Summary
Este protocolo descreve um método para coletar amostras lacrimais usando tiras de Schirmer e um fluxo de trabalho quantitativo integrado para a descoberta de biomarcadores não invasivos de proteína lacrimal. O fluxo de trabalho de preparação de amostras de aprisionamento de suspensão permite a preparação rápida e robusta de amostras lacrimais e análise por espectrometria de massa, resultando em rendimentos de recuperação de peptídeos e identificação de proteínas mais altos do que os procedimentos padrão em solução.
Abstract
O fluido lacrimal é um dos biofluidos de fácil acesso que pode ser coletado de forma não invasiva. A proteômica lacrimal tem o potencial de descobrir biomarcadores para diversas doenças e condições oculares. A coluna de aprisionamento de suspensão tem sido relatada como um fluxo de trabalho de preparação de amostras eficiente e fácil de usar para a ampla aplicação da análise proteômica a jusante. No entanto, essa estratégia ainda não foi bem estudada na análise do proteoma lacrimal humano. O presente protocolo descreve um fluxo de trabalho integrado de amostras lacrimais humanas clínicas a peptídeos purificados para pesquisa não invasiva de biomarcadores de proteína lacrimal usando espectrometria de massa, que fornece informações sobre biomarcadores e monitoramento de doenças quando combinado com análise de bioinformática. Uma preparação de amostra de aprisionamento de suspensão de proteínas foi aplicada e demonstrou a descoberta do proteoma lacrimal com procedimentos rápidos, reprodutíveis e fáceis de usar, como uma preparação universal e otimizada de amostras para análise de fluido lacrimal humano. Em particular, o procedimento de aprisionamento em suspensão superou a preparação de amostras em solução em termos de recuperação de peptídeos, identificação de proteínas e menor tempo de preparação da amostra.
Introduction
A proteômica lacrimal tem recebido atenção para explorar potenciais biomarcadores de doenças e condições oculares 1,2,3,4,5,6, para acessar a patogênese da condição ocular e sistêmica, bem como para explorar a vantagem da coleta não invasiva de amostras lacrimais usando tiras de Schirmer. O avanço tecnológico da espectrometria de massas de última geração permitiu a quantificação de proteínas em rasgos em escala de microlitros com precisão e precisão não possíveis no passado. Os métodos de preparo das amostras ainda não estão padronizados. Um fluxo de trabalho robusto e padronizado de preparação de amostras é essencial para o sucesso da aplicação clínica na pesquisa de biomarcadores de proteína lacrimal. O fluxo de trabalho de preparação de amostras de armadilhagem em suspensão (S-Trap) foi recentemente relatado como um método eficaz e sensível de preparação de amostras para ampla análise proteômica a jusante 7,8. No entanto, essa estratégia não tem sido bem relatada na análise do proteoma lacrimal humano, superando a preparação de amostra auxiliada por filtro (FASP) e a digestão em solução em termos de eficiência da digestão enzimática e do maior número de identificação de proteínas por análise espectrométrica de massa9. A abordagem baseada em S-Trap foi demonstrada na preparação de tecido retiniano 10, tecido fixado em formalina, incluído em parafina (FFPE) 11, células 12, microrganismo 13 e biópsias líquidas14,15.
Este protocolo descreve um fluxo de trabalho quantitativo integrado de amostras clínicas para proteína digerida enzimaticamente para a descoberta de um painel não invasivo de biomarcadores de proteína lacrimal com uma estratégia técnica rápida, reprodutível e robusta. Resumidamente, o fluido lacrimal foi coletado usando uma tira padrão de Schirmer e imediatamente seco com um aquecedor de quadro oftálmico para evitar autólise proteica à temperatura ambiente. As proteínas totais incluídas foram extraídas usando tampão de lise dodecil sulfato de sódio (SDS) a 5%, de acordo com a sugestão do fabricante, seguido de dosagem proteica. O lisado extraído foi então submetido à redução padrão com ditiotreitol (TDT) e alquilação com iodoacetamida (IAA).
Após acidificação com ácido fosfórico, a coluna de suspensão contendo 90% de metanol e 100 mM de trietilamônio bicarbonato (TEAB) foi adicionada às proteínas agregadas. A amostra foi então transferida para uma nova microcoluna de aprisionamento de suspensão. Digestão enzimática com tripsina grau sequencial na proporção de 1:25 (p/p, tripsina: proteína) a 47 °C por 1 h. Os peptídeos resultantes foram então eluídos por centrifugação, sequencialmente com TEAB 50 mM, ácido fórmico (AG) aquoso a 0,2% e acetonitrila (ACN) a 50% contendo AG a 0,2%. Os peptídeos eluídos foram secos a vácuo e reconstituídos em AG 0,1 %. A concentração do peptídeo foi medida e ajustada para 0,5 μg/μL para análise espectrométrica de massas.
Protocol
Os indivíduos assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido antes da participação no estudo. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Humana da Universidade Politécnica de Hong Kong e aderiu aos princípios da Declaração de Helsinque.
1. Coleta de fluido lacrimal humano com tira de Schirmer
- Use luvas e higienize para evitar a contaminação da amostra.
- Verifique se a embalagem interna está intacta, estéril e não expirou.
- Dobre ligeiramente o topo da tira de Schirmer para dentro na marca de 0 mm, conforme indicado próximo à ponta do semicírculo da tira (Figura 1).
- Retire a tira da embalagem interna segurando a extremidade da tira e evite o contato direto com a área de coleta da amostra de 0 a 25 mm.
- Peça ao sujeito que olhe para longe da posição da tira a ser colocada.
- Puxe a pálpebra inferior suavemente para baixo e prenda a extremidade da tira no fórnice inferior, próximo à região lateral do canto (Figura 2). Repita o mesmo procedimento no outro olho.
- Peça ao sujeito que feche suavemente as pálpebras para minimizar a irritação.
- Coletou-se líquido lacrimal por cerca de 5 min ou, preferencialmente, amostra lacrimal de 15-20 mm.
- Peça ao sujeito para abrir os dois olhos, puxar a pálpebra inferior suavemente e retirar as tiras do sujeito.
- Inspecionar o comprimento hidratado na tira de Schirmer e registrar a quantidade coletada em mm.
- Seque a tira com um aquecedor de estrutura padrão e limpo até que o fluido esteja completamente seco.
NOTA: O aquecimento excessivo que poderia potencialmente carbonizar o papel de filtro deve ser evitado. - Insira cada tira de Schirmer seca em um criotubo rotulado e guarde-a preferencialmente em um local fresco e seco no escuro até processamento posterior.
2. Preparação de produtos químicos e reagentes
- Tampão de lise (5% SDS, 50 mM TEAB, pH 7,5), 20 mL
- Pipetar 1 mL de TEAB 1 M e 80 μL de ácido fosfórico a 12%. Vórtice e sonicate brevemente para remover bolhas. Completar até 20 mL com água deionizada.
- Pesar 1 g de SDS e adicionar à solução com oscilação até dissolver.
- Tampão de precipitação proteico (metanol 90%, TEAB 100 mM, pH 7,1), 10 mL
- Adicionar 893 μL de TEAB 1 M e 92 μL de água deionizada.
- Adicionar 15 μL de ácido fosfórico a 85% em peso e 9 ml de metanol à solução e vórtice brevemente.
- Tampão de digestão (50 mM TEAB), 1 mL
- Adicionar 50 μL de TEAB 1 M e completar até 1 mL com água deionizada.
- Solução de ditiotreitol (TDT) a 200 mM, 500 μL
- Pesar 15 mg de TDT e dissolver em 500 μL de água deionizada; vórtice brevemente.
NOTA: Preparar antes de usar.
- Pesar 15 mg de TDT e dissolver em 500 μL de água deionizada; vórtice brevemente.
- Solução de iodoacetamida (IAA) 400 mM, 200 μL
- Pesar 15 mg de IAA e dissolver em 200 μL de água deionizada; vórtice brevemente. NOTA: Prepare antes de usar e evite a luz.
- ácido fórmico a 0,2%, acetonitrila a 50%, 10 mL
- Preparar 10 mL de acetonitrila a 50% em água deionizada.
- Adicionar brevemente 20 μL de ácido fórmico e vórtice.
- Solução de ácido fórmico a 0,2%, 10 mL
- Adicionar 20 μL de ácido fórmico a 10 mL de água deionizada e vórtice brevemente.
- Solução de ácido fórmico a 0,1%, 10 mL
- Adicionar 10 μL de ácido fórmico a 10 mL de água deionizada; vórtice brevemente.
3. Extração de proteínas em tiras de Schirmer
- Cortar e descartar a extremidade frontal além da marca de 0 mm da tira para remover a contaminação potencial devido ao contato dos tecidos conjuntivais com tesouras limpas de aço inoxidável.
- Cortar a tira em intervalos de 1 mm em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL (Figura 3).
- Adicionar 100 μL de tampão de lise ao tubo da microcentrífuga e vórtice a 1.000 rpm, temperatura ambiente por 1 h em um termomisturador.
- Centrifugar brevemente e transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
- Mova as tiras para as pontas da pipeta de 200 μL usando pinças limpas. Colocar as pontas no mesmo tubo a partir do passo 3.4 com suporte e centrifugar à temperatura ambiente a 4.000 × g durante mais 1 minuto para a máxima recuperação da amostra restante na tira.
- Medir a concentração de proteínas usando ácido bicinconínico (BCA) ou ensaio proteico compatível.
4. Preparação da amostra com armadilhagem em suspensão
- Normalizar as amostras para 50 μg de proteína com base no resultado do ensaio proteico.
- Adicionar 200 mM de TDT numa proporção de 1:10 (v/v, TDT: amostra) a uma concentração final de 20 mM de TDT e incubar a 95 °C durante 10 minutos.
- Arrefecer a solução proteica até à temperatura ambiente.
- Adicionar 400 mM de IAA numa proporção de 1:10 (v/v, IAA: amostra) para uma concentração final de 40 mM de IAA e incubar no escuro à temperatura ambiente durante 10 minutos.
- Adicionar 12% de ácido fosfórico aquoso numa proporção de 1:10 (v/v, ácido: amostra) para uma concentração final de 1,2% de ácido fosfórico e vórtice brevemente.
- Adicione tampão de ligação às proteínas numa proporção de 1:6 (v/v, amostra: tampão) e vórtice brevemente.
NOTA: Nesta etapa, a partícula de proteína coloidal deve ser formada, e a solução aparecerá translúcida se a quantidade de proteína for suficiente. - Desencape a Micro Coluna de Rotação de Aprisionamento de Suspensão e monte a coluna de spin em um tubo de microcentrífuga de 2 mL para coletar o fluxo.
- Adicionar até 200 μL de mistura de lisado proteico acidificado na coluna.
- Centrifugar a coluna a 4.000 × g por 20 s. Particulados proteicos foram aprisionados; Repita até que as amostras sejam carregadas na coluna.
- Adicionar 150 μL de tampão de ligação às proteínas e centrifugar a 4.000 × g por 20 s para lavar a proteína em suspensão. Repita 3x.
- Monte a Microcoluna de Aprisionamento de Suspensão em um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
- Adicionar 20 μL de tampão de digestão TEAB 50mM contendo protease na proporção de 1:25 (p/p, tripsina: proteína) no filtro dentro da coluna de spin, evitando bolhas e espaço de ar entre o filtro e a solução de digestão.
- Tampe a Coluna Micro de Rotação de Aprisionamento de Suspensão para evitar a evaporação. Incubar a 47 °C durante 1 h num misturador; Não agite ou vomite durante a digestão.
- Peptídeos eluídos com 40 μL de TEAB 50 mM por força centrífuga a 4.000 × g por 20 s.
- Adicionar 40 μL de AG a 0,2% e centrifugar a 4.000 × g por 20 s.
- Adicionar 35 μL de AG a 0,2%, acetonitrila a 50% e centrifugar a 4.000 × g por 20 s.
- Piscina três eluados e seque com uma centrífuga a vácuo.
- Conservar a -80 °C congelador a temperatura ultrabaixa até nova análise. NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.
5. Reconstituir peptídeos para análise por espectrometria de massa
- Reconstituir a amostra com 12 μL de AG 0,1%, vórtice e centrífuga brevemente.
- Meça a concentração de peptídeos com um Kit de Ensaio de Peptídeos.
- Normalizar a concentração de peptídeo para 0,5 μg/μL em AG a 0,1%.
- Transfira a mistura peptídica para um frasco de amostra automática e esteja pronta para análise por espectrometria de massa.
6. Aquisição de Amostras por Cromatografia Líquida-Espectrometria de Massas em Tandem
- Carregar 3 μg do peptídeo com tampão de carga isocrático (0,1% AG, 5% ACN) em uma coluna armadilha (C18, 5 μm, 100 μm, 20 mm) a uma taxa de fluxo de 2 μL/min por 15 min.
- Fracionar os peptídeos usando uma coluna nanoanalítica de fase reversa (C18, 5 μm, 100 μm, 300 mm) a uma taxa de fluxo de 350 nL/min em um gradiente de separação de 155 min. Use a fase móvel A compreendendo uma mistura de 0,1% de ácido fórmico (v/v), 5% de ACN (v/v) em água e a fase móvel B contendo 0,1% de AG (v/v), 98% de ACN (v/v) em água. Use o seguinte gradiente: 0-0,5 min: 5% B, 0,5-90 min: 10% B, 90-120 min: 20% B, 120-130 min: 28% B, 130-135 min: 45% B, 135-141 min: 80% B, 141-155 min: 5% B.
- Execute a aquisição dependente de dados (DDA) com uma faixa de varredura TOF-MS entre 350 a 1800 m/z com um tempo de acumulação de 250 ms e um tempo de exclusão de alvo dinâmico de 18 s. Em seguida, execute uma varredura MS/MS a 100 a 1.800 m/z no modo de alta sensibilidade com um tempo de acumulação de 50 ms para os 50 principais precursores por ciclo com um limite de 125 cps para o sinal MS/MS com um estado de carga de +2 a +4.
- Analise dados brutos com o software referenciado ou outros mecanismos compatíveis com um banco de dados de referência no FASTA a partir do banco de dados UniProt acessível publicamente.
Representative Results
Este protocolo permite a coleta de amostras lacrimais com Tiras de Schirmer que são armazenadas secas à temperatura ambiente antes do posterior preparo da amostra para análise por espectrometria de massa. O fluxo de trabalho de preparação de amostra auxiliada por filtro (FASP) com microcoluna de aprisionamento de suspensão permitiu a preparação rápida da amostra em horas, em comparação com os procedimentos de digestão em solução comumente adotados em dias que exigem incubação noturna. O rendimento da recuperação peptídica foi significativamente maior (p < 0,001) do que o protocolo padrão de digestão em solução e com boa reprodutibilidade a um coeficiente de variação (%CV) < 7%. Um pool de amostras de lágrimas foi repetido em seis réplicas técnicas com 74,2 ± 5,0% de recuperação de peptídeos e 52,8 ± 1,6% de recuperação de peptídeos em amostras preparadas com procedimentos em solução. Uma amostra de lágrima agrupada com uma quantidade de proteína de 36,3 μg foi cravada na tira de Schirmer e extraída como descrito anteriormente, a eficiência de extração da proteína foi de 81% (29,5 ± 6,8 μg, média ± DP).
Ambos os fluxos de trabalho carregaram 3 μg de peptídeos no MS, e a pesquisa DDA produziu um total de 1.183 ± 118 proteínas (5.757 ± 537 peptídeos distintos) e 874 ± 70 proteínas (4.400 ± 328 peptídeos) a 1% FDR no grupo de aprisionamento em suspensão e no grupo em solução, respectivamente. A análise da ontologia gênica (GO) utilizando o sistema de classificação PANTHER revelou proteomas muito semelhantes para ambas as abordagens, sendo a ligação, a atividade catalítica e a regulação da função molecular suas principais funções moleculares (Figura 4).
Figura 1: Dobre a parte superior da tira de Schirmer na marca de 0 mm antes da aplicação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Posição da tira de Schirmer durante a coleta da lágrima. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Ilustração do manuseio da tira de Schirmer antes da extração da proteína. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Gráfico de pizza ilustrando a análise da ontologia gênica para os proteomas identificados usando o fluxo de trabalho em solução e o fluxo de trabalho de armadilhagem de suspensão, usando o sistema de classificação Panther. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Para obter resultados precisos usando este método, luvas descartáveis sem energia devem ser usadas em todos os procedimentos desde a coleta da amostra lacrimal para evitar a contaminação da amostra. É importante evitar bolhas e lacunas de ar entre o filtro e a solução da amostra em cada etapa, utilizando microcolunas giratórias. Se o volume da amostra for maior que a capacidade das colunas, recomenda-se repetir o processo. Este protocolo provou ser mais eficiente do que o protocolo tradicional em solução em termos de tempo de preparação, recuperação de proteína e identificação de proteína total. Isso ocorre em grande parte porque as amostras passam pela maioria dos procedimentos necessários na mesma coluna, ao contrário do método em solução, que envolve várias etapas de transferência, como precipitação de acetona, digestão e limpeza (dessalinização), o que aumenta a probabilidade de variações nos dados resultantes.
Além das amostras lacrimais coletadas pelo método microcapilar16,17, esse fluxo de trabalho FASP com microcoluna de aprisionamento de suspensão fornece um método alternativo de preparação de amostras que permite a preparação rápida e robusta de amostras lacrimais coletadas com tiras de Schirmer, com preparação mínima do material e etapas fáceis de serem seguidas. Isso permite a preparação reprodutível de amostras lacrimais para grandes estudos de coorte em várias doenças oculares ou condições com melhor recuperação de peptídeos e identificação de proteínas pela EM em procedimentos em solução. Este processo confiável pode ser utilizado regularmente na preparação de amostras de biomarcadores lacrimais para pesquisa e outros fins clínicos. Mais importante ainda, requer treinamento mínimo da equipe para coleta no local e elimina a necessidade de armazenamento de amostras em um freezer. As amostras são secas no local para minimizar a autólise e degradação de proteínas. Assim, isso permite o envio conveniente pelo correio para facilitar a análise a jusante, em vez de usar tubos microcapilares.
Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela iniciativa InnoHK e pelo Governo da Região Administrativa Especial de Hong Kong; Centro de Pesquisa em Visão SHARP; e o Centro de Pesquisa para Inovação em Medicina Chinesa (RCMI) da Universidade Politécnica de Hong Kong.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 9 mm Plastic Screw Thread Vials | Thermo Scientific | C4000-11 | |
| Acetonitrile, LCMS Grade | Anaqua | AC-1026 | |
| Centrifuge MiniSpin plus | Eppendorf | 5453000097 | |
| DL-dithiothreitol (DTT), BioUltra | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | |
| Formic acid, ACS reagent, ≥96% | Sigma-Aldrich | 695076 | |
| Frame Heater OPTIMONSUN Electronic | Breitfeld & Schliekert GmbH | 1203166 | |
| Iodoacetamide (IAA), BioUltra | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| Methanol, HPLC Grade | Anaqua | MA-1292 | |
| Nunc Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes, 2 mL | Thermo Fisher Scientific | 368632 | |
| Phosphoric acid, 85 wt.% in H2O | Sigma-Aldrich | 345245 | |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Fisher Scientific | 23275 | |
| Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | A53225 | |
| Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry | Sciex | TripleTOF 6600 | |
| Schirmer Ophthalmic Strips | Entod Research Cell UK Ltd | I-DEW Tearstrips | |
| S-Trap Micro Column | Protifi | C02-micro-80 | |
| SureSTART 9 mm Screw Caps | Thermo Scientific | CHSC9-40 | |
| Triethylammonium bicarbonate (TEAB), 1 M | Sigma-Aldrich | 18597 | |
| Ultra-performance Liquid Chromatography | Eksigent | NanoLC 400 | |
| UltraPure Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Thermo Fisher Scientific | 15525017 |
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