथ इल्यूट पेप्टाइड्स।
  15. 0.2% एफए के 40 μL जोड़ें और 20 s के लिए 4,000 × g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  16. 0.2% एफए, 50% एसिटोनिट्राइल के 35 μL जोड़ें, और 20 s के लिए 4,000 × g पर सेंट्रीफ्यूज जोड़ें।
  17. पूल तीन को एक वैक्यूम सेंट्रीफ्यूज के साथ सूखते हैं।
  18. आगे के विश्लेषण तक -80 डिग्री सेल्सियस अल्ट्रा-कम तापमान फ्रीजर पर स्टोर करें। नोट: प्रोटोकॉल यहाँ रोका जा सकता है।

5. मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए पेप्टाइड्स का पुनर्गठन

  1. नमूने को 0.1% एफए, भंवर और सेंट्रीफ्यूज के 12 μL के साथ संक्षेप में पुनर्गठित करें।
  2. पेप्टाइड परख किट के साथ पेप्टाइड एकाग्रता को मापें।
  3. 0.1% एफए में 0.5 μg / μL तक पेप्टाइड एकाग्रता को सामान्य करें।
  4. पेप्टाइड मिश्रण को एक ऑटोसैंपलर शीशी में स्थानांतरित करें और मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए तैयार हों।

6. तरल क्रोमैटोग्राफी-टेंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा नमूना अधिग्रहण

  1. 15 मिनट के लिए 2 μL/min की प्रवाह दर पर एक ट्रैप-कॉलम (C18, 5 μm, 100 μm, 20 mm) में आइसोक्रेटिक लोडिंग बफर (0.1% FA, 5% ACN) के साथ पेप्टाइड के 3 μg लोड करें।
  2. 155 मिनट पृथक्करण ढाल में 350 nL / min की प्रवाह दर पर एक रिवर्स-फेज नैनो विश्लेषणात्मक कॉलम (C18, 5 μm, 100 μm, 300 मिमी) का उपयोग करके पेप्टाइड्स को अलग करें। मोबाइल चरण A का उपयोग करें जिसमें पानी में 0.1% फॉर्मिक एसिड (v/v), 5% ACN (v/v) और मोबाइल चरण B का मिश्रण हो जिसमें पानी में 0.1% FA (v/v), 98% ACN (v/v) हो। निम्नलिखित ढाल का उपयोग करें: 0-0.5 मिनट: 5% बी, 0.5-90 मिनट: 10% बी, 90-120 मिनट: 20% बी, 120-130 मिनट: 28% बी, 130-135 मिनट: 45% बी, 135-141 मिनट: 80% बी, 141-155 मिनट: 5% बी।
  3. 250 एमएस के संचय समय और 18 सेकंड के गतिशील लक्ष्य बहिष्करण समय के साथ 350 से 1800 मीटर / जेड के बीच टीओएफ-एमएस स्कैन रेंज के साथ डेटा-निर्भर अधिग्रहण (डीडीए) करें। फिर, उच्च संवेदनशीलता मोड में 100 से 1,800 मीटर / जेड पर एमएस / एमएस स्कैन करें, जिसमें प्रति चक्र शीर्ष 50 अग्रदूतों के लिए 50 एमएस के संचय समय के साथ एमएस / एमएस सिग्नल के लिए +2 से +4 तक चार्ज स्थिति के साथ 125 सीपीएस की सीमा है।
  4. सार्वजनिक रूप से सुलभ यूनिप्रोट डेटाबेस से FASTA में एक संदर्भ डेटाबेस के साथ संदर्भित सॉफ़्टवेयर या अन्य संगत इंजनों के साथ कच्चे डेटा का विश्लेषण करें।

Representative Results

यह प्रोटोकॉल शिमर स्ट्रिप्स के साथ आंसू नमूना संग्रह की अनुमति देता है जो मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए बाद में नमूना तैयार करने से पहले कमरे के तापमान पर सूखे संग्रहीत होते हैं। निलंबन-ट्रैपिंग माइक्रो कॉलम के साथ फिल्टर-एडेड नमूना तैयारी (एफएएसपी) वर्कफ़्लो ने रात भर इनक्यूबेशन की आवश्यकता वाले दिनों में आमतौर पर अपनाई जाने वाली इन-सॉल्यूशन पाचन प्रक्रियाओं की तुलना में घंटों में तेजी से नमूना तैयार करने में सक्षम बनाया। पेप्टाइड रिकवरी उपज मानक इन-सॉल्यूशन पाचन प्रोटोकॉल की तुलना में काफी अधिक (पी < 0.001) थी और 7% < भिन्नता के गुणांक (% सीवी) पर अच्छी प्रजनन क्षमता के साथ थी। इन-सॉल्यूशन प्रक्रियाओं के साथ तैयार किए गए नमूनों में 74.2 ± 5.0% पेप्टाइड रिकवरी और 52.8 ± 1.6% पेप्टाइड रिकवरी के साथ छह तकनीकी प्रतिकृतियों में आंसू के नमूनों का एक पूल दोहराया गया था। 36.3 μg की प्रोटीन मात्रा के साथ एक पूल आंसू नमूना शिमर पट्टी पर स्पाइक किया गया था और पहले वर्णित के रूप में निकाला गया था, प्रोटीन की निष्कर्षण दक्षता 81% थी (29.5 ± 6.8 μg, मतलब ± एसडी)।

दोनों वर्कफ़्लोज़ ने एमएस पर पेप्टाइड्स के 3 μg लोड किए, और डीडीए खोज ने क्रमशः सस्पेंशन ट्रैपिंग समूह और इन-सॉल्यूशन समूह में 1% एफडीआर पर कुल 1,183 ± 118 प्रोटीन (5,757 ± 537 विशिष्ट पेप्टाइड्स) और 874 ± 70 प्रोटीन (4,400 ± 328 पेप्टाइड्स) प्राप्त किए। पैंथर वर्गीकरण प्रणाली का उपयोग करके जीन ऑन्कोलॉजी (जीओ) के विश्लेषण से दोनों दृष्टिकोणों के लिए बहुत समान प्रोटिओम का पता चला, जिसमें बाध्यकारी, उत्प्रेरक गतिविधि और आणविक कार्य विनियमन उनके मुख्य आणविक कार्य हैं (चित्रा 4)।

Figure 1
चित्र 1: आवेदन से पहले 0 मिमी के निशान पर शिमर पट्टी के शीर्ष को मोड़ें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: आंसू संग्रह के दौरान शिमर पट्टी की स्थिति। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: प्रोटीन निष्कर्षण से पहले शिमर स्ट्रिप हैंडलिंग का चित्रण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: पैंथर वर्गीकरण प्रणाली का उपयोग करके इन-सॉल्यूशन वर्कफ़्लो और सस्पेंशन ट्रैपिंग वर्कफ़्लो का उपयोग करके पहचाने गए प्रोटिओम के लिए जीन ऑन्कोलॉजी विश्लेषण को दर्शाते हुए पाई चार्ट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

इस विधि का उपयोग करके सटीक परिणाम प्राप्त करने के लिए, नमूना संदूषण से बचने के लिए आंसू नमूना संग्रह से सभी प्रक्रियाओं में बिजली मुक्त डिस्पोजेबल दस्ताने पहने जाने चाहिए। माइक्रो-स्पिनिंग कॉलम का उपयोग करके प्रत्येक चरण में फिल्टर और नमूना समाधान के बीच बुलबुले और हवा के अंतराल से बचना महत्वपूर्ण है। यदि नमूना मात्रा स्तंभों की क्षमता से बड़ी है, तो प्रक्रिया को दोहराने की सिफारिश की जाती है। यह प्रोटोकॉल तैयारी के समय, प्रोटीन वसूली और कुल प्रोटीन पहचान के मामले में पारंपरिक इन-सॉल्यूशन प्रोटोकॉल की तुलना में अधिक कुशल साबित हुआ है। यह काफी हद तक है क्योंकि नमूने एक ही कॉलम पर अधिकांश आवश्यक प्रक्रियाओं से गुजरते हैं, इन-सॉल्यूशन विधि के विपरीत जिसमें एसीटोन वर्षा, पाचन और सफाई (डीसॉल्टिंग) जैसे कई स्थानांतरण चरण शामिल होते हैं, जिससे परिणामी डेटा में भिन्नता की संभावना बढ़ जाती है।

माइक्रोकेशिका विधि16,17 के साथ एकत्र किए गए आंसू नमूनों के अलावा, निलंबन-ट्रैपिंग माइक्रो कॉलम के साथ यह एफएएसपी वर्कफ़्लो एक वैकल्पिक नमूना तैयारी विधि प्रदान करता है जो न्यूनतम सामग्री तैयारी और उपयोगकर्ता के अनुकूल चरणों के साथ शिमर स्ट्रिप्स का उपयोग करके एकत्र किए गए तेज और मजबूत आंसू नमूना तैयारी की अनुमति देता है। यह इन-सॉल्यूशन प्रक्रियाओं पर एमएस द्वारा बेहतर पेप्टाइड रिकवरी और प्रोटीन पहचान के साथ कई ओकुलर रोगों या स्थितियों में बड़े कॉहोर्ट अध्ययनों के लिए प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य आंसू नमूना तैयार करने की अनुमति देता है। इस विश्वसनीय प्रक्रिया का उपयोग अनुसंधान और अन्य नैदानिक उद्देश्यों के लिए आंसू बायोमार्कर नमूने की तैयारी में नियमित रूप से किया जा सकता है। सबसे महत्वपूर्ण बात, इसे ऑन-साइट संग्रह के लिए न्यूनतम कर्मचारी प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है और फ्रीजर में नमूना भंडारण की आवश्यकता को नकारता है। प्रोटीन ऑटोलिसिस और गिरावट को कम करने के लिए नमूने को ऑनसाइट सुखाया जाता है। इसलिए, यह माइक्रो-केशिका ट्यूबों का उपयोग करने के विपरीत, डाउनस्ट्रीम विश्लेषण की सुविधा के लिए मेल द्वारा सुविधाजनक शिपमेंट की अनुमति देता है।

Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को इनोएचके पहल और हांगकांग विशेष प्रशासनिक क्षेत्र सरकार द्वारा समर्थित किया गया था; शार्प विजन के लिए अनुसंधान केंद्र; और हांगकांग पॉलिटेक्निक विश्वविद्यालय में चीनी चिकित्सा नवाचार (आरसीएमआई) के लिए अनुसंधान केंद्र।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
9 mm Plastic Screw Thread Vials Thermo Scientific C4000-11
Acetonitrile, LCMS Grade Anaqua AC-1026
Centrifuge MiniSpin plus Eppendorf 5453000097
DL-dithiothreitol (DTT), BioUltra Sigma-Aldrich 43815
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL Eppendorf 30120086
Formic acid, ACS reagent, ≥96% Sigma-Aldrich 695076
Frame Heater OPTIMONSUN Electronic Breitfeld & Schliekert GmbH 1203166
Iodoacetamide (IAA), BioUltra Sigma-Aldrich I1149
Methanol, HPLC Grade Anaqua MA-1292
Nunc Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes, 2 mL Thermo Fisher Scientific 368632
Phosphoric acid, 85 wt.% in H2O Sigma-Aldrich 345245
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay Thermo Fisher Scientific 23275
Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific A53225
Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry Sciex TripleTOF 6600
Schirmer Ophthalmic Strips Entod Research Cell UK Ltd I-DEW Tearstrips
S-Trap Micro Column Protifi C02-micro-80
SureSTART 9 mm Screw Caps Thermo Scientific CHSC9-40
Triethylammonium bicarbonate (TEAB), 1 M Sigma-Aldrich 18597
Ultra-performance Liquid Chromatography Eksigent NanoLC 400 
UltraPure Sodium dodecyl sulfate (SDS) Thermo Fisher Scientific 15525017

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References

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चिकित्सा अंक 202 आंसू द्रव शिमर पट्टी प्रोटिओमिक्स मास स्पेक्ट्रोमेट्री।
तरल क्रोमैटोग्राफी-टेंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा आंसू प्रोटिओमिक्स के लिए एक प्रोटीन सस्पेंशन-ट्रैपिंग नमूना तैयारी
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Tse, J. S. H., Sze, Y. H., Ka-Wai… More

Tse, J. S. H., Sze, Y. H., Ka-Wai Cheung, J., Li, K. K., Lam, T. C. A Protein Suspension-Trapping Sample Preparation for Tear Proteomics by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (202), e64617, doi:10.3791/64617 (2023).

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